CN111944833B

CN111944833B - 缺刻缘绿藻磷脂酶a2的基因序列及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN111944833B
Application number: CN202010856997.6A
Authority: CN
Inventors: 周志刚; 李斯琪; 毕燕会
Original assignee: Shanghai Ocean University
Current assignee: Shanghai Ocean University
Priority date: 2020-08-24
Filing date: 2020-08-24
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2040-08-24
Also published as: CN111944833A

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了缺刻缘绿藻磷脂酶A2的基因序列及其编码蛋白和应用。缺刻缘绿藻磷脂酶A2(MiPLA2)的基因序列如SEQ ID NO:3所示，可用于绿藻油脂合成调控，通过特异性地断裂甘油磷脂中甘油碳骨架sn‑2位的酯键，将磷脂酰胆碱水解为溶血磷脂酰胆碱和游离脂肪酸，经游离脂肪酸生产富含花生四烯酸的三酰甘油。本发明通过构建MiPLA2所编码蛋白的原核表达载体pET32a‑MiPLA2，将其转化至大肠杆菌中诱导表达和纯化获得重组蛋白MiPLA2，经检测MiPLA2能将磷脂酰胆碱水解成溶血磷脂酰胆碱，从而鉴定MiPLA2的基因功能。

Description

缺刻缘绿藻磷脂酶A2的基因序列及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及缺刻缘绿藻磷脂酶A2(MiPLA2)的基因序列及其编码蛋白和应用。

背景技术

磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是一种水解酶(EC 3.1.1.4)，它在酰基编辑(acyl editing)的Lands循环过程中，特异性地断裂甘油磷脂中甘油碳骨架sn-2位的酯键，从而将膜脂中甘油碳骨架sn-2位上经过去饱和等修饰作用的酰基释放到“酰基池(acylpool)”；这些经过修饰的脂肪酸(如多不饱和脂肪酸)再经过Kennedy等途径被合成为三酰甘油(triacylglycerol，TAG)，使TAG富含这些修饰过的酰基。在缺刻缘绿藻(Myrmeciaincisa)TAG生物合成的前期研究中发现，该藻TAG中花生四烯酸(arachidonicacid，ArA)(一种多不饱和脂肪酸)的含量占TAG总脂肪酸的68.02％(欧阳珑玲等，2016)，预示PLA2在富含ArA的TAG合成过程中发挥着重要作用。

现有技术中，专利号为ZL201810595704.6的中国专利公开了缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶(MiDGAT2C)，申请号为201810338650.5的专利申请公开了缺刻缘绿藻溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)，申请号为202010098613.9的专利申请公开了缺刻缘绿藻CDP-乙醇胺:二酰甘油乙醇胺磷酸转移酶(MiEPT)，但缺刻缘绿藻磷脂酶A2(MiPLA2)目前未见报道。

发明内容

本发明的第一目的是，提供一种分离的DNA。

本发明的第二目的是，提供一种DNA的应用。

本发明的第三目的是，提供一种蛋白。

本发明的第四目的是，提供一种蛋白的应用。

本发明的第五目的是，提供一种重组表达载体。

本发明的第六目的是，提供一种重组表达载体的应用。

本发明的第七目的是，提供一种分离的cDNA。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种分离的DNA，所述的DNA为：a)如SEQ ID NO:3所述的多核苷酸；或b)与a)所述的核苷酸序列互补的多核苷酸。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的DNA在绿藻油脂合成调控中的应用，通过特异性地断裂甘油磷脂中甘油碳骨架sn-2位的酯键，将磷脂酰胆碱(PC)水解成溶血磷脂酰胆碱(LPC)和游离脂肪酸，且经游离脂肪酸生产富含花生四烯酸的三酰甘油。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：上述DNA编码的蛋白。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：上述DNA编码的蛋白在绿藻油脂合成调控中的应用。

进一步地，上述DNA编码的蛋白通过特异性地断裂甘油磷脂中甘油碳骨架sn-2位的酯键，将磷脂酰胆碱(PC)水解成溶血磷脂酰胆碱(LPC)和游离脂肪酸，且经游离脂肪酸生产富含花生四烯酸的三酰甘油。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述DNA，且由其与质粒或病毒构建得到；在优选的实施方案中，所述的质粒为pMD19T质粒。

为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：一种重组表达载体在绿藻油脂合成调控中的应用。

进一步地，上述重组表达载体通过特异性地断裂甘油磷脂中甘油碳骨架sn-2位的酯键，将磷脂酰胆碱(PC)水解成溶血磷脂酰胆碱(LPC)和游离脂肪酸，且经游离脂肪酸生产富含花生四烯酸的三酰甘油。

为实现上述第七个目的，本发明采取的技术方案是：一种分离的cDNA，所述的cDNA为：ⅰ)如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；或ⅱ)与a)所述的核苷酸序列互补的多核苷酸。

本发明的优点在于：

在缺刻缘绿藻转录组高通量的测序数据中，筛选到一条与甜橙(Citrussinensis)PLA2(GenBank登录号ADF55750.1)氨基酸序列具有40.5％一致性且长453bp的Contig8456_14。基于该片段的序列设计引物并利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification ofcDNA ends，RACE)克隆到该基因的cDNA全长序列。它长1082bp，包含具有明显poly A尾且长为464bp的3′-非翻译区(untranslated region，UTR)，长为180bp的5′-UTR和长为438bp的开放阅读框(open reading frame，ORF)；该ORF编码由145个氨基酸残基组成的蛋白，它的氨基酸序列与Klebsormidiumnitens的PLA2(GenBank登录号GAQ79202.1)具有53.98％的一致性，因而将该基因命名为MiPLA2。

