CN109706133A

CN109706133A - 一组新型酯酶及其应用

Info

Publication number: CN109706133A
Application number: CN201711009481.2A
Authority: CN
Inventors: 杨广宇; 马富强; 冯雁; 栗林胜男; 钟孟庭
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2017-10-25
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2037-10-25
Also published as: CN109706133B

Abstract

本发明涉及一组新型酯酶及其应用，具体地，涉及一组对布洛芬类药物具有立体选择性嗜热酯酶及其应用。本发明利用布洛芬的酯化衍生物作为筛选底物，利用微流控双色荧光筛选体系对嗜热酯酶进行多轮定向进化改造，获得了一组立体选择性显著提升的酯酶。本发明还涉及了所述酯酶在制备以布洛芬为代表的芳基丙酸类分子衍生物中的应用。

Description

一组新型酯酶及其应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体地，本发明涉及一组新型酯酶及其应用，更具体地，涉及一组具有立体选择性的新型酯酶及其在制备非甾体类抗炎药中的应用。

背景技术

嗜热酯酶AFEST(Archaeoglobus fulgidus esterase，AFEST)由Giuseppe Manco等人于2000年从来自意大利温泉的嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus中克隆出来，该酶具有良好的热稳定性，其最适催化温度为85℃，该酶具有较为广泛的底物谱，最适底物为C4-C6的短链脂肪酸酯。

作为酯酶，AFEST具有一系列工业应用潜力，在食品、精细化工、洗涤剂、医药、油脂、能源等工业领域有着潜在的应用。

布洛芬药物是一类常见的非甾体抗炎药，具有非常广阔的市场，年产量高达两万吨。布洛芬类药物是2-芳基丙酸的衍生物，为手性分子，异丙基布洛芬是最常规的布洛芬药物之一，其中的主要药效来自于其S型对映体，而R型对映体药效作用较低，且具有胃肠道刺激性等副作用。目前市场上的异丙基布洛芬多数以外消旋体的形式出售，但随着人们对药物安全性要求的提高，尤其在儿童用药方面，越来越倾向于去除药物中的R型成分，仅保留S型的药效成分。这便要求对布洛芬进行对映体拆分，而酶法拆分具有高效、环境友好等特点。酶法拆分的一种重要方法就是先将外消旋体酯化后，利用酶的立体选择性，选择性水解一种对映体。

综上，亟需找到一种水解酯酶筛选的方法，以获取催化活性高和立体选择性好的酯酶突变体，进而应用于布洛芬类药物的手性拆分中，得到单一构型的S或R型产物。

发明内容

本发明的目的在于提供一组新型酯酶及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种酯酶，其特征在于，所述酯酶与SEQ ID No:2具有不低于80％的氨基酸序列一致性，且包含以下至少一个或多个位置的突变，所述的突变位点包括SEQ ID No:2的第8、11、13、37、41、49、81、87、88、89、90、203、206、209、211、216、257、284或302位中的至少一个或者其相应的位置。

优选地，所述的氨基酸序列一致性不低于90％，更优选地，不低于95％。

所述的突变为在所述的突变位点上发生取代、插入或删除一个或多个氨基酸残基。

所述的酯酶对以2-芳基丙酸类分子具有立体选择性；所述的2-芳基丙酸类分子为以2-芳基丙酸为母核的化合物，包括但不限于，异丙基布洛芬、酮洛酚、氟比洛芬、苯氧洛酚、萘普生等布洛芬类化合物；

所述的2-芳基丙酸类分子还可以包括其他非布洛芬类的2-芳基丙酸类化合物。

优选地，所述的突变为取代突变，至少包含以下一个或多个氨基酸残基的取代：

第8位脯氨酸被亮氨酸取代；

第11位酪氨酸被天冬酰胺取代；

第13位亮氨酸被组氨酸取代；

第37位天冬酰胺被丝氨酸取代；

第41位谷氨酸被赖氨酸取代；

第49位谷氨酰胺被亮氨酸取代；

第81位缬氨酸被丙氨酸取代；

第87位甘氨酸被丝氨酸取代；

第88位甘氨酸被精氨酸取代；

第88位甘氨酸被丝氨酸取代；

第89位甘氨酸被半胱氨酸取代；

第89位甘氨酸被丝氨酸取代；

第89位甘氨酸被脯氨酸取代；

第89位甘氨酸被酪氨酸取代；

第90位苯丙氨酸被色氨酸取代；

第90位苯丙氨酸被酪氨酸取代；

第90位苯丙氨酸被亮氨酸取代；

第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代；

第203位苯丙氨酸被甘氨酸取代；

第206位甘氨酸被谷氨酸取代；

第209位异亮氨酸被缬氨酸取代；

第211位天冬氨酸被甘氨酸取代；

第216位丝氨酸被甘氨酸取代；

第257位亮氨酸被脯氨酸取代；

第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

第302位天冬酰胺被丝氨酸取代。

更优选地，所述的突变为以上突变的组合，选自：

(1)第37位天冬酰胺被丝氨酸取代+第203位苯丙氨酸被甘氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代；

(2)第8位脯氨酸被亮氨酸取代+第11位酪氨酸被天冬酰胺取代+第41位谷氨酸被赖氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第302位天冬酰胺被丝氨酸取代；

(3)第8位脯氨酸被亮氨酸取代+第11位酪氨酸被天冬酰胺取代+第41位谷氨酸被赖氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代；

(4)第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代；

(5)第8位脯氨酸被亮氨酸取代+第11位酪氨酸被天冬酰胺取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第216位丝氨酸被甘氨酸取代；

(6)第8位脯氨酸被亮氨酸取代+第11位酪氨酸被天冬酰胺取代+第37位天冬酰胺被丝氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第216位丝氨酸被甘氨酸取代+第302位天冬酰胺被丝氨酸取代；

