CN109456924B - 一种增加弗托葡糖杆菌hd924生物量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增加弗托葡糖杆菌HD924生物量的方法，属于生物工程领域。本发明通过在弗托葡糖杆菌HD924中利用组成型启动子sldAp过量表达Bacillus lentus 168来源的葡萄糖脱氢酶基因gdh，同时在培养基中添加一定浓度的L‑葡萄糖，使重组菌细胞干重提高了21.2％。过量表达gdh基因的重组弗托葡糖杆菌二羟基丙酮产量、生产强度、甘油利用率、胞内NADH浓度均有显著的提升。

Description

一种增加弗托葡糖杆菌HD924生物量的方法
技术领域
本发明涉及一种增加弗托葡糖杆菌HD924生物量的方法，属于生物工程领域。
背景技术
弗托葡糖杆菌(Gluconobacter frateurii)HD924为革兰氏阴性菌，专性好氧，属于葡糖杆菌属。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.5397。该菌株具有优良的二羟基丙酮生产性能，好氧条件下二羟基丙酮产量可以在达到170g/L以上(CN，201110388519)。该菌株已经在长兴制药股份有限公司进行工业生产，是生产二羟基丙酮的工业菌株之一。刘宇鹏等(Bioresource technology 2013,142:384-389)研究发现，弗托葡糖杆菌HD924发酵过程中最大生物量OD560只有8.7。提高发酵过程中的生物量能够提高菌体生产二羟基丙酮的生产强度，目前促进弗托葡糖杆菌生长的方法主要是优化菌体的培养基组成和生长条件。
葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase，[EC:1.1.1.47]GDH)，是一种NAD+和NADP+辅酶依赖型蛋白。GDH能够催化葡萄糖脱氢氧化成葡萄糖酸，并将氧化态的NAD+和NADP+还原为NADH和NADPH，促进NAD+和NADP+再生，为细胞的生长提供还原力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中弗托葡糖杆菌HD924在发酵二羟基丙酮过程中的生物量低的缺陷，提供一种增加弗托葡糖杆菌HD924生物量的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
在弗托葡糖杆菌HD924中通过构建的重组质粒pBBR-sldAp-gdh过量表达Bacilluslentus 168来源的葡萄糖脱氢酶基因gdh，同时在培养基中添加一定浓度的L-葡萄糖。所述的重组质粒pBBR-sldAp-gdh是甘油脱氢酶基因启动子sldAp、gdh基因克隆在pBBR1MCS-4质粒的SacI和EcoRI的酶切位点之间，其物理图谱如附图1所示。所述的gdh基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列中包含该基因自身的终止子。所述的过量表达是通过弗托葡糖杆菌来源的甘油脱氢酶基因组成型启动子sldAp控制gdh在弗托葡糖杆菌细胞内进行组成型表达。sldAp的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
以甘油为底物发酵生产二羟基丙酮过程中，过量表达gdh的重组菌与野生菌株HD924相比，细胞干重提高了21.2％，发酵12h、18h和24h的胞内NADH分别提高了3.1、2.6和1.8倍。发酵48h，二羟基丙酮的生产强度提高了14.2％。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是pBBR-sldAp-gdh质粒物理图谱。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
本实施例中以G.frateurii HD924为实验菌株，Bacillus lentus 168购自美国模式菌种收集中心。
HPLC法测定DHA，测定方法：取发酵液1mL，12000r/min离心10min，取上清液0.5mL用蒸馏水稀释到测定线性范围(0～10g/L)，膜滤，然后进HPLC测定。外标法计算发酵液中DHA含量。色谱分离条件为:Aminex HPX-87H色谱柱(300mm×7.8mm，9μm)，UV检测器检测波长为260nm，流动相：8mmol/L硫酸。柱温为50℃，流速为0.5mL/min，进样量30μL。
甘油检测方法：采用HPLC法测定甘油含量。测定条件同DHA，检测器为RI检测器。
辅酶NADH检测方法：取20ml发酵液，6000rpm 4℃离心3min，弃上清，加入10ml-4℃预冷的甲醇盐溶液(20％甲醇v/v，0.9％氯化钠m/v)悬浮细胞，-20℃处理20min。6000rpm 4℃离心3min，弃上清,迅速置于液氮中保持3min，用液氮研磨破碎细胞。加入预冷的PBS溶液，用HPLC法测定NADH含量。色谱分离条件为:Waters XBridge C18Column,(5μm,4.6mm X250mm)，UV检测器检测波长为254nm，流动相：220mmol/L磷酸钾缓冲液，内含10％甲醇，用四丁基氢氧化胺调pH至6.5。柱温为40℃，流速为0.8mL/min，进样量15μL。
菌体量测定方法：采用比浊法，菌液用2％稀盐酸稀释10倍后在560nm处测定吸光值。细胞干重(DCW)为560nm处测定吸光值的0.3倍。
所用的培养基：一级种子培养基(g/L)：甘油50，酵母浸粉15，KH2PO4 3，琼脂粉20，pH 6.0；二级种子培养基(g/L)：甘油30，酵母浸粉10，KH2PO4 3，琼脂粉20，pH 6.0；发酵培养基(g/L)：甘油160，酵母浸粉15，CaCO3 15，pH6.0；培养基中根据需要添加氨苄青霉素(100μg/mL)。
5L发酵罐发酵方法：从-80℃超低温冰箱取50μL冻存的菌种，接种到一级种子，28℃、200r/min培养24h，按5％的接种子量转接二级种子，28℃、200r/min培养10h。取二级种子，按5％接种量接种5L罐发酵培养。5L罐发酵条件：转速400r/min，通气量2.5vvm，装液量3L，30℃发酵36h，发酵过程以0.5g/L/h流速补加L-葡萄糖至菌体到达最大生物量。
限制性内切酶EcoR I、SacI、T4连接酶均购自赛默飞公司；DNA聚合酶，细菌基因组提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自宝赛生物(杭州)公司。
过量表达gdh基因质粒和重组菌的构建
使用细菌基因组提取试剂盒分别提取G.frateurii HD924和B.lentus168的基因组，以此为模板，分别利用引物sldAp F、sldAp R和引物gdh F、gdh R通过PCR扩增得到sldAp和gdh核苷酸序列。以sldAp和gdh核苷酸序列为模版，S-G F和S-G R为引物，通过PCR扩增得到sldAp-gdh操纵子。
重叠PCR产物sldAp-gdh核酸片断通过胶回收、纯化，用SacI和EcoRI酶切后与SacI和EcoRI酶切的pBBR1MCS-4通过T4连接酶连接，构建重组质粒pBBR-sldAp-gdh,提质粒、测序。测序验证正确后，电击转入G.frateurii HD924。得到重组菌G.frateurii HD924(pBBR-sldAp-gdh)。
