JP7278261B2 - マルチコピー遺伝子タンパク質発現系 - Google Patents

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Description

本発明は、バイオテクノロジーの分野、具体的には組換えタンパク質発現の分野に属する。さらに、本発明は、組換えタンパク質（目的のタンパク質、ＰＯＩ）を高収率で発現するように改変された細胞及び前記改変細胞に導入された遺伝物質の再配列による遺伝的不安定性が少ない改変細胞に関する。別の態様において、本発明は、前記改変細胞を生成するために使用されるベクター、発現カセット、並びに前記改変細胞を生成する方法及び前記改変細胞、前記ベクター及び前記発現カセットを使用して組換えタンパク質を製造する方法に関する。
組換えタンパク質の発現には、一般に２つの主要な目的があり、第１は、高品質な、すなわち、例えば純粋で分解産物含量が低く、アミノ酸配列及び翻訳後修飾に関して均質であり、可溶性であり、三次元折り畳みが正しく、かつ天然の野生型タンパク質と比較して同じ生物活性を有する、組換えタンパク質を得ることである。第２の目的は、例えば、生産工程中のコスト、時間、供給源を節約するために、組換えタンパク質を短時間で大量に得ることである。
本発明は、組換えタンパク質発現中に一般に遭遇する２つの問題である、タンパク質発現の量の低さ及び組換えタンパク質発現に使用される細胞株の遺伝的不安定性に、焦点を置いている。
大量の組換えタンパク質を得るために、組換えタンパク質生成のために選択された細胞にいわゆる発現カセットのコピーを１つだけ導入しようとするだけではなく、細胞に該発現カセットのコピーをいくつか導入して、次いで最大量の目的のタンパク質（ＰＯＩ）を発現するために、最適な大きい数の発現カセットを有する改変宿主細胞を選択しようとすることも、一般的に行われる。この戦略は、少なくとも２つの欠点を有する。
第１に、細胞に導入される発現カセットのコピーが多いほど、これらの発現カセットの配列は、組換えを促進するそれらの配列の類似性により、時間と共に相互に組換えを起こす可能性が高い。結果として、改変宿主細胞内のヌクレオチド配列の再配列は、タンパク質発現に使用される改変宿主細胞のゲノムの不安定性をもたらす。これにより、経時的に改変細胞の組換えタンパク質発現が低下する。最悪の場合、これらの不要な組換え法によりＰＯＩの配列が変化し、組換えタンパク質の発現率が低下するだけでなく、品質が低下する。これは、該組換えタンパク質がＰＯＩのさまざまなバリアント、例えば、ＰＯＩの切断型若しくは変異型又は重複したドメイン及び領域を含むＰＯＩの混合物などを生じることによる。
第２に、発現カセットのコピー数が多ければＰＯＩの高い発現率を保証するものではないことは、一般的に認識されている。おそらく、発現カセットの数が多すぎると、改変宿主細胞のタンパク質発現に必要な分子機構のある種の過負荷又は過労が生じ、それにより改変宿主細胞内の発現カセットのコピー数が特定の閾値を超えると、ＰＯＩの発現率が低下すると思われる。
本発明の基本原理は、すべてが目的の同じ成熟組換えタンパク質をコードするが異なるヌクレオチド配列を有する、いくつかの発現カセットを、細胞に導入することである。本発明の主な利点の１つは、その普遍的な適用可能性であり、これは特定の細胞型に限定されず、原核細胞及び真核細胞に使用することができる。
例えば、発現カセットは異なるプロモーター、異なるターミネーター、異なるシグナル配列などを有してもよく、ＰＯＩのコード配列は複数の発現カセットで同じであっても、異なる発現カセットで異なってもよいが、ＰＯＩのアミノ酸配列は常に同じである。発現カセットは、縮重遺伝コードを利用することにより、同じアミノ酸配列を有する同じＰＯＩをコードする異なるヌクレオチド配列を有し得る。同じアミノ酸は、最大６つの異なるコドンによってコードされる場合があり、それにより、まったく異なるヌクレオチド配列によってコードされる同じアミノ酸配列を有することが可能である。さらに、発現カセット、選択マーカー、複製起点などの同じベクター要素がベクター内で２回使用される場合、又は複数のベクターで使用される場合、前記ベクター要素はそのベクター配列内で異なる向きで使用されることがある。これにより、ベクター配列の違いがさらに増大し、それにより、これらの２つ以上の同一のベクター要素を含むトランスフェクト宿主細胞内の前記ベクター要素の組換えの可能性が低下する。これは、前記宿主細胞の遺伝的安定性をさらに高める。
この戦略は、少なくとも２つの主要な利点を有する。一方では、発現カセットは今やまったく異なるヌクレオチド配列を有するため、相互に組換えを起こす可能性が低くなる。これにより、改変細胞のゲノムがより安定し、該改変細胞内で発現カセットのコピー数を増やすことができる。他方、改変細胞のタンパク質合成機構は、以下を改変細胞により並行して使用することにより、ＰＯＩの高い発現率による過負荷又は過労になる可能性が低くなる：
－異なるプロモーター、これにより異なるセットの転写因子が順に使用されるため、特定の転写因子の十分量の不足によるボトルネックの可能性を回避することができる
－異なるシグナル配列、これにより、異なるＰＯＩ分泌機序が並行して使用されるため、分泌経路のボトルネックの可能性を回避することができる
－ＰＯＩの異なるコード配列、これにより、ＰＯＩ合成に異なる比率のｔＲＮＡが順に使用されるため、特定のｔＲＮＡの供給における潜在的なボトルネックの可能性を回避することができる
－異なるターミネーター配列、これにより、異なる終結機序／終結因子が並行して使用されるため、終結経路のボトルネックの可能性を回避することができる。
これら２つの態様に加えて、本発明はさらに、第３の利点を有する。当業者は、プロモーターとＰＯＩとのどの組み合わせが改変される特定の宿主細胞において最も良く機能するかを一連の実験で見つけ出す必要はなく、プロモーターの異なるタイプのセットが常に平行して使用され、たとえ個々のプロモーターが特定のＰＯＩ／宿主細胞の組み合わせにおいてうまく機能しなくても、他の異なるプロモーターが同時に使用されて、最適でないプロモーターを補うことができるので、このことがＰＯＩの全体的な発現率に必ずしも大きな影響を与えることはない。これにより、例えば、費用対効果の高い、効率的なＰＯＩの組換え発現に適した改変宿主の開発時間を短縮することができる。
同じＰＯＩのための、それぞれ異なる単一発現カセットを含む、並行して使用される複数のベクターという構想は、複数の異なる発現カセットを同じベクター内に含むベクターを使用する、利用可能な構想と比較して、より融通が利くという追加の利点を有する。異なる単一発現カセットベクターのセットによって、当業者は、異なる発現カセットのさまざまな組み合わせを簡単かつ迅速にテストでき、個々の発現カセットの相対的な存在量を簡単に変更でき、異なるベクターを異なる量（各単一発現カセットベクターのトランスフェクトされるＤＮＡの量）で１つの宿主細胞に容易に同時トランスフェクトすることもできる。これにより、個々の発現カセットのコピー数を調整して、宿主細胞の遺伝的安定性及び／又はＰＯＩ発現率に関する最適な結果を得ることができる。
発現カセットが同じプロモーター配列を有する場合、同様の利点を得ることができる。例えば、発現カセットは、同じプロモーター配列、ＰＯＩの同一の成熟アミノ酸配列をコードする異なるヌクレオチド配列及び任意選択的に異なるターミネーター配列及び／又は存在する場合異なるシグナル配列を有する。
また、ＰＯＩの異なるコード配列から生じた異なるｍＲＮＡは、異なるヌクレオチド配列を有し、したがって、異なる安定性、半減期及び異なる二次構造を有し得るが、これらは、ＰＯＩへのｍＲＮＡの効率的な翻訳に干渉するかもしれないし、干渉しないかもしれない。この機序は、偶然にｍＲＮＡの特定の型が不安定であるか、若しくは不利な３次元構造を有することだけによって、全体的な発現率が低下することを回避する。何故なら、ｍＲＮＡの他のより適した型が同時に存在し、これを補うからである。
一般に、宿主細胞にトランスフェクトされるＰＯＩをコードする核酸のコピーが多いほど、発現率は高くなる。しかし、組換えタンパク質発現の分野の当業者には、それに対する特定の閾値があること、つまり発現率がもはや増加しないが、代わりに減少する可能性がある特定のコピー数が存在することが公知である。通常、最適なコピー数は各細胞又はＰＯＩについて経験的に決定される。本明細書に開示の本発明のタンパク質発現戦略を使用しても、同じ効果が観察される可能性が高い。本発明の個々の発現カセットのコピー数の増加は、特定の閾値コピー数においてタンパク質発現率をもはや増加させないことが予想される。さらに、同じＰＯＩアミノ酸配列をコードする異なる発現カセットの数を増やしても一定の閾値があり、さらに前記異なる発現カセットの数を増やしても発現するＰＯＩの量はさらには増えないことが予想される。組換えタンパク質発現の分野の当業者には、特定の型の宿主細胞における特定のＰＯＩのための発現カセットの最適な数を経験的に決定する方法は公知であり、例えば、単純に、発現したＰＯＩの量を測定し、それを同じ宿主細胞で検出された発現カセットのコピー数と比較する方法である。
本発明の主な利点の１つは、使用される細胞型とは無関係なその汎用性である。本発明は、真核細胞及び原核細胞のすべての細胞型に使用可能である。例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、細菌などで使用することができる。
先行技術では、この構想は知られていない。本明細書に記載の本発明の方向とはかけ離れている、唯一のタンパク質発現戦略は、同じ宿主細胞で同時にいくつかの異なるＰＯＩ、例えばＴ細胞受容体のα鎖及びβ鎖（ＷＯ２０１６／０７３７９４）、抗体の軽鎖及び重鎖（ＷＯ０３／０１８７７１）、Ｌ－及びＨ－フェリチン（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００８、１８：９２６－９３２）などを発現させる構想である。しかし、先行技術におけるこれらの構想は、いくつかの態様において本発明とは明らかに異なる：
－主な意図が、望ましくない組換えが少なく遺伝的に安定な宿主細胞を得ることではなく、また、その構想は、同じＰＯＩをコードする核酸のコピーをより多く宿主細胞に導入することによってより高い発現率を得ることでもない
－先行技術に記載されている、１つの宿主細胞で２以上の異なるＰＯＩを同時に発現させる唯一の理由が、理想的には、宿主細胞によって、Ｔ細胞受容体又は抗体などの最終タンパク質複合体に組み立てられる、異なるＰＯＩから構築されたタンパク質複合体を得ることである。
－先行技術の主な意図は、最大のＰＯＩ発現を得ることではなく、タンパク質複合体の正しい組立てを促進するために正しい化学量論的量的比率で異なるＰＯＩを発現することである。この理由のため、先行技術では、同じベクター内に２つの発現カセットを含むベクターが使用され、各発現カセットは、多量体タンパク質複合体（非常に多くの場合、２つのポリペプチド鎖で構成される抗体断片）の２つのポリペプチド鎖のうちの１つの発現を生じる。両方の発現カセットを同じベクター内に組み合わせることにより、両方のポリペプチド鎖を等モル量で発現させるという問題は、達成がはるかに簡単である。
ＷＯ２０１６／００５９３１は、両方のシストロンが１つのベクター内に配置された二重の独立したシストロン発現系を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質発現を増加させる方法を記載している。この出願の主な目的は、タンパク質、特に２つのポリペプチド配列からなるＦａｂ断片などの抗体断片の発現を増加させることである。唯一の目的のタンパク質の発現のためのデュアルシストロン発現系の使用も開示されている。しかし、この構想もいくつかの態様で本発明とは異なる。
－２つを超えるシストロンの使用は開示されておらず、これら２つのシストロンを含む１つのベクターの使用のみが開示されている。２つを超えるシストロンの使用も、あるいは、各ベクターが１つのシストロンを含むいくつかのベクターの並行した使用も、開示されていない。
－２つのシストロンを使用する理由は、抗体などの１つのタンパク質複合体に必要な２つの別個のポリペプチド鎖を同時に発現させ、組換えタンパク質の量を増加させることである。
－細菌細胞内の封入体としてのタンパク質発現のみが開示されている。
本発明の細目
本発明は、以下の態様、主題及び好ましい実施形態を提供し、それぞれ単独又は組み合わせて、本発明の目的の解決に寄与する。
細目（１）：３つ以上の異なるタイプの発現カセットを含む宿主細胞であって、各発現カセットが、同一の成熟アミノ酸配列を有する同じ目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードし、各タイプの発現カセットが、少なくともプロモーター配列、ＰＯＩのコード配列のポリヌクレオチド配列及びターミネーター配列を含み、
前記発現カセットが、
（ａ）異なるプロモーター配列、
並びに任意選択的に
（ｂ）縮重遺伝コードの使用によりＰＯＩの同一の成熟アミノ酸配列をコードする異なるヌクレオチド配列及び／又は
（ｃ）異なるターミネーター配列、及び／又は
（ｄ）存在する場合、異なるシグナル配列、
を含むという点で、前記発現カセットは異なり、
好ましくは
３つ以上の異なるタイプの発現カセットを含む宿主細胞であって、各発現カセットが、同一の成熟アミノ酸配列を有する同じ目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードし、各タイプの発現カセットは少なくともプロモーター配列、ＰＯＩのコード配列のポリヌクレオチド配列及びターミネーター配列を含み、前記発現カセットが、
（Ａ）
（Ａａ）異なるプロモーター配列、
（Ａｂ）縮重遺伝コードの使用によりＰＯＩの同一の成熟アミノ酸配列をコードする異なるヌクレオチド配列、
並びに任意選択的に
（Ａｃ）異なるターミネーター配列及び／又は
（Ａｄ）存在する場合、異なるシグナル配列、
を含むという点で、前記発現カセットは異なるか、
又は、前記発現カセットが、
（Ｂ）
（Ｂａ）同じプロモーター配列、
（Ｂｂ）縮重遺伝コードの使用によりＰＯＩの同一の成熟アミノ酸配列をコードする異なるヌクレオチド配列、
並びに任意選択的に
（Ｂｃ）異なるターミネーター配列及び／又は
（Ｂｄ）存在する場合、異なるシグナル配列、
を含むという点で前記発現カセットは異なる、宿主細胞。
細目（２）：同一のプロモーター配列を有する同数の発現カセットを含む宿主細胞と比較して、大量の前記ＰＯＩを発現し、前記大量の前記ＰＯＩが、例えば、ＥＬＩＳＡ測定、濃度測定ウェスタンブロット、濃度測定クーマシーブルー又は銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル、定量的質量分析又はサンプルからの前記ＰＯＩのクロマトグラフィー分離後の前記ＰＯＩのピーク下面積の定量を使用した前記ＰＯＩの測定により決定される、細目（１）に記載の宿主細胞。前記ＰＯＩの量は、同数だがしかし同一のプロモーター配列を有する発現カセットを含む宿主細胞と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は少なくとも５００％増加する。前記ＰＯＩの量は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも２０％、最も好ましくは少なくとも１０％増加する。ＰＯＩ発現の量を決定する適切な方法は、本明細書の他の場所に記載されている。
細目（３）：同一のプロモーター配列を有する同数の発現カセットを含む宿主細胞と比較して、ゲノムがより安定であり、遺伝的安定性が、例えば、定量的ＰＣＲなどによって少なくとも１００宿主細胞世代後に宿主細胞内のＧＯＰのコピー数を決定することによって、又はＧＯＰ特異的ＰＣＲプライマーの使用により得られたＰＣＲ産物の正しい長さを決定することによって、又は宿主細胞のゲノムの配列決定によって決定される、細目細目（１）又は（２）に記載の宿主細胞。宿主細胞のゲノムの安定性を決定する適切な方法は、本明細書の他の場所に記載されている。
