CN1910273A - 新型瘤胃细菌突变体及利用其制备琥珀酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使来自于瘤胃细菌的乳酸脱氢酶基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pfl)(其涉及产乳酸、甲酸和乙酸的过程)发生断裂而得到的新型瘤胃细菌突变体；一种具有乳酸脱氢酶基因(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶基因(pfl)、磷酸乙酰转移酶基因(pta)和乙酸激酶基因(ackA)的断裂的新型细菌突变体(Mannheimia sp.LPK7)；一种具有乳酸脱氢酶基因(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶基因(pfl)、磷酸乙酰转移酶基因(pta)的断裂的新型细菌突变体(Mannheimia sp.LPK4)，这些基因涉及产琥珀酸代谢途径中的CO2固定；以及一种生产琥珀酸的方法，其特征在于在厌氧条件下培养上述突变体。与生成各种有机酸的现有野生型菌株相比，该创造性的细菌突变体具有能产生高浓度琥珀酸而很少或不产生有机酸的特性。因此，该创造性的细菌突变体适于用作工业生产琥珀酸的菌株。

Description

新型瘤胃细菌突变体及利用其制备琥珀酸的方法
技术领域
本发明涉及一种能够产生高浓度琥珀酸而很少或不产生其它有机酸的瘤胃细菌突变体，以及一种生产琥珀酸的方法，其特征在于在厌氧条件下培养这种突变体。
背景技术
各种厌氧微生物，包括Succinivibrio dextrinosolvens，产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)，黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)等等，通过葡萄糖代谢过程产生琥珀酸作为最终产物(Zeikus，Annu.Rev.Microbiol.，34：423，1980)。除了已知的产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)在过量CO2存在的情况下可以以高浓度和高产量从葡萄糖产生琥珀酸之外(David et al.，Int.J.Syst.Bacteriol.，26：498，1976)，还没有关于适用于工业生产的产琥珀酸菌株的报道。然而，由于产琥珀酸厌氧螺菌是一种专性厌氧微生物，因而采用这种微生物产生琥珀酸的发酵过程有一个缺点，即，即使暴露于十分少量的氧气下该过程本身也会变得不稳定。
为了克服这个缺点，开发出Mannheimia succiniciproducens 55E，它是一种既具有耐氧性又具有高有机酸产量的菌株。然而，由于该菌株除了琥珀酸之外还可会产生甲酸、乙酸和乳酸，因而其缺点在于产量低，并且在提纯工艺中要花费大量的成本来去除琥珀酸之外的其它有机酸。
在多种文献中都报道了用于产生琥珀酸的重组大肠杆菌(E.coli)菌株。如果该大肠杆菌(E.coli)菌株在编码乳酸脱氢酶的基因中和编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因中有所断裂，就很难在厌氧条件下生长。而且，它们的产量太低以至于不能应用于工业领域，因为尽管乳酸并不作为一种发酵产物产生，但其它的代谢物(乙酸和乙醇)也占了琥珀酸产物的一半。在欲克服这些缺点的尝试中，使大肠杆菌(E.coli)细胞在有氧环境下生长，然后应用到厌氧条件中以引发琥珀酸的发酵。然而，这种尝试的产量仍很低(Vemuri et al.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，28：325，2002)。也曾报道过一些其它的例子，其中在琥珀酸发酵的代谢途径中固定CO2的酶基因，如丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、苹果酸酶的基因被引入大肠杆菌(E.coli)中，从而提高了琥珀酸的产量(Vemuri et al.，Appl.Environ.Microbiol.，68：1715，2002；Millard et al.，Appl.Environ.Microbiol.，62：1808，1996；Chaoand Liao，Appl.Environ.Microbiol.，59：4261，1993；Stols and Donnelly，Appl.Environ.Microbiol.，63：2695，1997)。
同时，众所周知，大肠杆菌(E.coli)中的ptsG断裂有助于提高细菌产量和琥珀酸产量(Chatterjee et al.，Appl.Environ.Microbiol.，67：148，2001)，但大多数瘤胃细菌没有ptsG，因而具有一个优点，即它们不像在E.coli中那样需要一个去除ptsG的过程。近来，人们进行了积极的尝试，将在琥珀酸发酵的代谢途径中固定CO2的酶基因引入瘤胃细菌，包括放线杆菌属和厌氧螺菌属。然而，在该尝试中，产生了大量的其它有机酸或者琥珀酸的产量很低，以致结果没有达到工业应用的水平。
发明内容
因此，在我们广泛研究开发能以高产量产生琥珀酸的细菌菌株的过程中，本发明者们通过断裂来自于一种瘤胃细菌Mannheimia succiniciproducens 55E的乳酸脱氢酶基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pfl)而构建了细菌突变体Mannheimia sp.LPK(KCTC 10558BP)，并且通过分别断裂来自于LPK菌株的磷酸乙酰转移酶基因(pta)和乙酸激酶基因(ackA)，以及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)而构建了细菌突变体Mannheimia sp.LPK7和LPK4，然后证实在厌氧条件下培养这些细菌突变体能提供高产量的琥珀酸，从而完成了本发明。
因而，本发明的一个主要目的是提供一种能以高产量产生琥珀酸而不产生其它有机酸的瘤胃细菌突变体，以及其生产方法。
本发明的另一个目的是提供一种生产琥珀酸的方法，其特征在于在厌氧条件下培养上述细菌突变体。
为了达到上述目的，一方面，本发明提供一种瘤胃细菌突变体，其乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)发生了断裂，并且具有在厌氧条件下产生高浓度琥珀酸而很少或不产生其它有机酸的特性。
另一方面，本发明提供了一种瘤胃细菌突变体，其乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)、磷酸乙酰转移酶编码基因(pta)和乙酸激酶编码基因(ackA)发生了断裂，并且具有在厌氧条件下产生高浓度琥珀酸而很少或不产生其它有机酸的特性。
还有一个方面，本发明提供了一种瘤胃细菌突变体，其乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因(ppc)发生了断裂，并且具有在厌氧条件下产生高浓度琥珀酸而很少或不产生其它有机酸的特性。
在本发明中，瘤胃细菌优选为同型发酵细菌，其可选自由以下物质构成的组：Mannheimia属、放线杆菌属和厌氧螺菌属，并且只产生琥珀酸而很少或不产生其它有机酸。在本发明的优选实施例中，瘤胃细菌突变体为Mannheimiasp.LPK，LPK7或LPK4。
