CN102317438A - 琥珀酸的新型微生物生产者和琥珀酸的纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够利用甘油作为碳源发酵生产琥珀酸的细菌菌株，其中所述菌株是经过遗传修饰的，使其包含失调的内源性丙酮酸-甲酸-裂解酶活性，并涉及利用此类微生物生产有机酸，特别是琥珀酸的方法。本发明还涉及通过阳离子交换层析对所生产的有机酸的下游加工。

Description

琥珀酸的新型微生物生产者和琥珀酸的纯化
本发明涉及能够利用甘油作为碳源发酵生产琥珀酸的细菌菌株，其中所述菌株是经过遗传修饰的，使其包含下调的内源性丙酮酸-甲酸-裂解酶活性，并涉及利用此类微生物生产有机酸，特别是琥珀酸的方法。
发明背景
从生物质发酵生产琥珀酸(SA)已引起了广泛关注，因为所述酸是合成树脂的重要成分，或者是其他有价值的低分子化学化合物的来源，特别是四氢呋喃(THF)、1，4-丁二醇(BFO)、γ-丁内酯(GBL)和吡咯烷酮(WO-A-2006/066839)。
Lee等(2002a)描述了从牛的瘤胃分离的SA生产菌。所述细菌是不动的、不形成芽孢的、嗜中温和嗜二氧化碳的革兰氏阴性的杆状或球杆菌。基于16S rRNA序列的系统发生学分析和生理学分析表明所述菌株属于曼海姆菌(Mannheimia)属，作为新种，被称为产琥珀酸曼海姆菌(Mannheimiasucciniciproducens)MBEL55E。在100％CO2条件下，它在6.0-7.5的pH范围内生长良好，并以2∶1∶1的恒定比例生产SA、乙酸和甲酸。当CO2饱和条件下，用葡萄糖作为碳源，无氧培养产琥珀酸曼海姆菌MBEL55E时，在孵育7.5h里，消耗了19.8g/L的葡萄糖，产生了13.3g/L的SA。此外，在该微生物中，通过突变/删除代谢基因，改善了SA的生产。乳酸脱氢酶IdhA、丙酮酸-甲酸-裂解酶pFlB、磷酸转乙酰基酶pta和乙酸激酶ackA基因的组合突变/删除导致菌株将碳转化为SA的产量(YP/S)为0.6gSA/g添加的碳源。生产SA的时空产量为1.8g/升/h(Lee，2006)。
Lin等，2005描述了在Idh和pfI基因中都携带突变的大肠杆菌的变体菌株，称为SB202。然而，该菌株的特征是生长缓慢，且在无氧条件下不能完全发酵糖类。失活的Idh和pfI导致碳流动被限制于丙酮酸节点，导致丙酮酸作为主要产物积累。在该方面，发现基于碳源的琥珀酸的碳产量(YP/S)低于0.15g/g SA/碳。
Sanchez等，2005描述了在Idh、adhE、ack-pta和icIR基因中携带突变的大肠杆菌菌株。在这些实验中，细胞有氧的生长在复杂培养基上，在有氧条件下收获、浓缩和用碳源孵育。在这些用于将碳水化合物直接转化为SA的特定条件下，发现碳产量YP/S为0.98至1.13g SA/g碳源，时空产量为0.79g/l h SA。在好氧转化阶段前的生物量生产的碳利用明确的不包括在该计算中，且未进行进一步描述。
Hong和Lee(2001)描述了在Idh和pfI基因中携带突变的大肠杆菌菌株。这些菌株确能从碳水化合物发酵中生产SA，然而，伴随缓慢的碳水化合物利用和从碳水化合物碳源葡萄糖的低的SA时空和碳产量(YP/S)。此外，产生琥珀酸、乙酸和乳酸的比例为1∶0.034∶1.6。在该分析中，与未突变的亲本菌株相比，在Idh和pfI基因中携带突变的菌株的生长是迟缓的。
Zhu等，2005描述了在pfI基因中突变的E.coli菌株，其不产生琥珀酸，但产生乳酸，当在以葡萄糖为惟一底物的条件下生长时，表现出低下的生长。
然而，生物产琥珀酸曼海姆菌的重要缺陷是它不能代谢甘油，而甘油作为三酰基甘油(TAG)的组分是便于获得的，例如作为生物柴油生产的酯基转移反应中的副产品(Dharmadi等，2006)。
科学文献中已描述了从甘油发酵生产SA(Lee等，2001；Dharmadi等，2006)，并且甘油获得了比普通糖类如葡萄糖更高的产量(生产的SA的质量/消耗的原材料的质量)(Lee等，2001)。然而，用甘油获得的时空产量显著低于葡萄糖(0.14vs.1.0g SA/[L h])。
仅在少数情况下描述了将甘油无氧代谢成发酵产物。E.coli能够在非常特定的条件下发酵甘油，例如酸性pH，避免积累发酵氢气，以及恰当的培养基组成(Dhamadi等，2006，Yazdani和Gonzalez 2007)。许多微生物能够在存在外部电子受体的条件下代谢甘油(呼吸代谢)，极少数能够发酵代谢甘油(即，在缺少电子受体的条件下)。在肠杆菌科的若干个种中，已详细的研究了甘油的发酵代谢，例如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。这些生物体中的甘油异化作用与它们合成高度还原的产物1，3-丙二醇(1，3-PDO)的能力是严格相关的(Dhamadi等，2006)。已报道了使用产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)将甘油转化为SA(Lee等，2001)。该研究证实，使用甘油作为碳源可以生产SA并极少形成副产物乙酸，因而有利于SA的纯化。通过间歇性添加甘油和酵母提取物，获得最高产量，该对策获得约19g/L SA的产量。然而应注意，酵母提取物中存在进行甘油发酵所需的未鉴定的营养组分。然而，由于糖类比多元醇甘油更低的还原状态，糖类理论上应该以比甘油显著更低的产量转化为SA。发现在生产SA的厌氧性生物体中，糖类与甘油的组合是有作用的(Lee等，2001)，但没有达到超过29g/L的SA滴度。此外，发现碳产量YP/S仅为92％，而SA/AA比为4.9∶1。最多仅4g/L甘油转化为琥珀酸。
由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPG)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和丙酮酸羧化酶(PycA)催化的草酰乙酸的羧化反应利用HCO3 -作为CO2源(Peters-Wendisch，PG等，1996，1998)。因此，碳酸氢盐来源例如NaHCO3、KHCO3、NH4HCO3等可用于发酵和培养基质，以改善底物至SA的代谢中HCO3 -的利用度。迄今为止的现有技术中尚未发现从葡萄糖生产SA依赖于添加HCO3 -。
厌氧生物体的生物质生产受从发酵通路生产的ATP量的限制。厌氧生物体中的甘油的生物量产量低于糖类的，例如己糖如葡萄糖、果糖，戊糖如木糖、阿拉伯糖或二糖例如蔗糖或麦芽糖(Lee等，2001，Dharmadi2007)。
早期的专利申请PCT/EP2008/006714公开了这样的细菌菌株，其属于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的成员，从瘤胃中原始分离，并能够利用甘油作为碳源，来源于它的变体和突变菌株保留了所述能力，特别是以保藏编号DSM 18541(ID 06-614)保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心，D-38124不伦瑞克，因霍芬路7B，德国)中的命名为DD1的细菌菌株，具有生产琥珀酸的能力，来源于它的变体和突变菌株至少保留了所述生产琥珀酸的能力，该申请的内容通过引用整合到本文中。根据Kuhner等，2010的分类，DD1菌株属于Basfia succiniciproducens种，巴斯德氏菌科。
因此，需要新型的细菌菌株，其具有从甘油生产有机酸，特别是SA的能力。特别的是，此类菌株应该以高生产力从甘油生产所述酸类，尤其是可以使用不进行在先纯化、例如来自生物柴油生产的粗制甘油。本发明的目标是提供此类新型菌株和生产方法。
发明概述
本发明人分离了名为DD1的细菌菌株，令人惊讶的通过突变所述菌株解决了所述目标，使得PFL蛋白质的活性下降，而使得所述菌株具有理想的代谢特征。因而，提供了能够利用甘油作为碳源发酵生产琥珀酸的新型细菌菌株，其中所述菌株是经过遗传修饰的，使得其包含下调的内源性PFL酶活性。
本发明人令人惊讶的发现此类突变的细菌菌株具有理想的代谢特征，在SA发酵中表现出极大改善的技术表现。
附图简介
图1描述了质粒pSacB(SEQ ID NO：3)的示意图。
图2描述了质粒pSacB(ΔpfI)(SEQ ID NO：4)的示意图。
图3描述了质粒pSacB(ΔIdh)(SEQ ID NO：5)的示意图。
发明详述
a)特定术语的一般定义：
本文使用的术语“细菌细胞”指原核生物体，即，细菌。细菌可以基于它们的生物化学、微生物学特性及其形态学来分类。这些分类标准是本领域普遍已知的。
术语“酸”(如本文所指的有机单羧酸或二羧酸，即乳酸和SA)理解为最广泛的含义，并且也涵盖了它的盐，例如碱金属盐、如Na和K盐，或碱土金属盐，如Mg和Ca盐，或铝盐；或所述酸的酸酐。
两条序列之间的“同一性”或“同源性”意指在所比对序列的完整长度上的残基的同一性，例如在生物信息学软件包EMBOSS(版本5.0.0，http://emboss.sourceforge.net/what/)中的程序needle的帮助下计算的同一性(对于较相似的序列)，使用默认参数为：
gapopen(打开1个空位的罚分)：10.0
gapextend(延伸空位的罚分)：0.5
datafile(软件包中包括的打分矩阵文件)：EDNAFUL