細目（４）：遺伝的安定性が、原核細胞の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、若しくは少なくとも５００細胞世代後、又は真核細胞の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、若しくは少なくとも５００細胞世代後に、前記宿主細胞中に前記発現カセットに関する遺伝的変異がどれだけ存在するかを決定することによって測定される、細目（１）～（３）のいずれかに記載の宿主細胞。原核細胞、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞の遺伝的変異は、少なくとも２００細胞世代後、好ましくは少なくとも１５０細胞世代後、より好ましくは少なくとも１００細胞世代後、最も好ましくは少なくとも５０細胞世代後に測定される。酵母細胞、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞、より好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞の遺伝的変異は、少なくとも１６０細胞世代後、好ましくは少なくとも１２０細胞世代後、より好ましくは少なくとも８０細胞世代後、最も好ましくは少なくとも４０細胞世代後に測定される。ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の遺伝的変異は、少なくとも１５０細胞世代後、好ましくは少なくとも１２０細胞世代後、より好ましくは少なくとも９０細胞世代後、最も好ましくは少なくとも６０細胞世代後に測定される。
細目（５）：前記遺伝的安定性が、少なくとも５～２０、好ましくは少なくとも５～１００、より好ましくは少なくとも５～５００、最も好ましくは少なくとも５～１５００ヌクレオチド長のヌクレオチド配列に影響を及ぼす宿主細胞ゲノムの変化によって示される、細目（１）～（４）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（６）：前記プロモーターが、一方向プロモーター、双方向プロモーター及び／又は例えば、ＩＲＥＳ配列の使用により２つ以上のＰＯＩの発現を制御するプロモーターを含むリストから選択される、細目（１）～（５）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（７）：前記プロモーター配列が、少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２５００又は少なくとも３０００ヌクレオチド長を有する、細目（１）～（６）のいずれかに記載の宿主細胞。前記プロモーター配列は、原核細胞については少なくとも５０、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも１５、最も好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド長を有する。酵母細胞の場合、好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の場合、より好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の場合、前記プロモーター配列は、少なくとも５００、好ましくは少なくとも３００、より好ましくは少なくとも２００、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長を有する。ＣＨＯなどの哺乳動物細胞のための前記プロモーター配列は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞用に少なくとも５００、好ましくは少なくとも３００、より好ましくは少なくとも２００、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長を有する。
細目（８）：前記プロモーターが構成的活性プロモーターであるか、又は前記プロモーターが誘導性プロモーターである、細目（１）～（７）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（９）：少なくとも１つの発現カセットが誘導性プロモーターを含み、少なくとも１つの発現カセットが構成的活性プロモーターを含む、細目（１）～（７）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（１０）：前記ターミネーター配列が少なくとも３つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも１つのコピーで存在し、複数のターミネーター配列が存在する場合、前記ターミネーター配列が同じか、又は異なるターミネーター配列である、細目（１）～（９）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（１１）：前記シグナル配列が、分泌シグナル配列及び／又はＰＯＩを細胞の特定の所望のコンパートメント、オルガネラ又は位置、例えば細菌細胞の場合ペリプラズムにターゲティングする細胞内ターゲティング配列を含む、細目（１）～（１０）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（１２）：前記シグナル配列がそのアミノ酸配列に関する異なるシグナル配列であるか、及び／又は前記シグナル配列が同じアミノ酸配列を有するが、異なるヌクレオチド配列によってコードされているかのいずれかである、細目（１）～（１１）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（１３）：少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５の発現カセットを含む、細目（１）～（１２）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（１４）：少なくとも１つの発現カセットが、同一の成熟アミノ酸配列を有する２つ以上のＰＯＩをコードし、前記２つ以上のＰＯＩのコード配列の間にＩＲＥＳ配列又はＩＲＥＳ配列のように機能する配列が配置される、細目（１）～（１３）のいずれかに記載の宿主細胞。ＩＲＥＳ配列のように機能するＩＲＥＳ配列の代替は、例えば、２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ及びＦ２Ａ配列である（Ｓ．Ｃ．Ｌ．Ｈｏ ｅｔ ａｌ，ＰＬＯＳ，２０１３，Ｖｏｌ．８，Ｉｓｓｕｅ ５，ｅ６３２４７）。
細目（１５）：細目（１）の項目（ｂ）が適用され、ＰＯＩのコード配列の前記異なるヌクレオチド配列が縮重遺伝コードによってコードされ、同一の成熟アミノ酸配列の前記特定のＰＯＩを得るために、該縮重遺伝コードが、その特定のＰＯＩコードヌクレオチド配列として可能な少なくとも５０％の最大の理論的なヌクレオチド配列の違いをもたらす、細目（１）～（１４）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（１６）：細目（１）の項目（ｂ）が適用され、ＰＯＩのコード配列の前記異なるヌクレオチド配列が縮重遺伝コードによってコードされ、特定の同一の成熟アミノ酸配列のＰＯＩを得るために、該縮重遺伝コードが、その特定のＰＯＩコードヌクレオチド配列として可能な少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、少なくとも９０％又は１００％の最大の理論的なヌクレオチド配列の違いをもたらす、細目（１）～（１４）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（１７）：前記プロモーター、前記ターミネーター及び／又は存在する場合前記シグナル配列が、それらのヌクレオチド配列に関して少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％異なる、細目（１）～（１６）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（１８）：前記プロモーター配列が、それらのヌクレオチド配列に関して少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５少なくとも８０％異なり、及び／又は前記ターミネーター配列が、それらのヌクレオチド配列に関して少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、少なくとも８０％異なり、及び／又は前記シグナル配列が存在する場合、それらのヌクレオチド配列に関して少なくとも（ａｔ ｌｅａｓｔ ａｔ ｌｅａｓｔ）５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、少なくとも８０％異なる、細目（１）～（１７）のいずれか１つに記載の宿主細胞。
細目（１９）：前記ＰＯＩが前記宿主細胞に対して異種である、細目（１）～（１８）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（２０）：細目（１）の項目（ｂ）が適用され、ＰＯＩのコード配列の前記異なるヌクレオチド配列が少なくとも３０、好ましくは少なくとも６０、より好ましくは少なくとも９０ヌクレオチド長を有する、細目（１）～（１９）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（２１）：細目（１）の項目（ｂ）が適用され、ＰＯＩのコード配列の前記異なるヌクレオチド配列が少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１５００、少なくとも２０００ヌクレオチド長を有する、細目（１）～（１９）のいずれかに記載の宿主細胞。ヌクレオチド配列は、少なくとも１８０、好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは少なくとも６０、最も好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの配列長を有することが好ましい。
細目（２２）：
（ｉ）真核細胞、好ましくは以下から選択されるもの
（ａ）糸状菌細胞、好ましくはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）若しくはペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、
（ｂ）酵母細胞、好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）若しくはヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、より好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、
（ｃ）哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞；
（ｄ）ヒト細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ＝ヒト胎児性肝臓細胞）、
（ｅ）昆虫細胞、好ましくはｓｆ５、ｓｆ２１若しくはハイファイブ細胞（ｓｆ＝スポドプテラ・フルギペルダ（ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））、又は
（ｉｉ）原核細胞、好ましくは細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、
である、細目（１）～（２１）のいずれかに記載の宿主細胞。
細目（２３）：ＣＨＯ細胞、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であり、好ましくはＣＨＯ細胞又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、細目（２２）に記載の宿主細胞。
細目（２４）：ＣＨＯ細胞である、細目（２２）又は（２３）に記載の宿主細胞。
細目（２５）：ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である、細目（２２）又は（２３）に記載の宿主細胞。
細目（２６）：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である、細目（２２）～（２３）に記載の宿主細胞。
細目（２７）：細目（１）～（２６）のいずれか一項で定義される宿主細胞を生成する方法であって、同じ成熟アミノ酸配列の前記ＰＯＩをコードする少なくとも１つの異なる発現カセットをそれぞれが含む、少なくとも３つの異なる核酸配列を前記宿主細胞にトランスフェクトするステップを含む方法。
細目（２８）：前記宿主細胞のトランスフェクションが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０の異なる核酸配列、例えば、異なるベクターで行われる、細目（２７）に記載の方法。前記トランスフェクションは、少なくとも６、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも３、最も好ましくは少なくとも２つの異なる核酸で行われる。
細目（２９）：細目（１）～（２６）のいずれかで定義される宿主細胞を生成する方法であって、それぞれが同じ成熟アミノ酸配列の前記ＰＯＩをコードする少なくとも３つの異なる発現カセットを含む、少なくとも１つの核酸配列を前記宿主細胞にトランスフェクトするステップを含む方法。
細目（３０）：前記宿主細胞にトランスフェクトするステップが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０の異なる発現カセットを含む核酸配列で行われる、細目（２９）に記載の方法。前記核酸は、少なくとも６、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも４、最も好ましくは少なくとも３つの発現カセットを含む。
細目（３１）：細目（１）～（２１）のいずれかで定義される少なくとも３つの発現カセットを含む核酸。
細目（３２）：細目（１）～（２１）のいずれかで定義される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０の発現カセットを含む核酸。前記核酸は、少なくとも６、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも４、最も好ましくは少なくとも３つの発現カセットを含む。
細目（３３）：細目（１）～（２１）のいずれかで定義される少なくとも３つの発現カセットを含むベクター。
細目（３４）：抗生物質選択マーカー又は代謝選択マーカー又は栄養要求性選択マーカーをさらに含む、細目（３３）に記載のベクター。
細目（３５）：細菌細胞の場合の前記抗生物質選択マーカーが、好ましくはアンピシリン、カナマイシン、ゼオシン、ジェネティシン（Ｇ４１８）、ネオマイシン、グリホサート、ピューロマイシン、ハイグロマイシンＢ、フレオマイシン、ブラスチシジン、ミコフェノール酸などに対する耐性である、細目（３４）に記載のベクター。
細目（３６）：ＣＨＯ細胞の場合の前記代謝選択マーカーが、好ましくはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、葉酸受容体（ｆｏｌＲ）などである、細目（３４）に記載のベクター。
細目（３７）：酵母細胞の場合の前記代謝選択マーカーが、好ましくはＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ＡＤＥ、５－ＦＯＡ（５－フルオロオロチン酸）（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ．，１９９８，Ｙｅａｓｔ，１４：１１５－１３２）などであり、及び／又は好ましくは、前記抗生物質選択マーカーが、ゼオシン、Ｇ４１８（ジェネチシン）、フレオマイシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ブラスチシジン、ミコフェノール酸などである、細目（３４）に記載のベクター。
細目（３８）：異なるプロモーターを含む少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０の発現カセットを含み、前記発現カセットが目的の遺伝子を欠落しており、任意選択的に目的の遺伝子を欠落している位置に、クローニング部位又はマルチクローニング部位が挿入されているベクター。前記ベクターは、少なくとも６、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも４、最も好ましくは少なくとも３つの発現カセットを含む。
細目（３９）：少なくとも３つの核酸を含むキットであり、前記核酸が好ましくはベクターであり、各核酸が細目（２７）～（３２）のいずれかで定義される少なくとも１つの発現カセットを含むキット。
細目（４０）：少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０の核酸を含む、細目（３９）に記載のキット。
細目（４１）：前記核酸がベクターである、細目（３９）又は（４０）に記載のキット。