还有一个方面，本发明提供了一种生产具有在厌氧条件下产生高浓度琥珀酸而很少或不产生其它有机酸的特性的瘤胃细菌突变体的方法，该方法包括在选自Mannheimia属，放线杆菌属和厌氧螺菌属的瘤胃细菌中断裂乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)。
在产生瘤胃细菌突变体的创造性方法中，优选通过同源重组来实现ldhA和pfl基因的断裂。同源重组优选采用含有断裂ldhA的遗传交换载体和含有断裂pfl的遗传交换载体来进行。优选地，含有断裂ldhA的载体为pMLKO-sacB，含有断裂pfl的载体为pMPKO-sacB。
而还有一个方面，本发明提供了一种生产具有在厌氧条件下产生高浓度琥珀酸而很少或不产生其它有机酸的特性的瘤胃细菌突变体的方法，该方法包括在选自Mannheimia属、放线杆菌属和厌氧螺菌属的瘤胃细菌中另外断裂磷酸乙酰转移酶编码基因(pta)和乙酸激酶编码基因(ackA)，而乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)已经被断裂。
pta和ackA基因的断裂优选通过同源重组实现。同源重组优选采用含有断裂pta和ackA的遗传交换载体来实现。含有断裂pta和ackA的载体优选为pPTA-sacB。
而还有一个方面，本发明提供了一种生产具有在厌氧条件下产生高浓度琥珀酸而很少或不产生其它有机酸的特性的瘤胃细菌突变体的方法，该方法包括在选自Mannheimia属、放线杆菌属和厌氧螺菌属的瘤胃细菌中另外断裂磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因(ppc)，而乳酸脱氢酶基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)已经被断裂。
ppc基因的断裂优选通过同源重组实现。同源重组优选采用含有断裂ppc的遗传交换载体来实现。含有断裂ppc的载体优选为pPPC-sacB。
在本发明中，具有乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)断裂的瘤胃细菌突变体优选为Mannheimia sp.LPK(KCTC10558BP)。
而还有一个方面，本发明提供了一种含有断裂ldhA的遗传交换载体pMLKO-sacB，含有断裂pfl的遗传交换载体pMPKO-sacB，含有断裂pta和ackA的遗传交换载体pPTA-sacB，含有断裂ppc的遗传交换载体pPPC-sacB。
另一方面，本发明提供了一种生产琥珀酸的方法，该方法包括步骤：在厌氧条件下培养瘤胃细菌突变体；以及从培养液中回收琥珀酸。
在此所使用的术语“断裂”指编码所述酶的基因被修改从而不能产生所述酶。
在本发明中，将乳酸脱氢酶基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pfl)分别从一种瘤胃细菌Mannheimia succiniciproducens 55E的遗传信息中识别出来，然后利用具有这些基因断裂的载体将所有这两个基因从Mannheimiasucciniciproducens 55E中去除，从而构建出细菌突变体Mannheimia sp.LPK(KCTC 10558BP)。接着，从该细菌突变体Mannheimia sp.LPK中断裂各个pta-ackA基因和ppc基因，从而构建出各种细菌突变体。然后，证实这些细菌突变体能产生高浓度的琥珀酸而很少或不产生其它有机酸。
该创造性细菌突变体(Mannheimia sp.LPK，LPK4和LPK7)是兼性厌氧的格兰氏阴性非移动杆菌或球菌，不产生内生孢子，并可在厌氧条件下产生琥珀酸。
附图简要说明
图1表示了构建含有断裂ldhA(pMLKO-sacB)的载体的过程。
图2表示了构建含有断裂pfl(pMPKO-sacB)的载体的过程。
图3表示了通过断裂Mannheimia succiniciproducens 55E中的ldhA和pfl基因来构建细菌突变体(LPK)的过程。
图4是表示Mannheimia sp.LPK中的ldhA和pfl基因断裂的电泳照片(M：λHindIII大小标记；泳道1-3：PCR产物LU1 & KM1(1.5kb)；泳道4-6：PCR产物LD2 & KM2(1.7kb)；泳道7-9：PCR产物PU1 & CM1(2.2kb)；泳道10-12：PCR产物PD2 & CM2(1.6kb))。
图5表示了Mannheimia sp.LPK在充满CO2的厌氧条件下的培养特征。
图6表示了构建含有断裂pta和ackA(pPTA-sacB)的载体的过程。
图7表示了构建含有断裂ppc(pPPC-sacB)的载体的过程。
图8表示了通过断裂Mannheimia sp.LPK中的pta和ackA基因来构建细菌突变体LPK7的过程。
图9表示了通过断裂Mannheimia sp.LPK中的ppc基因来构建细菌突变体LPK4的过程。
图10是表示Mannheimia sp.LPK7中pta和ackA基因断裂的电泳照片(M：1-kb梯带大小标记；泳道1：PCR产物P13 & P14(1.1kb)；泳道2：PCR产物P15 & P16(1.5kb))。
图11是表示Mannheimia sp.LPK4中ppc基因断裂的电泳图片(M：1-kb梯带大小标记；泳道1：PCR产物P13 & P17(1.1kb)；泳道2：PCR产物P15& P18(1.5kb))。
图12表示了Mannheimia sp.LPK7在充满CO2的厌氧条件下的培养特征。
图13表示了Mannheimia sp.LPK4在充满CO2的厌氧条件下的培养特征。
发明详细说明
下文中将通过实施例进一步详细地描述本发明。然而，对于本领域的技术人员来说显然给出这些实施例仅仅是出于说明性目的，而本发明不仅限于或受限于该实施例。
特别地，以下实施例只说明了一种方法，包括断裂Mannheimia属菌株中的基因以获得细菌突变体，然后通过这些细菌突变体生产高浓度的琥珀酸。然而，通过其它瘤胃细菌菌株，如放线杆菌属和厌氧螺菌属，来获得具有这些断裂基因的细菌突变体，并且利用该细菌菌株产生琥珀酸的方法对于本领域技术人员来说也是显而易见的。
此外，以下实施例只说明了一种特定的培养基和培养方法。然而，采用其它不同的培养基，如乳清、玉米浆(CSL)，如文献(Lee et al.，BioprocessBiosyst.Eng.，26：63，2003；Lee et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，54：23，2000；Lee et al.，Biotechnol.Bioeng.，72：41，2001)中所述，以及采用各种方法，如补料分批培养和连续培养，对于本领域技术人员来说也是显而易见的。
实施例1：pMLKO-sacB的构建
为了通过同源重组断裂乳酸脱氢酶基因(ldhA)，可按照以下方式构建基因交换载体。首先，用Mannheimia succiniciproducens 55E(KCTC 0769BP)的基因组DNA作为模板，用以下SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中列出的引物进行PCR，然后，将得到的PCR片段用SacI和PstI酶切，并引入pUC18中(New England Biolabs，Inc.，Beverly，Mass.)，从而构建出pUC18-L1。