(7)第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代；

(8)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代；

(9)第203位苯丙氨酸被甘氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代；

(10)第49位谷氨酰胺被亮氨酸取代+第81位缬氨酸被丙氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代；

(11)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第203位苯丙氨酸被甘氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代+第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

(12)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第90位苯丙氨酸被色氨酸取代+第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代+第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

(13)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第88位甘氨酸被丝氨酸取代+第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代+第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

(14)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第89位甘氨酸被半胱氨酸取代+第90位苯丙氨酸被色氨酸取代+第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代+第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

(15)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第89位甘氨酸被丝氨酸取代+第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代+第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

(16)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第89位甘氨酸被脯氨酸取代+第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代+第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

(17)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第89位甘氨酸被酪氨酸取代+第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代+第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

(18)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第89位甘氨酸被丝氨酸取代+第90位苯丙氨酸被色氨酸取代+第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代+第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

(19)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第88位甘氨酸被精氨酸取代+第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代+第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

(20)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第87位甘氨酸被丝氨酸取代+第88位甘氨酸被精氨酸取代+第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代+第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

(21)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第87位甘氨酸被丝氨酸取代+第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代+第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

(22)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第89位甘氨酸被酪氨酸取代+第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代+第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

(23)第13位亮氨酸被组氨酸取代+第89位甘氨酸被脯氨酸取代+第90位苯丙氨酸被亮氨酸取代+第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代+第206位甘氨酸被谷氨酸取代+第209位异亮氨酸被缬氨酸取代+第211位天冬氨酸被甘氨酸取代+第257位亮氨酸被脯氨酸取代+第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代。

在一优选实施例中，所述的突变为以上突变间的重新组合。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述酯酶。

在一优选实施例中，可以在所述多核苷酸的末端增加上编码组氨酸标签的多核苷酸，便于下一步的纯化与分析。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述的表达载体包括所述的多核苷酸。

在一优选实施例中，所述的表达载体选用pUC18；

在另一优选实施例中，所述的表达载体选用pET28a。

在本发明的另一方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞包括所述的表达载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一优选实施例中，所述的基因工程化的细胞可以为革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，放线菌如链霉菌，酵母如酿酒酵母，真菌如曲霉菌等其它宿主微生物；

在一优选实施例中，所述的基因工程化细胞选用大肠杆菌。

在本发明的另一方面，提供了一种产生本发明所述酯酶的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明所述的基因工程化的细胞，从而表达出酯酶；和

分离所述酯酶。

在本发明的另一方面，提供一种手性分子的拆分方法，所述方法为在生物酶法催化系统中，使用了本发明的所述酯酶作用于消旋体底物。

在一优选实施例中，所述的生物酶法催化体系为体外酶法；

在一优选实施中，所述的生物酶法催化体系为全细胞催化；

所述的生物酶法催化体系还包括固定化酶催化、纯化后的酶催化以及含有人工代谢途径的细胞工厂等。

在另一优选例中，所述的消旋体底物为2-芳基丙酸类分子的酯类衍生物。

在另一优选例中，所述的2-芳基丙酸类分子为以2-芳基丙酸为母核的化合物，包括但不限于，异丙基布洛芬、酮洛酚、苯氧洛酚、萘普生等布洛芬类化合物；

在另一优选例中，所述的2-芳基丙酸类分子还可以包括其他非布洛芬类的2-芳基丙酸类化合物(如对甲基异苯丙酸、2-乙基苯乙酸酯、异苯丙酸)。

在另一优选例中，所述的酯类衍生物为所述芳基丙酸类分子与含羟基的化合物形成的酯化产物；

优选地，含羟基化合物分别为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、对硝基苯酚等。

在本发明的另一方面，提供一种在制备非甾体类抗炎药中的应用，使用所述酯酶，作用于2-芳基丙酸类分子酯类衍生物，获得了单一构型的手性产物。

优选地，所述的单一构型手性产物为S型或R型布洛芬类化合物，包括但不限于，异丙基布洛芬、酮洛酚、氟比洛芬、苯氧洛酚、萘普生等等。

在另一优选例中，2-芳基丙酸类分子酯类衍生物还可以为其他非布洛芬类的2-芳基丙酸分子。

在一优选实施例中，芳基丙酸类分子的酯类衍生物为布洛芬酯。

在一优选实施例中，可得到单一构型的(S)或(R)型异丙基布洛芬。

在本发明的另一方面，提供了一种本发明所述的酯酶或本发明所述的基因工程细胞的用途，用于制备非甾体类抗炎药。

在一优选实施方式中，所述酯酶用于催化2-芳基丙酸分子的酯类衍生物，从而获得非甾体类抗炎药。

在另一优选例中，所述非甾体类抗炎药为单一构型的手性产物。

在另一优选例中，所述非甾体类抗炎药为S型或R型布洛芬类化合物。

在另一优选例中，所述非甾体类抗炎药选自下组：异丙基布洛芬、酮洛酚、氟比洛芬、苯氧洛酚、萘普生、或其组合。

在另一优选例中，2-芳基丙酸类分子酯类衍生物还可以为其他非布洛芬类的2-芳基丙酸分子(如对甲基异苯丙酸、2-乙基苯乙酸酯、异苯丙酸)。

在另一优选例中，所述芳基丙酸类分子的酯类衍生物为布洛芬酯。

在另一优选例中，可得到单一构型的(S)或(R)型异丙基布洛芬。

在本发明的另一方面，提供一种制备非甾体类抗炎药的方法，包括步骤：

(i)将本发明所述的酯酶与反应底物接触，进行催化反应，从而获得所述的非甾体类抗炎药；

(ii)任选的，分离并纯化所述非甾体类抗炎药。

在另一优选例中，所述反应底物为2-芳基丙酸类分子酯类衍生物。

在本发明另一方面，提供了一种酶制剂，所述酶制剂包含本发明所述的酯酶。

在另一优选例中，所述的酶制剂包括注射剂、和/或冻干制剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1基于荧光素和羧基香豆素的两种S型异丙基布洛芬酯底物的合成步骤。