細目（４２）：細目（３１）又は（３２）で定義される核酸、又は細目（３３）～（３８）のいずれかで定義されるベクターを含むキット。
細目（４３）：前記核酸が少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０の発現カセットを含む、細目（４２）に記載のキット。
細目（４４）：前記核酸がベクターである、細目（４１）又は（４２）に記載のキット。
細目（４５）：前記１又は複数のベクターが細目（３３）～（３８）のいずれかに記載のベクターである、細目（３９）～（４４）のいずれかに記載のキット。
細目（４６）：紙のリーフレット、電子マニュアル又は他の形態の、前記キットの使用方法を説明する取扱説明書をさらに含む、細目（３９）～（４５）のいずれかに記載のキット。
細目（４７）：細目（１）～（２６）のいずれかで定義される宿主細胞、細目（３１）又は（３２）で定義される核酸、細目（３３）～（３８）のいずれかで定義されるベクター、又は細目（３９）～（４６）のいずれかで定義されるキットの使用によるＰＯＩの製造方法。
細目（４８）：前記ＰＯＩが単鎖タンパク質であるか、又は例えばインスリンなどの単鎖ポリペプチドの前駆体から生じる、細目（４７）に記載の方法。
細目（４９）：前記単鎖タンパク質が、
ａ）単鎖タンパク質として自然に存在するタンパク質；
ｂ）少なくとも２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質として自然に存在するが、自然には例えばインスリンなどの単鎖前駆体タンパク質から生じるタンパク質（インスリンの前駆体は単鎖であり、最終的にプロセシングされたインスリンは、ジスルフィド架橋で接続された２つの鎖で構成される）；
ｃ）異なるタンパク質で作製された融合タンパク質；
ｄ）同じタンパク質の一部で作製された融合タンパク質；
ｅ）異なるタンパク質の一部で作製された融合タンパク質；又は
ｆ）少なくとも２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質として自然に存在するが、例えば単鎖抗体などの単鎖タンパク質をもたらす方法で分子生物学的技術の使用により製造されるタンパク質；
である、細目（４８）に記載の方法。
本発明の意味の範囲内の定義及び用語：
本出願の段落の前に与えられた表題は、本出願の本文を案内することを意図しているが、本発明の範囲を限定することを決して意図しておらず、そのように理解すべきではない。
本明細書で使用される「及び／又は」という用語は、「及び」、「又は」並びに「前記用語によって接続された要素のあらゆる他の組み合わせ」という意味を含む。例えば、Ａ、Ｂ及び／又はＣは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ及びＡ＋Ｂ＋Ｃを意味する。
「宿主細胞」とは、組換えタンパク質の発現に使用される細胞を意味する。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、がん細胞などの細胞株又は不死化細胞をもたらすように実験的に改変された細胞（＝がん細胞と同じように際限なく分裂する細胞）などのすべての細胞型であってよい。
「発現カセット」は、少なくともプロモーター配列、開始コドン、組換え発現を意図されるタンパク質（ＰＯＩ）をコードするポリヌクレオチド配列、終止コドン及びターミネーターを含むポリヌクレオチド配列を意味する。発現カセットは、エンハンサー、シグナル配列、エンハンサー、イントロン、ＩＲＥＳ配列などの追加の調節配列及び他の配列を含んでもよい。３つ以上の異なる発現カセットを含む宿主細胞は、それぞれが異なる発現カセットを含む３つ以上のベクターをトランスフェクトされた宿主細胞であり得る。得られた宿主細胞は、そのサイトゾル内にプラスミドとして存在する前記ベクターを含んでいても、又は前記発現カセット及び任意選択的に前記ベクターのさらなる部分をそのゲノムに組み込んでいてもよい。また、トランスフェクトされたベクターの一部は前記宿主細胞のゲノムに（部分的又は完全に）組み込まれるが、前記トランスフェクトされたベクターの他のものは前記宿主細胞のサイトゾル内にプラスミドとして存在することもあり得る。又は、前記宿主に、前記１つのベクター内に少なくとも３つの異なる発現カセットを含む少なくとも１つのベクターをトランスフェクトすることも、又は個別の発現カセットを含むベクターの混合物をトランスフェクトし、２つ以上の異なる発現カセットを含むベクターを同時にトランスフェクトすることもできる。
ＧＯＩ（ＧＯＩの発現カセットを意味する）又はベクター（ＧＯＩの少なくとも１つの発現カセットを含むベクターを意味する）の「トランスフェクション」により、トランスフェクトされた宿主細胞（又は形質転換された宿主細胞、これは同じである）が得られ、ここで、前記宿主細胞は、前記ＧＯＩ又は前記ベクターをそれらの染色体内に組み込んでいるか（前記細胞が染色体を１つだけ有する場合）、又は前記宿主細胞は、前記ＧＯＩ又は前記ベクターをそれらの染色体のいくつか又はすべてに組み込んでいる（前記宿主細胞が複数の染色体を有する場合）。前記ＧＯＩ又はベクターは、前記染色体内に１回又は数回組み込まれる場合があり、染色体内に数回組み込まれることが好ましい。好ましくは、同じ宿主細胞の複数の染色体に組み込まれる。ベクターが染色体に組み込まれる場合、前記ベクターの完全な配列又は配列の一部のみが前記染色体内に組み込まれ得るが、少なくとも前記ベクター中に存在する前記ＧＯＩの発現カセットは前記染色体内に組み込まれる。又は、前記ベクターは、前記宿主細胞の染色体内に組み込まれなくてもよく、前記宿主細胞のサイトゾル内の染色体の外側に、例えば、環状の二本鎖デオキシポリ核酸の形で存在してもよい。前記宿主細胞が真核生物である場合、より好ましくは前記宿主細胞が哺乳動物又は酵母又は真菌細胞である場合、最も好ましくは前記宿主細胞はＣＨＯ細胞又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞であり、好ましくは前記ＧＯＩ又は前記ベクターは前記宿主細胞の染色体内に組み込まれる。前記宿主細胞が原核生物、好ましくは細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である場合、前記ベクターは好ましくは前記宿主細胞の染色体に組み込まれず、前記宿主細胞のサイトゾルに位置する。
発現カセットが、組換え発現を意図されるタンパク質（ＰＯＩ）をコードする２つ以上のポリヌクレオチド配列を含み、前記２つ以上のポリヌクレオチド配列が、前記発現カセット内の単一のプロモーターポリヌクレオチドの機能により発現される場合、前記発現カセットはやはり１つの発現カセットと見なされる。そのような発現カセットは、例えば、ＩＲＥＳ配列の使用みより、又は双方向プロモーターの使用により生じ得る。双方向プロモーターは、１つはプロモーターの５’に位置し、１つはプロモーターの３’に位置する２つのコード配列の発現をもたらすプロモーターである。
本発明に従って使用されるベクターのさらなる部分、例えば複製起点（ｏｒｉ）、抗生物質耐性遺伝子又は代謝選択マーカーなどのＰＯＩの発現に直接必要とされない部分は、発現カセットの一部として考慮されない。しかし、ベクターのこれらの部分の一部又はすべては、ベクターによって異なり得る。例えば、本発明に従っていくつかの個別のベクターが使用される場合、これらのベクターはそれぞれ、異なる抗生物質耐性遺伝子又は異なる代謝選択マーカー又は異なる複製起点（ｏｒｉ）などを含み得る。又は、抗生物質耐性遺伝子及び／又は代謝選択マーカーなどは同じタンパク質であり得るが、前記タンパク質をコードするベクター内の核酸配列は、縮重遺伝コードのために異なる場合があり、それでも同一の抗生物質耐性タンパク質又は代謝選択マーカータンパク質をコードする。
「コーディング」：ポリヌクレオチド又は配列が「コードする」とは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、ターミネーターなどの適切な調節配列と組み合わされた場合に、ペプチド結合を介して接続された少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０又は少なくとも１００個のアミノ酸を含むタンパク質又はポリペプチドペプチド又はペプチドの発現をもたらすことである。
「コード配列」又は「コード領域」とは、成熟アミノ酸配列のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの部分を意味する。「成熟アミノ酸配列」は、以下のいくつかの段落で説明されている。
「オープンリーディングフレーム」とは、アミノ酸配列が最終成熟アミノ酸配列に存在するかどうか、又はアミノ酸配列がＰＯＩのプロセシング中に除去されるかどうかに関係なく、これらのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの部分、例えば、「成熟アミノ酸配列」を得るためにＰＯＩから除去されるシグナルペプチドのアミノ酸配列を意味する。
ＰＯＩとも略される「目的のタンパク質」は、宿主細胞の使用により組換え発現させることが意図されている、ペプチド結合を介して接続された少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０のアミノ酸を含むタンパク質、ポリペプチド又はペプチドである。ＰＯＩは「目的の遺伝子（Ｇｅｎｅ Ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」（ＧＯＩ）によってコードされる。ＰＯＩのアミノ酸配列は「成熟アミノ酸配列」と見なされる。
ＰＯＩは、自然に存在するタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド、又は自然に存在しないタンパク質、ポリペプチド、若しくはペプチド、例えば、自然に存在する２つのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質ドメインなどの、自然には存在しない融合タンパク質であり得る。例えば、ＰＯＩは、融合タンパク質を標識化若しくは精製することを意図して、Ｈｉｓタグに融合された、若しくは他のペプチドに融合された自然に存在するタンパク質、又は自然に存在する２つ以上のタンパク質のドメインを含むが、これらのドメインが通常１つのタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド内に自然には存在しない融合タンパク質、又は例えばヒト化抗体などの「ヒト化」された非ヒト配列であり得る。ヒト化抗体は、例えばマウス抗体であり、その定常アミノ酸配列部分は、ヒト抗体の対応するアミノ酸配列部分で置き換えられている。したがって、成熟アミノ酸配列とは概して、ＰＯＩを得るための実験を設計又は実行した人が製造を意図した最終アミノ酸配列を意味する。
その結果、ＰＯＩの成熟アミノ酸配列は下記の物であり得る：
－自然界に存在するタンパク質の配列；
－タンパク質の配列の自然には見られない断片又はドメイン；
－タンパク質の配列の自然には見られない変異体；
－例えば融合タンパク質の検出又は精製に使用されるペプチドの付加により得られる融合タンパク質；
－例えば、２つ以上の異なるタンパク質のタンパク質ドメインから構築される融合タンパク質；
－例えば、自然な配置と比較して、再配列されているタンパク質ドメインによって構築される融合タンパク質；
－人によって完全にゼロから設計されたタンパク質；
－など。
「成熟アミノ酸配列」とは、例えば、そのアミノ酸配列に関する対応する非組換えタンパク質、ポリペプチド又はペプチドが完全なプロセシングステップを受けた後のタンパク質のアミノ酸配列を意味する。例えば、プロセシングの際に、分泌シグナル配列は除去されており、例えばタンパク質のプレ又はプレプロ型は最終タンパク質、ポリペプチド又はペプチド配列に変換されており、又はアミノ酸配列内の内部配列は除去されている。例えば、インスリンの場合、これは次のことを意味する：プレプロインスリン：シグナル配列の除去＝プロインスリン；プロインスリン：内部Ｃペプチドの除去＝インスリン＝この場合の成熟アミノ酸配列。
「成熟組換えタンパク質」とは、上記で定義された成熟アミノ酸配列を含む組換えタンパク質を意味する。イントロンは一般に、成熟タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの一部をコードしない。
「プロセシング配列」とは、分泌シグナル配列、細胞内タンパク質ターゲティングのためのシグナル配列、プレプロ配列、プロ配列などの、成熟アミノ酸配列を得るためにタンパク質、ポリペプチド又はペプチドから除去されるアミノ酸配列を意味する。
ＰＯＩの配列は、プロセシング配列を含んでいてもよく、又は部分的若しくは完全に欠いていてもよい。前記プロセシング配列は、自然に存在するタンパク質（ネイティブタンパク質、天然タンパク質）に存在することが多く、ネイティブタンパク質を正しくプロセシングするため、又は細胞の内外の正しい位置にネイティブタンパク質を正しく物理的に配置するため、又はネイティブタンパク質の輸送ためなどに必要とされることが多い。膜貫通配列は通常、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのプロセシングの際に除去されないため、通常はプロセシング配列とは見なされない。膜貫通配列は、前記膜貫通配列の使用によりＰＯＩが細胞膜に一時的にのみ局在し、前記膜貫通配列が、ＰＯＩを得るためにＰＯＩのプロセシングの際にＰＯＩの残部から除去される場合にのみ、プロセシング配列と見なされる。
プロモーター又はプロモーター配列とは、遺伝子の転写を開始するか、又は本発明の場合、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列の転写を開始するポリヌクレオチドの領域を意味する。プロモーターは、「誘導性プロモーター」又は「構成的プロモーター」であり得る。ＩＲＥＳ配列及びＩＲＥＳ配列のように機能する配列は、プロモーター又はプロモーター配列とは見なされない。「誘導性プロモーター」とは、特定の誘導因子の存在又は非存在によって誘導できるプロモーターを指し、「構成的プロモーター」とは、特定の誘導因子の存在とは無関係に、常に活性である調節されていないプロモーターを指し、その関連する１又は複数の遺伝子の連続転写を可能にする。任意選択的に、例えば、２つ以上の遺伝子がＩＲＥＳ配列によって分離されている場合、プロモーターはこれらの２つ以上の遺伝子の転写を開始することができる。任意選択的に、例えば、プロモーターが双方向プロモーターである場合、前記プロモーターは２つの遺伝子の転写を開始することができる。
「縮重遺伝コード」とは、特定のアミノ酸に対して複数のヌクレオチドコドンがあることを意味する。例えば、アミノ酸のシステインは次の２つの異なるコドン：ＴＧＣ又はＴＧＴでコードされ、アミノ酸のアルギニンは次の６つのコドン：ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＴ、ＡＧＧ、ＡＧＡなどでコードされ得る。結果として、同じアミノ酸配列が、異なるヌクレオチド配列によってコードされ得る。個々のコドンのみが交換された場合、これらのコドンがコードするアミノ酸は交換されない。縮重遺伝コードは、いくつかの例外を除き、ほとんどすべての生物で同じである。例えば、ヒトのミトコンドリアは異なる遺伝コードを有する。この特許出願内では、「縮重遺伝コード」は常に、ＰＯＩの発現のための使用を意図している特定の細胞又は特定のオルガネラ（ミトコンドリアなど）の遺伝コードに関する意味である。
「ターミネーター」は「転写ターミネーター」と同じ意味である。本発明によれば、ターミネーターは、ＰＯＩをコードするために必要な核酸配列の末端を示す核酸配列のセクションである。通常、前記ターミネーターはＧＯＩの終止コドンのすぐ下流に局在している。原核生物の終結には、Ｒｈｏ非依存性及びＲｈｏ依存性の転写終結が含まれる。本発明に従って使用される原核生物終結配列は、好ましくは、Ｔ７及びｒｒｎＢ終結配列などのＲｈｏ非依存性終結配列である。Ｒｈｏ非依存性終結は、内在性終結（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）としても公知である。好ましくは、１つの発現カセットにおいて、１つ又は２つの終結配列が使用される。２つの終結配列の組み合わせにより、終結効率が向上する。ＩＲＥＳ配列が使用される場合、ＰＯＩの２つのコード配列の間に複数の終結配列が配置されることが好ましい。哺乳動物の終結配列は、例えば、ＳＢ４０－、ｈＧＨ－、ＢＧＨ－又はｒｂＧｌｏｂ終結配列である。