SEQ ID NO：1：5’-CAGTGAAGGAGCTCCGTAACGCATCCGCCG(LS1)
SEQ ID NO：2：5’-CTTTATCGAATCTGCAGGCGGTTTCCAAAA(LP1)
之后，用Mannheimia succiniciproducens 55E的基因组DNA作为模板，用以下SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中列出的引物进行PCR，然后，将得到的PCR片段用PstI和HindIII酶切，并引入pUC18-L1中，从而构建出pUC18-L1-L2。
SEQ ID NO：3：5’-GTACTGTAAACTGCAGCTTTCATAGTTAGC(LP2)
SEQ ID NO：4：5’-GCCGAAAGTCAAGCTTGCCGTCGTTTAGTG(LH2)
将pUC4K(Pharmacia，Freiburg，Germany)用PstI酶切，并将所得到的卡那霉素抗性基因与用PstI酶切了的pUC18-L1-L2进行融合，从而构建出pUC18-L1-KmR-L2。将SEQ ID NO：5中列出的接头插入到被SacI酶切的pUC18-L1-KmR-L2中，从而得到新的XbaI酶切位点。
SEQ ID NO：5：5’-TCTAGAAGCT
用以下SEQ ID NO：6和7中列出的引物，以pKmobsacB(Schafer et al.，Gene，145：69，1994)为模板进行PCR，将得到的PCR产物用XbaI酶切并插入上述XbaI限制性酶切位点中，从而构建出pMLKO-sacB(图1)。
SEQ ID NO：6：5’-GCTCTAGACCTTCTATCGCCTTCTTGACG(SXF)
SEQ ID NO：7：5’-GCTCTAGAGGCTACAAAATCACGGGCGTC(SXR)
实施例2：pMPKO-sacB的构建
为通过同源重组来断裂丙酮酸甲酸裂解酶基因(pfl)，可按照以下方式构建基因交换载体。将含有sacB基因(Genbank 02730)的pKmobsacB模板用下面SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9中列出的引物进行PCR。将得到的sacB产物通过PstI和BamHI酶切并引入pUC19(Stratagene Cloning System.La Jolla，Calif.)中，从而构建出pUC19-sacB。
SEQ ID NO：8：5’-AGCGGATCCCCTTCTATCGCCTTCTTGACG(SBG)
SEQ ID NO：9：5’-GTCCTGCAGGGCTACAAAATCACGGGCGTC(SPR)
将Mannheimia succiniciproducens 55E的基因组DNA作为模板，用以下SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中列出的引物进行PCR。将得到的PCR片段用BamHI酶切，并与用BamHI酶切了的pUC19-sacB融合，从而构建出pUC19-sacB-pfl。
SEQ ID NO：10：5’-CATGGCGGATCCAGGTACGCTGATTTCGAT(PB1)
SEQ ID NO：11：5’-CAAGGATCCAACGGATAAAGCTTTTATTAT(PB2)
为获得氯霉素抗性基因，将pACYC184(New England Biolabs，Inc.，Beverly，Mass.)作为模板用以下SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13中列出的引物进行PCR。将得到的PCR产物用SmaI酶切，并与用Bst1107I酶切了的pUC19-sacB-pfl融合，从而构建出pMPKO-sacB(图2)。
SEQ ID NO：12：5’-CTCGAGCCCGGGGTTTAAGGGCACCAATAA(CTR)
SEQ ID NO：13：5’-CTCGAGCCCCGGGCTTTGCGCCGAATAAAT(CTF)
实施例3：Mannheimia sp.LPK菌株的构建
图3表示了通过断裂来自于Mannheimia succiniciproducens 55E中的ldhA和pfl基因来构建突变体菌株(LPK)的过程。将Mannheimia succiniciproducens55E倒平板于含10g/l葡萄糖的LB-葡萄糖培养基上，并在37℃下培养36小时。将形成的菌落接种在10ml LB-葡萄糖液体培养基中，培养12小时。将经过充分生长的培养液的1％接种到100ml LB-葡萄糖液体培养基中，在振荡培养箱中以200rpm和37℃进行培养。
4-5小时后当培养液的OD值达到大约0.2-0.3时，在4℃下以4000rpm离心10分钟以收集细胞。之后，将细胞在4℃下重悬于200ml 10％的丙三醇溶液中。将该悬浮液在4℃下以4000rpm离心10分钟，收集细胞，并在4℃下重悬于200ml 10％的丙三醇溶液，然后在4℃和4000rpm下离心10分钟以收集细胞。将该细胞以体积比1∶1悬浮于丙三醇中，以获得细胞浓缩液。
将由此获得的细胞浓缩液与实施例1和2中构建的遗传交换载体pMLKO-sacB和pMPKO-sacB混合，然后在1.8kV、25μF和200ohm的条件下进行电穿孔。向电穿孔的混合液中加入1ml LB-葡萄糖液体培养基，并在振荡培养箱中以200rpm，在37℃下培养一小时。将培养液倒平板于含有适当抗生素[Km(终浓度为25μg/ml)或Cm(6.8μg/ml)]的LB-葡萄糖固体培养基中，并在37℃下培养48小时以上。为了选择出只发生了双交换的菌落，将形成的菌落划线于含有Km(25μg/ml)或Cm(6.8μg/ml)的LB-蔗糖培养基(100g/l蔗糖的LB培养基)上。24小时后，将形成的菌落再次在同样的平板上划线。
将平板上形成的菌落(突变体)在含有抗生素的LB-葡萄糖液体培养基中培养，并通过Rochelle et al(FEMS Microbiol.Lett.，100：59，1992)所述的方法将基因组DNA从培养的菌株中分离出来。用分离出来的突变体基因组DNA作为模板进行PCR，并将PCR产物进行电泳以证实该PCR产物中的ldhA和pfl基因断裂。
为了证实ldhA基因的断裂，可通过以下方式进行两次PCR。首先，将突变体基因组DNA作为模板，用以下SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15中列出的引物进行PCR。
SEQ ID NO：14：5’-GACGTTTCCCGTTGAATATGGC(KM1)
SEQ ID NO：15：5’-CATTGAGGCGTATTATCAGGAAAC(LU1)
然后，将突变体基因组DNA作为模板，用以下SEQ ID NO：16和SEQ IDNO：17中列出的引物进行PCR。将两次PCR获得的产物进行凝胶电泳，通过它们的大小(1.5kb)来证实ldhA基因的断裂(图4)。
SEQ ID NO：16：5’-GCAGTTTCATTTGATGCTCGATG(KM2)
SEQ ID NO：17：5’-CCTCTTACGATGACGCATCTTTCC(LD2)