图2双色微液滴检测分选体系工作原理示意图。A，用于双色FADS实验的检测/分选芯片示意图：a，微液滴重注射；b，分隔油相；c，激发光纤；d，检测光纤；e，微电极；f，废液通道；g，分选通道。B，光学组件，包括1，激光反光镜；2，425nm长通分光镜；3，中性滤光片；4，5，光纤耦合器；6，505nm长通分光镜；7，带通滤光片CW440nm,FWHM40nm；8，带通滤光片CW525nm,FWHM45nm；9，0.22NA光纤。C，控制模块工作流程图，由PMT产生的电信号同时被传送到DAQ卡和微控制器，可同时实现数据记录和信号反馈。

图3AFEST对两种布洛芬荧光底物的反应式以及产生荧光产物的荧光性质。

图4双色FADS体系对AFEST进行定向进化流程示意图。

具体实施方式

本发明人经过研究筛选，意外的获得了一组新型的酯酶，其具备显著提高的立体选择性。本发明的水解酯酶特别适用于芳基丙酸类分子的酯类衍生物的选择性水解过程，尤其是该酯酶在制备布洛芬类非甾体类抗炎药中的应用。

本发明人利用基于微流控双色荧光筛选体系(FADS)技术，针对嗜热酯酶(AFEST)突变库进行多轮定向进化改造，并通过测序分析及性质测定，筛选出一系列立体选择性显著提高的突变酶。

本发明的酯酶突变酶可以是重组蛋白、合成蛋白。其可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明的突变酶的序列与SEQ ID NO:2具有至少80％的氨基酸序列一致性，且包含以下至少一个或多个位置的突变，所述的突变位点包括SEQ ID No:2的第8、11、13、37、41、49、81、87、88、89、90、203、206、209、211、216、257、284或302位中的至少一个或者其相应的位置。

本发明还包括突变酶的衍生物和类似物。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的突变酶相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，水解酯酶突变酶可以指与上述突变酶相同功能的的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-3个、1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(例如为300个以内，较佳地200个以内，更佳地100个以内，更佳地50个以内，例如40、30、20、10、5、3、2、1)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括突变酶的活性片段和活性衍生物。

本发明中，也包括为了增加突变酶的稳定性、半衰期、促进功效而对一个或几个氨基酸加以修饰后构成的修饰形式的多肽(通常不改变一级结构)，包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了抗水解性能或优化了溶解性能的突变酶。

本发明还提供了编码本发明水解酯酶的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。也即，“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或水解酯酶的编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

α/β水解酶：水解酶的一个家族，典型的α/β水解酶折叠为一个八链的平行的α/β结构。该结构包含一条反平行于其他链的β2链。第一个和最后一个螺旋αA和αF位于折叠片的一面,其他的螺旋位于另一面。α/β折叠结构能够为多种酶的活性位点提供一个稳定的支撑结构。该家族包括乙酰胆碱酯酶,内酯水解酶,脂肪酶/酯酶,硫酯酶,丝氨酸羧肽酶,脯氨酸氨肽酶,脯氨酸寡肽酶等诸多种类。

催化三联体：指在水解酶和转移酶的活性位点中心同时作用的三个氨基酸残基(如蛋白酶、酰胺酶、酯酶、酰基转移酶、脂肪酶和β-内酰胺酶)。用于共价催化的亲核残基一般是酸-碱-亲核三联体。残基会形成一个电荷中继网络，以极化和活化亲核试剂，来攻击底物形成共价中间体，然后中间体水解，再生出游离的酶。亲核试剂大多是丝氨酸或半胱氨酸，也有少量是苏氨酸。

消旋体：由等量对映体构成的光学不活性的物质，包括(分子)内消旋体和(分子)外消旋体。

对映体：两个互为镜像而不能重合的立体异构体，称为对映异构体。

手性分子：是化学中结构上镜像对称而又不能完全重合的分子。

生物酶法催化体系为一类利用生物酶为催化剂，实现氧化、合成、水解等功能，制备或生产相应大分子或小分子化合物的过程，现有主要的生物酶法反应系统包括，体外酶法、全细胞催化、固定化酶催化、纯化后的酶催化以及含有人工代谢途径的细胞工厂等。其中，全细胞催化指的是利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行生物转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化。细胞工厂是指在细胞内表达人工构建的代谢途径基因，从而通过一系列催化反应生产目标代谢产物。

酶的立体选择性是指酶在催化过程中，优先识别其中一个立体异构体(或一对对映体底物或优先生成其中一个立体异构体(或一对对映体)的性质。

布洛芬类化合物为具有2-芳基丙酸结构且具有解热镇痛功效的一类分子。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所述的生物材料的来源的一般性说明：

1、引物合成：本发明中所使用的引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成制备。部分引物采用简并碱基，相关的简并碱基包括：

n为a，c，g或t；k为g或t；m为a或c。

2、实验中所使用T4DNA连接酶等购自于NewEngland Biolabs公司；PrimeSTAR HS高保真酶购自TakaRa公司；Phanta Max高保真酶购自Vazyme公司；限制性内切酶均购自于Fermentas公司；使用的DNA胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均购自于Axygen公司。