「シグナル配列」とは、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを細胞外領域に分泌させるために通常必要とされるアミノ酸配列を意味し、そのシグナル配列は通常、タンパク質分解によって成熟アミノ酸配列から除去される。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを細胞の特定のオルガネラに向けるシグナル配列もある。細菌細胞もまたシグナル配列、例えば、ＰＯＩをペリプラズムに向けるシグナル配列を使用する。シグナル配列は通常、アミノ酸配列のＮ末端に位置するが、Ｃ末端に存在することも、ポリペプチド配列内の内部に存在することもある。
「内部リボソーム進入部位」配列とも呼ばれる「ＩＲＥＳ」配列は、ｍＲＮＡ配列内の翻訳開始を可能にし、翻訳の開始に関してｍＲＮＡの５’末端に依存しないｍＲＮＡ内のヌクレオチド配列である。したがって、ＩＲＥＳ配列により、１つのｍＲＮＡから２つ以上のＰＯＩを発現できる。ＩＲＥＳ配列と同じ主要機能を有するＩＲＥＳ配列の代替は、例えば２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ及びＦ２Ａ配列である。
「異種」タンパク質、ポリペプチド、ペプチド配列とは、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列が宿主細胞に自然に存在しないことを意味する。宿主細胞に自然に存在するアミノ酸配列が突然変異している場合（例えば、点突然変異、挿入、欠失、融合など）、結果として生じる突然変異配列も異種配列と見なされる。
「異種」ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列とは、そのポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列が宿主細胞に自然には存在しないことを意味する。宿主細胞に自然に存在するポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列が、前記ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列が依然として同じアミノ酸配列をコードするように個々のヌクレオチドを交換することにより改変される場合、そのような改変ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列は異種と見なされる。
アミノ酸配列又は核酸配列に関連して言及される場合、用語「配列の違い（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）」及び「異なる（ｄｉｆｆｅｒ）」、「異なる（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）」、「異なる（ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ）」などの用語は、例えば以下のように決定されることを意味する：
本発明では、例えば、「異なるプロモーター配列」又はＰＯＩの（同一の）成熟アミノ酸配列をコードする異なるヌクレオチド配列について言及される。したがって、前記配列が「異なる」かどうかを決定するために、それぞれの対応する配列（アミノ酸配列又はヌクレオチド配列）が、それらの配列同一性に関して比較される。例えば、プロモーター配列を比較するか、又はＰＯＩの成熟アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を比較する。
２つ以上の配列を配列同一性に関して比較する場合、特定の位置にまったく同じヌクレオチド又はアミノ酸が存在する場合にのみ、この比較ではヌクレオチド又はアミノ酸が同一であると考えられる。特にアミノ酸配列の比較では、配列同一性と配列相同性を明確に区別する必要がある。配列比較の文脈における本特許出願では、反対のことが明示的に言及されない限り、比較とは常に配列相同性ではなく、配列同一性を意味する。相同性とは、例えば、配列内の特定の位置のアミノ酸が同一ではないが、その化学的及び／又は生物学的及び／又は物理的特性に関してのみ類似していることを意味する。一般にホモログと見なされるこのようなアミノ酸の例は以下のものである：
－正に帯電したアミノ酸：アルギニン、ヒスチジン、リジン又は
－負に帯電したアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸又は
－極性の非荷電アミノ酸：セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン又は
－芳香族アミノ酸：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン又は
－脂肪族アミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン又は
－硫黄含有アミノ酸：システイン、メチオニン又は
－複素環式第二級アルファアミノ酸：プロリン。
例えば、配列のアライメントや配列の違いは、さまざまな方法、ソフトウェア、アルゴリズムで決定することができる。このような決定は、例えば国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＷｅｂサービス（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を使用して、又は欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）のＷｅｂサービス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／）を使用して行うことができる。「配列同一性」又は「同一性％」とは、標準化アルゴリズムを使用してアライメントされた２つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸又はヌクレオチド配列間の残基一致の割合を指す。そのようなアルゴリズムは、標準化された再現可能な方法で、２つの配列間のアライメントを最適化するために比較される配列にギャップを挿入し、それによって２つの配列のより意味のある比較を実現する。アルゴリズムとソフトウェアの設定が異なるために、異なるソフトウェア／アルゴリズムを使用した同じ２つの配列のアライメント又は配列比較でまったく同じ結果が得られない可能性がある。したがって、結果を得る方法を明確に定義するために、ソフトウェアとソフトウェア設定を指定する必要がある。
本発明の目的のために、２つの配列間の配列同一性は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムバージョン２．６．０（２０１７年１月１０日）、ＢＬＡＳＴ＝Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９７）２５：３３８９－３４０２）を使用して決定される。参照配列として、比較される２つのプロモーター配列のうち短い方が常に使用される。例えば、１００ヌクレオチドの配列長の特定のプロモーターＸｓｈｏｒｔが、同じプロモーターであるが２００ヌクレオチドの前記プロモーターのより長いバージョンである同じプロモーターＸｌｏｎｇとアライメント／比較される場合、２つの配列ＸｓｈｏｒｔとＸｌｏｎｇとの比較は以下の結果を得る：短い配列Ｘｓｈｏｒｔが参照配列である場合、これが長いバージョンの配列Ｘｌｏｎｇと比較され、ＸｓｈｏｒｔはＸｌｏｎｇと１００％同一である。しかし、長い配列Ｘｌｏｎｇが参照であり、Ｘｓｈｏｒｔと比較すると、ＸｌｏｎｇはＸｓｈｏｒｔと５０％しか同一ではない。その結果、本特許出願では、配列Ｘｓｈｏｒｔと配列Ｘｌｏｎｇとの比較は常に、５０％同一ではなく１００％同一と見なされる。これは、この出願内の参照配列として常に比較されるプロモーター配列の短い方が使用されるためである。
例えば、２つのアミノ酸配列の配列同一性は、以下のデフォルトのアルゴリズムパラメーターに設定されたｂｌａｓｔｐで決定することができる：「最大標的配列」＝１００、「ショートクエリ」＝「短いインプット配列のためのパラメーターに自動的に調節」、「期待閾値」＝１０、「ワードサイズ」＝６、「クエリ範囲内の最大一致」＝０、「マトリックス」＝ＢＬＯＳＵＭ６２、「ギャップコスト」＝「存在：１１拡張：１」、「構成調整」＝「条件付き構成スコアマトリックスの調整」、フィルターとマスキング：「低複雑度領域」、「ルックアップテーブルのみをマスクする」、「小文字をマスクする」、３つのフィルターがすべて無効。
例えば、２つのヌクレオチド酸配列の配列同一性は、以下のデフォルトのアルゴリズムパラメーターに設定されたｂｌａｓｔｎで決定することができる：「最大標的配列」＝１００、「ショートクエリ」＝「短いインプット配列のためのパラメーターに自動的に調節」、「期待閾値」＝１０、「ワードサイズ」＝２８、「クエリ範囲内の最大一致」＝０、「一致／不一致スコア」＝１、－２、「ギャップコスト」＝「線形」、フィルターとマスキング：「低複雑度領域」、「ルックアップテーブルのみをマスクする」、両方のフィルターを活性化。
ヌクレオチド配列のヌクレオチドが言及される場合、略語Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ及びＵは異なるヌクレオチドを表す。ヌクレオチドとしてのＴ又はＵが言及されるときはいつでも、実験的又は科学的な観点から意味をなさない場合を除き、ＴとＵは互いに交換することができる。ヌクレオチド配列、ポリヌクレオチドなどの用語が本出願内で使用される場合は常に、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、又はデオキシ核酸及び／又はデオキシリボ核酸は、実験的又は科学的観点からこれが意味をなす範囲を意味する。
縮重遺伝コードの使用により、すべてが同一のアミノ酸配列をコードするいくつかの異なるヌクレオチド配列を有することができる。同じ成熟タンパク質をコードする２つのヌクレオチド配列間の違いの量は、前記成熟タンパク質のアミノ酸配列に依存する。非常に単純化されており、すべてのアミノ酸は３つのヌクレオチドによってコードされ、ほとんどのアミノ酸のコドンの最後のヌクレオチドは、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アラニン（Ａ）及びチミジン（Ｔ）の間で変化し得る。したがって、ほとんどのアミノ酸には４つの異なるコドンがあり、それぞれが同じアミノ酸をコードする。結果として、例えば１００アミノ酸長の成熟ポリペプチドは３００のヌクレオチドによってコードされ、それぞれの３番目のヌクレオチドはアミノ酸配列を変えることなく変異させることができる。したがって、この単純化されたモデルでは、対応するアミノ酸配列を変更せずに、縮重コードにより合計３００ヌクレオチドのうちの１００ヌクレオチドを交換することができる。この単純化されたモデルは、最大３３．３％の理論的なヌクレオチド配列の違いをもたらす。最大の理論的なヌクレオチド配列の違いの５０％が望ましい場合、これらの１００ヌクレオチドの５０％、すなわち５０ヌクレオチドを他のヌクレオチドと交換することができ、ヌクレオチド配列の違いは１６．６５％になる。
実際には、この計算はもう少し難しい。例えば、次のペプチド配列の最大ヌクレオチド配列は、以下のように計算することができる：
Figure 0007278261000001
 セリン（Ｓｅｒ）は、ＴＣＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣによってコードされる
したがって、Ｓｅｒのコドンは位置１、２及び３で変化させることができる＝ｘｘｘ
ロイシン（Ｌｅｕ）は、ＣＴＴ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、ＴＴＧによってコードされる
したがって、Ｌｅｕのコドンは位置１と３で変化させることができる＝ｘＴｘ
アルギニン（Ａｒｇ）は、ＣＧＴ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧによってコードされる
したがって、Ａｒｇのコドンは位置１及び３で変化させることができる＝ｘＴｘ
結果として、サンプルペプチドＰｅｐ１のヌクレオチド配列は３０のヌクレオチド位置のうち２４を有し、アミノ酸配列を変えることなく少なくとも１つの異なるヌクレオチドによって交換することができる。最大のヌクレオチド配列の違いは２４／３０＝０．８で、ヌクレオチド配列の違いが最大８０％であることを意味する。
ペプチドＰｅｐ２について同じ計算を行うと、結果は以下のようになる：
メチオニン及びトリプトファンはそれぞれコドンが１つしかないため、コードされているアミノ酸を変更せずにヌクレオチドを交換することはできない。他のすべてのアミノ酸には２つ、３つ又は４つの異なるコドンを有するが、すべてのコドンには最初と２番目のヌクレオチドが固定されており、３番目のヌクレオチドのみを変化させることができる。
結果として、Ｐｅｐ２のヌクレオチド配列は３０のヌクレオチドのうち７しかなく、これらを、コードされたアミノ酸配列を変えることなく交換することができる。したがって、最大の異なるヌクレオチド配列は７／３０＝０．２３であり、ヌクレオチド配列の違いが最大２３％であることを意味する。
したがって、アミノ酸配列を変えないヌクレオチド配列の最大変動は、ＰＯＩのアミノ酸配列に大きく依存する。例えば、同一の成熟アミノ酸配列を取得するために、ヌクレオチドの違いを可能な最大ヌクレオチド配列の違いの５０％に意図した場合、Ｐｅｐ １のこの５０％値は８０％の５０％＝４０％になり、一方、Ｐｅｐ２の５０％値は２３％の５０％＝１１．５％になる。
この戦略を使用すると、当業者は、任意のＰＯＩについて、成熟ヌクレオチド配列からの変動％を容易に計算することができ、例えば、ＰＯＩの同一の成熟アミノ酸配列を取得するために、可能な最大ヌクレオチド配列の違いの５０％を意図した場合、上記の計算が可能である。
本発明による「遺伝的安定性」は、代替的に「ゲノム安定性」とも呼ばれ、宿主細胞のゲノムに属する核酸配列が、例えば、前記宿主細胞の特定の数の細胞世代又は細胞分裂にわたって、経時的に「有意な変化」を起こさないことを意味する。そのような変化は、例えば、非常に類似した、又は同一のヌクレオチド配列の相同組換え事象から生じ得る。例えば、発現カセットのいくつかの同一のコピーが宿主細胞のゲノムに組み込まれている場合、これらの同一のヌクレオチド配列が後に各々と組換えを起こす可能性が高くなる。そのような組換え事象は、例えば、前記発現カセットの部分的又は完全な欠失、重複又は増加をもたらし得る。また、前記発現カセットの再配列は、染色体内のそれらの位置の変化、又は染色体内のそれらの向きに関する変化を起こし得る。
遺伝的安定性に関する「有意な変化」とは、宿主細胞のゲノムの比較的大きな再配列、例えば、宿主細胞のゲノム内のヌクレオチド配列の欠失、重複、増加、再配列、再配置、部分的欠失、部分的重複、部分的増加、部分的再配列、部分的再配置などを意味する。そのような遺伝的不安定性は、好ましくは、宿主細胞によりＰＯＩを発現させるために、前記宿主細胞ゲノム内に導入された発現カセットのヌクレオチド配列に影響を及ぼし得る。宿主細胞ゲノムの有意な変化は、少なくとも５～２０、好ましくは少なくとも５～１００、より好ましくは少なくとも５～５００、最も好ましくは少なくとも５～１５００ヌクレオチド長のヌクレオチド配列に影響を及ぼし得る。
例えば発現カセットの限られた数の点突然変異は、宿主細胞のゲノムのわずかな変化と見なされるだけである。そのような限られた数の点突然変異は自然には一般的であり、通常、特に細胞分裂及び細胞の老化の間に、経時的に任意の細胞で起こり得る。そのような限られた数の点突然変異は、遺伝的安定性の障害とは見なされず、核酸配列の有意な変化とは見なされない。
本発明による宿主細胞のゲノムは、ＰＯＩをコードする発現カセットの導入前に、宿主細胞に存在する染色体、ミトコンドリアの染色体及び染色体外プラスミドと見なされる。本発明によれば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどの核酸は、前記宿主細胞のゲノムに属するとは見なされない。
ゲノムに属するすべての型のそのような核酸が、すべての型の宿主細胞に存在するわけではない。例えば、細菌宿主細胞は通常、ミトコンドリア染色体を含まない。
本発明による「細胞世代」とは、１細胞世代は特定の宿主細胞の数が２倍に増えることを意味する。宿主細胞の型に応じて、１細胞世代は、例えば細菌宿主細胞の場合には数分しかかからず、又は例えば哺乳動物細胞の場合には数時間若しくは数日さえかかる場合がある。
