CN115094080A - 一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115094080A
CN115094080A CN202210762405.3A CN202210762405A CN115094080A CN 115094080 A CN115094080 A CN 115094080A CN 202210762405 A CN202210762405 A CN 202210762405A CN 115094080 A CN115094080 A CN 115094080A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aspergillus oryzae
sequence
expression
heterologous protein
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210762405.3A
Other languages
English (en)
Inventor
曾斌
刘琪聪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Technology University
Original Assignee
Shenzhen Technology University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Technology University filed Critical Shenzhen Technology University
Priority to CN202210762405.3A priority Critical patent/CN115094080A/zh
Publication of CN115094080A publication Critical patent/CN115094080A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/69—Aspergillus oryzae
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用，其中，构建方法包括步骤：通过生物信息学分析确定米曲霉中高表达蛋白酶基因AO090120000232，将高表达蛋白酶基因AO090120000232的上游1522bp序列的克隆片段与下游1598bp序列的克隆片段整合到载体pEX1中，得到基因AO090120000232敲除载体，将所述基因AO090120000232敲除载体整合到米曲霉中，构建得到异源蛋白高表达米曲霉工程菌。本发明利用生物信息学方法分析找到米曲霉中高表达的蛋白酶基因AO090120000232，利用同源重组技术敲除米曲霉中高表达的蛋白酶基因AO090120000232，构建的异源蛋白高表达米曲霉工程菌可提高异源蛋白表达水平。

Description

一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
丝状真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)是曲霉属中的一种，属于黄曲霉群，具有极强的蛋白分泌能力。米曲霉被应用于传统食品行业中已有上千年的历史，不会产生黄曲霉毒素，主要被应用于酱油酿造，此外还在酿酒过程中发挥糖化菌的作用等，在日本，其还被用作生产清酒。米曲霉被美国FDA(Food and Drug Administration)认证为GRAS(Generally Recognized as Safe)菌株，由于其公认的安全性，其还被广泛应用于现代食品工业，如食品用酶制剂的生产。此外，米曲霉还被用作皮革鞣制，曲酸生产、饲料添加剂等领域。随着对米曲霉研究的手段逐渐成熟，米曲霉的应用范围也在逐步扩展。
对于米曲霉来说，异源蛋白往往指的是来源于非曲霉属的其他物种的蛋白质，在米曲霉中对异源蛋白进行表达，是一个新的研究方向与领域。异源蛋白往往是来源于哺乳动物细胞的治疗性蛋白，具有结构复杂的特点，还会有复杂的糖基化结构。米曲霉已被探索用来表达来源于包括其他真菌、植物、昆虫、哺乳动物等的蛋白质。在这些探索中，来源于其他丝状真菌的蛋白质往往能够被更好地表达并分泌出来，作为酶制剂生产平台，已经被用作生产来源于其他真菌的果胶酯酶、漆酶、木糖聚酶、葡糖氧化酶、脂肪酶等。而来源于其他物种的异源蛋白却面临着产量低、活性差等问题。目前针对米曲霉作为异源蛋白的表达平台所面临的障碍，研究人员正在从各个方面进行菌株的改造和优化，以期获得合适的底盘菌株。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用，旨在解决现有米曲霉异源蛋白表达较低的问题。
本发明的技术方案如下：
一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌的构建方法，其中，包括步骤：
通过生物信息学分析确定米曲霉中高表达蛋白酶基因AO090120000232，所述高表达蛋白酶基因AO090120000232的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
获取米曲霉样品中基因AO090120000232上游1522bp序列，根据上游1522bp序列设计第一引物，根据所述第一引物从所述米曲霉样品中扩增得到上游1522bp序列的克隆片段，所述上游1522bp序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，所述第一引物的核苷酸序列为SEQID NO.3-4；
获取米曲霉样品中基因AO090120000232下游1598bp序列，根据下游1598bp序列设计第二引物，根据所述第二引物从所述米曲霉样品中扩增得到下游1598bp序列的克隆片段，所述下游1598bp序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，所述第二引物的核苷酸序列为SEQID NO.6-7；
使用SpeⅠ和HindⅢ酶对原始载体pEX1进行酶切得到线性化pEX1载体，将所述下游1598bp序列的克隆片段与上游1522bp序列的克隆片段先后整合到线性化pEX1载体中，得到基因AO090120000232敲除载体；
将所述基因AO090120000232敲除载体整合到米曲霉中，构建得到异源蛋白高表达米曲霉工程菌。
一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌，其中，采用本发明所述异源蛋白高表达米曲霉工程菌的构建方法制得。