经SignalP、TMHMM等预测，在MiPLA2的23Ala-24Ala处有一个典型的导肽酶切位点，酶切后的成熟蛋白由122个氨基酸组成，无跨膜区。氨基酸多序列的比对结果表明，MiPLA2有保守的Ca²⁺结合环YGKYCGxxxxGC和催化活性基序DxCCxxHDxC，且催化位点二联体His/Asp完全保守。为了进一步明确MiPLA2所编码蛋白的功能，我们构建了MiPLA2成熟蛋白的原核表达载体pET32a-MiPLA2，并将其转化至大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中诱导表达，纯化获得重组表达的目的蛋白；体外酶反应后的产物经薄层色谱(thin-layerchromatography，TLC)检测，结果显示纯化的重组MiPLA2能将磷脂酰胆碱水解成溶血磷脂酰胆碱，从而鉴定了MiPLA2的基因功能。

本发明采用的主要操作包括：

1)在温度为25℃、光照强度为115μmol photons/(m²·s)的条件下，于BG-11培养基中培养缺刻缘绿藻(Myrmeciaincisa)，收集藻细胞，并提取基因组DNA和总RNA。

2)从缺刻缘绿藻转录组测序数据中，通过NCBI的BLASTx比对，筛选得到一条与甜橙(Citrussinensis)PLA2(GenBank登录号ADF55750.1)编码序列具有40.5％一致性且长453bp的Contig8456_14，基于该片段序列设计引物，利用RACE技术得到PLA2基因的5′-和3′-末端cDNA序列；基于拼接的cDNA全长序列设计引物，以缺刻缘绿藻反转录的cDNA为模板进行扩增验证，确定获得缺刻缘绿藻磷脂酶A2(MiPLA2)的cDNA全长序列。

3)根据MiPLA2的cDNA全长序列设计引物，利用缺刻缘绿藻基因组DNA作为模版进行PCR扩增，得到MiPLA2的DNA序列。

4)结合MiPLA2的生物信息学分析结果，根据MiPLA2不含导肽的ORF序列以及克隆质粒pMD19-T和表达质粒pET-32a的多克隆位点序列设计带酶切识别位点的引物，利用PCR扩增技术构建携带MiPLA2成熟蛋白基因序列的克隆质粒pMD19T-MiPLA2。

5)分别对表达质粒pET-32a和携带目的基因的克隆质粒pMD19T-MiPLA2利用BamHI和HindIII进行双酶切反应；回收目的片段，再用T4连接酶过夜连接，得到携带目的基因的重组表达载体pET32a-MiPLA2；在序列验证无误后，将其转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞；将转化的大肠杆菌涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基上，挑菌后测序以验证，并提取质粒。

6)将重组表达质粒pET32a-MiPLA2利用热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。然后，将转化的大肠杆菌涂布于含卡那霉素(Kan)的LB固体培养基上，筛选到携带目的基因表达质粒pET32a-MiLPLA2的大肠杆菌。

7)将携带目的基因表达质粒pET32a-MiPLA2及携带空载体pET-32a的大肠杆菌分别培养后，再用0.1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)于30℃下诱导培养3h，收集菌体。

8)利用超声波法破碎菌体，提取表达的重组MiPLA2(rMiPLA2)蛋白，利用Bio-Scale^TM Mini Profinity^TM IMAC Cartridges蛋白亲和层析纯化预装柱(Bio-Rad公司)纯化得到重组目的蛋白rMiPLA2。

9)用2×蛋白上样缓冲液以1:1(v/v)的比例混合洗脱的蛋白样品，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)技术检测重组蛋白的表达和纯化情况。

10)从凝胶上分离出目的条带，使用胰蛋白酶(Trypsin)对蛋白质样品进行酶解，再使用液相色谱-质谱-质谱(nanoLC-QE)联用对酶解后的多肽样品进行分析，以鉴定重组蛋白的氨基酸序列。

11)利用纯化到的rMiPLA2构建磷脂酰胆碱(PC)的体外水解反应体系；反应结束后，经薄层色谱(TLC)检测，结果显示重组表达的rMiPLA2能将PC水解为溶血磷脂酰胆碱(LPC)，进而鉴定基因MiPLA2所编码蛋白的功能。

附图说明

图1是缺刻缘绿藻MiPLA2的基因克隆产物电泳图(上)及基因结构示意图(下)；上图中，M：DL-2000分子量标准(天根生化)；泳道1：contig序列的PCR验证产物；泳道2：5′-RACE的PCR扩增产物；泳道3：3′-RACE的PCR扩增产物；泳道4：MiPLA2基因的DNA扩增产物；下图中，灰线是非翻译区，黑线为内含子，黑色框为外显子。

图2是PLA2蛋白的多序列比对图；60％以上一致性的氨基酸用“灰色阴影”表示；保守的氨基酸用“黑色阴影”表示；钙结合位点用“*”；催化位点用“+”表示，其中的His/Asp二联体用“#”表示；预测的导肽用“下划线”表示。

图3是pET-32a质粒图谱(上)及多克隆位点区域的序列图(下)。

图4是重组表达质粒pET32a-MiPLA2构建过程中相关产物的电泳图；M1和M2：DL2000 DNA及Marker IV DNA分子量标准(天根生化)；M3：DL5000 DNA分子量标准(TaKaRa公司)；泳道1：带有酶切识别位点引物的PCR扩增产物(不含导肽)；泳道2：克隆质粒pMD19T-MiPLA2的双酶切产物；泳道3：重组表达质粒pET32a-MiPLA2的双酶切产物；泳道4：空载体pET-32a的双酶切产物。

图5是rMiPLA2诱导表达产物的SDS-PAGE电泳及Western印迹图谱；M：预染蛋白分子量标准(Thermo Scientific公司)；泳道1：含空载体pET-32a的大肠杆菌诱导蛋白；泳道2和5：经IPTG诱导3h表达的全菌蛋白；泳道3：经IPTG诱导3h表达的可溶性蛋白；泳道4：经IPTG诱导3h表达的包涵体蛋白；泳道6：利用镍柱纯化的rMiPLA2。