本発明による「単鎖タンパク質」には、単一のアミノ酸鎖のみを含むタンパク質が含まれる。単鎖前駆体からの翻訳後プロセシングの際に改変されるが、例えばヒトインスリンなどの、ジスルフィド架橋を介して最終的に接続されるいくつかのアミノ酸鎖からなるタンパク質は、依然として本発明による単鎖タンパク質と見なされる。翻訳後プロセシングの後に２つ以上のアミノ酸鎖を含むこのような単鎖タンパク質は、そのオープンリーディングフレームについて前記単鎖タンパク質のコードヌクレオチド配列を分析することにより容易に同定することができる。オープンリーディングフレームとは、ヌクレオチド配列内に終止コドン（通常、デオキシリボ核酸の場合はＴＡＡ、ＴＡＧ若しくはＴＧＡ、又はリボ核酸の場合はＵＡＡ、ＵＡＧ若しくはＵＧＡ）を含まない、コドンの連続ストレッチである。オープンリーディングフレームは、前記ポリペプチド鎖のプロセシングの後に、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質にプロセシングされ得る単一のポリペプチド鎖をコードしてもよい。このようなタンパク質は、本発明によれば、依然として単鎖タンパク質と見なされる。
本発明による「ベクター」は、好ましくは、環状の二本鎖デオキシポリヌクレオチドであり、例えば、前記ベクターのヌクレオチド配列内の部位のみを認識する制限エンドヌクレアーゼによる消化によって線形化され得る。ベクターは、分子生物学的技術によって製造されてもよく、又は当技術分野で公知の技術を使用して化学的又は酵素的に合成されてもよい。
本発明による「耐性遺伝子」又は「耐性マーカー」は、毒性物質、好ましくは抗生物質の活性に対する耐性を宿主細胞に付与するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。
本発明による「代謝マーカー」は通常、例えば宿主細胞の成長又は生存に必要な特定のアミノ酸などの、特定の代謝産物を合成する能力を宿主細胞に提供するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。
本発明による「選択マーカー」は、通常、耐性遺伝子、代謝マーカー又は栄養要求性マーカーであるが、例えば、前記遺伝子を保有する宿主細胞を認識可能にする遺伝子、例えば、有色タンパク質をコードする遺伝子、有色物質を生成又は代謝する酵素、又は基質を代謝すると発光するルシフェラーゼなどの酵素をコードする遺伝子であってもよい。
本発明によるキットは、例えば組換えタンパク質又はＰＯＩを発現するのに適切な材料のセットである。キットには通常、宿主細胞、タンパク質発現ベクター、前記タンパク質発現ベクターの一部を検出するのに適したＰＣＲプライマー、前記宿主細胞の成長に適した培地、ベクターを宿主細胞にトランスフェクトするのに適した化学物質及びバッファー、ＰＣＲ反応を実行するための酵素、環状ベクターを線形ベクターに切断する酵素、前記キットの使用方法を説明する、又は前記キットの目的を説明する取扱説明書などの材料が含まれる。
「細胞の誘導体」若しくは細胞株の誘導体、又は「宿主細胞の誘導体」若しくは「宿主細胞株の誘導体」は、例えば、特定の耐性遺伝子を含むか、又は含まない、特定の代謝遺伝子を含むか、又は含まない、前記細胞又は宿主細胞を対応する改変されていない細胞又は宿主細胞から区別できる特定の遺伝子を含むか、又は含まないように操作されている細胞又は宿主細胞に由来する細胞である。通常、細胞又は宿主細胞の誘導体は、それらが由来する対応する細胞又は宿主細胞（それらの母細胞）と遺伝的にほぼ同一であるが、上記のタイプの遺伝子などの１つ又は非常に少数の遺伝子に関してのみ異なる。
本発明による宿主細胞は、原則として、細胞株若しくは初代細胞、又は異なる型の細胞若しくは組織試料、器官の混合物又は多細胞生物全体などの任意の細胞型であり得る。好ましくは、細胞は原核細胞株又は真核細胞株である。
本発明に従って原核細胞が使用される場合、細胞は好ましくは、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｗ３１１０、ＭＧ１６５５、ＲＢ７９１、ＲＶ３０８などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、又はＱＭ Ｂ１５５１、ＰＶ３６１、ＤＳＭ３１９などのバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、又はシュードモナス・アエルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１－ＬＡＣ、シュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０などのシュードモナス属、又はストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏ）Ａ３、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・スキャビエス（Ｓ．ｓｃａｂｉｅｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４、ストレプトマイセス・Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６などのストレプトマイセス属などの細菌である。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の例には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２株、特にＨＭＳ １７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｃ６００、ＤＨ１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９に由来するもの、及びＢ株、特にＢＬ－２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）などに由来するものが含まれる。一般に、細菌などの改変された原核細胞などの誘導体も、本発明での使用に適している。そのような改変は、例えば、プロテアーゼの欠失又は不活性化、又は他の遺伝子の欠失又は不活性化であり得る。
本発明により真核細胞が使用される場合、細胞は好ましくは酵母細胞、糸状菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞又はヒト細胞である。
酵母細胞は、メチロトローフ酵母（＝メタノールを炭素源及びエネルギー源として利用できる酵母細胞）、例えばコマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）＝ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐａ）、オガタエア・ミヌタ（Ｏ．ｍｉｎｕｔａ）、カンジダ・ボイジニ（Ｃ．ｂｉｏｄｉｎｉｉ）、又は非メチロトローフ酵母、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・スチピチス（Ｐ．Ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ジゴサッカロミセス・ルキシ（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）、ジゴサッカロミセス・バイリィ（Ｚ．ｂａｉｌｉｉ）、アルクスラ・アデニニボランス（Ａ．ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、クルイベロミセス・マーキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）及びアルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）であることが好ましい。本発明において有用なピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株の例は、Ｘ３３及びそのサブタイプＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ；ＣＢＳ７４３５（ｍｕｔ＋）及びそのサブタイプＣＢＳ７４３５ ｍｕｔｓ、ＣＢＳ７４３５ ｍｕｔｓｄｅｌｔａＡｒｇ、ＣＢＳ７４３５ ｍｕｔｓｄｅｌｔａＨｉｓ、ＣＢＳ７４３５ ｍｕｔｓｄｅｌｔａＡｒｇ、ｄｅｌｔａＨｉｓ、ＣＢＳ７４３５ ｍｕｔｓ ＰＤＩ＋、ＣＢＳ ７０４（＝ＮＲＲＬ Ｙ－１６０３＝ＤＳＭＺ ７０３８２）、ＣＢＳ ２６１２（＝ＮＲＲＬ Ｙ－７５５６）、ＣＢＳ ９１７３－９１８９ 及びＤＳＭＺ ７０８７７、ＰＰＳ－９０１０（ＡＴＵＭ、元ＤＮＡ２．０、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡから入手可能）及びＰＰＳ－９０１６（ＡＴＵＭ、元ＤＮＡ２．０、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡから入手可能）並びにそれらの突然変異体である。一般に、例えば改変酵母細胞などのそのような酵母細胞の誘導体も、本発明での使用に適している。そのような改変は、例えば、酵母プロテアーゼの欠失又は不活性化、又は例えばｓｓｎ６様遺伝子（詳細についてはＷＯ２０１６１３９２７９Ａ１を参照されたい）などの他の遺伝子の欠失又は不活性化、又は酵母ゲノム、特にピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムからのいわゆるキラープラスミドの欠失（Ｓｔｕｒｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１６，２３５：１２１－１３１）であろう。
糸状菌細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）などのアスペルギルス属、又はトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ９４１４、トリコデルマ・（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＲＵＴ－Ｃ３０、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｉ）ＱＭ６ａ、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・ビレンス（Ｔ．ｖｉｒｅｎｓ）、トリコデルマ・アスペレルム（Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）などのトリコデルマ属、又はペニシリウム・パルロゼラム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐ．ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・エメルソニイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ（タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ））ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ペニシリウム・カメンベルティ（Ｐ．ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）及びペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）などのペニシリウム属、並びにそれらの誘導体であることが好ましい。
昆虫細胞は、Ｓｆ９又はＳｆ２１細胞（両方ともスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来）、ハイファイブ細胞（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｖｅ－ｃｅｌｌ）（Ｈｉ５と同じ、Ｈｉｇｈ－Ｆｉｖｅ ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４と同じ）又はＴｎ－３６８細胞（両方ともトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）由来）又はＳｅ３０１細胞（スポドプテラ・エクシグア（Ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）由来）並びにそれらの誘導体であることが好ましい。
哺乳動物細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ＤＧ４４などのＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣＝ＣＨＯ）細胞並びにそれらの誘導体であることが好ましい。
ヒト細胞は、ＨＴ－１０８０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＫＢ－１１、ＣＡＰ及びＨｕＨ－７などのＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓＝ＨＥＫ）細胞並びにそれらの誘導体であることが好ましい。
細胞及び細胞株は、組織培養コレクションなどのさまざまな供給源、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０，ＵＳＡ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ），Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ ７Ｂ，３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ），Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ ８，３５８４ ＣＴ Ｕｔｒｅｃｈｔ（Ｕｔｒｅｃｈｔ），Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ、Ｔｈｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ），７３０ Ｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｏｗｅｒ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ，ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６６ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ａｖｅ．，ＰＯ ｂｏｘ ２０８１０３，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ ０６５２０－８１０３，ＵＳＡ、又は販売業者、例えば、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒａβｅ ２５０，６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ Ｇｉｌｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｆｉｃ，１６８ Ｔｈｉｒｄ Ａｖｅｎｕｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ ０２４５１などから入手することができる。
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＊使用するプロモーターに応じて、特定の細胞型には、前記プロモーターを機能可能にさせるために前記細胞内に特定のタンパク質又は因子が存在する必要があり、例えば、Ｔ７プロモーターの場合Ｔ７－ＲＮＡ－ポリメラーゼが必要であり、これはすべての細胞型の中に存在するわけではないが、必要であれば前細胞内にトランスフェクトすることができる。
＊＊ＬＬＰ－プロモーターが機能するためには、ｓｓｎ６－遺伝子を不活性化又は欠失する必要がある（詳細はＷＯ２０１６１３９２７９Ａ１を参照されたい）
Figure 0007278261000008
Figure 0007278261000009
Figure 0007278261000010
＊すべての場合において、ＰＯＩの元々のシグナルペプチドが特定の細胞型で機能するわけではないが、細胞が十分に類似している場合、多くの場合、ネイティブシグナル配列が機能する。
Figure 0007278261000011
Figure 0007278261000012