一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌的应用，其中，将本发明构建方法制得的异源蛋白高表达米曲霉工程菌用于生产异源蛋白。
有益效果：本发明利用生物信息学方法分析找到米曲霉中高表达的蛋白酶基因AO090120000232，利用同源重组技术敲除米曲霉中高表达的蛋白酶基因AO090120000232，构建的异源蛋白高表达米曲霉工程菌可提高异源蛋白表达水平。
附图说明
图1为为本发明一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌的构建方法流程图。
图2为本发明实施例1中扩增得到的上游1522bp序列的克隆片段和下游1598bp序列的克隆片段的电泳结果图。
图3为本发明实施例1中经过SpeⅠ和HindⅢ酶酶切的线性化pEX1载体的电泳结果图。
图4为本发明下游1598bp序列的克隆片段整合到线性化pEX1载体后的电泳验证结果图。
图5为上游1522bp序列的克隆片段整合到中间载体后的电泳验证结果图。
图6为本实施例1构建得到的异源蛋白高表达米曲霉工程菌的培养菌落图。
图7为采用验证引物232-F/232-R对构建的异源蛋白高表达米曲霉工程菌进行PCR扩增后电泳验证结果图。
具体实施方式
本发明提供一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，图1为本发明提供的一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌的构建方法流程图，如图所示，其包括步骤：
S10、通过生物信息学分析确定米曲霉中高表达蛋白酶基因AO090120000232，所述高表达蛋白酶基因AO090120000232的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
S20、获取米曲霉样品中基因AO090120000232上游1522bp序列，根据上游1522bp序列设计第一引物，根据所述第一引物从所述米曲霉样品中扩增得到上游1522bp序列的克隆片段，所述上游1522bp序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，所述第一引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3-4；
S30、获取米曲霉样品中基因AO090120000232下游1598bp序列，根据下游1598bp序列设计第二引物，根据所述第二引物从所述米曲霉样品中扩增得到下游1598bp序列的克隆片段，所述下游1598bp序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，所述第二引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6-7；
S40、使用SpeⅠ和HindⅢ酶对原始载体pEX1进行酶切得到线性化pEX1载体，将所述下游1598bp序列的克隆片段与上游1522bp序列的克隆片段先后整合到线性化pEX1载体中，得到基因AO090120000232敲除载体；
S50、将所述基因AO090120000232敲除载体整合到米曲霉中，构建得到异源蛋白高表达米曲霉工程菌。
具体来讲，米曲霉被预测有135个编码分泌型蛋白酶的基因，约占基因组大小的1％，这135个基因中包括构巢曲霉和烟曲霉中所有蛋白酶编码基因中除了一个编码氨基肽酶基因之外的所有同源基因。这些蛋白酶对异源蛋白的表达分泌是很不利的，不但会在胞内与异源蛋白竞争分泌途径，还会降解已经分泌到胞外的异源蛋白。基于此，本发明利用生物信息学方法分析找到米曲霉中高表达的蛋白酶基因AO090120000232，利用同源重组技术敲除米曲霉中高表达的蛋白酶基因AO090120000232，构建的异源蛋白高表达米曲霉工程菌可提高异源蛋白表达水平。
在一些实施方式中，还提供一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌，其采用本发明所述异源蛋白高表达米曲霉工程菌的构建方法制得。
在一些实施方式中，还提供一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌的应用，将本发明构建方法制得的异源蛋白高表达米曲霉工程菌用于生产异源蛋白。
下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
实施例1
异源蛋白高表达米曲霉工程菌的构建：
1、通过生物信息学分析确定米曲霉中高表达蛋白酶基因AO090120000232，所述高表达蛋白酶基因AO090120000232的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
2、获取米曲霉样品中基因AO090120000232上游1522bp序列，根据上游1522bp序列设计第一引物，根据所述第一引物从所述米曲霉样品中扩增得到上游1522bp序列的克隆片段，所述上游1522bp序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，所述第一引物的核苷酸序列为SEQID NO.3-4；
3、获取米曲霉样品中基因AO090120000232下游1598bp序列，根据下游1598bp序列设计第二引物，根据所述第二引物从所述米曲霉样品中扩增得到下游1598bp序列的克隆片段，所述下游1598bp序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，所述第二引物的核苷酸序列为SEQID NO.6-7；
4、使用SpeⅠ和HindⅢ酶对原始载体pEX1进行酶切得到线性化pEX1载体，将所述下游1598bp序列的克隆片段与上游1522bp序列的克隆片段先后整合到线性化pEX1载体中，得到基因AO090120000232敲除载体；
5、将所述基因AO090120000232敲除载体整合到米曲霉中，构建得到异源蛋白高表达米曲霉工程菌。
对实施例1中扩增得到的上游1522bp序列的克隆片段和下游1598bp序列的克隆片段进行电泳验证后回收，结果如图2所示，图2中，1、2为上游1522bp序列的克隆片段泳道；3、4为下游1598bp序列的克隆片段泳道。
将实施例1中经过SpeⅠ和HindⅢ酶酶切的线性化pEX1载体进行电泳验证后回收，结果如图3所示，图3中最上端的大片段为原始载体pEX1使用SpeⅠ和HindⅢ酶切得到的线性化载体。
将下游1598bp序列的克隆片段整合到线性化pEX1载体后进行电泳验证，结果如图4所示，从图4可以看出下游1598bp序列的克隆片段成功连接到线性化pEX1载体中，得到中间载体。