图6是一条rMiPLA2部分肽段的质谱图；下划线表示质谱检测到的肽段序列，其中，下划点虚线表示上述质谱图所检测到的且在MiPLA2中对应的氨基酸序列。

图7是另一条rMiPLA2部分肽段的质谱图；下划线表示质谱检测到的肽段序列，其中，下划点虚线表示上述质谱图所检测到的且在MiPLA2中对应的氨基酸序列。

图8是rMiPLA2酶催化反应产物的薄层层析(TLC)图谱；PC和LPC：分别是磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的标准品；rMiPLA2：指在反应体系中加入纯化的rMiPLA2；对照：指在反应体系中加入反应缓冲液以代替纯化的rMiPLA2。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1、材料

缺刻缘绿藻(Myrmeciaincisa Reisigl)H4301购自捷克布拉格查理斯大学藻类培养中心(CAUP)。在温度为25℃、光照强度为115μmol photons/(m²·s)、光/暗比为12h/12h的条件下培养，培养基为BG-11。

大肠杆菌克隆菌株DH5α、表达菌株BL21(DE3)和增强型HRP-DAB底物显色试剂盒以及DL-2000、Marker IV核酸分子量标准均购自天根生化科技(北京)有限公司。

pET-32a载体、抗聚His标签抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG购自上海友科生物科技有限公司。

TRIzol试剂购自Invitrogen公司，SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒购自Clontech公司。

Taq DNA聚合酶、限制性核酸内切酶BamHI和HindIII、T4 DNA连接酶、TA克隆载体pMD19-T、PrimeScrip^TMII 1st Strand cDNA合成试剂盒、DL-5000DNA分子量标准均购自TaKaRa公司。

Bio-Scale^TM Mini Profinity^TM IMAC Cartridges蛋白亲和层析纯化预装柱购自Bio-Rad公司。

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法植物基因组DNA提取试剂盒、2×蛋白上样缓冲液均购自北京艾德莱生物科技有限公司。

预染蛋白质分子量标准购自Thermo Scientific公司。

氨苄青霉素钠(Amp)、卡那霉素(Kan)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

硅胶60F254板购自德国Merck公司。

PC购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，溶血磷脂酰胆碱(LPC)标准品购自中国食品药品检定研究院。

2、方法

1)取100mg新鲜的缺刻缘绿藻细胞置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。

2)利用CTAB法试剂盒提取缺刻缘绿藻的基因组DNA，利用TRIzol法抽提其总RNA，-20℃保存备用。

3)目的基因的序列验证。利用cDNA合成试剂盒反转录合成缺刻缘绿藻的cDNA。自缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)的转录组数据库(Ouyang et al.,2013)中，筛选得到一条与甜橙(Citrus sinensis)PLA2(GenBank登录号ADF55750.1)氨基酸序列具有40.5％一致性且长453bp的Contig8456_14。根据该序列设计引物ORF1(5′-atgcgtacagcgctgttgtccc-3′)(如SEQ ID NO:5所示)和ORF2(5′-tcatagctcgcctttcgcctgg-3′)(如SEQ ID NO:6所示)，并以合成的cDNA为模板进行PCR扩增以验证该contig的序列。

PCR反应体系包含1μL的cDNA、12.5μL的2×Taq PCR Master Mix(天根生化)及上、下游引物各1μL，最后加去离子H₂O至25μL。PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，66.7℃退火30s，72℃延伸2min，运行35个循环；72℃延伸10min，10℃保存。利用胶回收试剂盒回收PCR产物并连接至克隆载体pMD19-T。然后将连接好的10μL反应液加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用手指轻弹后，置于冰上孵育30min；然后在42℃的水浴锅中热激90s，取出后立即在冰上孵育2min，完成热激法的转化。接着加入890μL不含抗生素的LB培养基，将含有培养基的转化物置于振荡培养箱中，在37℃条件下以180rpm的转速振荡培养1h，取出后涂板。蓝白斑筛选后，挑取阳性克隆，进行菌落PCR验证；将验证后含有目的片段的阳性克隆菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，以验证目的片段的序列。

4)目的基因cDNA全长序列的克隆。根据上述验证的目的基因序列，设计基因特异引物，利用Clontech公司的SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒进行PCR扩增，获得5′-和3′-末端的cDNA序列。

5′-RACE采用巣式PCR。第一轮的PCR反应条件为：94℃变性30s、66.5℃退火45s及72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min；引物为5PLA1(5′-atcccacagtccctgcaaggcaa-3′)(如SEQ ID NO:7所示)和试剂盒中的UPM(long)。第二轮PCR反应取1μL第一轮PCR产物作为第二轮反应模板，以5PLA2(5′-agttgcagtcttcagtctggcagg-3′)(如SEQ ID NO:8所示)和试剂盒提供的NUP为引物。反应条件为：94℃变性30s、65℃退火45s和72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

3′-RACE同样也采用巢式PCR。第一轮的PCR反应条件为：94℃变性30s、65℃退火30s及72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min；引物为3GSP3(5′-cctgccgagctgaagactgcaact-3′)(如SEQ ID NO:9所示)和试剂盒中的UPM(long)。第二轮PCR反应取1μL第一轮PCR产物作为第二轮反应模板，以3GSP4(5′-caagaagcatgatgactgctgtgacc-3′)(如SEQ ID NO:10所示)和NUP为引物。反应条件为：94℃变性30s、63℃退火1min和72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

将两轮反应后的产物，按照3)的方法，进行胶回收、TA克隆、转化并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序得到的5′-和3′-末端序列与验证的目的基因序列进行拼接，并重新设计引物以验证，从而得到MiPLA2基因的cDNA全长序列。

5)MiPLA2的DNA序列克隆。根据MiPLA2的cDNA全长序列设计引物DNAF(5′-ggtgatcttgcaaagcggatcgaca-3′)(如SEQ ID NO:11所示)和DNAR(5′-aggctggtttacgcctacgatg-3′)(如SEQ ID NO:12所示)，以缺刻缘绿藻的基因组DNA为模版进行PCR扩增，获得MiPLA2的DNA序列。扩增条件为94℃预变性5min，35个循环包含94℃变性45s、63℃退火45s、72℃延伸2min，最后72℃延伸10min。PCR产物按3)的方法经胶回收、连接、转化和蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，并经菌落PCR验证后测序，得到缺刻缘绿藻MiPLA2的DNA序列。