クローニング、トランスフェクション、トランスフェクトされた発現カセットのコピー数の決定、ベクターの設計及び化学合成、複製起点、抗生物質耐性、選択マーカー、プロモーター、シグナル配列、ターミネーターなどのベクター要素の使用及び選択などの分子生物学的技術、細胞培養技術、例えばバキュロウイルス系などに使用されるウイルス技術、タンパク質発現の定量的及び半定量的決定を含むタンパク質発現技術はすべて標準的な実験室的方法であり、当業者には公知である。プロトコルは、標準のテキストブック及び実験室マニュアル、Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．ＩＳＳＮ １９３４－３６５５；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．ＩＳＳＮ １９３４－３６３９；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ Ｍ．Ｃｒｉｓｔｉｎａ Ｖｅｇａ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１６，ＩＳＳＮ ００６５－２５９８；Ｂａｃｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｍｕｒｈａｍｍｅｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０１６，ＩＳＳＮ １０６４－３７４５；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｒｅｖｉｅｗｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ Ａ．Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＳＮ １０６４－３７４５などから入手することができる。
ＰＯＩの宿主細胞発現の測定
本発明による異なる発現カセットをトランスフェクトされた宿主細胞が、同一の発現カセット配列を有する同数の発現カセットを含む宿主細胞と比較してより高い量の前記ＰＯＩを発現するかどうかを決定するために、多数の標準検査系、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイ（酵素結合免疫スポットアッセイ）、表面プラズモン共鳴アッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、現在ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、タンパク質チップアッセイ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、ウェスタンブロット、クーマシーブルー又は銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの濃度測定（ｄｅｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）、定量的質量分析、ＰＯＩサンプルのクロマトグラムの対応するＰＯＩピーク下のピーク面積の計算など）が公知である。前記方法を実施するための適切なプロトコルは、当業者に公知であり、、例えば、Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．ＩＳＳＮ １９３４－３６５５に見出すことができる。
遺伝的安定性の測定
例えば、遺伝的安定性は、宿主細胞のカセットにおける当技術分野で公知の同一発現のコピー数と比較して、本発明の宿主細胞における本発明による異なる発現カセットのコピー数を決定することにより測定できる。例えば、発現カセットのコピー数は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって決定することができる。ｑＰＣＲのプライマーは、発現カセットの全部又は一部を増幅するように設計することができる。発現カセットのコピー数が多くの細胞世代の後に変化する場合、これはゲノムの不安定性を証明する。さらに、ｑＰＣＲ産物の配列長は、例えばアガロースゲル電気泳動により決定することができる。発現産物の一部の欠失又は重複が発生した場合、ｑＰＣＲ産物の配列長はそれに応じて変化し、これもゲノムの不安定性を示す。発現カセットのコピー数を決定する他の方法は、例えばサザンブロット又は蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である。前記方法を実施するための適切なプロトコルは、当業者に公知であり、例えば、Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．ＩＳＳＮ １９３４－３６３９に見出すことができる。
図１は酵母細胞（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ））のトランスフェクションに使用されるベクターのベクターマップである。ベクターはＰＯＩの１、２、３又は４つの発現カセットを含み、各ＰＯＩ発現カセットの１つのベクター内には常に、異なる配列のプロモーター配列、シグナル配列、ＧＯＩ配列（異なるコード配列であるが、縮重遺伝コードのために常に同じアミノ酸配列のＰＯＩをもたらし、ＧＯＩはバリアント１～バリアント４と呼ばれ、ｖａｒ１～ｖａｒ４と略される）及びターミネーター配列が使用される。すべての酵母ベクターは、ベクター骨格として、酵母及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で機能するハイブリッドプロモーター（ｐＩＬＶ５とｐＥＭ７２との組み合わせ）、その後にゼオシンの抗生物質耐性のコード配列（ＺｅｏＲ）、次いで、アルコールオキシダーゼターミネーター（ＡＯＤＴＴ）、ｐＵＣの複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含むゼオシン抗生物質耐性発現カセットを含む。Ｙ３９２＿１ｘＧＯＩの場合のみ、ｐＵＣ ｏｒｉの後にレクチン様タンパク質ターミネーター配列（ＬＬＰＴＴ）が続く。酵母ベクターＹ３９１＿１ｘＧＯＩは、ベクター骨格に加えて、この場合は単鎖抗体（ｓｃＦＶ）であるＧＯＩの以下の発現カセットを含む：－レクチン様タンパク質プロモーター（ｐＬＬＰ）、目的の遺伝子（ＧＯＩ）として単鎖抗体（ｓｃＦｖ＿ｖａｒ４）、アルコールデヒドロゲナーゼターミネーター配列（ＡＤＨＴＴ） 図１は酵母細胞（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ））のトランスフェクションに使用されるベクターのベクターマップである。ベクターはＰＯＩの１、２、３又は４つの発現カセットを含み、各ＰＯＩ発現カセットの１つのベクター内には常に、異なる配列のプロモーター配列、シグナル配列、ＧＯＩ配列（異なるコード配列であるが、縮重遺伝コードのために常に同じアミノ酸配列のＰＯＩをもたらし、ＧＯＩはバリアント１～バリアント４と呼ばれ、ｖａｒ１～ｖａｒ４と略される）及びターミネーター配列が使用される。すべての酵母ベクターは、ベクター骨格として、酵母及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で機能するハイブリッドプロモーター（ｐＩＬＶ５とｐＥＭ７２との組み合わせ）、その後にゼオシンの抗生物質耐性のコード配列（ＺｅｏＲ）、次いで、アルコールオキシダーゼターミネーター（ＡＯＤＴＴ）、ｐＵＣの複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含むゼオシン抗生物質耐性発現カセットを含む。Ｙ３９２＿１ｘＧＯＩの場合のみ、ｐＵＣ ｏｒｉの後にレクチン様タンパク質ターミネーター配列（ＬＬＰＴＴ）が続く。酵母ベクターＹ３９３＿２ｘＧＯＩには、ベクター骨格に加えて、以下のＧＯＩの発現カセットを含み、どちらの場合も、同じアミノ酸配列の単鎖抗体（ｓｃＦＶ）をコードする：－グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ｐＧＡＰ）、接合因子アルファ２シグナル配列（ＭＦａ２ＳＳ）、目的の遺伝子として同じ単鎖抗体のバリエーション１（ｓｃＦｖ＿ｖａｒ １）、レクチン様タンパク質ターミネーター配列（ＬＬＰＴＴ）－レクチン系タンパク質プロモーター（ｐＬＬＰ）、目的の遺伝子として同じ単鎖抗体のバリエーション２（ｓｃＦｖ＿ｖａｒ ４）、アルコールデヒドロゲナーゼターミネーター配列（ＡＤＨＴＴ） 図１は酵母細胞（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ））のトランスフェクションに使用されるベクターのベクターマップである。ベクターはＰＯＩの１、２、３又は４つの発現カセットを含み、各ＰＯＩ発現カセットの１つのベクター内には常に、異なる配列のプロモーター配列、シグナル配列、ＧＯＩ配列（異なるコード配列であるが、縮重遺伝コードのために常に同じアミノ酸配列のＰＯＩをもたらし、ＧＯＩはバリアント１～バリアント４と呼ばれ、ｖａｒ１～ｖａｒ４と略される）及びターミネーター配列が使用される。すべての酵母ベクターは、ベクター骨格として、酵母及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で機能するハイブリッドプロモーター（ｐＩＬＶ５とｐＥＭ７２との組み合わせ）、その後にゼオシンの抗生物質耐性のコード配列（ＺｅｏＲ）、次いで、アルコールオキシダーゼターミネーター（ＡＯＤＴＴ）、ｐＵＣの複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含むゼオシン抗生物質耐性発現カセットを含む。Ｙ３９２＿１ｘＧＯＩの場合のみ、ｐＵＣ ｏｒｉの後にレクチン様タンパク質ターミネーター配列（ＬＬＰＴＴ）が続く。酵母ベクターＹ３９４＿３ｘＧＯＩは、ベクター骨格に加えて、以下のＧＯＩの発現カセットを含み、３つの場合すべてにおいて、同じアミノ酸配列の単鎖抗体（ｓｃＦＶ）をコードする：－アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ｐＡＤＨ）、ヒト血清アルブミンシグナル配列（ＨＳＡＳＳ）、単鎖抗体バリアント２（ｓｃＦｖ＿ｖａｒ２）、シトクロムｃ１ターミネーター配列（ｃｙｃ１ＴＴ）－グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ｐＧＡＰ）、接合因子アルファ２シグナル配列（ＭＦａ２ＳＳ）、単鎖抗体バリアント１（ｓｃＦｖ＿ｖａｒ１）、レクチン様タンパク質ターミネーター配列（ＬＬＰＴＴ）－レクチン様タンパク質プロモーター（ｐＬＬＰ）、レクチン様タンパク質シグナル配列（ＬＬＰＳＳ）、単鎖抗体バリアント４（ｓｃＦｖ＿ｖａｒ４）、アルコールデヒドロゲナーゼターミネーター配列（ＡＤＨＴＴ） 図１は酵母細胞（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ））のトランスフェクションに使用されるベクターのベクターマップである。ベクターはＰＯＩの１、２、３又は４つの発現カセットを含み、各ＰＯＩ発現カセットの１つのベクター内には常に、異なる配列のプロモーター配列、シグナル配列、ＧＯＩ配列（異なるコード配列であるが、縮重遺伝コードのために常に同じアミノ酸配列のＰＯＩをもたらし、ＧＯＩはバリアント１～バリアント４と呼ばれ、ｖａｒ１～ｖａｒ４と略される）及びターミネーター配列が使用される。すべての酵母ベクターは、ベクター骨格として、酵母及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で機能するハイブリッドプロモーター（ｐＩＬＶ５とｐＥＭ７２との組み合わせ）、その後にゼオシンの抗生物質耐性のコード配列（ＺｅｏＲ）、次いで、アルコールオキシダーゼターミネーター（ＡＯＤＴＴ）、ｐＵＣの複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含むゼオシン抗生物質耐性発現カセットを含む。Ｙ３９２＿１ｘＧＯＩの場合のみ、ｐＵＣ ｏｒｉの後にレクチン様タンパク質ターミネーター配列（ＬＬＰＴＴ）が続く。酵母ベクターＹ３９５＿４ｘＧＯＩは、ベクター骨格に加えて、以下のＧＯＩの発現カセットを含み、４つの場合すべてにおいて、同じアミノ酸配列の単鎖抗体（ｓｃＦＶ）をコードする：－アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ｐＡＤＨ）、ヒト血清アルブミンシグナル配列（ＨＳＡＳＳ）、単鎖抗体バリアント２（ｓｃＦｖ＿ｖａｒ２）、シトクロムｃ１ターミネーター配列（ｃｙｃ１ＴＴ）－グリセルアルデヒド－３－リン酸（３－ｐｈｏａｓｐｈａｔｅ）デヒドロゲナーゼプロモーター（ｐＧＡＰ）、接合因子アルファ２シグナル配列（ＭＦａ２ＳＳ）、単鎖抗体バリアント１（ｓｃＦｖ＿ｖａｒ１）、レクチン様タンパク質ターミネーター配列（ＬＬＰＴＴ）－レクチン様タンパク質プロモーター（ｐＬＬＰ）、レクチン様タンパク質シグナル配列（ＬＬＰＳＳ）、単鎖抗体バリアント４（ｓｃＦｖ＿ｖａｒ４）、アルコールデヒドロゲナーゼターミネーター配列（ＡＤＨＴＴ）延長因子プロモーター（ｐＴＥＦ）、接合因子アルファ４－シグナル配列（ＭＦａ４ＳＳ）、単鎖抗体バリアント３（ｓｃＦｖ＿ｖａｒ３）、アルコールオキシダーゼターミネーター配列（ＡＯＸＴＴ） 図２は、図１の発現ベクターの配列を示す図である。酵母ベクターＹ３９１＿１ｘＧＯＩ（配列番号１） 図２は、図１の発現ベクターの配列を示す図である。酵母ベクターＹ３９１＿１ｘＧＯＩ（配列番号１） 図２は、図１の発現ベクターの配列を示す図である。酵母ベクターＹ３９３＿２ｘＧＯＩ（配列番号２） 図２は、図１の発現ベクターの配列を示す図である。酵母ベクターＹ３９３＿２ｘＧＯＩ（配列番号２） 図２は、図１の発現ベクターの配列を示す図である。酵母ベクターＹ３９３＿２ｘＧＯＩ（配列番号２） 図２は、図１の発現ベクターの配列を示す図である。酵母ベクターＹ３９４＿３ｘＧＯＩ（配列番号３） 図２は、図１の発現ベクターの配列を示す図である。酵母ベクターＹ３９４＿３ｘＧＯＩ（配列番号３） 図２は、図１の発現ベクターの配列を示す図である。酵母ベクターＹ３９４＿３ｘＧＯＩ（配列番号３） 図２は、図１の発現ベクターの配列を示す図である。酵母ベクターＹ３９４＿３ｘＧＯＩ（配列番号３） 図２は、図１の発現ベクターの配列を示す図である。酵母ベクターＹ３９５＿４ｘＧＯＩ（配列番号４） 図２は、図１の発現ベクターの配列を示す図である。酵母ベクターＹ３９５＿４ｘＧＯＩ（配列番号４） 図２は、図１の発現ベクターの配列を示す図である。酵母ベクターＹ３９５＿４ｘＧＯＩ（配列番号４） 図２は、図１の発現ベクターの配列を示す図である。酵母ベクターＹ３９５＿４ｘＧＯＩ（配列番号４） 図３は、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞）のトランスフェクションに使用されるベクターのベクターマップである。各ベクターは、ＧＯＩとしてＴＮＦ受容体２のリガンド結合ドメインに融合した抗体の定常領域からなる融合タンパク質の配列を含む単一の発現カセットを含む。各ベクターはさらに、代謝選択マーカージヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を含み、この酵素は、例えばチミジンを欠く細胞培養培地でＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を成長可能にし、それによりＤＨＦＲ－含有ベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ（又は他の細胞）を非トランスフェクト細胞から選択可能にする。さらに、各ベクターはネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）の配列を含み、抗生物質ネオマイシンを使用して形質転換細胞を選択することができる。さらに、各ベクターは、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）、スペクトロマイシン耐性（ＳｐｅｃｔＲ）及びクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）から選択される別の抗生物質耐性遺伝子を含む。各ベクターは、ＧＯＩの発現カセット内に異なるプロモーター、異なるシグナル配列及び異なるターミネーター配列を含む。図３ＡはベクターｐＮＴ－ＭＧ００１を表す。ベクター要素の詳細を表７に示す。 図３は、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞）のトランスフェクションに使用されるベクターのベクターマップである。各ベクターは、ＧＯＩとしてＴＮＦ受容体２のリガンド結合ドメインに融合した抗体の定常領域からなる融合タンパク質の配列を含む単一の発現カセットを含む。