将上游1522bp序列的克隆片段整合到上述中间载体后进行电泳验证，结果如图5所示，从图5可以看出上游1522bp序列的克隆片段整合到上述中间载体后得到最终的敲除载体。
将本实施例1构建得到的异源蛋白高表达米曲霉工程菌进行培养，结果如图6所示，从图6可以看出所述异源蛋白高表达米曲霉工程菌菌落呈淡黄色，与原始菌株表型基本一致。
从SEQ ID NO.2中选取一段序列设计得到232-F引物序列为：TTTACGACCTTCCCATCTCC，记为SEQ ID NO.8；从SEQ ID NO.5中选取一段序列设计得到232-R引物序列为：AGTACATCAATGATGCTTCC，记为记为SEQ ID NO.9。采用验证引物232-F/232-R对构建的异源蛋白高表达米曲霉工程菌进行PCR扩增及电泳验证，结果如图7所示，其中，1、2、3泳道为转化子煮DNA验证，4为米曲霉原始菌株基因组DNA验证，阳性转化子扩增片段大小应为750bp，原始菌株扩增片段大小应为2505bp。从图7中可以看出成功获得了两株敲除掉基因AO090120000232的阳性转化子。
实施例2
本发明通过在GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、NR等数据库中进行比对，对基因AO090120000232所编码蛋白质功能进行预测，预测其具有丝氨酸羧肽酶活性。具体来讲，通过对4株不同蛋白酶活力的菌株进行转录组测序，找到其中可能影响蛋白酶活力的差异表达基因，通过blast比对数据库对所有差异表达基因进行注释，发现基因AO090120000232在米曲霉参考基因组中注释为未命名蛋白，在COG数据库中被注释为与氨基酸转运与代谢相关，GO数据库中注释为具有丝氨酸羧肽酶的分子功能，KEGG数据库中K01288carboxypeptidase D[EC:3.4.16.6]，KOG数据库中注释为Posttranslationalmodification,protein turnover,chaperones；；Amino acid transport andmetabolism，pfam数据库中注释为丝氨酸羧肽酶，Swiss-Prot注释为丝氨酸羧肽酶，eggNOG注释为Posttranslational modification,protein turnover,chaperones，同时在转录组数据中，该基因在低蛋白酶活菌株，中蛋白酶活菌株及高蛋白酶活菌株1，高蛋白酶活菌株2中的表达量分别为42.2134、116.655、254.3833、288.306(以上表达量数据为FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)作为衡量基因表达水平的指标)。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳技术大学
<120> 一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用
<160> 9
<210> 1
<211> 1775
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 1
atgcgctttc aaggcgttgt gccgacggct ttattggcca tctcatgcac cgacaaggcg 60
tgtgcttcca agcatggacg ctctgatcag ccagtgcacg aaccctcggt cctagacagg 120
agaacatcat tgtcttcgga ggagcgtcag ctccgctcac acgataactt tcgatttctc 180
aatgacgaga cgaggcgtat gtattcatac ttcctggtgg atgaatgctg atgtaggcat 240
atggatcaat agcctacctc gtggagagct tgcctgatgt gccattcgac gtcggtgaat 300
tgtactcggg atcagtgcca atcgaaaagg gtaacagctc gagaactctc ttctttgtgt 360
tccagccgac agtgggggag cctgtggacg aaattacaat cgaggttaat gggggcccgg 420
gtgctagctc cctcgaaggg ttcctccaag aaaccggcag atttgtttgg ccaccaggaa 480
cctatgcgcc agtcattaat ccgtattcct gggtaaatct gactaacatg ttgtggtacg 540
tttcgattgt ctcctttggg attccttctt taatcttcac tatagggttg atcagcccgt 600
tgggacgggg ttttctacag gcacacctac tgctaccact gaagaggaga cgtccaggga 660
ctttattaat ttctttaaga actttcaaga catctttgga atcaagaaat tcaagattta 720
cgtgaccggt cagagctatg ctgggcgtta tgtgccgtac attgctgcgg caatgctgga 780
tcaaaatgac aaggactatt atgacgtcca tggtaggctc tttctcttgc aacgaggaag 840
taggccccac aaacattcat atgctgatgc ttttcaatgt aggggcactg gtttacgacc 900
cagtcattgg ccaatttgac tatgtgggac aacaagtggc tgctgtgcca actgtgcagg 960
agaacgctaa catcttcaac tttaatgcaa gctttatgaa tcaactacaa agtcttcaca 1020
aatcgtgtgg ttatcaggac tttatagacg aatatcttac tttccctcca tcgggggtcc 1080
agcctccgaa gtcttttgac cctaccagcg acgctgattg taatatctat aacatgatca 1140
cggatgcagc ttatcgagtc aacccttgct acaacgtgta cgccatcaac cagatgtgtc 1200
cctttctgtg ggatgttctt ggagggccca cgaaactgca ctacctaccc gccggagcca 1260
cggtgtattt cgatcgcgat gatgtcaaga aagctatgca cgcacccaat atgacctggt 1320