术语“含有编码具有活性减少的丙酮酸-甲酸-裂解酶的突变基因的细菌菌株”涵盖了具有减少的活性或者甚至不可检测的PEL活性的修饰的细菌细胞。用于检测和确定PFL活性的罚分可见于Knappe等，1990和Knappe1993及其中的参考文献中。此外，术语涵盖了当相比表现出生理学丙酮酸-甲酸-裂解酶活性的细菌细胞时，具有显著降低的PFL活性的细菌细胞。通过本领域技术人员普遍已知的统计学方法，可以确定降低是否是显著的。PFL活性缺陷的细菌细胞可以天然的存在，即由于自发突变。可以通过各种技术来修饰细菌细胞至缺少或具有显著降低的PFL活性。优选的，此类细菌细胞时、是通过化学处理或辐射可获得的。为此目的，通过例如诱变的化学试剂、X射线或UV光处理细菌细胞。在随后的步骤中，选择这些缺少PFL或至少具有降低的PFL活性的细菌细胞。细菌细胞还可通过同源重组技术获得，所述技术的目标是突变、断裂或切除细菌细胞基因组中的PFL，或者导入将导致编码具有减少活性的蛋白质的突变基因的突变。下文描述了重组的优选技术，特别是用于导入突变或删除序列的。
上文的定义还适用于编码本文提及的另一种酶的、待调节的其他基因，特别是所述调节指其活性是减少的、消失的或关闭的。
术语“减少的活性”包括例如所述遗传操作的(例如，遗传改造的)微生物的基因产物(例如，丙酮酸-甲酸-裂解酶(pfI)、乳酸脱氢酶(Idh)或其他)的表达处于比操作微生物前的表达更低的水平。遗传操作可以包括但不限于改变或修饰与特定基因表达相关的调控序列或位点(例如，通过去除强启动子、诱导型启动子或多重启动子)、修饰特定基因的染色体位置、改变与特定基因相邻的核酸序列如在启动子区域的序列，包括对启动子活性重要的调控序列、核糖体结合位点或转录终止子、减少特定基因的拷贝数、修饰涉及特定基因转录和/或特定基因产物的翻译的蛋白质(例如，调控蛋白、抑制子、增强子、转录激活子等)，或者任何其他的常规手段，来降低现有技术中常规的特定基因的减少的表达(包括但不限于使用反义核酸分子，或者其他的敲除或阻断表达靶蛋白的方法)。
特别的是，可以操作基因使得从宿主生物体的染色体中删除一个或多个核苷酸。还可以通过导入一个或多个基因突变，来获得活性减少的基因产物，例如丙酮酸-甲酸-裂解酶分子，其中上市突变导致基因产物的活性减少。活性减少可以是将酶活性降低了≥50％的非突变或未改变的酶活性，或者降低了酶活性≥90％，或者更优选降低酶活性≥95％，或者更优选降低酶活性≥98％，或者甚至更优选降低酶活性≥99％，或者甚至更优选降低酶活性≥99.9％。
术语“重组”微生物包括经遗传改变的、修饰的或改造的(例如遗传改造的)微生物(例如，细菌、酵母细胞、真菌细胞等)，使其相比来源的天然存在的微生物，表现出改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)。术语“启动子”指指导结构基因转录生产mRNA的DNA序列。典型的，启动子位于基因的5’区，靠近结构基因的起始密码子。如果启动子是可诱导型启动子，则转录速率响应诱导剂而增加。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂的调控。
术语“增强子”指一种启动子元件。增强子可以增加特定基因转录成mRNA的效率，不论增强子相对于转录的起始位点的距离或方向。
术语“克隆载体”指DNA分子，例如质粒、粘粒、噬菌粒或噬菌体，其具有在宿主细胞中自主复制的能力，且用于转化细胞进行基因操作。克隆载体典型的含有一个或少量的限制性核酸内切酶识别位点，其中可以以可确定的方式插入外源DNA序列而不丧失载体的基本生物学功能，以及标志物基因，其适合用于鉴别和选择用克隆载体转化的细胞。标志物基因典型的包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
术语“载体”指包含编码外源蛋白质的克隆的结构基因的DNA分子，其在重组宿主中提供基因。典型的，在用于整合到宿主基因组中的载体的情况下，将克隆的基因置于或可操作的连接于某些与宿主遗传序列同源或相同的上游和下游序列。
术语“重组宿主”指可以是任何原核或真核细胞的宿主，其含有克隆载体或表达载体。该术语还意在包括经遗传改造而在宿主细胞的染色体或基因组中含有克隆基因的原核或真核细胞。合适的实例参见Sambrook等，1989。
术语“表达”指基因产物(例如，本申请中定义和描述的通路或反应中的基因的生物合成的酶)以这样的水平表达，在所述水平获得的该编码蛋白质的酶活性或其指代的通路或反应允许代谢流通过表达该基因/通路的生物体中的所述通路或反应。表达可以通过遗传改变用作起始生物的微生物来进行。在一些实施方案中，微生物可以经过遗传改变(例如，遗传改造的)，以增加的水平表达基因产物，所述水平是相对于起始微生物生产的或未经改变的可比较的生物体的。遗传改变包括但不限于改变或修饰与特定基因表达相关的调控序列或位点(例如，通过添加强启动子、诱导型启动子或多重启动子，或者通过去除调控序列使得表达是组成型的)，修饰特定基因的染色体位置，改变与特定基因相邻的核酸序列例如核糖体结合位点或转录终止子，增加特定基因的拷贝数，修饰涉及特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(例如，调控蛋白、抑制子、增强子、转录激活子等)，或者本领域常规使用的任何其他解除特定基因表达的常规调节的手段(包括但不限于使用反义核酸分子，例如阻断抑制子蛋白的表达)。
可以生理上或环境上“改变”或“修饰”微生物，来以增加的或较低的水平表达基因产物，所述水平是相对于起始微生物的基因产物的表达水平的。例如，微生物可以用(化学或遗传的)试剂处理，或培养在存在试剂的条件下，已知或怀疑所述试剂增加或减少特定基因的转录和/或翻译，和/或特定基因产物的翻译，使得转录和/或翻译是增加的或减少的。可选的，微生物可以在培养选定的温度下，所述温度增加或减少特定基因的转录和/或翻译，和/或特定基因产物的翻译，使得转录和/或翻译是增加的或减少的。“遗传修饰的”指通过本领域可获得的遗传工程技术，例如转化、突变、同源重组，按上述意义改变的微生物。
术语“失调(deregulate)”指微生物中至少一个基因的改变或修饰，其中所述改变或修饰导致相对于缺少所述改变或修饰条件下的SD生产，微生物中SA的效率增加。在一些实施方案中，改变或修饰的基因编码生物合成通路中的酶或运输蛋白，使得微生物中的生物合成酶的水平或活性是改变或修饰的，或者运输特异性或效率是改变或修饰的。在一些实施方案中，至少一个编码生物合成通路中的酶的基因是改变或修饰的，使得相对于在未改变或野生型基因的条件下，酶的水平或活性是增强或增加的。失调还包括改变改变一个或多个基因的编码区，产生例如反馈耐受的或具有更高或更低比活的酶。此外，失调进一步涵盖了编码转录因子(例如，激活子、抑制子)的基因的遗传改变，所述转录因子调控编码酶或运输蛋白的基因的表达。更具体的是，失调可以导致“减少的”酶活性，其中所获得的酶活性少于100％酶活性，如在未失调状态“关闭”时观察到的，即可逆的或不可逆的，通过常规的分析工具如酶活性测定，不再存在或至少不再可检测的。
术语“能够利用”指本发明的微生物转化底物的能力，例如将甘油转化为至少一种结构上和/或空间结构上不同的化学产品。
“涉及或关联甘油发酵转化为琥珀酸的酶活性”意指影响甘油转化为琥珀酸和/或副产品的任何酶的催化活性或调控活性，如可由下文定义的参数集合的任一项确定的。
本文描述的不同的产量参数(“产量”或YP/S；“比产出率”；或时空产量(STY))是本领域普遍已知的，并如Song和Lee，2006所述来确定。
“产量”或YP/S(分别按所生产的产品质量/所消耗的材料的质量来表述)在本文中用作同义词。
比产出率描述了单位h和L的发酵培养液/g干燥生物量所生产的产品、如SA的量。称为DCW的干细胞重量的量描述了生化反应中的生物学活性的微生物的量。给出的值为g产物/g DCW/h(即，g/g DCW-1h-1)。
术语“发酵生产”或“发酵”指微生物在细胞培养物中利用至少一种添加到孵育中的碳源生产化学化合物的能力(受所述微生物中含有的或产生的酶活性的辅助)。
术语“发酵培养液”理解为意指基于发酵过程的且尚未耗尽(work up)或已经耗尽的含水溶液，例如本文所述。
b)不同微生物的一般性定义
根据本发明的“细菌细胞”或“细菌菌株”指选自肠杆菌科、巴斯德氏菌科、芽孢杆菌科或放线菌科的。
“肠杆菌科”代表了细菌的一大科，包括许多熟悉的细菌，如沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌。它们属于变形菌(Proteobacteria)，并形成自己的目(肠杆菌目)。肠杆菌科的成员是杆状的。类似于其他变形菌，它们具有革兰氏阴性菌株，并且是兼性厌氧型生物，发酵糖生产乳酸和多种其他终产物，例如琥珀酸。大部分也还原硝酸盐为亚硝酸盐。与大部分相似的细菌不同，肠杆菌科一般缺少细胞色素C氧化酶。大部分具有许多鞭毛用于移动，但少数属是不动的。它们不形成芽孢，并且大部分情况下是过氧化氢酶阳性的。该科的许多成员是人和其他动物的肠中的肠道菌群的正常部分，同时其他成员可见于水或土壤中，或者是多种不同动物和植物的寄生物。大肠杆菌，更被称为E.coli，是最重要的模式生物之一，它的遗传和生物化学已被严密的研究过。肠杆菌科的大部分成员都具有周生的I型菌毛，参与细菌细胞与其宿主的附着。肠杆菌科的实例是E.coli、变形杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌。
“巴斯德氏菌科”包括革兰氏阴性变形菌的一个大的且多样的科，成员从细菌如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)至动物和人类粘膜的共生菌。大部分成员作为共生菌生活在鸟类和哺乳动物的粘膜表面，特别是在上呼吸道。巴斯德氏菌科典型的是杆状的，并且是令人注意的一群兼性厌氧生物。可以通过存在氧化酶与相关的肠杆菌科区分开，并且通过缺少菌毛与其他相似的细菌区分开。巴斯德氏菌科中的细菌基于代谢特性和16S和23S RNA的序列分类为多个属。巴斯德氏菌科的更精确的定义可见于Dousse等，2008和Kuhnert，P.2008及其中的参考文献。许多巴斯德氏菌含有丙酮酸-甲酸-裂解酶，能够将碳源厌氧发酵为有机酸。