6)带酶切识别位点的目的基因开放阅读框(open reading frame，ORF)序列克隆。经生物信息学分析可知，MiPLA2所编码的蛋白没有跨膜区，但在其氨基端具有长为23个氨基酸的导肽。为了能更容易重组表达出具有活性的目的蛋白，切除这个导肽的同时选择表达载体pET-32a，因为该载体带有可溶性标签，使表达的目的蛋白更具有可溶性。根据MiPLA2除去导肽的ORF序列及pMD19-T、pET-32a多克隆位点的序列，设计含有BamHI和HindIII的酶切识别位点引物HeMiPLA2F(5′-ggatccATGGCAGGGCAGCCTTCGTGCT-3′，小写字母为BamHI酶切识别位点)(如SEQ ID NO:13所示)和HeMiPLA2R(5′-aagcttTCATAGCTCGCCTTTCGCCTGGGA-3′，小写字母为HindIII酶切识别位点)(如SEQ ID NO:14所示)，利用PCR扩增反应克隆MiPLA2不带有导肽的ORF序列，以构建质粒pMD19T-MiPLA2。25μL的PCR扩增反应体系包含12.5μL的2×Taq PCR Master Mix(天根生化)、1μL的cDNA模版、引物各1μL及9.5μL无菌水。扩增条件为94℃预变性5min，35个循环包含94℃变性45s、68℃退火45s、72℃延伸2min，最后72℃延伸10min。PCR产物按3)的方法经胶回收、连接、转化和蓝白斑筛选，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

7)重组表达质粒pET32a-MiPLA2的构建。利用质粒提取试剂盒抽提克隆质粒pMD19T-MiPLA2，然后，用限制性内切酶BamHI和HindIII分别对其及pET-32a空载体进行双酶切反应。20μL为总反应体系包括2μL的10×K缓冲液，6μL的质粒DNA，BamHI和HindIII各1μL。37℃酶切反应4h。反应产物经琼脂糖凝胶电泳，割胶回收酶切后的目的片段，并用T4 DNA连接酶将酶切后的MiPLA2片段与pET-32a片段于16℃过夜连接，得到重组表达载体pET32a-MiPLA2。连接反应体系为2μL的T4缓冲液，12μL MiPLA2目的片段，2μL pET-32a载体片段，1μL的T₄ DNA连接酶，加无RNA酶的水3μL。连接反应后，按照3)的热激方法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并按照3)的方法进行蓝白斑筛选、菌落PCR验证和测序。

8)重组表达质粒的提取与转化。利用质粒提取试剂盒抽提重组表达质粒pET32a-MiPLA2，按照3)的热激法将其转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，并同时按照3)的方法进行蓝白斑筛选、菌落PCR验证和测序。同样抽提空载体pET-32a并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，作为阴性对照。

9)重组蛋白的诱导表达与检测。将携带重组表达质粒pET32a-MiPLA2且目的基因序列无误的菌液，按1:1000的比例接种于含氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，在37℃条件下以180rpm的转速震荡培养过夜。取2mL过夜培养的菌液按1:100的比例接种至200mL含Amp的LB液体培养基，同样条件下扩大培养，约2～3h后，菌液在600nm处的光密度检测值在0.6～0.8之间。此时，加入0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，30℃条件下继续培养3h以诱导重组(recombinant)MiPLA2(rMiPLA2)的表达。然后将培养液置于冰上冷却15min使细胞停止生长。4℃条件下以7000rpm的转速离心5min收集大肠杆菌，用20mL预冷的无菌水洗涤细胞2次，同样条件下离心收集菌体；再用20mL预冷的1×PBS(0.137mM NaCl、2.7mMKCl、10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄)溶液洗涤细胞2次，然后置于15mL预冷的1×PBS溶液中。取适量刚收集的细胞按1:1的比例加入2×蛋白上样缓冲液混合后沸水煮10min，留样备用。将余下重悬菌体利用超声波进行破碎，破碎条件为利用160W功率的超声破碎仪超声4s、间隔8s以破碎菌体，至澄清(约15min)，在此过程中，样品一直保持在冰浴中。之后，在4℃条件下，以14000rpm的转速离心10min。收集上清液和沉淀，沉淀用15mL预冷的1×PBS溶液溶解后与上清液一起分别留样保存。利用SDS-PAGE凝胶电泳检测重组蛋白的诱导表达情况。

10)rMiPLA2的Western印迹。在将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳时，将事先剪好的与凝胶块大小相近的硝酸纤维素膜(NC)用去离子H₂O浸泡1h，95％乙醇处理5s，然后放入转膜缓冲液(将30.2g的Tris和144g的Gly溶解于去离子H₂O中并定容至1000mL)中至少平衡10min。待电泳结束后，在电转仪上，由下至上分别放入事先用转膜缓冲液平衡过的海绵垫、三层滤纸、电泳凝胶、NC膜、三层滤纸、海绵垫，使NC膜与正极相连。于4℃冰箱中在100V电压下转膜120min。转膜结束后，将NC膜取出用丽春红染色，观察蛋白是否成功转到膜上，然后用1×TBST(含0.137M的NaCl、2.7mM的KCl、0.025M的Tris和0.05％的Tween 20，pH 7.4)溶液在室温下用摇床洗3次，每次10min。清洗后，将NC膜立即浸入含5％脱脂奶粉的1×TBST封闭液中，室温下孵育60min。选用抗聚His标签的商用抗体作为一抗，用封闭液按1:2000(一抗:封闭液)的比例稀释一抗。将丽春红染色后的NC膜放入，室温孵育90min后，用1×TBST在摇床上洗3次，每次10min。用1×TBST按1:4000的比例稀释HRP标记的羊抗兔IgG，室温下在摇床中孵育60min后，再用1×TBST洗3次，每次10min，用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒在暗室中进行显色反应，并拍照记录。