为了证实pfl的断裂，用下列方式进行两次PCR。首先，将突变体基因组DNA作为模板，用以下SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19中列出的引物进行PCR。
SEQ ID NO：18：5’-GGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT(CM1)
SEQ ID NO：19：5’-CTTTGCAACATTATGGTATGTATTGCCG(PU1)
之后，将突变体基因组DNA作为模板，用以下SEQ ID NO：20和SEQ IDNO：21中列出的引物进行PCR。将两次PCR获得的产物进行凝胶电泳，通过它们的大小(1.5kb)来证实pfl的断裂(图4)。在图4中，M表示λHindIII大小标记；泳道1-3表示PCR产物LU1 & KM1(1.5kb)；泳道4-6表示PCR产物LD2 & KM2(1.7kb)；泳道7-9表示PCR产物PU1 & CM1(2.2kb)；泳道10-12表示PCR产物PD2 & CM2(1.6kb)。
SEQ ID NO：20：5’-TACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAA(CM2)
SEQ ID NO：21：5’-CCCCAGCATGTGCAAATCTTCGTCAC(PD2)
通过使用SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的引物(LU1和KM1)进行PCR所得到的产物大小为1.5kb，同时使用SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的引物(LD2和KM2)进行PCR所得到的产物大小为1.7kb，证实了ldhA基因的断裂。并且，通过使用SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的引物(PU1和CM1)进行PCR所得到的产物大小为2.2kb，同时使用SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21的引物(PD2和CM2)进行PCR所得到的产物的大小为1.6kb，证实了pfl基因的断裂。每个引物的位置如图3所示。通过上述方法构建的突变体，即具有ldhA和pfl断裂的细菌突变体，被命名为“Mannheimia sp.LPK”，并于2003年11月26日以保藏号KCTC 10558BP保藏于韩国生命科学与生物技术研究所(KRIBB)的Korean Collection for Type Cultures(KCTC)中。
实施例4：Mannheimia sp.LPK的发酵特征
为了检测在上述实施例3中构建的Mannheimia sp.LPK的发酵特征，将该突变体在充满CO2的厌氧条件下进行培养，并分析所得到的反应产物。首先，将二氧化碳引入100ml由20g/L葡萄糖、5g/L多聚蛋白胨、5g/L酵母提取物、3g/L K2HPO4、1g/L NaCl、1g/L(NH4)2SO4、0.2g/L CaCl2·2H2O、0.2g/L的MgCl2·6H2O和10g/L的MgCO3构成的预培养基中，然后将Mannheimia sp.LPK接种到预培养基中，并在39℃下预培养14小时。之后，将0.9L由20g/L葡萄糖、5g/L多聚蛋白胨、5g/L酵母提取物、3g/L的K2HPO4、1g/L的NaCl、5g/L(NH4)2SO4、0.2g/L CaCl2·2H2O，0.2g/L MgCl2·6H2O和5g/L NaCO3构成的培养基放入2.5-L的培养罐中，并将100ml预培养的微生物接种到培养基中，在39℃、PH6.5下进行分批培养，同时以0.25vvm的流速提供二氧化碳。
用分光光度计(Ultraspec 3000，Pharmacia Biotech.，Sweden)测定培养液中的细胞浓度，并通过HPLC(Aminex HPX-87H column，Bio-Rad，USA)测定琥珀酸、葡萄糖、乳酸、乙酸和甲酸的含量(图5)。图5中符号表示了随培养时间的推移细胞(●)、琥珀酸(○)、葡萄糖(■)、甲酸(◇)和乙酸(△)浓度的变化。如图5所示，经14小时培养之后，消耗的葡萄糖浓度为20g/L，而产生的琥珀酸浓度为17.2g/L，表明琥珀酸的产率(产生的琥珀酸量/消耗的葡萄糖量)为81％，而琥珀酸的体积产量(产生的琥珀酸浓度/经过时间)为1.23g/L/h。通过在充满CO2的厌氧条件下培养Mannheimia sp.LPK来生产琥珀酸的该创造性方法与通过在充满CO2的厌氧条件下培养亲本菌株Mannheimia succiniciproducens 55E来产生琥珀酸的方法相比在产率上表现出有很大提高，并且表现出的琥珀酸∶乙酸之比为40.7∶1，表明其能够生产出带有很少或不带副产物的琥珀酸。
实施例5：pPTA-sacB的构建
为通过同源重组来断裂磷酸乙酰转移酶基因(pta)和乙酸激酶基因(ackA)，可通过以下方式构建基因交换载体。首先将Mannheimia sp.LPK(KCTC 10558BP)的基因组DNA作为模板，用以下SEQ ID NO：22和SEQ IDNO：23中列出的引物进行PCR扩增，将得到的PCR片段用XbaI和BamHI酶切并引入pUC19中，从而构建出pUC19-PTA1。
SEQ ID NO：22：5’-GCTCTAGATATCCGCAGTATCACTTTCTGCGC
SEQ ID NO：23：5’-TCCGCAGTCGGATCCGGGTTAACCGCACAG
之后，将Mannheimia sp.LPK的基因组DNA作为模板，用以下SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25中列出的引物进行PCR扩增，将得到的PCR片段用XbaI和SacI酶切并引入pUC19-PTA1中，从而构建出pUC19-PTA12。
SEQ ID NO：24：5’-GGGGAGCTCGCTAACTTAGCTTCTAAAGGCCATGTTTCC
SEQ ID NO：25：5’-GCTCTAGATATCCGGGTCAATATCGCCGCAAC
用含有壮观霉素抗性基因(GenBank X02588)的质粒pIC156(Steinmetz etal.，Gene，142：79，1994)作为模板，用以下SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27中列出的引物进行PCR扩增，将得到的PCR片段(壮观霉素抗性基因)用EcoRV酶切并引入pUC19-PTA12中，从而构建出具有壮观霉素抗性基因的pUC19-PTA1S2。将构建的pUC19-PTA1S2用SacI和BamHI酶切并引入pUC19-SacB中(见实施例2)，从而构建出pPTA-sacB载体(图6)。
SEQ ID NO：26：5’-GAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCGATCCTC
SEQ ID NO：27：5’-CCCGGGCCGACAGGCTTTGAAGCATGCAAATGTCAC
实施例6：pPPC-sacB的构建