术语“芽孢杆菌”指细菌的一个分类学类别，包括两个目，芽孢杆菌目和乳杆菌目(Lactobacillales)。芽孢杆菌代表了大型的(～4-8x1.5ìm)圆柱状细菌，可以生长在37℃下的好氧条件中。典型的是非致病性的。芽孢杆菌科含有脂环酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae)、芽孢杆菌属(Bacillaceae)、显核菌科(Caryophanaceae)、李斯特氏菌科(Listeriaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)、动性球菌科(Planococcaceae)、芽孢乳杆菌科(Sporolactobacillaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、高温放射菌科(Thermoactinomycetaceae)、Turicibacteraceae。许多芽孢杆菌含有丙酮酸-甲酸-裂解酶，能够将碳源厌氧发酵为有机酸。
术语“放线菌”或“放线菌类”指一类具有高G+C比例的革兰氏阳性菌。包括一些最常见的土壤生物，在有机材料降解中发挥作用作用。其他的放线菌栖居在植物和动物中，实例是分支杆菌(Mycobacterium)、棒状杆菌(Corynebacterium)、诺卡氏菌(Nocardia)、红球菌(Rhodococcus)和链霉菌(Streptomyces)。一些放线菌形成分支的菌丝，一些类似于不相关的真菌的菌丝体，最初分在名为放射菌(Actinomycetes)的目下。大部分成员是好氧的，但少数生长在厌氧条件下。与另一大类革兰氏阳性菌--硬壁菌(Firmicutes)不同，其具有高GC含量的DNA。
优选的细菌菌株是“巴斯德氏菌”属。巴斯德氏菌属的细菌是革兰氏阴性和兼性厌氧的。巴斯德氏菌是不动的、多形的和在大多数情况下过氧化氢酶和氧化酶阳性的(Kuhnert和Christensen，2008，ISBN978-1-904455-34-9)。优选的细菌细胞是巴斯德氏菌细胞，更优选的是巴斯德氏菌菌株DD1细胞。
最优选的，巴斯德氏菌菌株DD1是按布达佩斯条约保藏在德国DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，GmbH)的细菌菌株，具有保藏编号DSM 18541。该菌株最初从德国来源的牛的瘤胃中分离。
可以从动物，优选哺乳动物的胃肠道中分离巴斯德氏菌。特别是细菌菌株DD1可分离自牛的瘤胃，并能够利用甘油(包括粗制甘油)作为碳源。优选的，所述菌株具有从甘油(包括粗制甘油)生产SA的能力，特别是在厌氧条件下。此外，巴斯德氏菌菌株DD1表现出至少一种下列额外的代谢特征：
a)从蔗糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；
b)从麦芽糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；
c)从D-果糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；
d)从D-半乳糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；
e)从D-甘露糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；
f)从D-葡萄糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；
g)从D-木糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；
h)从L-阿拉伯糖生产琥珀酸；特别是在厌氧条件下；
i)不利用木糖醇、肌醇和山梨糖醇；
j)在好氧和厌氧条件下都可生长；
k)在75g/l或更高的初始葡萄糖浓度下生长；
l)氨耐受性。
特别的，所述菌株表现出至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或所有的所述代谢特征。
分析菌株DD1共同代谢(co-metabolize)糖类和多元醇甘油的能力(PCT/EP2008/006714)。发现DD1能够共同代谢麦芽糖和甘油，产生生物量形成、SA形成和同步的麦芽糖和甘油利用。
c)优选的实施方案
本发明的第一个实施方案涉及能够利用甘油作为碳源发酵生产SA的细菌菌株，其中所述菌株是经过遗传修饰的，使其包含失调的内源性丙酮酸-甲酸-裂解酶活性。特别的是，所述丙酮酸-甲酸-裂解酶活性是减少或关闭的。
所述含有活性减少的丙酮酸-甲酸-裂解酶的突变细菌，可通过遗传学手段以及应用现有技术文献中普遍已知的突变方法导入突变来构建(修饰细菌基因组的实例和描述可见于Saier，Milton H Jr 2008；Foster，Patricia L，2007；Witkin，E M 1969；Eisenstark，A 1971；Walker，GC等，1983和1984；Botstein，D和Shortle，D 1985及其中的参考文献)，所述细菌能够利用不同碳源的混合物如糖类和甘油；或者只利用甘油。分离pfI基因中具有突变的菌株的方法可见于Varenne S等，1975和Pascal，M等，1981中。
优选的所述菌株具有从不同的碳源(包括甘油)生产SA的能力，特别是在厌氧的条件下。
在所述菌株的另一个实施方案中，参与或关系到甘油发酵转化为琥珀酸的至少一种其它酶活性是失调的。
特别的是，所述菌株源自选自肠杆菌科、巴斯德氏菌科、芽孢杆菌科或放线菌科微生物的微生物。
特别的是，所述菌株源自巴斯德氏菌科的微生物，具有SEQ ID NO：1或表现出与其至少有96、97、98、99或99.9％的序列同源性的序列的16SrDNA；和/或具有SEQ ID NO：2或表现出与其至少有95、96、97、98、99或99.9％的序列同源性的序列的23S rDNA。在本发明的一个实施方案中，细菌菌株是源自巴斯德氏菌科的微生物，并属于物种产琥珀酸巴斯德氏菌。产琥珀酸巴斯德氏菌是由Kuhnert等，2010定义的，其通过引用整合到本文中。
本发明的细菌菌株还表现出至少一种下列额外的代谢特征：
a)从蔗糖生产琥珀酸；
b)从麦芽糖生产琥珀酸；
c)从麦芽糊精生产琥珀酸；
d)从D-果糖生产琥珀酸；
e)从D-半乳糖生产琥珀酸；
f)从D-甘露糖生产琥珀酸；
g)从D-葡萄糖生产琥珀酸；
h)从D-木糖生产琥珀酸；
i)从L-阿拉伯糖生产琥珀酸；
j)从乳糖生产琥珀酸；
k)从棉子糖生产琥珀酸；
l)从甘油生产琥珀酸；
m)在75g/l或更高的初始葡萄糖浓度下生长；
n)在70g/l或更高的初始甘油浓度下生长。
作为示例，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或所有所述特征与特征1)(甘油-＞SA)组合，其中特征1)作为每种所述组合中强制性的构成要素。
在其他实施方案中，本发明的菌株将蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油转化为琥珀酸，产率系数YP/S为至少0.5g/g，优选达1.28g/g；作为示例，产率系数YP/S为至少0.6g/g，至少0.7g/g，至少0.75g/g，至少0.8g/g，至少0.85g/g，至少0.9g/g，至少0.95g/g，至少1.0g/g，至少1.05g/g，至少1.07g/g，至少1.09g/g，至少1.10g/g，至少1.11g/g，至少1.22g/g，至少1.24g/g。
在其他实施方案中，本发明的菌株表现出至少一种下列特征：
a)将至少25g/L的甘油转化为至少25.1g/L琥珀酸，产率系数YP/S为至少1.01g/g；
b)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.58g g DCW-1h-1琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；
c)将至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(Lh)琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖和/或甘油；
d)将至少25g/L的至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(Lh)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖和/或甘油；
e)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.58g g DCW-1h-1琥珀酸，且琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油。
根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株将至少28g/L的甘油转化为至少28.1g/L SA，产率系数YP/S为至少1.0g/g，或＞1.0g/g，或＞1.05g/g，或＞1.1g/g，或＞1.15g/g，或＞1.20g/g，或＞1.22g/g，或＞1.24g/g，多达约1，28g/g。例如，28g/L葡萄糖可转化为多达约40或多达约35g/LSA。
