CN104031926A - 重组乙肝病毒、含有重组乙肝病毒基因的真核汉逊酵母工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开重组乙肝病毒、含有重组乙肝病毒基因的真核汉逊酵母工程菌及其制备方法和应用，在已知HBsAg(adr2)的病毒编码的基础上，考虑已知HBsAg(adr2)病毒编码和汉逊酵母优选编码频率合成重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因，并以胞内型质粒pMPT-02为出发载体构建含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的质粒pMPT-HBS adr2，并转化细胞后筛选得到工程菌CGMCCNo.9179。本发明实现重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因和汉逊酵母的优选编码频率，本发明工程菌株的诱导反应显著强于CHO细胞重组HBsAg诱导的反应，可实现重组乙肝疫苗的生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，更加具体地说，涉及一种含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌及其构建方法。
背景技术
根据2000年世界卫生组织、联合国儿童基金会/艾滋病基金会和美国疾病控制中心的报告，乙肝已排为全世界第7大传染病。全世界约20亿人有现状或既往乙肝病毒感染标志。3.7亿人为慢性HBV携带者，其中15％～25％将死于慢性肝病(肝癌和肝硬化)，每年乙肝死亡数为75万例。我国乙肝病毒携带者超过1亿，现有患者超过2000万，南方流行重于北方，农村重于城市。目前并无特意性治疗乙肝的药物，最有效的手段就是接种乙肝疫苗。
第一代乙肝疫苗为血源疫苗，采用无症状带毒者(HBsAg阳性)血浆为原料制备。由于提取方法不同，所得成分也有差别，但均含提纯的22nm小颗粒乙型肝炎表面抗原。80年代以来开始研制第二代乙肝疫苗，系将S基因编码的226个氨基酸产物装配而成的抗原颗粒，采用基因工程方法在哺乳动物细胞和重组酵母中均能表达。因其有效成分仅为乙肝病毒包膜的主蛋白，约有10％成人不产生应答。目前已发展到第三代的核酸疫苗。当前使用较为广泛的是乙肝基因工程疫苗。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因、及含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌及其构建方法，使用这一真核汉逊酵母工程菌可实现重组乙肝疫苗的生产。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：
一种重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因，其序列是序列表中SEQIDNo.1所述的核苷酸序列。
本专利提供一种含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)的质粒，如附图3所示的胞内型质粒pMPT-HBSadr2。
本专利提供的含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.9179，保藏日期为2014年5月20日，分类命名为异常毕赤酵母Pichiaanomala。
所述含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌的宿主细胞株(即含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌的出发菌株)为真核汉逊酵母菌株RB-11(直接购自德国莱茵生物公司)。RB-11细胞株为LR9细胞株的改良衍生株(Roggenkamp.Retal.,1986TransformationofthemethylotrophicyeastHanseunlapolymorphabyautonomousreplicationandintegrationvectors,Mol.GenGenet202:302)。RB-11细胞株为5′-乳清酸苷磷酸脱羧酶基因缺陷性突变株，已被广泛应用于工业重组菌的构建。
本发明公开了重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌的构建方法，按照下述步骤进行：
步骤1，以胞内型质粒pMPT-02为出发载体构建含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的质粒pMPT-HBSadr2；
步骤2，将步骤1制备的质粒pMPT-HBSadr2转化真核汉逊酵母菌株RB-11，经筛选得到表达水平和质粒拷贝数最高的含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌。
本发明的含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌在制备乙肝疫苗中的应用。
本发明通过基因克隆，构建含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌，与现有技术相比，具有以下优点：(1)重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因在已知HBsAg(adr2)的病毒编码的基础上，充分考虑已知HBsAg(adr2)的病毒编码和汉逊酵母优选编码频率的基础上，进行研发合成的，与已知HBsAg(adr2)的病毒编码相比，SEQ IDNo.1所述的核苷酸序列共有121个碱基突变，DNA的同源性百分率(678-121)/678×100％为82.15％，但表达的氨基酸的同源性率为100％；(2)实现重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因和汉逊酵母的优选编码频率，更好地进行表达；(3)与现有的CHO细胞重组HBsAg相比，本发明的工程菌株的诱导反应显著强于CHO细胞重组HBsAg诱导的反应。