11)rMiPLA2的分离与纯化。取新的1mL预装镍柱，先用2倍于柱床体积的20％乙醇以2mL/min的流速洗涤，再用2倍于柱床体积的预冷无菌水以相同的流速洗涤，镍柱即达到平衡，可用于蛋白纯化。用5倍于柱床体积的漂洗缓冲液(含5mM咪唑、50mM KH₂PO₄和300mMKCl，pH 8.0)平衡镍柱，流速控制在2mL/min左右；将上清液中的可溶性蛋白用0.22μm规格的滤器过滤，防止细胞碎片等杂质堵塞镍柱，然后以0.5mL/min的流速加入到平衡后的镍柱中；分别用含5mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM不同浓度咪唑的漂洗缓冲液(除咪唑外，其他的组分均为50mM KH₂PO₄和300mM KCl，pH 8.0)洗脱镍柱，收集洗脱液；吸取50μL每一梯度的洗脱液与2×蛋白上样缓冲液等体积混合后于沸水中煮10min，利用SDS-PAGE检测洗脱液中rMiPLA2的纯化情况，以确定可以洗脱到目的蛋白的理想咪唑浓度。

12)rMiPLA2的质谱鉴定。利用理想的咪唑浓度洗脱镍柱，使用SDS-PAGE对洗脱液进行电泳检测后，从凝胶上分离出目的条带。使用胰蛋白酶(Trypsin)对蛋白质样品进行酶解，然后利用液相色谱-质谱-质谱(nanoLC-QE)联用技术对酶解后的多肽样品进行分析。采集多肽和多肽碎片的质量电荷比，通过搜索蛋白质质谱数据库解析氨基酸序列，并与目的基因所编码蛋白进行序列比对，以了解重组的是否为目的蛋白。

13)rMiPLA2对PC水解活性的定性分析。在玻璃反应管中构建体外酶反应体系。400μL的水解反应体系包含50mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM CaCl₂，0.05％Triton X-100，30μL的PC(浓度为100mg/mL)和100μg纯化后的重组蛋白rMiPLA2。于30℃水浴锅中反应30min后，加入750μL氯仿:甲醇(2:1，v/v)终止反应并且涡旋，再加200μL氯仿和200μL KCl(2M)，涡旋，以5500rpm的转速离心15min，吸取下层有机相转移至新的反应管中，加入660μL氯仿，相同条件下离心，再次从反应液中提取有机相，混合两次抽提的有机相，然后用氮气吹干，加入20μL氯仿溶解，在硅胶60F254板(德国Merck公司)薄板上用毛细吸管点样，然后展开，所用展开剂为氯仿:无水甲醇:氨水:水(65:39:4:4，v/v/v/v)，展开距离为12.5cm，时间约2h。然后将薄板用樱草灵溶液显色，对比LPC和PC标样，检查rMiPLA2酶促反应中LPC的生成情况，以添加Tris-HCl溶液以取代重组蛋白酶液作为对照。

3、结果

1)MiPLA2的基因序列克隆与特征。自缺刻缘绿藻的转录组数据库(Ouyang etal.,2013)中，筛选得到一条与甜橙PLA2(GenBank登录号ADF55750.1)氨基酸序列具有40.5％一致性且长453bp的Contig8456_14。根据该序列设计引物ORF1和ORF2，并以合成的cDNA为模板进行PCR扩增，经胶回收、克隆、测序及比对，明确了它为目的条带(图1泳道1)的序列。利用RACE技术自缺刻缘绿藻中扩增该基因的5′-及3′-末端序列，它们的大小分别为450bp和751bp(图1泳道2和3)，其中，3′-末端有明显的poly A尾巴序列；将其与验证的contig序列进行手工拼接并经过重新设计引物进行PCR扩增验证，得到缺刻缘绿藻MiPLA2的cDNA全长序列如下(加粗处为起始或终止密码子，下划线部分为ORF)：

tttctaatattcttattcgactccctattgttttatgagtctctttaaagcagacaccggggggacttctgaaaagttgtgtctcccggtgatcttgcaaagcggatcgacatcgttgcagtgaagaaaagagcggtgattgccttgcagggactgtgggatacctgctggtatccggacatgcgtacagcgctgttgtccctcctggtgtggacggccc tctgcacaagtacagcactggcacaggcagcagggcagccttcgtgctcgcgcacctgccgagctgaagactgcaa ctcgttaaatatcaagtatggcaagtactgcggcgtgggctataccggctgtaggggcgaggccccatgtgacggt gtcgacaagtgctgcaagaagcatgatgactgctgtgaccgccacgggctgatgtacataccctgtcatgatcgct tcatcaagtgccttagcaaggaagttgcgtctggccgcaagggcttctccgatcagtgcggctatgcccaggtggt gcccttgatgcagcagagcatgcaggtggcaatgatgtttggcacgcatgactctgccgaggtgcgtagatcccag gcgaaaggcgagctatgatcccgctgcgatctgctggatgcagaataggggttggtctggtgcctacacggcggtgtcgtctgcaggctgtattgctgagtgcaagcagcaagctgcacggcagagtgggtctgtactgtggacacattgagtcctgcatgctgacttgcagaccttcaaccagtgcatcgtaggcgtaaaccagcctgtgcgttgtcagtggctggcattgttctctgtagggctgctgtatgtatggcaaccccatgcaggctgtcccgaaccactgcagccaatcgttggtgcaggttgtctgtgctgcgaaatggtacattgctgttagcaaagtcgccagtgcgccagcctgtgcaggctgtcagttctcaggtgttggtgatatattactgaatgcaccatcaagtggctgcgattgcagtcctatctgcagatactgcaacaccgatgtaacaggcgctacagcgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(如SEQ ID NO:1所示)，它长1082bp(不含poly A)，5′-非翻译区(untranslated region，UTR)长180bp，3′-UTR长464bp(不含poly A尾巴)(图1下)，ORF长438bp，编码由145个氨基酸残基组成且分子量为15.8kD的前体蛋白如下(下划线部分为预测的导肽序列)：MRTALLSLLVWTALCTSTALAQAAGQPSCSRTCRAEDCNSLNIKYGKYCGVGYTGCRGEAPCDGVDKCCKKHDDCCDRHGLMYIPCHDRFIKCLSKEVASGRKGFSDQCGYAQVVPLMQQSMQVAMMFGTHDSAEVRRSQAKGEL(如SEQ ID NO:2所示)，该蛋白的氨基酸序列与Klebsormidiumnitens这种同属于绿藻的PLA2(GenBank登录号GAQ79202.1)序列具有53.98％的一致性，因而将自缺刻缘绿藻中克隆到的基因命名为MiPLA2。