根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株将至少一种碳源转化为SA，其比产出率为至少0.6g g DCW-1h-1SA，或至少0.65，至少0.7g g DCW-1h-1，至少0.75g g DCW-1h-1，或至少0.77g g DCW-1h-1SA，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油。
根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株将至少一种碳源转化为SA，SA的时空产量为至少2.2g/(L h)，或至少2.5，至少2.75，至少3，至少3.25，至少3.5，或至少3.7g/(L h)SA，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油。
根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株将至少28g/L的至少一种碳源转化为SA，SA的时空产量为至少2.2g/(L h)，或至少2.5，至少2.75，至少3，至少3.25，至少3.5，或至少3.7g/(Lh)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油。
根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株将至少一种碳源转化为SA，其比产出率为至少0.6g g DCW-1h-1，或至少0.65，或至少0.7g g DCW-1h-1SA，或至少0.77g g DCW-1h-1SA，且SA的时空产量为至少2.2g/(L h)，或至少2.5，至少2.75，至少3，至少3.25，至少3.5，或至少3.7g/(L*h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油。
优选的，本发明的所述菌株可源自用保藏编号DSM 18541保藏在DSMZ的菌株DD1，或者源自具有生产琥珀酸能力的DD1的变体或突变菌株。
本发明的特定的菌株生产琥珀酸(SA)和副产品(SSP)，SA/SSP的比值＞10∶1、或＞12.5∶1、或＞15∶1、或＞17.5∶1、或＞20∶1、或＞25∶1、或＞30∶1、或＞33∶1，其中SSP代表副产物乳酸(LA)、甲酸(FA)、乙酸(AA)和苹果酸(MA)的总和，每种量都按g/L表示。
其他特定的菌株生产琥珀酸(SA)和副产品乙酸(AA)，SA/AA的比值＞10∶1、或＞12.5∶1、或＞15∶1、或＞17.5∶1、或＞20∶1、或＞25∶1、或＞30∶1、或＞40∶1、或＞50∶1、或＞75∶1、或＞90∶1，每种量都按g/L表示。
其他特定的菌株生产琥珀酸(SA)和副产品甲酸(FA)，SA/FA的比值＞90∶1或＞100∶1，每种量都按g/L表示。
本发明的另一个实施方案涉及发酵生产有机酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤：
a)在含有可同化的碳源的培养基中孵育任一项前述权利要求定义的细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；和
b)从培养基中获得所述有机酸，特别是SA，或其盐或衍生物。
根据特定的方法，发酵是在存在二氧化碳的条件下，在约10至60℃的温度范围内，例如20至50℃，30至45℃，或25至35℃，和pH 5.0-9.0，例如5.5-8，或6-7下实施的。可以通过添加NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、MgH(CO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N和/或其混合物来控制pH。
特别的是，所述可同化的碳源选自甘油、蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、棉籽糖、淀粉的降解产物、纤维素、半纤维素和木质纤维素，及其混合物。
特别的是，所述碳源是甘油或甘油与至少一种其它碳源的混合物，所述其它碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖、棉籽糖和L-阿拉伯糖。
根据所述方法的特定的实施方案，可同化的碳源的浓度调节至在5-80g/L的范围内的值，例如10至60。
本发明还提供了发酵生产琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤：
a)在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；
b)从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；
额外的由至少一个下列特征来表征：
c)将至少25g/L的甘油转化为至少25.1g/L琥珀酸，产率系数YP/S为至少1.0g/g；
d)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.58g g DCW-1h-1琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；
e)将至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(L h)琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；
f)将至少25g/L的至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；
g)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.6g g DCW-1h-1琥珀酸，且琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；
h)生产琥珀酸(SA)和副产品(SSP)，SA/SSP的比值＞10∶1、或＞12.5∶1、或＞15∶1、或＞17.5∶1、或＞20∶1、或＞25∶1、或＞30∶1、或＞33∶1，其中SSP代表副产物乳酸(LA)、甲酸(FA)、乙酸(AA)和苹果酸(MA)的总和，每种量都表示为g/L；
i)生产琥珀酸(SA)和副产品乙酸(AA)，SA/AA的比值＞10∶1、或＞12.5∶1、或＞15∶1、或＞17.5∶1、或＞20∶1、或＞25∶1、或＞30∶1、或＞50∶1、或＞75∶1、或＞90∶1，每种量都表示为g/L。
根据所述方法的特定的实施方案，所述细菌菌株是如上定义的遗传修饰的细菌菌株。
本发明的方法可以不连续或连续的实施。可通过常规的手段监控酸生产的过程，例如HPLC或GC分析。
优选的在厌氧条件下生产SA。可以通过常规技术建立厌氧条件，例如将反应培养基的成分脱气(degassing)和通过导入二氧化碳或氮气或其混合物以及任选的氢气来维持厌氧条件，所述导入气体的流速为例如0.1-1或0.2-0.5vvm。
可以通过常规技术建立好氧条件，例如通过导入空气或氧气，所述导入气体的流速为例如0.1-1或0.2-0.5vvm。
合适时，可以根据本发明应用0.1-1.5bar的轻微超压。
在另一个实施方案中，本发明提供了生产琥珀酸和/或琥珀酸铵盐的方法，所述方法包括如上定义的发酵生产琥珀酸，和额外的用碱性氨水或其含水溶液、或NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、MgH(CO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N及其混合物来控制pH。一般而言，碱的物理条件可以是含水溶液、含水悬浮液、气体或固体。
在一个实施方案中，通过任一项上下文所述的方法生产有机酸，特别是琥珀酸和/或其盐，并通过下列步骤进一步分离和/或纯化：
过滤和/或离心，
阳离子交换层析和/或
结晶。
优选的，通过下列步骤进一步分离和/或纯化有机酸和/或其盐：
过滤，然后
阳离子交换层析，然后
结晶。
过滤可用于分离细菌细胞和含琥珀酸的液体。过滤可以是渗滤、错流过滤和/或超滤。
用于阳离子交换层析的材料可以是强酸性阳离子交换树脂。强酸性阳离子交换树脂携带例如磺酸基。特别的是，用于阳离子交换层析的材料可以是携带H+形式的磺酸基的苯乙烯-二乙烯苯共聚物。H+形式意指磺酸基是以酸性形式存在。优选的，阳离子交换层析树脂的平均颗粒尺寸是0.3-1.5，更优选0.55-0.75mm，和/或堆积密度是700-800g/l。阳离子交换层析树脂可以是大孔的。大孔意指阳离子交换树脂的平均孔直径优选从20至120nm，优选从20至100nm，更优选从20至40nm。颗粒分布优选是单分散的。优选的，阳离子交换层析材料的总容量是0.5-2.0，更优选0.8-1.7，更优选1.0-1.5，更优选1.4-1.9min eq./l.。x eq./l.意指1L阳离子交换树脂携带x mo l磺酸基。因此，eq./l.是相当于单电荷分子计算的。待纯化的琥珀酸盐可以是Na、K、Ca、Mg和/或铵盐。例如，强酸性阳离子交换树脂可以是Lanxess的Type Lewatit Monoplus SP 112。
优选的，在20-60℃，更优选45-60℃下实施阳离子交换层析。
其他生产SA的优选方法描述如下：
方法1：