为通过同源重组断裂磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)，可通过以下方式构建基因交换载体。首先，将Mannheimia sp.LPK的基因组DNA作为模板，用以下SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29中列出的引物进行PCR扩增，将得到的PCR产物用XbaI和BamHI酶切并引入pUC19中，从而构建出pUC19-PPC1。
SEQ ID NO：28：5’-TACGGATCCCCAGAAAATCGCCCCCATGCCGA
SEQ ID NO：29：5’-GCTCTAGATATCGTTTGATATTGTTCCGCCACATTTG
之后，将Mannheimia sp.LPK的基因组DNA作为模板，用以下SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31中列出的引物进行PCR，将得到的PCR片段用XbaI和SacI酶切并引入pUC19-PPC1中，从而构建出pUC19-PPC12。
SEQ ID NO：30：5’-GCTCTAGATATCCGTCAGGAAAGCACCCGCCATAGC
SEQ ID NO：31：5’-GGGGAGCTCGTGTGGCGCTGCGGAAGTAAGGCAAAAATC
将用EcoRV酶切了的壮观霉素抗性基因(见实施例5)引入pUC19-PPC12中以构建出pUC19-PPC1S2。用SacI和BamHI酶切该pUC19-PPC1S2并引入pUC19-SacB中，从而构建出pPPC-sacB载体(图7)。
实施例7：Mannheimia sp.LPK7和LPK4菌株的构建
图8和图9表示通过断裂Mannheimia sp.LPK中的pta-ackA和ppc，分别构建突变体菌株LPK7和LPK4的过程。将Mannheimia sp.LPK倒平板于含10g/l葡萄糖的LB-葡萄糖培养基上，在37℃下培养36小时。将形成的菌落接种在10ml LB-葡萄糖液体培养基上培养12小时。将经过充分生长的培养液的1％接种到100ml LB-葡萄糖液体培养基中，在振荡培养箱中以37℃进行培养。
用与实施例3中所述相同的方式从所得到的培养液中收集细胞浓缩物。将所收集的细胞浓缩物与实施例5和6中构建的遗传交换载体pPTA-sacB和pPPC-sacB相混合，然后在1.8kV、25和200ohm条件下进行电穿孔。在电穿孔后的混合物中加入1ml LB-葡萄糖液体培养基，并在振荡培养箱中以200rpm和37℃培养1小时。
将该培养液倒平板于含有壮观霉素抗生素(最终浓度：50(g/ml))的LB-葡萄糖固体培养基上，并在37℃下培养至少48小时。为了选出发生了双交换的菌落，将形成的菌落划线于含50(g/ml)壮观霉素的LB-蔗糖培养基(含100g/l蔗糖的LB培养基)上。24小时后，将形成的菌落在同样的平板上再划线。将平板上形成的菌落(突变体)在含有抗生素的LB-葡萄糖液体培养基中培养，并通过Rochelle et al的方法将基因组DNA从培养的菌株中分离出来。用分离出来的突变体基因组DNA作为模板进行PCR扩增，并将PCR产物进行电泳以证实pta-ackA和ppc基因分别断裂。
为证实pta-ackA基因的断裂，按照下列方式进行两次PCR。首先，将突变体基因组DNA作为模版，用以下SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33中列出的引物进行PCR。然后，将突变体基因组DNA作为模板用以下SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35中列出的引物进行PCR。
SEQ ID NO：32：5’-CCTGCAGGCATGCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTC
SEQ ID NO：33：5’-GCTGCCAAACAACCGAAAATACCGCAATAAACGGC
SEQ ID NO：34：5’-GCATGTAACTTTACTGGATATAGCTAGAAAAGGCATCGGGGAG
SEQ ID NO：35：5’-GCAACGCGAGGGTCAATACCGAAGGATTTCGCCG
将两次PCR中获得的产物进行凝胶电泳，通过它们的大小来证实pta-ackA基因的断裂(图10)。在图10中，M表示1-kb的梯带大小标记；泳道1表示PCR产物P13 & P14(1.1kb)；泳道2表示PCR产物P15 & P16(1.5kb)。通过使用SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的引物(P13 & P14)进行PCR所得到的产物具有1.1kb的条带，同时使用SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35的引物(P15 & P16)进行PCR所得到的产物具有1.5kb的条带，证实了pta-ackA的断裂。引物的位置如图8中所示。通过上述方法构建的突变体菌株，即Mannheimia sp.LPK中的pta-ackA断裂所得到的菌株，被命名为“Mannheimiasp.LPK7”，并以保藏号“KCTC 10626BP”保藏于国际保藏单位KCTC。
此外，为证实ppc基因的断裂，可按照下列方式执行两次PCR。首先，将突变体基因组DNA作为模版，用SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：36中列出的引物进行PCR。然后，将突变体基因组DNA作为模板用SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：37中列出的引物进行PCR。
SEQ ID NO：36：5’-GATCCAGGGAATGGCACGCAGGCTTTCAACGCCGCC
SEQ ID NO：37：5’-GCAAAGCCAGAGGAATGGATGCCATTAACCAATAGCG
将两次PCR中获得的产物进行凝胶电泳，通过它们的大小来证实ppc的断裂(图11)。在图11中，M表示1-kb梯带大小标记；泳道1为PCR产物P13 & P17(1.1kb)；泳道2表示PCR产物P15 & P18(1.5kb)。通过使用SEQID NO：32和SEQ ID NO：36的引物(P13 & P17)进行PCR所得到的产物具有1.1kb的条带，同时使用SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：37的引物(P15 &P18)进行PCR所得到的产物具有1.5kb的条带，证实了ppc的断裂。每个引物的位置如图9中所示。上述构建的突变体菌株，即Mannheimia sp.LPK中ppc断裂得到的菌株，被命名为“Mannheimia sp.LPK4”。
实施例8：LPK7和LPK4的发酵特征
为了检测在上述实施例7中构建的Mannheimia sp.LPK7和LPK4的发酵特征，将该突变体在充满CO2的厌氧条件下进行培养，分析得到的反应产物。首先，将二氧化碳引入200ml如实施例4中所述的预培养基中，分别将Mannheimia sp.LPK7和LPK4接种到预培养基中，并在39℃下预培养24小时。接着，将1.8L培养基，(该培养基除葡萄糖浓度为18g/L(终浓度100mM)以外，与实施例4的中均相同)装在6.6L的培养罐中，并将100ml预培养的微生物接种到该培养基中，然后在39℃和PH6.5下进行分批培养，同时以0.25vvm的流速提供二氧化碳。