对MiPLA2所编码蛋白进行生物信息学分析后发现，在MiPLA2的氨基端存在由23个氨基酸组成的导肽，表明在缺刻缘绿藻细胞中，该前体蛋白氨基端的前23个氨基酸将被切除，只以122个氨基酸组成的成熟蛋白行使功能，预测的成熟蛋白分子量为13.42kD。跨膜区的预测结果表明，MiPLA2不存在跨膜区。将它与其他不同植物物种的5条PLA2进行氨基酸多序列比对，结果(图2)显示MiPLA2含有12个半胱氨酸；同时还含有很保守的催化活性基序DxCCxxHDxC和Ca²⁺结合环基序YGKYCGxxxxGC，且催化位点二联体His/Asp完全保守。这些都与已报道的PLA2序列特征一致，预测MiPLA2具有PLA2的活性。

根据MiPLA2的cDNA全长序列设计一对引物DNAF和DNAR，以缺刻缘绿藻基因组DNA为模版进行PCR扩增反应(图1泳道4)，产物经序列分析后得到MiPLA2的DNA序列如下(下划线加粗部分为起始或终止密码子，双下划线部分为内含子)：

tttctaatattcttattcgactccctattgttttatgagtctctttaaagcagacaccggggggacttctgaaaagttgtgtctcccggtgatcttgcaaagcggatcgacatcgttgcagtgaagaaaagagcggtgattgccttgcagggactgtgggatacctgctggtatccggacatgcgtacagcgctgttgtccctcctggtgtggacggccctctgcacaagtacagcactggcacaggtaaaagagttgtcatactgggcttctcgtgtgatctacccttggtgctc gcttgctgacctttaagcgttgtccctgcaggcagcagggcagccttcgtgctcgcgcacctgccgagctgaagactgcaactcgttaaatatcaagtatggcaagtactgcggcgtgggctataccggctgtaggggtccgttcgcctccc tgctgcaccctgtgagcaggcctgacttagcctgtgtctgcatatcctgtcctgcacagcacagtctctctggcta ctgcaggttgcaacaaaattctggtgccctgcgctgtgagcaagcaactgcttgtgatatattgccctctcggcta gccctcaagggctgcggcccgcgtgctgctcacgctgcgctgcttgcttacaggcgaggccccatgtgacggtgtcgacaagtgctgcaagaagcatgatgactgctgtgaccgccacgggctgatgtacataccctgtcatgatcgcttcatcaagtgccttagcaaggaagttgcgtctggccgcaagggcttctccgatcaggtgcagacgcatgcttttgcatg cttttcagataccagtcctaacagactgaaggtcctcgcgctcaactcaatccaagtgctagctggatcgcactgg atgttgtcctgatgcgtatcaaattgctgctgatgtgcatggtcctgacgagcgctgacagatgatgtctggctgc tgcatgcagtgcggctatgcccaggtggtgcccttgatgcagcagagcatgcaggtggcaatgatgtttggcacgcatgactctgccgaggtgcgtagatcccaggcgaaaggcgagctatgatcccgctgcgatctgctggatgcagaataggggttggtctggtgcctacacggcggtgtcgtctgcaggctgtattgctgagtgcaagcagcaagctgcacggcagagtgggtctgtactgtggacacattgagtcctgcatgctgacttgcagaccttcaaccagtgcatcgtaggcgtaaaccagcctgtgcgttgtcagtggctggcattgttctctgtagggctgctgtatgtatggcaaccccatgcaggctgtcccgaaccactgcagccaatcgttggtgcaggttgtctgtgctgcgaaatggtacattgctgttagcaaagtcgccagtgcgccagcctgtgcaggctgtcagttctcaggtgttggtgatatattactgaatgcaccatcaagtggctgcgattgcagtcctatctgcagatactgcaacaccgatgtaacaggcgctacagcg(如SEQ ID NO:3所示)，它长1567bp。将该基因的cDNA与DNA序列进行比对，结果(图1下)显示，MiPLA2存在3个内含子，它们的长从5′-末端开始分别为81bp、220bp、184bp，将该基因的ORF序列分割成4个外显子。

2)重组表达质粒pET32a-MiPLA2的构建与转化。根据MiPLA2编码成熟蛋白(即去除23个残基的导肽序列)的ORF序列(图2)以及表达质粒pET-32a多克隆位点的序列(图3)，本发明设计了一对带酶切识别位点的引物HeMiPLA2F和HeMiPLA2R，克隆到MiPLA2不含有导肽序列长381bp的ORF(图4泳道1，同时含12个碱基用于内切酶识别位点)，并将该序列连接至克隆载体pMD19-T上，以构建携带目的基因的克隆质粒pMD19T-MiPLA2；然后使用BamHI和HindIII分别双酶切该质粒(图4泳道2)以及空表达质粒pET-32a(图4泳道4)，使用T4 DNA连接酶将这2条目的片段连接，以构建重组表达质粒pET32a-MiPLA2。提取该表达质粒，经过双酶切反应，其产物经电泳检测，只出现381bp目的基因和5881bp载体条带(图4泳道3)；并经菌落PCR及测序等验证，综合表明已成功构建携带MiPLA2成熟蛋白基因序列的重组表达质粒pET32a-MiPLA2。利用热激法将该重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后，筛选到转基因菌株ET32a-MiPLA2。同样的方法，获得转空载体细胞系ET32a。