ccctgtcctc gctccagcct gtcttcgttg gtggcgacgc cggagttggg agactgggtg 1380
atttgtccgc caacccaatc gaacgtgttc taccccaagt gattgaagcc acaaaccgag 1440
ttctcatcag tcacggagat tacgatttta ttctccagac caatggaacc cttttggcta 1500
tccagaacat gacttggaac ggacaactag gattccagtc tcagccgagc accccgattg 1560
agattggtct gccggacctc cagtatgcgg aggtgtttga agagaacgat ctcttctcat 1620
ggcgcagcgg ccagggagta atgggcatac aacactatga gagaggaatg atgtgggcgg 1680
agacattcca gagcggccac atgcagcctc agtaccagcc ccgagtcgcc taccgtcaca 1740
tccagtggct actcgggcgg attgaagaat tgtag 1775
<210> 2
<211> 1522
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 2
ctccagcagt ttggagtttg ccagcagaaa aagcaagtct agcgacgcaa acatgctggt 60
agtacgtcat gaccctgggc ttatggctga gccacaggtc aaggttgcct gtcaggttgc 120
attggacgcc tggagatctc ttggctgccg cgatgctgga cgtgttgaca ttcgattcag 180
ctccgatgag cacgatgctg tccctaacgt tctagaggta agcctgccaa ggtcgatctc 240
gccttaagga agaacgattt tatctaatgt catatagctg aatcctattt ccggcctcct 300
tcccggccat tctccattgc cgagcagtgc cgaagaaaat gggcttccat ataaaaggct 360
gttggcagca attatccaaa gtgctctcac cagaaagtct gcttgctatt attagctagg 420
aatttatagc tatatgctgc acactcactt tgctttgata tgcctatcgt gatgcatctt 480
atgagtctta atatgattat tttctagatc ttgaacccga aaccgaccgg ttaacaactc 540
tactgtcaat ctcattgaga tttactagat attgtacgca gctatccagg tgggtataat 600
gacgtataat ataatagcga gaatgaacgg atttatgtag ggatcatagt taaagatgag 660
aggaagtttc aatatccctt ctatctttct tattgaaatg ttccttgggg ttaattctct 720
ttggactgat tgactgataa ggtttcaacg gcgttacatt cggttgggca gggaatgatt 780
tgattgacgg atcgaataga aaagcgacga taagatttgg agggctgact cgtagtgtcg 840
tgatcaagac acatgagaag cccgtctggg tcaatccacc atatccattg gtttgttgga 900
acacatgttc atgaactccg agggtaacca aagagtgatt tcatcaccct atatcatcac 960
gagacccctc gggacccagt gacttttgcc catggggtgc aaacagagca aagcaaatcg 1020
atgggatctg gaactgaagt ttaaaaacta caccgcaaat gaacagcagc ctggtcgatg 1080
ccaggaacat ccctgtccct tgctactcaa tcaaaatgtg gcagacgcta gatccataaa 1140
ctgtccaatt attatggtaa tcggacatgt tcagtcacgc aagggatggg tactaaagct 1200
tttccgaccg ttgtcattta cgaccttccc atctccagac gcagcagcca ccctcattat 1260
tgggtttctt tcacgcgatg actggcccgg ggatcttatc agtcccctgt caaaaatgtc 1320
attgtttcac tagccctttc tttaaagaca tcttcggcct ccacaatgcc cctaaaatgg 1380
taccctacag atcttagcat gcatcctctt acccctaccg gataatacat aaaataatcc 1440
agtcttcccc aaaaaatctg caaaaagact tcgtctgtct ctcacgtcca tcgcagccag 1500
atcgcccaaa tccaactcag aa 1522
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 3
tcagagccta gccaactagt ctccagcagt ttggagtttg 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 4
tggtcctaac tcacactagt tctgagttgg atttgggcga 40
<210> 5
<211> 1598
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 5
gtgagttagg accatgaagt tggaagatga tgatatgcta catatacctg tatactgttc 60
tgatactact gatactacac tacctgttat gtcatatctc gagataagga gacaagagct 120
ttgaccgacg ggaatacatt tcctaatcaa gcatattctt agaagcatcc gctaattggc 180