用与实施例4中相同的方式测定细胞、琥珀酸、葡萄糖、乳酸、乙酸和甲酸的浓度(图12和图13)。图12和图13中的符号表示了随培养时间的推移，细胞(上部分●)，琥珀酸(下部分●)，葡萄糖(□)，甲酸(◆)和乙酸(▲)的浓度变化。如图12所示，Mannheimia sp.LPK7经过22个小时的培养之后，消耗的葡萄糖的浓度为100mM，产生的琥珀酸浓度为124mM，表明琥珀酸的产率(产生琥珀酸的量/消耗葡萄糖的量)为124mol％。并且，乙酸产量明显减少(表1)。同样，如图13所示，Mannheimia sp.LPK4经过22个小时的培养之后，消耗的葡萄糖的浓度为100mM，产生的琥珀酸浓度为123.7mM，表明琥珀酸的产率(产生琥珀酸的量/消耗葡萄糖的量)为123.7mol％。并且，与野生型相比乙酸的产量明显减少(表1)。
在充满CO2的厌氧条件下培养Mannheimia sp.LPK7来生产琥珀酸的该创造性方法与在充满CO2的厌氧条件下培养亲本菌株Mannheimiasucciniciproducens 55E来生产琥珀酸的方法相比，在琥珀酸产率上有很大的提高，在琥珀酸∶乙酸的比例上也提高了9.8倍，表明该创造性方法能够生产出带有很少或不带副产物的琥珀酸(表1)。
根据Bulter et al.的报道，即使将迄今为止已知的微生物中的产乙酸的基因全部断裂，在氨基酸和脂肪酸代谢中也会产生大量的乙酸，但其还没有被认可(Bulter et al.PNAS，101：2299，2004)。因此，本发明切断了迄今为止已知的所有产乙酸途径，并实现了高产率和浓度的琥珀酸发酵。
表1：厌氧条件下LPK4和LPK7的发酵产物与55E的发酵产物之比较
菌株   发酵产物(mM)   S/A比例(倍数)
  琥珀酸   乙酸   甲酸   乳酸   丙酮酸   乙醇
  55E   99.1   40.6   53.8   8.2   13   ＜1.0   2.44(1.0)
  LPK4   123.7±6.2   28.1±5.4   ND   ND   12.2±6.3   ＜1.0   4.40(1.8)
  LPK7   124.0±5.2   5.2±0.2   ND   ND   36.36±4.7   ＜1.0   23.84(9.8)
尽管参考特定技术特征对本发明进行了详细描述，但对本领域技术人员来说显然该说明仅仅针对优选的实施例，而并非限制了本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求及其等价方式所限定。
工业实用性
如上述详细描述和所提供的那样，Mannheimia sp.突变体菌株(LPK、LPK7和LPK4)在充满CO2的厌氧条件下能产生琥珀酸，并且是对氧气有高抗性的兼性厌氧菌株。因此，与采用专性厌氧菌株生产琥珀酸的现有方法相比，使用本发明的这些菌株生产琥珀酸不仅能消除发酵过程由于暴露于氧气中等所引起的不稳定性，而且还避免了其它有机酸的生成，从而可以优化纯化工艺并使产量最大化。
序列表
<110>韩国科学技术院(Korean Advanced Institute of Science andTechnology)
<120>新型瘤胃细菌突变体及利用其制备琥珀酸的方法
<130>FP06KR110
<140>PCT/KR2004/001210
<141>2004-05-20
<150>10-2003-0084934
<151>2003-11-27
<150>10-2004-0028105
<151>2004-04-23
<160>37
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer LS1
<400>1
cagtgaagga gctccgtaac gcatccgccg                                       30
<210>2
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<213>Artificial
<220>
<223>Primer LP1
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ctttatcgaa tctgcaggcg gtttccaaaa                                       30
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<213>Artificial
<220>
<223>Primer LP2
<400>3
gtactgtaaa ctgcagcttt catagttagc                                       30
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer LH2
<400>4
gccgaaagtc aagcttgccg tcgtttagtg                                       30
<210>5
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Linker 1
<400>5
tctagaagct                                                             10
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<223>Primer SXF
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer SXR
<400>7
gctctagagg ctacaaaatc acgggcgtc                                        29
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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caaggatcca acggataaag cttttattat                                       30
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<212>DNA
<213>Artificial
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<213>Artificial
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ctcgagcccc gggctttgcg ccgaataaat                                       30
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cattgaggcg tattatcagg aaac                                             24