在另一个实施方案中，本发明提供了发酵生产SA或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤：
a.在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；
b.从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；
所述方法另外的特征是将至少50g/L的甘油转化为至少50g/L SA，产率系数YP/S为至少1.0g/g；或＞1.0g/g，或＞1.05g/g，或＞1.1g/g，或＞1.15g/g，或＞1.20g/g，或＞1.22g/g，或＞1.24g/g，多达约1，28g/g；例如，产率系数YP/S为至少0.6g/g；至少0.7g/g，至少0.75g/g，至少0.8g/g，至少0.85g/g，至少0.9g/g，至少0.95g/g，至少1.0g/g，至少1.05g/g，至少1.1g/g，至少1.15g/g，至少1.20g/g，至少1.22g/g，或至少1.24g/g。例如，50g/L甘油可转化为多达约65或多达约62.5g/L SA或多达约60g/L SA。
方法2：
在另一个实施方案中，本发明提供了发酵生产SA或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤：
a.在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株，其中所述菌株具有活性减少的丙酮酸-甲酸-裂解酶；
b.从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；
所述方法另外的特征是将碳源转化为SA，其比产出率为至少0.42g gDCW-1h-1SA，或至少0.45，或至少0.47g g DCW-1h-1SA，或至少0.49gg DCW-1h-1SA，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、棉籽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油。
方法3：
在另一个实施方案中，本发明提供了发酵生产SA或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤：
a.在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株，其中所述菌株具有活性减少的丙酮酸-甲酸-裂解酶；
b.从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；
所述方法另外的特征是将碳源转化为SA，SA的时空产量为至少2.22g/(L h)，或至少2.5，至少2.75，至少2.9g/(L*h)SA，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、棉籽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油。
方法4：
在另一个实施方案中，本发明提供了发酵生产SA或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤：
a.在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；
b.从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；
所述方法额外的特征是将至少50g/L的碳源转化为SA，SA的时空产量为至少2.2g/(L h)，或至少2.5，至少2.75，至少3，至少3.25，至少3.5或至少3.7g/(L*h)SA，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、棉籽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油。
方法5：
在另一个实施方案中，本发明提供了发酵生产SA或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤：
a.在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；
b.从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；
所述方法额外的特征是将碳源转化为SA，其比产出率为至少0.6g gDCW-1h-1SA，或至少0.65，或至少0.7g g DCW-1h-1SA，或至少0.75gg DCW-1h-1SA，或至少0.77g g DCW-1h-1SA，且SA的时空产量为至少2.2g/(L h)，或至少2.5，至少2.75，至少3，至少3.25，至少3.5或至少3.7g/(L*h)SA，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、棉籽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油。
在上文所述的生产SA的方法1至5的另一个实施方案中，碳源是甘油，或甘油与至少一种其他碳源的混合物，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖。
用于生产SA的特别合适的条件是：
碳源：葡萄糖、木糖、麦芽糖或麦芽糊精、棉籽糖和/或甘油(包括粗制甘油)
温度：30至45℃；
pH：5.5至7.0，如上所述由碱控制，优选通过HCO3 -源，如Na2CO3、NaHCO3、Mg(HCO3)2、Ca(HCO3)2或Mg(OH)2、MgCO3、Ca(OH)2、CaCO3。
供气：CO2。
可以通过本领域已知方法的常规方式分离所产生的SA和/或SA盐，例如结晶、过滤、电透析、层析。例如，进一步分离和/或纯化有机酸和/和其盐。可以通过在发酵过程中使用氢氧化钙、氧化钙、碳酸钙或碳酸氢钙中和，在发酵罐中沉淀琥珀酸钙产物并过滤所述沉淀进行分离。通过用硫酸酸化琥珀酸，再通过过滤去除硫酸钙(石膏)或沉淀物，从沉淀的琥珀酸钙中回收所需的SA产物。为了去除不需要的残留离子，可通过离子交换层析的手段进一步纯化所获得的溶液。
在另一个实施方案中，本发明提供了生产四氢呋喃(THF)和/或1，4-丁二醇(BDO)和/或γ-丁内酯(GBL)的方法，包括：
b)如上定义的发酵生产琥珀酸和/或琥珀酸盐，和
b1)将获得的游离酸直接催化加氢为THF和/或BDO和/或GBL，或
b2)将获得的游离琥珀酸和/或琥珀酸盐化学酯化成其相应的二-低烷基酯，和之后将所述酯催化加氢为THF和/或BDO和/或GBL。
在另一个实施方案中，本发明提供了生产吡咯烷酮的方法，包括：
a)如上定义的发酵生产琥珀酸铵盐，和
b)以本身已知的方式将琥珀酸铵盐化学转化成吡咯烷酮。
在所述甘油加工的特定实施方案中，所述用作可同化的碳源的甘油是粗制甘油，特别是通过酯切割三甘油酯(triacylglyceride)获得的。例如，甘油是从生物柴油生产中获得的废弃产品。
本发明还涉及如上定义的细菌菌株的用途，用于发酵生产有机精细化学品，例如琥珀酸或其盐或衍生物。
d)其他具体实施方案
d1)遗传操作
根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株含有编码丙酮酸-甲酸-裂解酶(pfl)突变酶的基因，其酶活性是如EC编号EC 2.3.1.54定义的。例如，pfl酶活性受pflA基因中的突变的负面影响，或受pflA基因的表达调控的负面影响。pflA基因和pflA基因产物的序列可见于下列登录号GeneID：6268899、YP_001880903。该基因的同源物已知位于登录号：NCBI-GeneID 945514、945444、947623、948454、3075405；相应的蛋白质位于登录号：UniProt：P09373、P75793、P42632、P32674、Q65VK2。
在本发明范围内的还有编码丙酮酸-甲酸-裂解酶的激活酶的基因，是由EC编号EC 1.97.1.4定义的，并描述在Knappe等，1990和1993中，具有减少的或失调的活性。可以通过导入突变或通过本发明描述的方法删除基因来实施。该酶的实例是由以下基因编码的，其中所述酶的活性可以减少或者其编码基因可以突变或失调：pfl激活酶基因pflA和yfiD基因、在登录GeneID：947068下已知的E.coli K12基因、具有登录号NCBI-GeneID：945445的基因ybiY和相应的蛋白质NP_415345、在登录GeneID：AAU37008下已知的产琥珀酸曼海姆氏菌(Mannheimia succiniproducens)基因、在登录号YP_087593、NP_417074和YP_087564下的相应的蛋白质及该基因的同源物。描述的是非突变基因序列的登录号，所述序列将进行本发明所述的突变或删除。
还落入本发明范围内的是通过携带相应基因的基因突变，表现出降低活性的蛋白质arcA的菌株，例如登录号：ECK4393(还已知位于下列描述下：cpxC、fexA、sfrA、msp)或fnr，已知arcA是登录号NCBI-GeneID：948874，而fnr是NCBI-GeneID：945908。相应的蛋白质序列可见于登录号P0A9E5。已知其他生物体相似的基因，例如产琥珀酸曼海姆氏菌。arcA是NCBI-GeneID：3076294和相应的蛋白质YP_088696，fnr是NCBI-GeneID：3075449和UniProt：Q65TM6。