3、本发明所改造的酯酶来源于Archaeoglobus fulgidus的嗜热酯酶AFEST(根据NCBI检索序列自行合成编码DNA)。

实施例1微流控双色荧光筛选体系

1，针对布洛芬的两种荧光底物的设计：

底物1的合成：将荧光素(图1-A化合物3，fluorescein，Sigma-Aldrich)(332mg,1.0mmol)溶于20mL DMF中，冷却到0℃，缓慢加入EDC(372mg,2.4mmol)及DMAP(12.2mg,0.1mmol)，再加入(S)-ibuprofen(图1-A化合物4，异丙基布洛芬S型，495mg,2.4mmol)。混合物置于室温搅拌5h，TLC实验(EtOAc:PE＝1:1)显示反应完全。用DCM萃取反应物并干燥浓缩，获得粗品经硅胶柱层析纯化(EtOAc:PE＝1:4to 1:1)后获得黄色固体物质，即为fluorescein-(S)-ibuprofen(图1-A化合物1，荧光素异丙基布洛芬S型，380mg，产率53.4％)。¹H-NMR(CDCl3,400MHz):δ0.92-0.94(d,J＝6.72Hz,12H),1.59-1.63(m,7H),1.86-1.91(m,2H),2.48-2.50(m,4H),3.93-3.98(m,2H),6.77-7.01(m,4H),7.15(m,2H),7.17(m,5H),7.28-7.31(m,5H),7.66(m,2H),and 8.03(d,J＝7.79Hz,1H).ESI显示分子量为709.4[M+1]⁺.

fluorescein-(R)-ibuprofen的合成方法如上，仅用(R)-ibuprofen取代(S)-ibuprofen即可得到fluorescein-(R)-ibuprofen(荧光素异丙基布洛芬R型)。

底物2的合成：根据Singh等人报道的方法合成7-羟基香豆素-3-羧酸(7-Hydroxycoumarin-3-carboxylic acid)(图1-化合物5，HCCA，羧基香豆素)。将HCCA(700mg,3.4mmol)and DBU(568mg,3.74mmol)溶于20mL DMF，在室温下缓慢加入(bromomethyl)benzene(635mg,3.74mmol)，继续在室温下搅拌14h，TLC检测(EtOAc:PE＝1:1)显示反应完全。反应体系加入100mL去离子水并过滤获得黄色固体苄基-7-羟基-2-oxo-2H-苯并吡喃(Benzyl 7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate)(图1-化合物6)(720mg,产率72％)；将化合物6(720mg,2.43mmol)溶于15mL CCl4和15mL THF的混合溶剂，在0℃下缓慢加入TEA(358mg,3.55mmol)，然后加入(S)-ibuprofen(图1-化合物4)(618mg,3mmol)。混合物置于室温搅拌3h，TLC检测(EtOAc:PE＝1:1)表明反应完全。在反应体系中加入去离子水终止反应，用二氯甲烷萃取反应产物，经干燥浓缩后，获得的粗品经硅胶柱层析纯化(EtOAc:PE＝1:3to 1:1)后，获得淡黄色油状物，即为化合物7(820mg，产率69.7％)；将化合物7(484mg,1mmol)溶于20mL EtOAc中，加入Pd/C(85mg,15％)混合物在H₂气氛中(50Psi)搅拌1h，TLC测试(EtOAc:PE＝1:1)表明反应完全。将反应体系中的固体滤去，蒸干溶剂，所得粗品在EtOAc:PE＝1:5的混合溶剂中重结晶后获得浅黄色固体，即为化合物2，7-羟基香豆素-3-羧酸-S型异丙基布洛芬酯(HCCA-(S)-ibuprofen)(208mg，产率52.8％)(图1-B-2)¹H-NMR(CDCl3,400MHz)results wereδ:0.94(d,J＝6.72Hz,6H),1.65(d,J＝7.15Hz 3H),1.86-1.93(m,1H),2.51(d,J＝7.28Hz,2H),3.98-4.03(q,J＝7.15Hz1H),7.16-7.31(m,6H),7.74(d,J＝8.49Hz,1H),and 8.92(s,1H).ESI质谱测定其分子量为395.2[M+1]⁺。

2，微流控检测系统

微液滴检测与分选体系包括三个模块：流体模块、光学模块以及控制模块。检测/分选芯片置于倒置显微镜(TS-100,Nikon)的载物台上进行工作，采用高速摄像仪(phantomMiro eX4)观察微液滴运动。用两台波长分别为405nm和475nm的激光器(Thorlabs)分别来激发HCCA和荧光素，激光通过光纤(F-MCB-T-1FC,Newport corp.)倒入检测/分选芯片，再通过另一根光纤传输到PMT中进行光电倍增转换(Hamamatsu H9306-03)，发射光在进入PMT前，通过相应的带通滤光片滤去杂光。采用LP425nm及LP505nm两种分光镜分别合并激发光和区分发射光。通过信息采集卡(DAQ card，PCI-6111,NationalInstrument)记录由PMT发出的电压信号。用稳定气压泵(MPR1-1,Dwyer)驱动微液滴从1.5mL离心管中重注射进入检测/分选芯片，通过注射泵(KDS-200,KD scientific)驱动10mL注射器(BD)将分隔油相(纯Novec7500)注入芯片。控制模块包括一块微控制器(Uno32,Chipkit)和一个自制的信号处理回路，能够根据微液滴荧光强度产生TTL信号(2V直流脉冲信号)，TTL信号能够进一步触发脉冲信号源(33220A,Agilent)产生方波脉冲电压，该脉冲电压经电压放大器(AV-110B-PS-D,Avtech)放大后传输到检测/分选芯片的微电极上，由此产生的介电泳效应将目标微液滴分选到收集通道中(图2)。