各ベクターはさらに、代謝選択マーカージヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を含み、この酵素は、例えばチミジンを欠く細胞培養培地でＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を成長可能にし、それによりＤＨＦＲ－含有ベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ（又は他の細胞）を非トランスフェクト細胞から選択可能にする。さらに、各ベクターはネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）の配列を含み、抗生物質ネオマイシンを使用して形質転換細胞を選択することができる。さらに、各ベクターは、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）、スペクトロマイシン耐性（ＳｐｅｃｔＲ）及びクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）から選択される別の抗生物質耐性遺伝子を含む。各ベクターは、ＧＯＩの発現カセット内に異なるプロモーター、異なるシグナル配列及び異なるターミネーター配列を含む。図３ＢはベクターｐＮＴ－ＭＧ００２を表す。ベクター要素の詳細を表７に示す。 図３は、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞）のトランスフェクションに使用されるベクターのベクターマップである。各ベクターは、ＧＯＩとしてＴＮＦ受容体２のリガンド結合ドメインに融合した抗体の定常領域からなる融合タンパク質の配列を含む単一の発現カセットを含む。各ベクターはさらに、代謝選択マーカージヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を含み、この酵素は、例えばチミジンを欠く細胞培養培地でＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を成長可能にし、それによりＤＨＦＲ－含有ベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ（又は他の細胞）を非トランスフェクト細胞から選択可能にする。さらに、各ベクターはネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）の配列を含み、抗生物質ネオマイシンを使用して形質転換細胞を選択することができる。さらに、各ベクターは、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）、スペクトロマイシン耐性（ＳｐｅｃｔＲ）及びクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）から選択される別の抗生物質耐性遺伝子を含む。各ベクターは、ＧＯＩの発現カセット内に異なるプロモーター、異なるシグナル配列及び異なるターミネーター配列を含む。図３ＣはベクターｐＮＴ－ＭＧ００３を表す。ベクター要素の詳細を表７に示す。 図３は、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞）のトランスフェクションに使用されるベクターのベクターマップである。各ベクターは、ＧＯＩとしてＴＮＦ受容体２のリガンド結合ドメインに融合した抗体の定常領域からなる融合タンパク質の配列を含む単一の発現カセットを含む。各ベクターはさらに、代謝選択マーカージヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を含み、この酵素は、例えばチミジンを欠く細胞培養培地でＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を成長可能にし、それによりＤＨＦＲ－含有ベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ（又は他の細胞）を非トランスフェクト細胞から選択可能にする。さらに、各ベクターはネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）の配列を含み、抗生物質ネオマイシンを使用して形質転換細胞を選択することができる。さらに、各ベクターは、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）、スペクトロマイシン耐性（ＳｐｅｃｔＲ）及びクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）から選択される別の抗生物質耐性遺伝子を含む。各ベクターは、ＧＯＩの発現カセット内に異なるプロモーター、異なるシグナル配列及び異なるターミネーター配列を含む。図３Ｄは、ベクターｐＮＴ－ＭＧ００４を表す。ベクター要素の詳細を表７に示す。 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐＮＴ－ＭＧ００１（配列番号５） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐＮＴ－ＭＧ００１（配列番号５） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐＮＴ－ＭＧ００１（配列番号５） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐＮＴ－ＭＧ００１（配列番号５） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐ１１ＮＴ－ＭＧ００２（配列番号６） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐ１１ＮＴ－ＭＧ００２（配列番号６） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐ１１ＮＴ－ＭＧ００２（配列番号６） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐ１１ＮＴ－ＭＧ００２（配列番号６） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐＮＴ－ＭＧ００３（配列番号７） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐＮＴ－ＭＧ００３（配列番号７） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐＮＴ－ＭＧ００３（配列番号７） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐＮＴ－ＭＧ００３（配列番号７） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐＮＴ－ＭＧ００４（配列番号８） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐＮＴ－ＭＧ００４（配列番号８） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐＮＴ－ＭＧ００４（配列番号８） 図４は図３の発現ベクターの配列を示す図である。哺乳動物ベクターｐＮＴ－ＭＧ００４（配列番号８）
実施例及び方法
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞のための方法
酵母ベクターの生成：ベクターのセットには、１つの発現カセットを有する１つのベクター、２つの異なる発現カセットを有する１つのベクター、３つの異なる発現カセットを有する１つのベクター及び４つの異なる発現カセットを有する１つのベクターが含まれる。ベクターセットでは、４つの異なる発現カセットのそれぞれが異なるヌクレオチド配列のＧＯＩを有するが、得られたＰＯＩは同一の成熟アミノ酸配列を有し、４つの異なる発現カセットのそれぞれが異なるプロモーターヌクレオチド配列、異なるシグナル配列及び異なるターミネーターヌクレオチド配列を含む。図１Ａ～１Ｄはこれらのベクターのベクターマップを示し、図２Ａ～２Ｄ及び配列番号１、２、３及び４は、これらのベクターの完全なヌクレオチド配列を示す。
ＰＯＩの４つの異なるヌクレオチド配列は、縮重遺伝コードを使用して設計されている。ＰＯＩは単鎖抗体である（ｓｃＦＶ、ＥＳＢＡ１８４５＝ｓｃＦｖ＝単鎖可変断片＝抗原結合ドメインを含む単一ポリペプチド鎖を含む人工抗体断片）。ｓｃＦｖ＿ｖａｒ１、ｓｃＦｖ＿ｖａｒ２、ｓｃＦｖ＿ｖａｒ３及びｓｃＦｖ＿ｖａｒ４と呼ばれる前記ｓｃＦｖの４つの異なるバリアントが使用され、これらはすべて同一のアミノ酸配列をコードするが、縮重遺伝コードの使用により異なるヌクレオチド配列を有する。使用するプロモーター配列は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のレクチン様タンパク質プロモーター（ｐＬＬＰ）、ＧＡＰプロモーター（ｐＧＡＰ）、ＡＤＨプロモーター（ｐＡＤＨ）及びＴＥＦプロモーター（ｐＴＥＦ）である。ＰＯＩのために使用する分泌シグナル配列は、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のレクチン様タンパク質のシグナル配列（ＬＬＰＳＳ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の接合因子アルファ－４のシグナル配列（ＭＦａ４ＳＳ）、ヒト血清アルブミンのシグナル配列（ＨＳＡＳＳ）及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の接合因子アルファ－２のシグナル配列（ＭＦａ２ＳＳ）である。終結配列は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＴＴ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のレクチン様タンパク質の終結配列（ＬＬＰＴＴ）、シトクロムｃ１ターミネーターの終結配列（ｃｙｃ１ＴＴ）及びアルコールオキシダーゼの終結配列（ＡＯＸＴＴ）である。すべてのベクターで使用する酵母細胞選択マーカーは、ＩＬＶ５プロモーター、ＥＭ７２シグナル配列及びＡＯＤターミネーターの使用により発現されるゼオシン－ｒである。ｐＵＣ ｏｒｉは、すべての酵母発現ベクターで使用されている。
ベクターの生成
４つの異なる発現ベクターを、図１Ａ～１Ｄのベクターマップに示されるように設計し、これらは図２Ａ～２Ｄ並びに配列番号１、２、３及び４に示されるベクター配列を有する。すべてのベクターは、（米国カリフォルニア州ニューアークのＡＴＵＭ）のＤＮＡ２．０（現在のＡＴＵＭ）合成サービスを使用して化学的に合成される。
ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のトランスフェクション
４つの異なるベクターを個別にピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母細胞ＳＳＳ１にトランスフェクトする。この酵母細胞は、特許出願ＷＯ２０１６１３９２７９Ａ１に記載されており、ＷＯ ２０１６／１３９２７０ Ａ１に記載の発現カセットの挿入により、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＢＳ ７４３５ゲノムの第１染色体の位置８０７，４８０においてｓｓｎ６様遺伝子が破壊されていることを除いて、ピキアパストリスＣＢＳ ７４３５及びＮＲＲＬ Ｙ－１１４３０と同一である。ＣＢＳ ７４３５の完全な配列は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ２０１１，Ｖｏｌ．１５４，ｐａｇｅ ３１２－３２０ ｙｅａｒ ２０１１に開示されている。ヌクレオチド配列は、以下のアクセッション番号：第１染色体：ＦＲ８３９６２８．１；第２染色体：ＦＲ８３９６２９．１；第３染色体：ＦＲ８３９６３０．１；第４染色体：ＦＲ８３９６３１．１；ミトコンドリア：ＦＲ８３９６３２．１でＧｅｎＢａｎｋに公開されている。
４８ディープウェルプレートにおけるＰＯＩの発現、ＰＯＩの半定量測定
トランスフェクションをストリークアウト（ｓｔｒｅａｋ ｏｕｔ）し、個々の形質転換クローンを合成培地で培養する。７０時間後、細胞培養上清を培養液から移し、酵母細胞と細胞デブリを遠心分離によって上清から除去し、１０μｌの上清をロードして、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ ＮｕＰａｇｅ ４－１２％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲルで電気泳動分離する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルをクーマシーブルーで染色した後、又は銀染色した後、約２６ ｋＤａの分子量を有するｓｃＦｖ（ＥＳＢＡ１８４５）のタンパク質バンドを、ゲル内のタンパク質バンドのスキャニング及び濃度測定により半定量的に決定する。シグナル強度により、ｓｃＦｖタンパク質の発現率の推定値を得る。
上清中のＰＯＩの濃度を、自動キャピラリー電気泳動（ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ－Ｔｏｕｃｈ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を製造業者の推奨に従って適用することにより決定した。
Figure 0007278261000013
シェーカーフラスコにおけるピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＰＯＩの発現、遺伝的安定性の決定
個々のピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）クローンを、シェーカーフラスコで４週間培養する。細胞の増殖を確実にするために、必要に応じて細胞培養液を培地で希釈する。この４週間培養の前後に、発現カセットのコピー数を、例えば定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって決定する。任意選択的に、又は加えて、発現カセットの配列を配列決定により決定して、ＰＣＲ増幅された核酸の正確なサイズを、当技術分野で公知の方法に従って、アガロースゲル電気泳動により決定する。これらの実験は、クローンの遺伝的安定性を決定するために行う。
ＣＨＯ細胞のための方法
ベクターの生成
それぞれが同じＰＯＩをコードする４つの異なるＣＨＯ発現ベクターを設計する。同じアミノ酸配列のＰＯＩをコードする２つの異なるヌクレオチド配列を使用した（エタネルセプトｖａｒ１及びエタネルセプトｖａｒ２）。４つの異なるベクターはそれぞれ、同じＰＯＩをコードする発現カセットを１つだけ、ネオマイシン（抗生物質選択マーカー）の１つの発現カセット、別の抗生物質耐性の発現カセット、及びＤＨＦＲ（ＣＨＯ細胞株の増殖に必要な代謝選択マーカーの１つの発現カセットを含む。４つの異なる各ベクター内で、ＧＯＩのための異なるプロモーター及びターミネーター、ネオマイシン選択マーカー並びにＤＨＦＲが使用され、つまり、ベクター内では異なるプロモーター及びターミネーターが使用される。ネオマイシン選択マーカー及びＤＨＦＲのヌクレオチド配列は、４つのベクターすべてで同一である。すべてのベクターは、ＧｅｎｅＡｒｔ合成サービス（Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、現在Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに所属）を使用して化学的に合成される。さまざまなベクターのベクター要素の詳細は表６に見ることができ、ベクターマップは図３Ａ～３Ｄに、配列は図４Ａ～４Ｄ及び配列番号５、６、７及び８に示されている。
ＣＨＯ－ベクターは毎回発現カセットを１つだけ含み、その発現カセットは４つの各ベクターで異なる。詳細には、各発現カセットは異なるプロモーター、異なるシグナル配列及び異なるターミネーターを使用する。ＰＯＩは常に同じである。さらに、各ベクターは、代謝選択マーカーＤＨＦＲの発現カセット（毎回同じヌクレオチド配列によってコードされる）、抗生物質選択マーカーネオマイシンＲ（ＮｅｏＲ）の発現カセット（毎回同じヌクレオチド配列によってコードされる）、及び異なる選択マーカー、すなわちアンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）、スペクトロマイシン耐性（ＳｐｅｃｔＲ）若しくはクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）、又は同じ選択マーカーであるが、異なる向きでベクターに挿入されている選択マーカー、例えばこの場合、ベクターｐＮＴ－ＭＧ００１及びｐＮＴ－ＭＧ００４内の２つの異なる向きのアンピシリン耐性マーカー、のいずれかの別の抗生物質選択マーカーをコードする発現カセットを含む。さらに、４つのベクターはすべて、ベクター骨格としてファージｆ１配列の複製起点ｐＢＲ３２２又はｐ１６Ａのいずれかを含み、ｐＢＲ３２２もベクター内で２つの異なる向きで使用される。哺乳動物ベクターのさまざまなベクター要素の概要を以下の表６に示す。