atacaatgat cctgatatca ttttttaacc cgtcaaggta aaaaccttca cgcagcctcc 240
agatctttgg gactttgatt tgacttccag atatacttcc catcaccttt tccgccaaca 300
gcctaagatc tccgttgtaa cgagcaggag tagaacagcg cagccacgga atgataggga 360
aagctgtcta ttccgacagt acctttgagt ttgtaaaaga agactggaag catcattgat 420
gtactcctca taggttcata cttgtaacgt acaaatatac atacatgtat aaacatgtac 480
ggatcccgtg gtggagacac aatacatgta ctgtacttgg ttctaccttg ccctatacag 540
cgcatgatag cgaagtccca gccttgcatg atgctcaatt agttaataat tgtatccagt 600
tctccgtcac agtgtaccag acaatgccac ggtcgggaca cacgaagtat gcttagaggg 660
cacatcgatc ggatccatgt atgtaccatc tgtatgtacc atcacgatcc aacgatcacg 720
atatctcgtg accagagatt ccccgggtcc atcaggcctc ctcattccga ggaaaactgg 780
agaccagggc ccttctccag agtccggaac tagggagtaa ccgaaatcat acccaccgat 840
aaagtcctct tttgacaacc tccatgtacg agtctcaagt tggcatagtt agactttggg 900
agtggagtta tacccgatat atgcactcca gtcgccgttg actgcgtccc tctgtccggt 960
cgcactttgg agggtacgat gcccacatga gtccccatcg caatttggag taccaatgaa 1020
tctctccagt ttcatggcag tattcgtaag tgatgttcct gataatttta tcagaccacg 1080
ttatttgtta ttgaatgtca atcgtatcat cgaggattac cccgtatcgt agaattagag 1140
tacgtaggaa taaacaattt tttctcctca tcttctcacc ttattttcgt tccccctcct 1200
ttccccttcg tcgtttctcg atctctcccc gcattcttgc ggatcttgtg acgccacgtg 1260
cgtatttgac tcttttatcg tccgtgaagg tcgtatggcg tggtgaaaca actctttggg 1320
ggatccaaat gtttggttgt cggattggga aaaggtggtt tgcacttgac cattcccgag 1380
gacgtggggc gggatttact ccgagtacag accaatttac taagaccatg taacgctatt 1440
ccgcaatgaa tctctgctcg tatatgagca acggaggtta tgtaaatggc ataattgtac 1500
tgcctaaaaa tagcgaggaa aaaaaaaaaa aagaggatac ttcgtgtcat ctatcatatt 1560
atcaaatctt ttttcccatc cttctttcac gatatcgg 1598
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 6
tcagagccta gccaactagt gtgagttagg accatgaagt 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 7
cgacggccag tgccaagctt ccgatatcgt gaaagaagga 40
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 8
tttacgacct tcccatctcc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 9
agtacatcaa tgatgcttcc 20

Claims (3)

1.一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括步骤：
通过生物信息学分析确定米曲霉中高表达蛋白酶基因AO090120000232，所述高表达蛋白酶基因AO090120000232的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
获取米曲霉样品中基因AO090120000232上游1522bp序列，根据上游1522bp序列设计第一引物，根据所述第一引物从所述米曲霉样品中扩增得到上游1522bp序列的克隆片段，所述上游1522bp序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，所述第一引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.3-4；
获取米曲霉样品中基因AO090120000232下游1598bp序列，根据下游1598bp序列设计第二引物，根据所述第二引物从所述米曲霉样品中扩增得到下游1598bp序列的克隆片段，所述下游1598bp序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，所述第二引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.6-7；
使用SpeⅠ和HindⅢ酶对原始载体pEX1进行酶切得到线性化pEX1载体，将所述下游1598bp序列的克隆片段与上游1522bp序列的克隆片段先后整合到线性化pEX1载体中，得到基因AO090120000232敲除载体；
将所述基因AO090120000232敲除载体整合到米曲霉中，构建得到异源蛋白高表达米曲霉工程菌。
2.一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌，其特征在于，采用权利要求1所述异源蛋白高表达米曲霉工程菌的构建方法制得。