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<212>DNA
<213>Artificial
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gcagtttcat ttgatgctcg atg                                              23
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
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cctcttacga tgacgcatct ttcc                                             24
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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ccccagcatg tgcaaatctt cgtcac                                           26
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<213>Artificial
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gctctagata tccgcagtat cactttctgc gc                                    32
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<212>DNA
<213>Artificial
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<223>Primer
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tccgcagtcg gatccgggtt aaccgcacag                                       30
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<213>Artificial
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<223>Primer
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ggggagctcg ctaacttagc ttctaaaggc catgtttcc                             39
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<212>DNA
<213>Artificial
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<223>Primer
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gctctagata tccgggtcaa tatcgccgca ac                                    32
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gaattcgagc tcgcccgggg atcgatcctc                                       30
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<213>Artificial
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cccgggccga caggctttga agcatgcaaa tgtcac                                36
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<213>Artificial
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<223>Primer
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tacggatccc cagaaaatcg cccccatgcc ga                                    32
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer
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gctctagata tcgtttgata ttgttccgcc acatttg                               37
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<212>DNA
<213>Artificial
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<223>Primer
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gctctagata tccgtcagga aagcacccgc catagc                                36
<210>31
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer
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ggggagctcg tgtggcgctg cggaagtaag gcaaaaatc                             39
<210>32
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer
<400>32
cctgcaggca tgcaagcttg ggctgcaggt cgactc                                36
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<212>DNA
<213>Artificial
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<223>Primer
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gctgccaaac aaccgaaaat accgcaataa acggc                                 35