Figure 0007278261000014
 ｐ＝プロモーター、ＳＳ＝シグナル配列、ＴＴ＝ターミネーター、ＤＨＦＲ＝ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ＮｅｏＲ＝ネオマイシンＲ耐性、ｏｒｉ＝複製起点、ｖａｒ１＝配列のバリエーション１、ｖａｒ２＝配列のバリエーション２、ｖａｒ３＝配列のバリエーション３、ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性、ＳｐｅｃｔＲ＝スペクトロマイシン耐性、ＣｍＲ＝クロラムフェニコール耐性
＊ｏｒｉ ｐＢＲ３２２は、ｐＮＴ－ＭＢ００３及びｐＮＴ－ＭＢ００４と比較して、ｐＮＴ－ＭＢ００１のベクター内で異なる向きを有する。
＊＊抗生物質耐性ＡｍｐＲは、ｐＮＴ－ＭＢと比較して、ｐＮＴ－ＭＢ００１のベクター内で異なる向きを有する。
ベクターｐＮＴ－ＭＧ００１～ｐＮＴ－ＭＧ００４のヌクレオチド配列を図４Ａ～Ｄ及び配列プロトコル、配列番号５、６、７及び８に示す。表６及び図３Ａ～Ｄからわかるように、ｐＮＴ－ＭＧ００１～ｐＮＴ－ＭＧ００３はすべてＰＯＩとしてエタネルセプトｖａｒ２（＝バージョン２）の配列を含み、ｐＮＴ－ＭＧ００４はエタネルセプトｖａｒ１（＝バージョン１）を含む。ｖａｒ１とｖａｒ２とは両方ともコドン最適化ヌクレオチド配列を表し、どちらも同じアミノ酸配列をコードするが、コドン使用量がわずかに異なる。ｖａｒ１及びｖａｒ２のヌクレオチド配列は９０％超同一であり（本明細書の他の箇所で説明する方法によって決定）、その違いはｖａｒ１及びｖａｒ２の２つの異なるコドン最適化アルゴリズムの使用によってのみ引き起こされる。ｖａｒ２のヌクレオチド配列（ベクターｐＮＴ－ＭＧ００１～ｐＮＴ－ＭＧ００３で使用）のみを図４及び配列プロトコルに示す。本発明の原理及び記載の実験を実施するために、ｖａｒ１及びｖａｒ２の両方が正確に同じアミノ酸配列をコードすることが明らかである限り、ｖａｒ１ヌクレオチド配列を知る必要はない。
表７は、使用した発現ベクターＹ３９１＿１ｘＧＯＩ、Ｙ３９３＿２ｘＧＯＩ、Ｙ３９４＿３ｘＧＯＩ、Ｙ３９４＿４ｘＧＯＩ、ｐＮＴ－ＭＧ００１、ｐＮＴ－ＭＧ００２、ｐＮＴ－ＭＧ００３及びｐＮＴ－ＭＧ００４のすべての特徴を示す。
Figure 0007278261000015
Figure 0007278261000016
Figure 0007278261000017
Figure 0007278261000018
Figure 0007278261000019
ＳＳ＝シグナル配列、ＴＴ＝ターミネーター、ｖａｒ１＝バリアント１、ｏｒｉ＝複製起点、ｅｎｈ＝エンハンサー
安定した細胞株の取得
ＣＨＯ（ＤＨＦＲ）細胞に、４つのベクターの個々のベクターのいずれか、又は４つすべてのベクターの混合物をトランスフェクトする。安定したトランスフェクションを、製造元の取扱説明書に従って、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎキット（Ｌｏｎｚａ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して実行する。簡単に言えば、５×１０６ ＣＨＯ細胞に、トランスフェクションあたり３μｇの線形化ベクターＤＮＡをトランスフェクトする。すべてのベクターを、個別にトランスフェクトするか、又は４つのベクターすべてを混合してトランスフェクトする。トランスフェクション後、増殖培地を添加し、１０％ＣＯ２雰囲気において２４～４８時間、３７℃において１１０ｒｐｍで振盪しながら細胞を増殖させる。細胞の回収後、２回の選択ラウンドを実行する。まず、Ｇ４１８を含む培地を使用して細胞を選択し、９０％の細胞生存率に達した後、メトトレキサート（ＭＴＸ）を使用して選択する。細胞の生存率が９０％を超えるまで（通常、トランスフェクション後３～４週間）、細胞をＭＴＸ選択下で維持する。選択期間を通して、週に２回新鮮な培地を使用して細胞を培養する。単一細胞のクローニングを、標準的な限界希釈クローニングアプローチを使用して実行する。個別のクローンを、ベクターコピー数（すなわち、クローンごとに少なくとも２つのコピー）に基づいて選択した。
各トランスフェクションから、個々のクローンを選択し、ＰＯＩの発現率（力価）、経時的なクローンの力価安定性、クローンごとのリーダーペプチド切断、及び経時的なクローンの遺伝的安定性について試験する。力価とは、組織培養培地中の組換えＰＯＩ（この場合はエタネルセプト）の濃度（ｍｇ／Ｌ）を意味する。
細胞株のベクターコピー数の分析
組み込まれたベクターコピー数を、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して評価する。相対的な定量化を使用して、クローンごとの組み込まれた発現構築物の数を推定する。個々の細胞株内のＰＯＩのコピー数が経時的に安定しているかどうかを判断するために、３ヶ月後にコピー数評価を繰り返して使用する。アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の分離により、ＰＣＲ増幅ポリヌクレオチドのサイズが経時的に安定しているかどうかを判断することができ、このことは、細胞株の個別のクローンの遺伝的安定性のもう１つの指標である。ＰＣＲ産物の高解像度融解分析を使用して、ＰＣＲ産物の同一性を確認することができる。
細胞株によるＰＯＩ生産の分析
生産性評価には、１４日間の一般的な流加工程が適用される。すべての流加工程は、１００ｍＬの無血清培地において行う。培地に４×１０５個の生細胞／ｍＬを接種し、細胞培養液を１０％ＣＯ２雰囲気、３７℃において１１０ｒｐｍ（振盪直径５０ｍｍ）で振盪し、７日目に温度を３３℃にシフトしてインキュベートする細胞濃度と生存率は、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲアナライザーを使用して測定する。力価を、Ｃｅｄｅｘシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、培養７、１０及び１４日目に測定する。測定は、ヒトＦｃ領域に対する抗体を使用した比濁法に基づいている。回収物を、流加工程の最後に収集し、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製する。
細胞株の遺伝的安定性の分析
個別の細胞クローンを、選択圧の非存在下で、７５ｃｍ３フラスコにおいて３×１０５細胞／ｍｌの密度で懸濁培養液中に播種する。生産性試験は６週間ごとに３ヶ月間行う。ＰＯＩの発現は、当業者に公知の標準的な方法、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴ、定量的ウェスタンブロット法、定量的質量分析、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定する。
細胞株によるシグナルペプチド切断の分析
正しいリーダーペプチド切断の分析は、質量分析又はエドマン分解を使用したペプチド配列決定によって行う。シグナルペプチドの誤切断は、無傷の質量の測定を使用して評価することができる。タンパク質を最初にＮ－グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）Ｆで脱グリコシル化させ、続いて高分解能質量分析計でＬＣ－ＭＳを使用してタンパク質の無傷の質量を分析する。質量を、タンパク質及びシグナルペプチド付加物の計算された理論上の質量に従って特定し、誤切断されたシグナルペプチドの割合をピーク強度から計算する。
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母細胞、ＣＨＯ哺乳動物細胞並びに本発明による他の細胞型について本明細書に記載又は述べたすべての方法は、当業者に公知の標準的な方法である。そのような方法は、標準的実験質方法のマニュアル、例えば、Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１３，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．又は“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．ＩＳＳＮ １９３４－３６３９ 及び“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．ＩＳＳＮ １９３４－３６５５又はＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．の「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」の他のタイトルなどに記載されている。
本発明は、同じＧＯＩを含むが、同じ発現カセットに対して異なるコード配列を有する２つ以上の発現カセットが、偶然に細胞ライブラリーの個別の細胞内に存在する可能性を含まず、前記細胞ライブラリーは、その細胞ライブラリー構築に使用される細胞株において発現率が最大であるＧＯＩコード配列をスクリーニングすることを意図している。

Claims (19)

  1. ３つ又は４つの異なるタイプの発現カセットを１つの細胞に含む宿主細胞であって、各発現カセットが、同一の成熟アミノ酸配列を有する同じ目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードし、各タイプの発現カセットが、少なくともプロモーター配列、前記ＰＯＩのコード配列のポリヌクレオチド配列及びターミネーター配列を含み、前記発現カセットが、
    （Ａ）
    （Ａａ）異なるプロモーター配列、及び
    （Ａｂ）縮重遺伝コードの使用により前記ＰＯＩの前記同一の成熟アミノ酸配列をコードする異なるヌクレオチド配列、
    を含むという点で、前記発現カセットは異なるか、
    又は、前記発現カセットが、
    （Ｂ）
    （Ｂａ）同じプロモーター配列、及び
    （Ｂｂ）縮重遺伝コードの使用により前記ＰＯＩの前記同一の成熟アミノ酸配列をコードする異なるヌクレオチド配列、
    を含むという点で、前記発現カセットは異なり、
    前記宿主細胞は、酵母細胞又は哺乳動物細胞である、宿主細胞。
  2. 前記発現カセットが、
    （Ａｃ）異なるターミネーター配列、及び／又は
    （Ａｄ）前記発現カセットにシグナル配列が存在する場合、異なるシグナル配列、
    を含むという点で、前記発現カセットは異なるか、
    又は、前記発現カセットが、
    （Ｂｃ）異なるターミネーター配列、及び／又は
    （Ｂｄ）前記発現カセットにシグナル配列が存在する場合、異なるシグナル配列、
    を含むという点で、前記発現カセットはさらに異なる、請求項１に記載の宿主細胞。
  3. 少なくとも１つの発現カセットが、同一の成熟アミノ酸配列を有する２つ以上のＰＯＩをコードし、前記２つ以上のＰＯＩのコード配列の間にＩＲＥＳ配列がそれぞれ配置される、請求項１又は２に記載の宿主細胞。
  4. 請求項１の選択肢（Ａ）の項目（Ａｂ）において、ＰＯＩのコード配列の前記異なるヌクレオチド配列が、縮重遺伝コードによってコードされ、特定のＰＯＩの同一の成熟アミノ酸配列を得るために、該縮重遺伝コードが、前記特定のＰＯＩコードヌクレオチド配列として可能な、少なくとも５０％の最大の理論的なヌクレオチド配列の違いをもたらすか、
    又は、選択肢（Ｂ）の項目（Ｂｂ）において、ＰＯＩのコード配列の前記異なるヌクレオチド配列が、縮重遺伝コードによってコードされ、特定のＰＯＩの同一の成熟アミノ酸配列を得るために、該縮重遺伝コードが、前記特定のＰＯＩコードヌクレオチド配列として可能な、少なくとも５０％の最大の理論的なヌクレオチド配列の違いをもたらす、請求項１～３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  5. 選択肢（Ａ）において、前記プロモーター、前記ターミネーター及び／又は存在する場合にはシグナル配列、並びに
    選択肢（Ｂ）において、前記ターミネーター及び／又は存在する場合にはシグナル配列、
    が、使用される異なる発現カセット間で、ヌクレオチド配列に関して、少なくとも２０％異なる、請求項１～４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  6. 選択肢（Ａ）において、前記プロモーター、前記ターミネーター及び／又は存在する場合にはシグナル配列、並びに
    選択肢（Ｂ）において、前記ターミネーター及び／又は存在する場合にはシグナル配列、
    が、使用される異なる発現カセット間で、ヌクレオチド配列に関して、少なくとも３０％異なる、請求項１～４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  7. 選択肢（Ａ）において、前記プロモーター、前記ターミネーター及び／又は存在する場合にはシグナル配列、並びに
    選択肢（Ｂ）において、前記ターミネーター及び／又は存在する場合にはシグナル配列、
    が、使用される異なる発現カセット間で、ヌクレオチド配列に関して、少なくとも４０％異なる、請求項１～４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  8. 選択肢（Ａ）において、前記プロモーター、前記ターミネーター及び／又は存在する場合にはシグナル配列、並びに
    選択肢（Ｂ）において、前記ターミネーター及び／又は存在する場合にはシグナル配列、
    が、使用される異なる発現カセット間で、ヌクレオチド配列に関して、少なくとも５０％異なる、請求項１～４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  9. 前記ＰＯＩが、前記宿主細胞に対して異種である、請求項１～８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  10. ＰＯＩのコード配列の前記異なるヌクレオチド配列が、少なくとも３０ヌクレオチド長を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  11. ＰＯＩのコード配列の前記異なるヌクレオチド配列が、少なくとも６０ヌクレオチド長を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  12. ＰＯＩのコード配列の前記異なるヌクレオチド配列が、少なくとも９０ヌクレオチド長を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  13. 哺乳動物細胞がＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  14. 酵母細胞がピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  15. ３つ又は４つの異なる核酸により宿主細胞をトランスフェクトするステップを含む、請求項１～１４のいずれか一項で定義される宿主細胞を生成する方法であって、各核酸は、前記ＰＯＩの同じ成熟アミノ酸配列をコードする１つの異なる発現カセットを含む、方法。
  16. 少なくとも１つの核酸により宿主細胞をトランスフェクトするステップを含む、請求項１～１４のいずれか一項で定義される宿主細胞を生成する方法であって、前記核酸は、３つ又は４つの異なる発現カセットを含み、前記発現カセットの各々は、前記ＰＯＩの同じ成熟アミノ酸配列をコードする、方法。
  17. 請求項１～１４のいずれか一項に定義される宿主細胞を使用するステップを含む、ＰＯＩの製造方法。
  18. 前記ＰＯＩが単鎖タンパク質であるか、又は単鎖ポリペプチドの前駆体から生じる、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＰＯＩがインスリン前駆体から生じる、請求項１８に記載の方法。
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