3.一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌的应用，其特征在于，将权利要求1构建方法制得的异源蛋白高表达米曲霉工程菌用于生产异源蛋白。
CN202210762405.3A 2022-06-30 2022-06-30 一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用 Pending CN115094080A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210762405.3A CN115094080A (zh) 2022-06-30 2022-06-30 一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210762405.3A CN115094080A (zh) 2022-06-30 2022-06-30 一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115094080A true CN115094080A (zh) 2022-09-23

Family

ID=83293907

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210762405.3A Pending CN115094080A (zh) 2022-06-30 2022-06-30 一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115094080A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110747221A (zh) * 2019-12-02 2020-02-04 齐鲁工业大学 一种宿主米曲霉敲除系统及其构建方法与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110747221A (zh) * 2019-12-02 2020-02-04 齐鲁工业大学 一种宿主米曲霉敲除系统及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "GenBank:AP007166.1", 《GENBANK》 *
GUSTAVO ADOLFO SAAVEDRA PINTO ET AL.: "Production of proteolytic extract by Aspergillus oryzae grown by solid state fermentation using canola meal as substrate", 《BMC PROC》 *
吴琛等: "米曲霉奶酪发酵剂培养条件优化", 《沈阳农业大学学报》 *
张建军等: "提高蛋白质在米曲霉中表达量的策略", 《中国生物工程杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Porro et al. Recombinant protein production in yeasts
KR101952469B1 (ko) 변경된 점성 표현형을 갖는 사상균
JP7430189B2 (ja) 外来遺伝子を発現させるためのピキア・パストリス変異株
CA2617832A1 (en) Yeast host, transformant and method for producing heterologous proteins
CN107574159A (zh) 一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体
CN109790510A (zh) 在不存在诱导底物下丝状真菌细胞中的蛋白产生
EP3453763B1 (en) Construction of genetically modified yeast pichia pastoris for high expression of recombinant human serum albumin
CN105358706A (zh) 用于蛋白质表达的酵母启动子
EP4092128A1 (en) Factor regulating protein expression efficiency of trichoderma reesei, and regulation method and use thereof
JP2021521821A (ja) 粘性が低下した表現型を含む糸状菌株
CN105492604A (zh) 受调节的pepc表达
WO2012128260A1 (ja) シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体、該形質転換体の製造方法、β－グルコシダーゼの製造方法、およびセルロースの分解方法
EP2684948A1 (en) Method for producing heterologous protein using yeast having knocked out vps gene
Madzak et al. Yarrowia lipolytica
JP2023523925A (ja) 糸状菌細胞におけるタンパク質産生の増強のための組成物及び方法
CN116286421B (zh) 一种用于生产麦角硫因的毕赤酵母菌株及其构建方法和应用
CN115725632B (zh) 一种Aomsn2过表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用
EP2062967A1 (en) Genetically engineered aspergillus
JP4526638B2 (ja) タンパク質の高発現システム
CN115094080A (zh) 一种异源蛋白高表达米曲霉工程菌及其构建方法与应用
CN114058606B (zh) 缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌在异源蛋白生产中的应用
CN111849790B (zh) 重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用
JP5105691B2 (ja) アスペルギルス属糸状菌由来の環状ヌクレオチド、アスペルギルス属糸状菌セルフクローニング株の製造方法及びセルフクローニング株
CN108949579B (zh) 嗜热子囊菌基因表达系统
CN115820746B (zh) 激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220923