3，微液滴的生成与分选

用流动聚焦的原理制备水包油w/o一级微液滴，流动聚焦尺寸为宽20μm，高25μm。油相为含有2％(w/w)的008氟化表面活性剂(RAN Biotechnologies)的碳氟油Novec7500(3M)，表面活性剂的加入能够很好地保证微液滴的稳定性。液滴制备时，油相以4μL/min的速度进入通道，用气压泵控制两个水相(细胞悬液和底物-BugBuster溶液)进入芯片，气压为150mbar(流速约为2μL/min)。在此条件下能够以10000Hz的速度，稳定地生成直径约为25μm的微液滴，用1.5mL离心管收集微液滴并在冰上保存。反应后的微液滴在气压的驱动(～230mbar)下进入检测/分选芯片，同时分隔油相由注射泵以的15μL/min流速注入芯片，在此条件下微液滴的流速约为1400/s。根据微液滴的荧光强度分选相应的微液滴。在检测点之后主通道分为Y型结构，其中一支宽度较大且长度较短，因而阻力较小，为废液通道；另一支则较窄且较长，具有较大的流阻，为分选通道。当没有电压施加到微电极上时，微液滴自发进入废液通道；当分选电压施加到微电极上时，产生的介电泳效应将微液滴吸引进入分选通道中，从而实现分选。

实施例2 AFEST突变库的构建

本发明使用来自Archaeoglobus fulgidus的嗜热酯酶AFEST，将其序列(SEQ IDNO:1)克隆至pUC18载体上并在E.coli10G(Lucygen)宿主中表达，由于pUC18载体大小较小，而E.coli10G适合于制备高效感受态细胞且能够作为表达宿主，因此采用该组合能够达到很高的转化效率，从而方便地构建AEFST的大容量突变库。将AFEST单菌落接种于5mL 2×YT(含有100μg/mL氨苄青霉素)，在37℃摇床中250rpm培养20h，培养过程不需进行诱导即可表达AFEST蛋白(SEQ ID NO：2)，从而简化了实验操作。

1，AFEST随机突变库的构建。

采用易错PCR技术，以带有野生型afest基因的pUC18质粒作为模板，采用低保真度DNA聚合酶进行目的基因扩增，通过提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变。

引物序列如下：

上游引物：

5’GGTACTCCTCTAGAGATGCTTGATATGCCAATCG 3’(SEQ ID NO:3)

下游引物：

5’CCAAAACAGAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAGAGC 3’(SEQ ID NO:4)

反应体系如下：

pUC18-AFEST重组质粒	20ng
		MnCl2(10mM)	0，1，2，3μl
MgCl2(25mM)	6μl
		上游引物(20μM)	2μl
上游引物(20μM)	2μl
		dNTP(2.5mM)	10μl
dCTP(10mM)	2μl
		dTTP(10mM)	2μl
Generay rTaq polymerase	1μl
		10×rTaq buffer	10μl
ddH2O	补足100μl

PCR反应条件为：首先95℃预变性3分钟；每个循环包括95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测易错PCR产物。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到1.2kb大小的条带，与预期结果相符。DpnI消化模板，回收，纯化该目的片段，将其用限制性内切酶EcoR I和Hind III进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pUC18进行连接，纯化后的连接产物电击法转化大肠杆菌JM107(FKP)电转化感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，第二天计数菌落数以计算得到库容量。随机从平板上挑取10个转化子，送测序，计算突变率。以此获得4个不同突变率的突变库，分别为1.3个碱基突变/基因，2.0个碱基突变/基因，3.1个碱基突变/基因，4.2个碱基突变/基因的突变库。将4个突变库以1:1:1:1的比例混合，得到总库容量为4×10⁶，平均突变率为2.5个碱基突变/基因的突变库。

2，DNA shuffling突变库的构建。

将AFEST出发突变体分别进行PCR扩增，PCR体系为：

2×PrimeStar HSpolymerase Premix(25μL,Takara)

AFEST上游引物(1μL,20μM,underlined:XbaI sites)：5’-GGTACTCCTCTAGAGATGCTTGATATGCCAATCG-3’,(SEQ ID NO:5)

AFEST下游引物(1μL,20μM,underlined:HindIII sites)5’-CCAAAACAGAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAGAGC-3’(SEQ ID NO:6)

pUC18质粒(1μL,50ng/μL)

DI water(22μL)

PCR条件：1)98℃3min；2)98℃10s；3)55℃5s；4)72℃20s；5)repeat 2-4)for29times；6)72℃5min；and 7)12℃hold。将不同突变体的PCR产物纯化后合并，备酶切。将2mU/μL的DNase I溶液，配方为：500μL甘油，400μL去离子水，10×DNaseI Buffer(100μL)，1μL DNase I(2U/μL，Thermofisher Scientific Inc.)。DNase I酶切配方(50μL体系)：5 10×DNase I Buffer，PCR混合产物(1-2μg)，氯化锰溶液(5μL，100mM)，DNase I(2-4μL，2mU/μL)，去离子水补齐至50μL。在15℃下反应，每隔10min取样5μL加入1μL EDTA终止酶切，电泳，判断获得100-200bp酶切片段的最佳反应条件。

在最佳反应条件下酶切初始DNA，电泳，切胶回收100-200bp的DNA片段进行退火重组PCR，PCR体系为：

2×PrimeStar HS polymerase Premix(25μL,Takara)

酶切片段(100-500ng)

去离子水补齐至50μL。

PCR条件：1)98℃3min；2)98℃10s；3)50℃5s；4)72℃10s；5)repeat 2-4)for39times；6)72℃5min；and 7)12℃hold。电泳，确定重组产物片段大小与原始AFEST基因大小相当，PCR产物不经纯化，直接用于下一步扩增PCR。

扩增PCR条件为：

2×PrimeStar HS polymerase Premix(25μL,Takara)

AFEST上游引物(1μL,20μM,含XbaI酶切位点)5’-GGTACTCCTCTAGAGATGCTTGATATGCCAATCG-3’(SEQ ID NO:7)