还落入本发明范围内的是表现出降低的乳酸脱氢酶活性的菌株，所述乳酸脱氢酶是由EC编号EC 1.1.1.27和EC 1.1.1.28定义的，编码具有特异性生产D-乳酸或L-乳酸或两者的特异性的酶。实例是E.coli基因NCBI-GeneID：946315和相应的蛋白质NP_415898，或M产琥珀酸基因NCBI-GeneID：3075603和相应的蛋白质YP_089271。
根据另一个实施方案，本发明的细菌菌株含有：(1)编码由EC命名法如EC 2.3.1.54定义的丙酮酸-甲酸-裂解酶的突变基因，所述酶具有减少的活性；和/或(2)编码由EC命名法如EC 1.97.1.4定义的编码丙酮酸-甲酸-裂解酶的激活酶的突变基因，所述酶具有减少的活性；和/或(3)编码arcA蛋白的突变基因，和/或(4)编码由EC命名法如EC1.1.1.27或EC1.1.1.28定义的乳酸脱氢酶的突变基因，具有减少的活性。
用于制备遗传修饰的本发明细菌菌株的特定方法是有时在本文中被称为“Campbel l重组”的技术(Leenhout s等，1989，Appl Env Microbiol 55，394-400)。本文使用的“Campbell in”指制备原始宿主细胞的转化体，其中完整的环状双链DNA分子(例如，质粒)已通过单次同源重组事件(交叉加入事件)整合到染色体中，有效的导致将所述环状DNA分子的线性化版本插入到染色体的第一DNA序列中，所述染色体的第一DNA序列是与所述环状DNA分子的第一DNA序列同源的。“被Campbell in的”指整合到“Campbell in”转化体的染色体中的线性化DNA序列。“Campbell in”含有第一同源DNA序列的重复，每份拷贝都包括并围绕了同源重组交叉点的拷贝。
本文使用的“Campbell out”指来自“Campbell in”转化体的细胞，其中第二同源重组事件(交叉去除事件(cross out))发生在两种第二DNA序列之间，一种第二DNA序列包含在“被Campbell in的”DNA的线性化的插入DNA中，另一种是染色体来源的第二DNA序列，后者与所述线性化插入物的第二DNA序列是同源的。第二重组事件导致一部分整合的DNA序列的删除(丢弃(jettisoning))，但重要的是，还导致一部分(可以少至单个碱基)整合的“被Campbell in的”DNA保留在染色体中，使得相比原始的宿主细胞，“Campbell out”细胞在染色体中含有一个或多个有目的的改变(例如，DNA序列的删除、单碱基取代、多碱基取代、异源基因或DNA序列的插入、额外的拷贝的同源基因或修饰的同源基因的插入、或者插入包含一个以上上文列举的上述实例的DNA序列)。
“Campbell out”细胞优选的是通过对包含在“被Campbell in的”的DNA序列的一部分(所述部分是需要被丢弃的)中基因进行反选择(counter-selection)而获得的，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)sacB基因，其在存在约5％至10％的蔗糖的条件下生长的细胞中表达时是致死的。不论有或没有反选择，都可使用任何可筛选的表型，通过筛选理想的细胞获得“Campbell out”细胞，可筛选的表型例如但不限于菌落形态、菌落颜色、存在或缺少抗生素抗性、通过聚合酶链式反应存在或缺少给定的DNA序列、存在或缺少营养缺陷型、存在或缺少某种酶、存在或缺少某种酶活性如丙酮酸-甲酸裂解酶活性或乳酸脱氢酶活性、菌落核酸杂交、抗体筛选等。术语“Campbell in”和“Campbell out”还可用作各种时态的动词，指代上文所述的方法或工艺。
可以理解，导致“Campbell in”或“Campbell out”的同源重组事件可以发生在同源DNA序列内的一系列的DNA碱基上，由于在至少一部分该系列中的同源序列是彼此相同的，通常不能确切的说明交换事件发生的位置。换言之，不能准确的说明哪条序列是原始来自插入DNA的，哪条是原始来自染色体DNA的。此外，第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常被部分非同源区分开，该非同源区仍然储存在“Campbell out”细胞的染色体中。
优选的，第一和第二同源DNA序列的长度至少是约200碱基对，并且长度可多达数千碱基对。然而，所述程序可作用于更短或更长的序列。例如，第一和第二同源序列的长度范围可从约500至2000个碱基，通过安排第一和第二同源序列为约相同长度，可有利于获得“Campbell out”和“Campbell in”细胞，优选少于200碱基对的差异，最优选两链中较短的链是按碱基对计长度较长链的至少70％。
通过应用上述遗传修饰的方法，通过按下列实施例中更详细描述的，删除内源性丙酮酸-甲酸-裂解酶和/或乳酸脱氢酶的基因，来制备特定SA生产菌株(即，DD1)的变体菌株。
d2)发酵步骤：
根据本发明使用的发酵可以在例如搅拌发酵罐、泡罩塔和环流反应器中实施。对可能的方法类型(包括搅拌类型和几何设计)的综合概述可见于“Chmiel：Bioprozesstechnik：Einf ührung in dieBioverfahrenstechnik，Band 1”中。在本发明的工艺中，可获得的典型的变体是本领域技术人员已知的下列变体或解释在例如“Chmiel，Hammesand Bailey：Biochemical Engineering”中，如在有或没有生物量循环的条件下的分批式、分批补料式(fed-batch)、重复分批补料式或者连续式发酵。根据生产菌株，为了实现良好的产量(YP/S)，可实施空气、氧气、二氧化碳、氢气、氮气或恰当的气体混合物喷射。
在根据本发明的方法实施发酵液中预计的化学转化之前，可以预处理发酵液；例如可以去除发酵液的生物量。去除生物量的方法是本领域技术人员已知的，例如过滤、沉降和浮选。随后，可以去除生物量，例如用离心机、分离器、倾析器(decanter)、滤器或浮选装置。为了最大程度回收有价值的产品，洗涤生物量通常是明智的，例如以渗滤的形式。方法的选择取决于发酵液中的生物量含量和生物量的特性，还有生物量与有价值的产物的相互作用。在一个实施方案中，可以将发酵液灭菌或巴氏消毒。
在其他实施方案中，浓缩发酵液。根据需求，可以分批或连续的进行所述浓缩。压力和温度范围的选择应使得首先不发生产品损坏，其次只需要最小程度的使用装置和能量。为多级蒸发熟练的有技巧地压力和温度水平尤其能够节省能量。
可以在天然的或强制的循环模式下，利用搅拌槽、降膜式蒸发器、薄膜式蒸发器、强制快速循环蒸发器和其他的蒸发器类型。
d3)SA的酯化作用和氢化作用：
用于实施化学酯化作用，再直接催化氢化的合适实验条件是普遍已知的，例如，描述在欧洲专利申请06007118.0中，通过引用整合到本文中。
a)酯化方法：
包含活性蒸馏(reactive distillation)的酯化方法可使用本身已知的各种设计的装置来实施。
例如，可以使用以连续模式操作的酯化设备，其包括整流柱(rectification column)，所述整流柱通过安装塔板(tray)或填料筐(packing)而获得恰当数量的理论级数(theoretical stage)。一旦柱内形成了稳态的温度谱，就将包括SA的铵盐在内的含水电荷从储存容器加到柱的顶部，所述温度谱是进料链烷醇的结果，所述链烷醇在附着在柱的贮槽上的蒸发器环路中蒸发。反应形成了下降的、含铵盐的液体与冷凝且上升的、含链烷醇的蒸汽相的逆流。为了催化酯化反应，可以向铵盐初始量中添加均质性催化剂。可选的，可以在柱内部提供异质性催化剂。在方法条件下形成的羧酸酯是液体，并通过柱的较低端进入蒸馏柱的贮槽中，并从贮槽中持续取出。气态组分，例如包含链烷醇-水和/或氨的共沸混合物，被从反应柱中去除，因而从柱顶部的反应平衡中去除。
本领域技术人员可以在不付出不可接受的努力的条件下，执行上述具体实施方案的其他修饰。
根据所使用的装置的结构，例如使用的柱内部的类型、反应物的类型和量、和恰当时使用的催化剂的类型和量，本领域技术人员可以容易的确定为根据本发明的酯化过程安排的合适的过程参数。例如，在不限于此的条件下，各个参数可设定在下列参数范围内：
柱温度：0-300℃，特别是40-250℃，或70-200℃；
压力：从0.1至6bar，特别是标准压力；
停留时间：若干秒(例如1-60秒)至数天(例如1-5天)，特别是从若干分钟(例如1-60分钟)至若干小时(例如1-15小时)，更优选从若干分钟(例如5-20分钟)至2h。
b)氢化过程
以本身已知的方式，氢化根据本发明本身制备的SA或SA酯，使用本领域技术人员熟知的方法、装置和助剂，例如催化剂。
特别的是，在存在适合酯类氢化的异质性催化剂的条件下进行连续或分批的气相氢化。本领域技术人员可以在不进行不可接受的努力的条件下，为特定的酯确立优化的过程参数。例如，反应温度在从约100至约300℃的范围内，优选在从约200至280℃的范围内，压力是从约5至约100bar，例如从约10至约50bar。反应物与氢的摩尔比设定在从约1∶100至约1∶2000的范围内，例如从约1∶800至约1∶1500。
可用于氢化反应的催化剂是本领域技术人员已知的。例如，可使用各种铜催化剂。现有技术描述了例如使用还原的亚铬酸铜催化剂，其可从Davy Process Technology Ltd.，England以商品名85/1获得。然而，特别适合本发明的催化剂是负载型氧化铜(supported copper oxide)催化剂，氧化铜覆于铝或硅支持材料上。用铜催化剂将琥珀酸酯氢化为BDO(1，4-丁二醇)/GBL(γ-丁内酯)/THF的实例也描述在下列论文中：Schlander，Jan.，Feb.2000，University of Karlsruhe，“Gasphasenhydrierung von 