3)重组蛋白的诱导表达与Western印迹。转基因细胞系ET32a-MiPLA2及ET32a经扩大培养及添加IPTG诱导培养后，经冻融后破碎细胞，获得蛋白。电泳结果(图5泳道1和2)显示，与ET32a菌株的总蛋白相比，ET32a-MiPLA2菌株的总蛋白中，在31kD附近出现1条新带。在构建MiPLA2成熟蛋白重组表达质粒时，因在插入目的片段的上游存在His-Tag、Trx-Tag、S-Tag等基因序列以及质粒上携带的适用其它酶切识别位点的序列(图3)，这样在原来的122个氨基酸基础上增加了165个氨基酸(下划线部分为目的基因编码的氨基酸序列)：

MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSAGQPSCSRTCRAEDCNSLNIKYGKYCGVGYTGCRGEAPCDGVDKCCKKHDDCCDR HGLMYIPCHDRFIKCLSKEVASGRKGFSDQCGYAQVVPLMQQSMQVAMMFGTHDSAEVRRSQAKGEL(如SEQ IDNO:4所示)，重组表达蛋白的预测分子量达到31.12kD。从分子量大小来判断，这条新带与目的条带的理论分子量大小一致，推测这条新出现的条带应包含目的基因所编码蛋白即MiPLA2成熟蛋白。

在重组表达质粒pET32a-MiPLA2的构建时，为了便于后续利用商业提供的镍柱以亲和层析纯化rMiPLA2，在目的蛋白的氨基端引入了由6个组氨酸组成的His-tag标签，因而可以利用His₆-tag的商用抗体，对重组表达的rMiPLA2进行Western印迹分析，以确信诱导表达的是目的蛋白。免疫印迹的显色结果(图5泳道5)显示，约31kD处有一单一条带，所对应蛋白与重组蛋白的预测分子量大小(31.12kD)相符。进一步说明已在大肠杆菌中成功地表达rMiPLA2。

4)rMiPLA2的纯化与质谱鉴定。将转基因菌株上清液及沉淀中的蛋白进行电泳，结果显示rMiPLA2主要以可溶性蛋白的形式存在(图5泳道3)，但也可以包涵体形式表达(图5泳道4)。为了满足下一步酶活性检测所需，选用Bio-Scale Mini预装亲和层析柱(Bio-Rad公司)从上清液的可溶性蛋白中纯化重组的rMiPLA2。上样后，用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱层析柱。洗脱液经电泳后表明，当利用50mM的咪唑进行洗脱时效率最高，故收集50mM洗脱液进行透析。将透析后收集于50mL超滤离心管中进行浓缩，最后进行电泳。结果(图5泳道6)显示，在目的条带大小处的附近出现两条大小相近的明亮条带。

电泳过后，从SDS-PAGE上割胶、分离约31kD的两条目的条带，经胰蛋白酶酶解后，利用液相色谱-质谱-质谱联用技术，采集多肽及多肽碎片的质荷比，并搜索蛋白质谱数据库，分别检测到6个肽段(图6，共46个氨基酸)和4个肽段(图7，共41个氨基酸)，它们虽分别只占成熟目的蛋白氨基酸总长度(122aa)的37.7％和33.61％，但每个肽段均与MiPLA2所编码蛋白的相应片段完全匹配，说明这两条大小有点差异的蛋白均是rMiPLA2，进而表明已成功地重组表达并纯化不含有导肽的rMiPLA2。

5)rMiPLA2酶促反应产物的TLC检测。将上述纯化的rMiPLA2添加到含有反应物PC的反应体系中，对反应后的产物进行薄层层析。TLC色谱结果(图8)显示，在添加rMiPLA2的反应体系中能检测到LPC的产生，而在没有添加该重组蛋白的反应体系中却没有检测到。表明这个经纯化的rMiPLA2在体外具有水解PC的活性，进而鉴定基因MiPLA2所编码蛋白的功能。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海海洋大学

<120> 缺刻缘绿藻磷脂酶A2的基因序列及其编码蛋白和应用

<141> 2020-08-24

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1109

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tttctaatat tcttattcga ctccctattg ttttatgagt ctctttaaag cagacaccgg 60

ggggacttct gaaaagttgt gtctcccggt gatcttgcaa agcggatcga catcgttgca 120

gtgaagaaaa gagcggtgat tgccttgcag ggactgtggg atacctgctg gtatccggac 180

atgcgtacag cgctgttgtc cctcctggtg tggacggccc tctgcacaag tacagcactg 240

gcacaggcag cagggcagcc ttcgtgctcg cgcacctgcc gagctgaaga ctgcaactcg 300

ttaaatatca agtatggcaa gtactgcggc gtgggctata ccggctgtag gggcgaggcc 360

ccatgtgacg gtgtcgacaa gtgctgcaag aagcatgatg actgctgtga ccgccacggg 420

ctgatgtaca taccctgtca tgatcgcttc atcaagtgcc ttagcaagga agttgcgtct 480

ggccgcaagg gcttctccga tcagtgcggc tatgcccagg tggtgccctt gatgcagcag 540

agcatgcagg tggcaatgat gtttggcacg catgactctg ccgaggtgcg tagatcccag 600

gcgaaaggcg agctatgatc ccgctgcgat ctgctggatg cagaataggg gttggtctgg 660

tgcctacacg gcggtgtcgt ctgcaggctg tattgctgag tgcaagcagc aagctgcacg 720

gcagagtggg tctgtactgt ggacacattg agtcctgcat gctgacttgc agaccttcaa 780

ccagtgcatc gtaggcgtaa accagcctgt gcgttgtcag tggctggcat tgttctctgt 840

agggctgctg tatgtatggc aaccccatgc aggctgtccc gaaccactgc agccaatcgt 900

tggtgcaggt tgtctgtgct gcgaaatggt acattgctgt tagcaaagtc gccagtgcgc 960

cagcctgtgc aggctgtcag ttctcaggtg ttggtgatat attactgaat gcaccatcaa 1020

gtggctgcga ttgcagtcct atctgcagat actgcaacac cgatgtaaca ggcgctacag 1080

cgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1109

<210> 2

<211> 145

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Arg Thr Ala Leu Leu Ser Leu Leu Val Trp Thr Ala Leu Cys Thr