在5L发酵罐上比对研究了野生菌株G.frateurii HD924和过量表达gdh基因的重组菌G.frateurii HD924(pBBR-sldAp-gdh)的生长性能和二羟基丙酮生产能力。发酵48h,与野生菌株相比，G.frateurii HD924(pBBR-sldAp-gdh)的生物量提高了21.2％。过量表达gdh基因能显著提高G.frateurii HD924的生长性能。重组菌G.frateurii HD924(pBBR-sldAp-gdh)的二羟基丙酮产量和生产强度、甘油利用率均有显著的增强，与G.frateuriiHD924相比，分别提高了14.1％、12.5％、14.38％。单位细胞生产能力与G.frateurii HD924相比下降了3.48％，变化不显著。
表1野生菌株G.frateurii HD924和重组菌G.frateurii HD924(pBBR-sldAp-gdh)5L发酵罐48h发酵结果
检测了5L罐发酵生产二羟基丙酮过程中，对数期(12h)、稳定期(18h)、稳定后期(24h)过量表达gdh的重组菌与野生菌株HD924胞内NADH的含量。生物量增加的过程中，相对于野生菌株HD924，重组菌G.frateurii HD924(pBBR-sldAp-gdh)胞内NADH分别提高了3.1、2.6和1.8倍，胞内NADH含量显著提高。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河南大学
<120> 一种增加弗托葡糖杆菌HD924生物量的方法
<130> W201810038
<141> 2018-12-20
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1042
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60
aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120
aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180
gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240
aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300
tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360
tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420
attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccgt tatttgtcca ctatgcggca 480
agtaaaggcg ggataaagct gatgacagaa acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540
attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacgc caatcaatgc tgaaaaattc 600
gctgacccta aacagaaagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660
ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720
ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acacaatatc cttcattcca ggcaggccgc 780
ggttaattag gcacgctttt tctttacaag tgctgctaca gataaaataa tggcagccgc 840
agacagcacc atcgctgtaa tgtctagagc tgaagaacct gagttttcgg aatcgtcttc 900
tgttttcgtg gcgccgtgct catctgtcac ttgctttgca gacgtgatgt ttgtaatgga 960
atgaggtgta tcggcatcct cgtcacctgt ccactcaaca atgctgccgt ctttgtaata 1020
ttggtatgcg tcccaagcag ct 1042
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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attcctgtat ctgggtgcgc tggcctacac ctgggtctgg tccctgtggg aagtgggctt 180
cagccccgtt gaccttctgc cgcgcgattt cggcccgacg ctgctgggca tccttgtcgc 240
cctcaccatc ccggttcttc gccggatgga aacccgccgt accctgaggg gaaccgtctg 300
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgtatccgg atttaaaagg 20
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgaggggaac cgtctgatgt atccggattt aa 32
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttaaatccgg atacatcaga cggttcccct ca 32

Claims (4)

1.一种增加弗托葡糖杆菌HD924生物量的方法，其特征在于，所述方法为在弗托葡糖杆菌HD924菌中过量表达葡萄糖脱氢酶基因gdh，同时在培养基中添加一定浓度的L-葡萄糖；所述的葡萄糖脱氢酶基因gdh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的增加弗托葡糖杆菌HD924生物量的方法，其特征在于，所述的葡萄糖脱氢酶基因gdh来源于Bacillus lentus 168。
3.如权利要求1所述的增加弗托葡糖杆菌HD924生物量的方法，其特征在于，所述的过量表达是通过弗托葡糖杆菌HD924来源的甘油脱氢酶基因组成型启动子sldAp控制gdh在弗托葡糖杆菌细胞内进行组成型表达，所述启动子sldAp的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求1所述的增加弗托葡糖杆菌HD924生物量的方法，其特征在于，培养基中L-葡萄糖的添加量为0.1～1g/L/h。
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