<210>34
<211>43
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer
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gcatgtaact ttactggata tagctagaaa aggcatcggg gag                        43
<210>35
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer
<400>35
gcaacgcgag ggtcaatacc gaaggatttc gccg                                  34
<210>36
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<220>
<223>Primer
<400>36
gatccaggga atggcacgca ggctttcaac gccgcc                                36
<210>37
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer
<400>37
gcaaagccag aggaatggat gccattaacc aatagcg                               37

Claims (30)

1.一种瘤胃细菌突变体，其特征在于乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)发生了断裂，并且具有在厌氧条件下产生高浓度琥珀酸而很少或不产生其它有机酸的特性。
2.一种瘤胃细菌突变体，其特征在于乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)、磷酸乙酰转移酶编码基因(pta)和乙酸激酶编码基因(ackA)发生了断裂，并且具有在厌氧条件下产生高浓度琥珀酸而很少或不产生其它有机酸的特性。
3.一种瘤胃细菌突变体，其特征在于乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因(ppc)发生了断裂，并且具有在厌氧条件下产生高浓度琥珀酸而很少或不产生其它有机酸的特性。
4.根据权利要求1-3中任意一项的瘤胃细菌突变体，其特征在于其中所述瘤胃细菌选自以下物质构成的组：Mannheimia属、放线杆菌属和厌氧螺菌属。
5.根据权利要求1-3中任意一项的瘤胃细菌突变体，其特征在于其中所述瘤胃细菌优选为同型发酵细菌，其只产生琥珀酸而很少或不产生其它有机酸。
6.根据权利要求1的瘤胃细菌突变体，其特征在于其中所述瘤胃细菌突变体为Mannheimia sp.LPK。
7.根据权利要求6的瘤胃细菌突变体，其特征在于其中所述Mannheimiasp.LPK为KCTC 10558BP。
8.根据权利要求2的瘤胃细菌突变体，其特征在于其中所述瘤胃细菌突变体为Mannheimia sp.LPK7。
9.根据权利要求8的瘤胃细菌突变体，其特征在于其中所述Mannheimiasp.LPK7为KCTC 10626BP。
10.根据权利要求3的瘤胃细菌突变体，其特征在于其中所述瘤胃细菌突变体为Mannheimia sp.LPK4。
11.一种生产具有在厌氧条件下产生高浓度琥珀酸而很少或不产生其它有机酸的特性的瘤胃细菌突变体的方法，其特征在于在选自Mannheimia属，放线杆菌属和厌氧螺菌属的瘤胃细菌中断裂乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)。
12.一种产生具有在厌氧条件下产生高浓度琥珀酸而很少或不产生其它有机酸的特性的瘤胃细菌突变体的方法，其特征在于在选自Mannheimia属、放线杆菌属和厌氧螺菌属的瘤胃细菌中另外断裂磷酸乙酰转移酶编码基因(pta)和乙酸激酶编码基因(ackA)，而乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)已经被断裂。
13.一种产生具有在厌氧条件下产生高浓度琥珀酸而很少或不产生其它有机酸的特性的瘤胃细菌突变体的方法，其特征在于在选自Mannheimia属、放线杆菌属和厌氧螺菌属的瘤胃细菌中另外断裂磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因(ppc)，而乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)已经被断裂。
14.根据权利要求12或13所述的产生瘤胃细菌突变体的方法，其特征在于其中所述具有乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因(pfl)断裂的瘤胃细菌突变体为Mannheimia sp.LPK(KCTC 10558BP)。
15.根据权利要求11所述的产生瘤胃细菌突变体的方法，其特征在于其中ldhA和pfl基因的断裂通过同源重组实现。
16.根据权利要求15所述的产生瘤胃细菌突变体的方法，其特征在于其中所述同源重组采用含有断裂ldhA的遗传交换载体和含有断裂pfl的遗传交换载体来进行。
17.根据权利要求16所述的产生瘤胃细菌突变体的方法，其特征在于其中所述含有断裂ldhA的遗传交换载体为pMLKO-sacB，含有断裂pfl的遗传交换载体为pMPKO-sacB。
18.根据权利要求12所述的产生瘤胃细菌突变体的方法，其特征在于其中pta和ackA基因的断裂通过同源重组实现。
19.根据权利要求18所述的产生瘤胃细菌突变体的方法，其特征在于其中所述同源重组采用含有断裂pta和ackA的遗传交换载体来实现。
20.根据权利要求19所述的产生瘤胃细菌突变体的方法，其特征在于其中所述含有断裂pta和ackA的遗传交换载体为pPTA-sacB。
21.根据权利要求13所述的产生瘤胃细菌突变体的方法，其特征在于其中ppc基因的断裂通过同源重组实现。
22.根据权利要求21所述的产生瘤胃细菌突变体的方法，其特征在于其中所述同源重组采用含有断裂ppc的遗传交换载体来实现。
23.根据权利要求22所述的产生瘤胃细菌突变体的方法，其特征在于其中含有断裂ppc的遗传交换载体为pPPC-sacB。
24.一种含有断裂ldhA的遗传交换载体pMLKO-sacB。
25.一种含有断裂pfl的遗传交换载体pMPKO-sacB。
26.一种含有断裂pta和ackA的遗传交换载体pPTA-sacB。
27.一种含有断裂ppc的遗传交换载体pPPC-sacB。
28.一种生产琥珀酸的方法，其特征在于包括下述的步骤：在厌氧条件下培养权利要求1-3中任意一项中的瘤胃细菌突变体；以及从培养液中回收琥珀酸。
29.根据权利要求28所述的生产琥珀酸的方法，其特征在于其中所述培养步骤为同型发酵，其产生高浓度的琥珀酸而很少或不产生其它的有机酸。
30.根据权利要求28所述的生产琥珀酸的方法，其特征在于其中所述瘤胃细菌突变体为Mannheimia sp.LPK，LPK4或LPK7。
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