附图说明
图1是本发明提供的重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因与现有文献中已知HBsAg(adr2)的病毒编码序列的同源性比较示意图，其中上行为现有文献中已知HBsAg(adr2)的病毒编码序列，下行为本发明提供的重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因，背景标注黑色的核苷酸即为突变的核苷酸。
图2是本发明中构建胞内型质粒pMPT-HBSadr2的过程示意图。
图3是本发明中构建胞内型质粒pMPT-HBSadr2的物理图谱。
图4是利用本发明含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌与现有CHO细胞重组HBsAg进行CTL检测的结果图，其中黑色柱状代表现有CHO细胞重组HBsAg，空白柱状代表本发明含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌。
图5是利用本发明含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌与现有CHO细胞重组HBsAg进行血清抗体应答检测的结果图，其中黑色柱状代表现有CHO细胞重组HBsAg，空白柱状代表本发明含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌。
本发明涉及的生物材料的保藏日期为2014年5月20日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.9179。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
步骤一、根据真核汉逊酵母优选编码频率设计乙肝病毒HBsAg基因核苷酸序列。
乙肝病毒HBsAg基因核苷酸序列有其固有的偏爱密码子，为使其与真核汉逊酵母RB-11基因的密码子使用方式更接近，以真核汉逊酵母菌的偏爱密码子使用系数为参照，首选兼并密码子中汉逊酵母使用四叔最大的密码子其次选用偏爱性较小的密码子。利用DNAMAN软件避免出现BamHI和EcoRI酶切位点，尽可能少出现七个碱基以上的发卡结构和重复序列，避免出现内含子剪接序列、转录终止序列(ATTATTTTAT等富含AT序列)、内部启动子序列(TATA)和核糖体结合位点(GGAGG)。
根据文献(A.K.RaneyandA.Mclachlan,TheBiologyofHepatitisBVirus,In:EditorA.Mclachlaned.MolecularBiologyoftheHepatitisBVirus,2000,CRCPress)中已知HBsAg(adr2)的病毒编码，结合真核汉逊酵母RB-11优选编码频率，合成本发明提供的重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因，其序列是序列表中SEQIDNo.1所述的核苷酸序列。
将序列表中SEQIDNo.1所述的核苷酸序列(即重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因)与上述文献中已知HBsAg(adr2)的病毒编码序列做同源性比较，如附图1所示，上行为文献中已知HBsAgadr2病毒码序列，下行为本发明重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因序列，在本发明重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因序列中共有121个碱基突变，DNA的同源性百分率(678-121)/678×100％为82.15％，氨基酸的同源性率为100％。
步骤二、构建胞内型质粒pMPT-HBSadr2
胞内型质粒pMPT-HBSadr2的构建工作委托大连高新生物工程有限公司进行。以胞内型质粒pMPT-02为出发载体，连接人工合成的HBsAgadr2优选码序列(如图4)后热转化至E.coliCompetentCellJM109(CodeNo.D9052)中，提取阳性克隆，DNA测序筛选出结果正确的质粒pMPT-HBSadr2。
载体质粒pMPT-02包含以下真核汉逊酵母和酿酒酵母的DNA序列：
(1)MOX(甲醇氧化酶)启动子，1.5kb
(2)MOX(甲醇氧化酶)终止子，350bp
(3)真核汉逊酵母自主复制序列HARS，1.0kb
(4)酿酒酵母尿嘧啶URA3基因，1.1kb
上述四个基因元件应用PCR技术，紧密相连地插入pBluescriptⅡ质粒中，从而删除了原有技术中带有的残留序列，并删除了URA3与pBluescriptⅡ之间多克隆位点134bp的序列，构建成穿梭载体pMPT-02。
具体来说，质粒pMPT-HBSadr2的构建工作包含以下内容：
(1)合成重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因，构建成含该重组乙肝病毒HBsAgadr2基因质粒的质粒，将其命名为MC407B-16；
(2)测序正确后的MC407B-16号质粒用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，酶切产物用TaKaRaPCRFragmentRecoveryKit(CodeNo.D301)切胶回收701bp的目的片段DNA，称其为InsetDNA6；