1 5 10 15

Ser Thr Ala Leu Ala Gln Ala Ala Gly Gln Pro Ser Cys Ser Arg Thr

20 25 30

Cys Arg Ala Glu Asp Cys Asn Ser Leu Asn Ile Lys Tyr Gly Lys Tyr

35 40 45

Cys Gly Val Gly Tyr Thr Gly Cys Arg Gly Glu Ala Pro Cys Asp Gly

50 55 60

Val Asp Lys Cys Cys Lys Lys His Asp Asp Cys Cys Asp Arg His Gly

65 70 75 80

Leu Met Tyr Ile Pro Cys His Asp Arg Phe Ile Lys Cys Leu Ser Lys

85 90 95

Glu Val Ala Ser Gly Arg Lys Gly Phe Ser Asp Gln Cys Gly Tyr Ala

100 105 110

Gln Val Val Pro Leu Met Gln Gln Ser Met Gln Val Ala Met Met Phe

115 120 125

Gly Thr His Asp Ser Ala Glu Val Arg Arg Ser Gln Ala Lys Gly Glu

130 135 140

Leu

145

<210> 3

<211> 1567

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tttctaatat tcttattcga ctccctattg ttttatgagt ctctttaaag cagacaccgg 60

ggggacttct gaaaagttgt gtctcccggt gatcttgcaa agcggatcga catcgttgca 120

gtgaagaaaa gagcggtgat tgccttgcag ggactgtggg atacctgctg gtatccggac 180

atgcgtacag cgctgttgtc cctcctggtg tggacggccc tctgcacaag tacagcactg 240

gcacaggtaa aagagttgtc atactgggct tctcgtgtga tctacccttg gtgctcgctt 300

gctgaccttt aagcgttgtc cctgcaggca gcagggcagc cttcgtgctc gcgcacctgc 360

cgagctgaag actgcaactc gttaaatatc aagtatggca agtactgcgg cgtgggctat 420

accggctgta ggggtccgtt cgcctccctg ctgcaccctg tgagcaggcc tgacttagcc 480

tgtgtctgca tatcctgtcc tgcacagcac agtctctctg gctactgcag gttgcaacaa 540

aattctggtg ccctgcgctg tgagcaagca actgcttgtg atatattgcc ctctcggcta 600

gccctcaagg gctgcggccc gcgtgctgct cacgctgcgc tgcttgctta caggcgaggc 660

cccatgtgac ggtgtcgaca agtgctgcaa gaagcatgat gactgctgtg accgccacgg 720

gctgatgtac ataccctgtc atgatcgctt catcaagtgc cttagcaagg aagttgcgtc 780

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cagtcctaac agactgaagg tcctcgcgct caactcaatc caagtgctag ctggatcgca 900

ctggatgttg tcctgatgcg tatcaaattg ctgctgatgt gcatggtcct gacgagcgct 960

gacagatgat gtctggctgc tgcatgcagt gcggctatgc ccaggtggtg cccttgatgc 1020

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tctggtgcct acacggcggt gtcgtctgca ggctgtattg ctgagtgcaa gcagcaagct 1200

gcacggcaga gtgggtctgt actgtggaca cattgagtcc tgcatgctga cttgcagacc 1260

ttcaaccagt gcatcgtagg cgtaaaccag cctgtgcgtt gtcagtggct ggcattgttc 1320

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tacagcg 1567

<210> 4

<211> 287

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Ser Ala Gly Gln Pro Ser Cys Ser Arg Thr Cys Arg

165 170 175

Ala Glu Asp Cys Asn Ser Leu Asn Ile Lys Tyr Gly Lys Tyr Cys Gly

180 185 190

Val Gly Tyr Thr Gly Cys Arg Gly Glu Ala Pro Cys Asp Gly Val Asp

195 200 205

Lys Cys Cys Lys Lys His Asp Asp Cys Cys Asp Arg His Gly Leu Met

210 215 220

Tyr Ile Pro Cys His Asp Arg Phe Ile Lys Cys Leu Ser Lys Glu Val

225 230 235 240

Ala Ser Gly Arg Lys Gly Phe Ser Asp Gln Cys Gly Tyr Ala Gln Val

245 250 255

Val Pro Leu Met Gln Gln Ser Met Gln Val Ala Met Met Phe Gly Thr

260 265 270

His Asp Ser Ala Glu Val Arg Arg Ser Gln Ala Lys Gly Glu Leu

275 280 285

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atgcgtacag cgctgttgtc cc 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tcatagctcg cctttcgcct gg 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atcccacagt ccctgcaagg caa 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

agttgcagtc ttcagtctgg cagg 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

cctgccgagc tgaagactgc aact 24

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

caagaagcat gatgactgct gtgacc 26

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ggtgatcttg caaagcggat cgaca 25

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

aggctggttt acgcctacga tg 22

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ggatccatgg cagggcagcc ttcgtgct 28

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

aagctttcat agctcgcctt tcgcctggga 30

Claims

1.一种分离的DNA，其特征在于，所述的DNA为序列如SEQ ID NO:3所示的多核苷酸。

2.权利要求1所述的DNA在绿藻油脂合成调控中的应用。

3.权利要求1所述的DNA编码的蛋白。

4.权利要求3所述的蛋白在绿藻油脂合成调控中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白通过特异性地断裂甘油磷脂中甘油碳骨架sn-2位的酯键，将磷脂酰胆碱水解成溶血磷脂酰胆碱和游离脂肪酸，且经游离脂肪酸生产富含花生四烯酸的三酰甘油。

6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的DNA，且由其与质粒或病毒构建得到。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述质粒为pMD19T质粒。

8.权利要求6或7所述的重组表达载体在绿藻油脂合成调控中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述蛋白通过特异性地断裂甘油磷脂中甘油碳骨架sn-2位的酯键，将磷脂酰胆碱水解成溶血磷脂酰胆碱和游离脂肪酸，且经游离脂肪酸生产富含花生四烯酸的三酰甘油。

10.一种分离的cDNA，其特征在于，所述的cDNA为序列如SEQ ID NO:3所示的多核苷酸。