AFEST下游引物(1μL,20μM,含HindIII sites酶切位点)5’-CCAAAACAGAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAGAGC-3’(SEQ ID NO:8)

重组PCR产物(2-5μL)

去离子水补齐至50μL。

PCR条件：1)98℃3min；2)98℃10s；3)55℃5s；4)72℃20s；5)repeat 2-4)for29times；6)72℃5min；and 7)12℃hold。电泳验证PCR产物，经纯化、双酶切后重新构建到pUC18载体中，再电转化到E.coli 10G感受态中，即获得DNA shuffling突变库。

3，AFEST单点/双点饱和突变库的构建

以pUC18-AFEST-IE9基因为出发模板设计引物分别构建87，88，89，90单点饱和突变库及87+88，89+90双点饱和突变库，引物序列为：

87WHOP上游引物

5’-CTGGTTTACTATCACNNKggtGGATTTGTGATTTGCAGCATCG-3’(SEQ ID NO:9)

87WHOP下游引物

5’-GCAAATCACAAATCCaccMNNGTGATAGTAAACCAGAACC-3’(SEQ ID NO:10)

88WHOP上游引物

5’-CTGGTTTACTATCACggtNNKGGATTTGTGATTTGCAGCATCG-3’(SEQ ID NO:11)

88WHOP下游引物

5’-GCAAATCACAAATCCMNNaccGTGATAGTAAACCAGAACC-3’(SEQ ID NO:12)

89WHOP上游引物

5’-GGTTTACTATCACGGTGGTNNKtttGTGATTTGCAGCATCGAGTCG-3’(SEQ ID NO:13)

89WHOP下游引物

5’-CGATGCTGCAAATCACaaaMNNACCACCGTGATAGTAAACCAGAACC-3’

(SEQ ID NO:14)

90WHOP上游引物

5’-GGTTTACTATCACGGTGGTggaNNKGTGATTTGCAGCATCGAGTCG-3’(SEQ ID NO:15)

90WHOP下游引物

5-CGATGCTGCAAATCACMNNtccACCACCGTGATAGTAAACCAGAACC-3(SEQ ID NO:16)

87/88WHOP上游引物

5’-CTGGTTTACTATCACNNKNNKGGATTTGTGATTTGCAGCATCG-3’(SEQ ID NO:17)

87/88WHOP下游引物

5’-GCAAATCACAAATCCMNNMNNGTGATAGTAAACCAGAACC-3’(SEQ ID NO:18)

89/90WHOP上游引物

5’-GGTTTACTATCACGGTGGTNNKNNKGTGATTTGCAGCATCGAGTCG-3’

(SEQ ID NO:19)

89/90WHOP下游引物

5’-CGATGCTGCAAATCACMNNMNNACCACCGTGATAGTAAACCAGAACC-3’

(SEQ ID NO:20)

PCR体系为：2×PrimeStar HS polymerase Premix(25μL,Takara),Fprimer(1μL,20μM),Rprimer(1μL,20μM,)，pUC18-AFEST-IE9质粒(1μL,50ng/μL)，DI water(22μL)；PCR条件：1)98℃ 3min；2)98℃ 10s；3)55℃ 5s；4)72℃ 1min 30s；5)repeat 2-4)for29times；6)72℃ 5min；and 7)12℃ hold。电泳验证PCR产物，经纯化、DpnI消化模板后再分别电转化到E.coli10G感受态中，即获得单点/双点饱和突变库。

实施例3微液滴中的酶反应

为考察单细胞在微液滴中的酶反应，首先利用双水相流动聚焦芯片，将细胞用PBS洗涤后按照1：10的比例包裹入w/o微液滴(包裹前细胞浓度约为～1.2×10⁸cells/mL)，液滴同时包含25％(v/v)细胞裂解液BugBuster(Novagen,Mi llipore)，以及两种荧光底物分别为20μM。微液滴制备后置于37℃反应，每个10min用检测/分选芯片测定两种荧光强度的变化。96孔板中的酶反应与微液滴中的条件一致，在37℃下检测60min内每隔2min两种荧光强度的变化，其中HCCA和fluorescein的检测Ex/Em分别为385/450nm和485/528nm(图3)。

实施例4微流控双色荧光(FADS)筛选

为提高AFEST对(S)-异丙基布洛芬底物的活性，利用双色FADS体系对AFEST进行了多轮定向进化改造。首先将AFEST突变库(随机突变库、DNA shuffling库等)构建在pUC18载体上，在宿主E.coli 10G中表达后进行双底物单细胞酶反应，然后用FADS筛选出阳性细胞，PCR扩增后重新转入宿主细胞中进行新一轮筛选(图4)。经过几轮筛选后用96孔板进行复筛，鉴定出阳性单克隆并进行序列分析。

首先，以AFEST随机突变库位起始，从中筛选对异丙基布洛芬活性提高的突变体。由于野生型AFEST对底物1的活力较低，因此我们以底物2为筛选底物，对突变库进行单色FADS筛选，挑选出20株活性最高的突变体进行序列测定，鉴定出七种突变类型(表1)，其对底物2的活性相比于野生型AFEST都有不同程度的提高。

表1单色FADS筛选后获得的突变体

为将阳性突变位点进行优化组合，我们在上述获得的7个阳性突变体基础上进行DNA shuffling突变库构建，从突变库中随机挑取克隆进行测序验证发现，重组突变体中随机整合了不同的突变位点。在多轮突变库的筛选中，我们先利用底物1(Fluorescein-(S)-ibuprofen)和2(HCCA-(S)-ibuprofen)对DNA shuffling库进行双色FADS筛选，先确认对(S)-异丙基布洛芬对硝基苯酚酯底物活性提高的突变，再进一步采用正向筛选底物(HCCA-(S)-ibuprofen)和负向筛选底物(Fluorescein-(R)-ibuprofen)进行立体选择性筛选，最终获得了一批立体选择性都有提高的突变体(表2)。