(3)将酶切鉴定正确的质粒pMPT-02同样用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，切胶回收后所得到的载体DNA，称其为VectorDNA6；
(4)使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6022)中的Solution Ⅰ将InsetDNA6与Vector DNA6连接后，热转化至E.coli Competent Cell JM109(Code No.D9052)中，16℃涂布平板过夜培养菌体。从转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA后用EcoRⅠ/Bam.0H Ⅰ双酶切，酶切结果表明，MC407A+B+C+D-77～80均为阳性克隆；
(5)引物MC407BF11和MC407BR11扩增含载体pMPT-HBSadr2的转化子，筛选后扩大培养，用宝生物工程大连有限公司的质粒回收试剂盒(TaKaRa MiniBest PlasmidPurificationKitVer2.0)提纯。
整个载体构建示意图如附图2所示，整个载体物理图谱如附图3所示，使用的引物MC407BF11和MC407BR11的序列(如序列表中SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示)如下所示：
MC407BF11:5′-GGGCATGTTGCCAGTCTGCCCTC-3′ (23base)
MC407BR11:5′-GGGATGCAGGTGCAATTGCCGTC-3′ (23base)
步骤三：含重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌的转化和筛选
用SacⅠ酶切载体pMPT-HBSadr2使其线性化，使用LN-101型基因脉冲导入仪对真核汉逊酵母菌株RB-11进行电转化。电击脉冲为1500v，电容为21.5μF，感受态细胞为100μL的真核汉逊酵母菌株RB-11，进行电转化。选取电转化的菌株进行筛选，检测HBsAg表达水平和遗传稳定性，以获得最佳菌株，此菌株表达水平和质粒拷贝数最高，且始终稳定。将筛选得到的菌株进行保藏，即为本发明提供的含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.9179，保藏日期为2014年5月20日。
步骤四：利用本发明的含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌在制备乙肝疫苗中的应用，选择细胞培养诱导表达操作和CTL检测予以性质证明
将冻存于﹣75℃冰箱中的502-14号工程菌株取出迅速溶解，取30μL接种于10mLMD培养基中，设温度为30±1℃，160rpm摇床培养24h至OD600为10，取0.2mL菌悬液至另一10mLMD培养基中，继续160rpm摇床培养24h。将所得菌悬液离心后，菌体接种于10mL含0.5％甲醇的无碳源培养基中，温度为30±1℃，160rpm摇床培养48h，24h后补加甲醇两次。
诱导结束后，菌悬液3000rpm离心后取上清，分别经微孔膜过滤、超滤膜过滤、硅胶吸附及洗脱粗制提取抗原，再经丁基琼脂糖精制纯化，溶于TBS缓冲液中。经十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测为纯化的HBsAg。Bradford法测得HBsAg浓度为0.157mg/ml。
委托南开大学对BALB/c小鼠进行CTL检测。BALB/c小鼠经HBsAg腹腔免疫三次后做CTL检测，以CHO细胞重组HBsAg为参考(即在实验条件一致的情况下，仅仅改变两种菌株)。CHO细胞重组HBsAg比真核汉逊酵母重组HBsAg诱导产生血清抗体应答略强或相同，无明显差别，如附图5所示。在CTL(CYTOTOXICRESPONSE，细胞毒素反应)检测结果中可以看出真核汉逊酵母重组HBsAg诱导的反应显著强于CHO细胞重组HBsAg诱导的反应，如附图4所示。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因，其特征在于，其序列是序列表中SEQIDNo.1所述的核苷酸序列。
2.一种包含权利要求1所述基因的重组载体，其特征在于，将权利要求1所述基因加入到胞内型质粒pMPT-02，所述重组载体为胞内型质粒pMPT-HBSadr2。
3.一种包含权利要求2所述重组载体的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主菌为真核汉逊酵母菌株RB-11。
4.含有权利要求1所述的重组乙肝病毒基因的真核汉逊酵母工程菌，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9179，保藏日期为2014年5月20日，分类命名为异常毕赤酵母Pichia anomala。
5.重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌的构建方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
步骤1，以胞内型质粒pMPT-02为出发载体构建含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的质粒pMPT-HBS adr2；
步骤2，将步骤1制备的质粒pMPT-HBSadr2转化真核汉逊酵母菌株RB-11，经筛选得到表达水平和质粒拷贝数最高的含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌。
6.含有重组乙肝病毒HBsAg(adr2)基因的真核汉逊酵母工程菌在制备乙肝疫苗中的应用。
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