Figure BDA0000083666060000271
zu1，4-Butandiol，gamma-Butyrolacton und Tetrahydrofuran anKupfer-Katalysatoren”。
通过下列实施例可更详细的描述本发明。下列实施例是用于示例的目的，并非意在限制本发明的范围。
实施例--遗传修饰和培养
实施例1：DD1转化的一般方法
表1：实施例中提及的DD1野生型和变体的命名。
  菌株  描述
  LU13843  野生型DD1(保藏号DSM18541)
  LU15348  DD1Δpfl
  LU15050  DD1Δldh
  LU15224  DD1Δpfl Δldh
使用下列规程，通过电穿孔用DNA转化巴斯德氏菌菌株LU13843(野生型DD1)：
为了制备预培养物，将LU13843从新鲜生长的BHI-琼脂平板上接种到100ml摇瓶的40ml BHI(脑心灌流液，Difco)中。在30℃，200rpm下实施孵育过夜。
为了制备主培养物，将50ml BHI置于100ml摇瓶中，并用预培养物接种至终OD(610nm)为0.4。在30℃，200rpm下实施孵育约1.5h。在OD约1.3时收获细胞，用4℃的10％冷甘油洗涤细胞沉淀1次，并重悬在1.7ml 10％甘油(4℃)中。
将100μl感受态细胞与5-10μg DNA(10-20μl)混合，在宽度为0.2cm的电穿孔槽中保持在冰上2min。在下列条件下电穿孔：800Ω；25μF；2kV(Gene Pulser，Bio-Rad)。在电穿孔后，立即加入1ml BHI，在30℃实施孵育2h。
将细胞铺板于含5mg/l氯霉素的BHI上，并在30℃孵育2-5d，直到转化体的菌落可见。分离克隆，并在5mg/l氯霉素的BHI上重新划线，直到获得纯的克隆。
实施例2：产生缺失构建体
基于载体pSacB(SEQ ID NO：3)构建突变/缺失质粒。图1显示了质粒pSacB的示意图。通过PCR，从LU 13843的染色体DNA上扩增将被删除的染色体片段的5’和3’侧翼区，并使用标准技术导入所述载体中。一般而言，至少80％的ORF被靶向删除。如此构建丙酮酸-甲酸-裂解酶pfl的删除质粒pSacB(Δpfl)(SEQ ID NO 4)，和乳酸脱氢酶IdhA的删除质粒pSacB(ΔldhA)(SEQ ID NO 5)。图2和3显示了质粒pSacB(Δpfl)和pSacB(ΔldhA)的示意图。
在pSacB(SEQ ID NO：3)的质粒序列中，sacB基因包含在碱基5169-6590中。氯霉素基因包含在碱基526-984中。sacB启动子包含在碱基3802-4264中。氯霉素基因包含在碱基526-984中。E.coli的复制起点(ori EC)包含在碱基1477-2377中。
在pSacB Δpfl(SEQ ID NO：4)的质粒序列中，pfl基因的3’侧翼序列(其与DD1的基因组同源)包含在碱基65-1533中，而pfl基因的5’侧翼序列(其与DD1的基因组同源)包含在碱基1534-2956中。sacB基因包含在碱基5256-6677中。sacB启动子包含在碱基6678-7140中。氯霉素基因包含在碱基3402-3860中。E.coli的复制起点(ori EC)包含在碱基4353-5213中。
在pSacB ΔIdh(SEQ ID NO：5)的质粒序列中，Idh基因的5’侧翼序列(其与DD1的基因组同源)包含在碱基2850-1519中，而Idh基因的3’侧翼序列(其与DD1的基因组同源)包含在碱基1518-63中。sacB基因包含在碱基5169-6590中。sacB启动子包含在碱基6591-7053中。氯霉素基因包含在碱基3315-3773中。E.coli的复制起点(ori EC)包含在碱基4266-5126中。
实施例3：产生改良的琥珀酸生产菌株
a)如上所述，用pSacB(Δpfl)转化LU 13843和“被Campbell in的”(序列)产生“Campbell in”菌株。通过PCR产生的关于质粒在LU 13843基因组中的整合事件的条带，来验证转化和整合到LU 13843的基因组中。
然后，使用含蔗糖的琼脂平板作为逆向选择培养基，将“Campbell in”菌株进行“Campbell out”，选择sacB基因(功能)的缺失。因此，在37℃，220rpm下，将“Campbell in”菌株在25-35ml非选择性培养基(不含抗生素的BHI)中孵育过夜。然后，将过夜培养物在新鲜制备的含蔗糖的BHI平板(10％，无抗生素)上划线，并在37℃孵育过夜(“第一次蔗糖转移”)。将从第一次转移获得的单个菌落再次在新鲜制备的含蔗糖(10％)的BHI平板上划线，并在37℃孵育过夜(“第二次蔗糖转移”)。重复该程序直到最少在蔗糖中完成五次转移(“第三、第四、第五次蔗糖转移”)。术语“第一至第五次蔗糖转移”指出于选择缺少sacB基因和周围的质粒序列的菌株的目的，在含有sacB果聚糖蔗糖酶的载体染色体整合后，将菌株转移到含蔗糖和生长培养基的琼脂平板上。将来自第五次转移平板的单个菌落接种在25-35ml非选择性培养基(不含抗生素的BHI)上，并在37℃，220rpm孵育过夜。连续稀释过夜培养物，接种在BHI平板上，获得分离的单菌落。
通过链霉素敏感度验证含pfl基因突变/缺失的经“Campbell out”的菌株。通过PCR分析鉴别和验证这些菌株中的突变/缺失变体。获得pfl突变/缺失变体DD1Δpfl LU 15348。
b)如上所述，用pSacB(ΔldhA)转化LU 13843，并经“Campbell in”产生“Campbell in”菌株。通过PCR验证转化和整合。然后，如上所述，将“Campbell in”菌株“Campbell out”。通过PCR分析鉴别和验证这些菌株中的缺失变体。获得pfl IdhA双缺失变体LU 15224。
c)如上所述，用pSacB(Δldh)转化LU 13843，并经“Campbell in”产生“Campbell in”菌株。通过PCR验证转化和整合。然后，如上所述，将“Campbell in”菌株“Campbell out”。通过PCR分析鉴别和验证这些菌株中的缺失变体。获得IdhA缺失变体LU 15050。
实施例4：细胞库制备
1.培养基制备
表2中描述了培养基质的组成。
表2：用于制备细胞库的固体和液体基质的组成。
Figure BDA0000083666060000311
a葡萄糖浓度是15g/l(平板)和20或50g/l(液体培养基)。
bMgCO3(Riedel-de Haen，产品编号：13117，Sigma-AldrichLaborchemikalien GmbH)浓度是5g/l(平板)和0或30g/l(液体培养基)。
在900ml蒸馏水中混合5g酵母提取物、5g蛋白胨、MgCO3和(用于固体培养基)12g Bacto-琼脂，并高压灭菌(20min)。在冷却至65℃后，以无菌的储液加入缺少的组分。将葡萄糖、硫酸铵和K2HPO4分别进行高压灭菌。将氯化钙、氯化镁和氯化钠一起高压灭菌。
2、MCB制备
如下实施用于单个实验接种的主细胞库(MCB)。用所需的菌株新鲜接种两块琼脂平板，并在厌氧罐(Anaerocult A，Merck)中37℃孵育过夜。从平板采集生物量，重悬在葡萄糖为20g/l的、不含MgCO3的液体培养基中，调节OD600≈1.0。用0.5ml该细胞悬浮液实施接种。在有气密型丁基橡胶瓶塞的100ml血清瓶(Ochs GmbH，Bovenden/Lenglern，Germany)中实施培养，所述瓶中含有50ml液体培养基，所述培养基含20g/l葡萄糖和30g/l MgCO3和CO2--空气为0.8bar超压。在37℃孵育血清瓶(总计10个)，转速为160rpm，振荡直径为2.5cm。
为了监控葡萄糖消耗，在0、3、4、5、7、8和8.5h后，终止一个瓶中的培养，采样并实施HPLC分析。在8.5h后(葡萄糖浓度为3.4g/l)，终止培养。将等分的0.5ml细胞悬浮液和0.5ml无菌甘油装入冷冻管中，混合并在-20℃储存13h直至-80℃作为MCB。通过将1环最后的冷冻管在琼脂平板上划线进行污染控制，和在液体培养(表8描述的培养基)中检测产物光谱和污染(通过显微镜)，来测试MCB的纯度。
使用RI检测，通过HPLC分析培养液的未稀释无细胞上清液，定量葡萄糖的消耗和SA与副产物的形成。用无菌注射器通过丁基橡胶塞采集培养液样品，通过过滤(0.22μm)实施细胞分离。分别使用300x7.8mmI.D.Column Aminex HPX-87H(Biorad)和5mm H2SO4作为静止相和移动相。柱温度是30℃，流速是0.5ml min-1。
将一瓶MCB用于接种100ml有气密性丁基橡胶瓶塞的血清瓶(见上文)，实施血清瓶含有50ml含50g/l葡萄糖的液体培养基。在振动孵育箱中(转速：180rpm；振动直径：2.5cm)37℃下实施孵育10h。在培养结束时，葡萄糖浓度是20g/l，pH约6.5。将等分的0.5ml细胞悬浮液和0.5ml无菌甘油装入冷冻管中，混合并在-80℃储存作为WCB。与MCB相同的检测纯度。HPLC条件与上述相同。
实施例5：在甘油或甘油加麦芽糖上培养各种DD1菌株
在甘油或甘油和麦芽糖作为碳源的条件下，利用下列培养基和培养条件进一步分析变体菌株DD1Δpfl(LU15348)和DD1ΔpflΔldh(LU15224)的生产率。
1、培养基制备
培养基的组成和制备如下表3所述。
表3：在底物甘油或者甘油和麦芽糖上进行DD1培养的培养基组成。
Figure BDA0000083666060000331
可选的合成生长培养基