表2多轮双色FADS筛选后获得的突变以及其立体选择性

(E值：对映体选择率，是酶对两种光学对映体反应速率的比值)

通过参考AFEST晶体结构发现，F90和G88两点位于紧邻活性中心底物结合部位的一个loop上，该loop靠近活性中心的区域共包含4个氨基酸残基：G87,G88,G89,F90；推测该段loop可能与AFEST对布洛芬底物的立体选择性有关。为进一步提高AFEST的立体选择性，我们对loop上四个氨基酸残基分别进行了单点饱和突变和两点组合(87+88及89+90)饱和突变，获得了一系列立体选择性提高的突变体(表3)。其中最好的突变体对pNP-(S)-ibuprofen底物的立体选择性高达100以上，达到工业应用的水平，该突变体立体选择性的提高主要归功于其对pNP-(R)-ibuprofen底物的活力降低。从突变库中还筛选到了对R型底物的选择性大大提高的突变体，其E值高达74，而这也主要归功于突变体对S型底物的活力降低。

表3Loop区域AFEST的突变对布洛芬底物的立体选择性

针对上述突变体，我们还分别探索了各个单点突变的情况，发现在表2和表3所述的单个氨基酸位点的取代、删除以及插入一个或多个氨基酸残基，均能提高对2-芳基丙酸类分子酯类衍生物的底物的立体选择性。

实施例7 AFEST突变体对异丙基布洛芬对硝基苯酚酯的手性拆分

我们进一步考察了野生型AFEST及其突变体24和突变体26对外消旋对硝基苯酚-异丙基布洛芬酯(pNP-(R,S)-ibuprofen)手性拆分效果，经过反应后，对于突变体24，当底物转化率为18％时，产物中S型异丙基布洛芬的比例高达99％，从而进一步验证了突变体24的立体选择性。

实施例8 AFEST突变体对其他类型的2-芳基丙酸酯底物的手性拆分实验

本发明还探索了多种类型的2-芳基丙酸类分子的酯类衍生物底物，都可以实现相应的手性拆分(表4)。

表4.AFEST突变体对不同底物的手性拆分实验

ee_p：产物的对映体过量值，指的是外消旋酯化合物经酶水解后生成两种对映体产物的比例。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一组新型酯酶及其应用

<130> P2017-2049

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 936

<212> DNA

<213> 闪烁古球菌属(Archaeoglobus fulgidus)

<400> 1

atgcttgata tgccaatcga ccctgtttac taccagcttg ctgagtattt cgacagtctg 60

ccgaagttcg accagttttc ctcggccaga gagtacaggg aggcgataaa tcgaatatac 120

gaggagagaa accggcagct gagccagcat gagagggttg aaagagttga ggacaggacg 180

attaagggga ggaacggaga catcagagtc agagtttacc agcagaagcc cgattccccg 240

gttctggttt actatcacgg tggtggattt gtgatttgca gcatcgagtc gcacgacgcc 300

ttatgcagga gaattgcgag actttcaaac tctaccgtag tctccgtgga ttacaggctc 360

gctcctgagc acaagtttcc cgccgcagtt tatgattgct acgatgcgac caagtgggtt 420

gctgagaacg ccgaggagct gaggattgac ccgtcaaaaa tcttcgttgg gggggacagt 480

gcgggaggga atcttgccgc ggcggtttca ataatggcga gagacagcgg agaagatttc 540

ataaagcatc aaattctaat ttaccccgtt gtgaactttg tagcccccac accatcgctt 600

ctggagtttg gagaggggct gtggattctc gaccagaaga taatgagttg gttctcggag 660

cagtacttct ccagagagga agataagttc aaccccctcg cctccgtaat ctttgcggac 720

cttgagaacc tacctcctgc gctgatcata accgccgaat acgacccgct gagagatgaa 780

ggagaagttt tcgggcagat gctgagaaga gccggtgttg aggcgagcat cgtcagatac 840

agaggcgtgc ttcacggatt catcaattac tatcccgtgc tgaaggctgc gagggatgcg 900

ataaaccaga ttgccgctct tcttgtgttc gactag 936

<210> 2

<211> 311

<212> PRT

<213> 闪烁古球菌属(Archaeoglobus fulgidus)

<400> 2

Met Leu Asp Met Pro Ile Asp Pro Val Tyr Tyr Gln Leu Ala Glu Tyr

1 5 10 15

Phe Asp Ser Leu Pro Lys Phe Asp Gln Phe Ser Ser Ala Arg Glu Tyr

20 25 30

Arg Glu Ala Ile Asn Arg Ile Tyr Glu Glu Arg Asn Arg Gln Leu Ser

35 40 45

Gln His Glu Arg Val Glu Arg Val Glu Asp Arg Thr Ile Lys Gly Arg

50 55 60

Asn Gly Asp Ile Arg Val Arg Val Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Ser Pro

65 70 75 80

Val Leu Val Tyr Tyr His Gly Gly Gly Phe Val Ile Cys Ser Ile Glu

85 90 95

Ser His Asp Ala Leu Cys Arg Arg Ile Ala Arg Leu Ser Asn Ser Thr

100 105 110

Val Val Ser Val Asp Tyr Arg Leu Ala Pro Glu His Lys Phe Pro Ala

115 120 125

Ala Val Tyr Asp Cys Tyr Asp Ala Thr Lys Trp Val Ala Glu Asn Ala

130 135 140

Glu Glu Leu Arg Ile Asp Pro Ser Lys Ile Phe Val Gly Gly Asp Ser

145 150 155 160

Ala Gly Gly Asn Leu Ala Ala Ala Val Ser Ile Met Ala Arg Asp Ser

165 170 175

Gly Glu Asp Phe Ile Lys His Gln Ile Leu Ile Tyr Pro Val Val Asn

180 185 190

Phe Val Ala Pro Thr Pro Ser Leu Leu Glu Phe Gly Glu Gly Leu Trp

195 200 205

Ile Leu Asp Gln Lys Ile Met Ser Trp Phe Ser Glu Gln Tyr Phe Ser

210 215 220

Arg Glu Glu Asp Lys Phe Asn Pro Leu Ala Ser Val Ile Phe Ala Asp

225 230 235 240

Leu Glu Asn Leu Pro Pro Ala Leu Ile Ile Thr Ala Glu Tyr Asp Pro

245 250 255

Leu Arg Asp Glu Gly Glu Val Phe Gly Gln Met Leu Arg Arg Ala Gly

260 265 270

Val Glu Ala Ser Ile Val Arg Tyr Arg Gly Val Leu His Gly Phe Ile

275 280 285

Asn Tyr Tyr Pro Val Leu Lys Ala Ala Arg Asp Ala Ile Asn Gln Ile

290 295 300

Ala Ala Leu Leu Val Phe Asp

305 310

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtactcctc tagagatgct tgatatgcca atcg 34

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccaaaacaga agcttctagt cgaacacaag aagagc 36

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtactcctc tagagatgct tgatatgcca atcg 34

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaaaacaga agcttctagt cgaacacaag aagagc 36

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtactcctc tagagatgct tgatatgcca atcg 34

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccaaaacaga agcttctagt cgaacacaag aagagc 36

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 9

ctggtttact atcacnnkgg tggatttgtg atttgcagca tcg 43

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 10

gcaaatcaca aatccaccmn ngtgatagta aaccagaacc 40

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 11

ctggtttact atcacggtnn kggatttgtg atttgcagca tcg 43

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 12

gcaaatcaca aatccmnnac cgtgatagta aaccagaacc 40

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 13

ggtttactat cacggtggtn nktttgtgat ttgcagcatc gagtcg 46

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(22)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 14

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<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 15

ggtttactat cacggtggtg gannkgtgat ttgcagcatc gagtcg 46

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(19)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 16

cgatgctgca aatcacmnnt ccaccaccgt gatagtaaac cagaacc 47

<210> 17

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 17

ctggtttact atcacnnknn kggatttgtg atttgcagca tcg 43

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 18

gcaaatcaca aatccmnnmn ngtgatagta aaccagaacc 40

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 19

ggtttactat cacggtggtn nknnkgtgat ttgcagcatc gagtcg 46

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(19)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(22)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 20

cgatgctgca aatcacmnnm nnaccaccgt gatagtaaac cagaacc 47

Claims

1.一种酯酶，属于α/β水解酶家族，其催化活性中心包含有“丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸”催化三联体，其特征在于，所述酯酶与SEQ ID No:2具有不低于80％的氨基酸序列一致性，且包含以下至少一个或多个位置的突变，所述的突变位点包括SEQ ID No:2的第8、11、13、37、41、49、81、87、88、89、90、203、206、209、211、216、257、284或302位中的至少一个或者其相应的位置；所述的突变为在所述的突变位点上发生取代、插入或删除一个或多个氨基酸残基。

2.根据权利要求1所述的酯酶，其特征在于，所述酯酶对以2-芳基丙酸类分子具有立体选择性。

3.根据权利要求1所述的酯酶，其特征在于，所述的突变位点为取代突变，至少包含以下一个或多个氨基酸残基的取代：

第8位脯氨酸被亮氨酸取代；

第11位酪氨酸被天冬酰胺取代；

第13位亮氨酸被组氨酸取代；

第37位天冬酰胺被丝氨酸取代；

第41位谷氨酸被赖氨酸取代；

第49位谷氨酰胺被亮氨酸取代；

第81位缬氨酸被丙氨酸取代；

第87位甘氨酸被丝氨酸取代；

第88位甘氨酸被精氨酸取代；

第88位甘氨酸被丝氨酸取代；

第89位甘氨酸被半胱氨酸取代；

第89位甘氨酸被丝氨酸取代；

第89位甘氨酸被脯氨酸取代；

第89位甘氨酸被酪氨酸取代；

第90位苯丙氨酸被色氨酸取代；

第90位苯丙氨酸被酪氨酸取代；

第90位苯丙氨酸被亮氨酸取代；

第203位苯丙氨酸被谷氨酸取代；

第203位苯丙氨酸被丝氨酸取代；

第206位甘氨酸被谷氨酸取代；

第209位异亮氨酸被缬氨酸取代；

第211位天冬氨酸被甘氨酸取代；

第216位丝氨酸被甘氨酸取代

第257位亮氨酸被脯氨酸取代；

第284位亮氨酸被苯丙氨酸取代；

第302位天冬酰胺被丝氨酸取代。

4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1-3所述的任一酯酶。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含有权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述的细胞包括权利要求5所述的表达载体或其基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

7.一种手性分子的拆分方法，其特征在于，在生物酶法催化系统中，将如权利要求1-3任一所述的酯酶作用于消旋体底物。

8.根据权利要求7所述的拆分方法，其特征在于，所述的消旋体底物为2-芳基丙酸类分子的酯类衍生物。

9.一种权利要求1-3任一所述的酯酶的用途，其特征在于，用于制备非甾体类抗炎药。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述酯酶用于催化2-芳基丙酸分子的酯类衍生物，从而获得非甾体类抗炎药。

11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的非甾体类抗炎药为单一构型手性产物。

12.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述非甾体类抗炎药为S型或R型布洛芬类化合物。