为了改善下游加工而使用没有复杂成分的合成的生长培养基进行发酵，以及为成本效率发酵设计合成的生长培养基是有利的。
培养基制备
合成的生长培养基是相对于用于瘤胃细菌的其他合成生长培养基(Nili和Brooker，1995；McKinlay等，2005)发展来的，之前用于其他细菌的安置经验(house experience)和实施单因子省略实验。最后，所述培养基含有50g/L葡萄糖、1g/L(NH4)2SO4、0.2g/L CaCl2*2H2O、0.2g/L MgCl2*6H2O、1g/L NaCl、3g/L K2HPO4、1mg/L烟酸、1.5mg/L泛酸、5mg/L吡哆醇、5mg/L核黄素、5mg/L生物素、1.5mg/L硫胺HCl、0.26g/L赖氨酸、0.15g/L苏氨酸、0.05g/L甲硫氨酸、0.71g/L谷氨酸、0.06g/L组氨酸、0.07g/L色氨酸、0.13g/L苯丙氨酸、0.06g/L酪氨酸、0.5g/L丝氨酸、0.5g/L甘氨酸、0.5g/L半胱氨酸、0.1g/L β-丙氨酸、0.27g/L丙氨酸、0.19g/L缬氨酸、0.23g/L亮氨酸、0.16g/L异亮氨酸、0.33g/L天冬氨酸、0.1g/L天冬酰胺、0.13g/L脯氨酸、0.15g/L精氨酸和/或0.1g/L谷氨酰胺。
用水和30g/L MgCO3作为缓冲系统，将含50ml合成生长培养基的血清瓶高压灭菌。将葡萄糖、硫酸铵和磷酸钾分别灭菌。将氯化钙、氯化镁和氯化钠一起灭菌。将维生素和氨基酸组合在各种储液中，并过滤灭菌。在血清瓶冷却后，将组分作为无菌储液加入。
2、培养和分析
为了生长种子培养物，将一瓶WCB用于接种有气密性丁基橡胶瓶塞的100ml血清瓶(见上文)，所述血清瓶含有50ml表2所述的液体培养基，但含20g/l葡萄糖和0.8bar超压的CO2气氛。在37℃和160rpm(振动直径：2.5cm)下实施孵育，时间为变体特异的小时数(表4)。将细胞悬浮液5000g离心(Biofuge primo R，Heraeus)5分钟，然后洗涤细胞沉淀，重悬在50ml不含碳源和MgCO3的培养基中，产生无葡萄糖的接种物(所有步骤都再室温下，并在厌氧室中)。
表4：各种DD1变体种子培养物的孵育时间
  菌株   孵育时间
  LU 13843   8hrs
  LU 15050   10hrs
  LU 15348   13hrs
  LU 15228   20hrs
主培养物生长在100ml血清瓶中，瓶中含有10ml有50g/l甘油或者50g/l甘油和10g/l D-麦芽糖的液体培养基，在两种情况下，都是0.8bar超压的CO2气氛。所有的实验都使用优质的“99％甘油，特纯”(Riedel-deHaen，产品编号：15523-1L-R；Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH，Seelze，Germany)。用1.5ml无葡萄糖接种物实施接种。在37℃和160rpm(振动直径：2.5cm)下孵育瓶子。
在24h后，如实施例4所述，通过HPLC定量C源的消耗和羧酸的生产。随着甘油的测量，柱温被调节至50℃，获得具有相似的停留时间的SA、乳酸和甘油的充分分离。
通过使用分光光度计(Ultrospec3000，Amersham Biosciences，Uppsala Sweden)测量660nm(OD660)的吸收值，测量细胞生长。根据预先确定的OD660相对于DCW的标准曲线(1 OD600＝0.27g DCW l-1)，计算每升的细胞干重(DCW)克数，来定义细胞浓度。
3、结果
使用不同DD1菌株的培养实验的结果显示在表5和表6中，表5的底物为甘油，表6的底物为甘油和麦芽糖的混合物。
表5：在甘油上培养各种DD1菌株
Figure BDA0000083666060000351
a培养时间。
b消耗的底物(甘油、麦芽糖)。
c形成的琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸和苹果酸。
d副产物乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸和苹果酸的总量。
e SA与副产物总量的比例。
f SA与副产物的比例(FA＝甲酸；AA＝乙酸)。
g时空产量和SA产量(YP/S)。
h在给定的HPLC方法中，乙酸、乳酸、苹果酸和甲酸的检测下限为低于0.01g/l。
在甘油培养实验中，显示出在SA生产生物体(例如DD1)中敲除丙酮酸-甲酸裂解酶基因pfl导致显著更高的SA的碳产量(YP/S)和STY，相比生长在甘油作为底物时的野生型。碳产量(YP/S)从DD1菌株的1.12g/g增加至Δpfl变体菌株的LU 153481.15g/g。
除Lee等，2006或Lin等，2005对SA生产细菌在葡萄糖上的报道外，在DD1中只敲除乳酸脱氢酶基因IdhA(LU 15050)没有表现出所述发酵的技术相关特征的改善，例如SA的STY，并且碳产量(YP/S)仅有少量增加。然而，即使乳酸脱氢酶活性减少，乙酸的量仍然增加。根据对单突变菌株的行为分析，令人惊讶且未预期的是发现在pfl和Idh基因中携带组合基因突变的变体菌株，其发酵甘油成为SA表现出甚至比单突变LU 15050和LU 15348预期达到的碳产量(YP/S)更大的非累加性改善。所观察到的1.26g/g的碳产量(YP/S)接近于将1Mol甘油+1Mol CO2转化为1Mol SA的1.28g/g的潜在理论碳产量(YP/S)。
当生长在甘油上时，在LU 15348中产生的副产物(SSP)的总和也是显著减少的，不产生甲酸且产生较少的乙酸。如上所述，相比野生型或LU15050，SA浓度是显著增加的。该观察结果表述为SA与副产物(SSP)的算术总和的比例SA：SSP g/g，其中相比LU 13843和LU 15050的水平为10，LU 15348大于40，而LU 15224大于100。
在上述实验中发现，在pfl和Idh基因中携带突变的菌株将甘油发酵为SA的STY不超过1.5g/(l*h)。因此，开发了改善的过程，使得在厌氧发酵中的SA生产表现出改善的STY值。该过程描述在申请PCT/EP2008/006714的第44-46页。该过程适应于利用在上述基因中携带突变的菌株生产琥珀酸。
表6：在甘油和麦芽糖上培养各种DD1菌株
Figure BDA0000083666060000371
a培养时间。
b消耗的底物(甘油、麦芽糖)。
c形成的琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸和苹果酸。
d副产物乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸和苹果酸的总量。
e SA与副产物总量的比例。
f SA与副产物的比例(FA＝甲酸；AA＝乙酸)。
g时空产量和SA产量(YP/S)。
h 600nm的光密度，在Ultrospec2000，Amersham Biosciences，Uppsala Sweden中测量之前，用1M HCl 1∶20稀释样品。
i按细胞干重(DCW)计的g生物量。
j比产出率：g SA/g生物量(细胞干重)/h。
l在给定的HPLC方法中，乙酸、乳酸、苹果酸和甲酸的检测下限为低于0.01g/l。
相比使用甘油作为单一底物，DD1在甘油同时和另一种糖类麦芽糖上的生长表现出允许更高的SA STY和产量(YP/S)，和增加的副产物浓度(PCT/EP2008/006714的第44-46页)。
LU 15348与DD1野生型的比较表现出pfl酶的活性减少时增加的SA量、STY和碳产量(YP/S)。令人惊讶的是，与现有技术中描述的其他实例相反(Lee等，2006；Lin等，2005)，突变菌株相对于非突变菌株DD1没有观察到任何生长缺陷。该观察结果具有重要的技术相关性，因为菌株的良好生长对技术生产过程是关键的。相比野生型，所有突变体中的细胞生长都是增加的。敲除pfl或Idh对突变的细菌菌株的生长具有正面影响。
由于缺少可检测的甲酸，减少的乙酸的量和增加的SA浓度，含有由基因突变推断减少的pfl酶活性的突变菌株中的比例SA/SSP是增加的。然而，副产物乳酸相比野生型是增加的。双敲除LU 15224具有进一步增加的产量(YP/S)和STY，同时LU 15050没有表现出任何所观察到的碳产量(YP/S)、STY或SSP的改善。
应注意，在有或无第二种糖类底物的条件下，pfl突变对改善甘油发酵而言都是必须且充分的，所述改善是相对于野生型菌株在基于甘油代谢的SA过程中的性能的。与该发现相反，在野生型来源菌株中的现有pfl突变没表现出诱导SA的发酵(Zhu，2005)。
只有若干突变的组合(包括pfl和Idh)导致了可测量的琥珀酸生产，但是以降低的生长和低下的STY性能(Lin，2005；Lee，200；)。该项工作的发现教导了构建发酵生产SA的改善的方法，包括突变的菌株以及特定的过程，以产生比现有技术更优越性能的方法。
令人惊讶的是，pfl突变菌株LU 15348的SA比产出率优于LU 15050和LU 15224，其中LU 15050在Idh基因中，LU 15224同时在Idh和pfl基因中携带突变。本领域专业人员已知根据所述方法，产物形成的高比活是技术方法的理想的特征。显而易见的，敲除乙酸脱氢酶的负面效应是将LU 15348的比产出率降到低于野生型的值。
实施例6：在甘油和各种碳水化合物的混合物上培养LU 15348
利用下列培养基和孵育条件，分析在存在甘油和各种碳水化合物作为碳源的条件下，突变体菌株LU 15348的生产力。
1、培养基制备、培养和分析
培养基的组成和制备描述在实施例5的表3中。如实施例5所述进行培养和分析。
该实验中使用优质的“麦芽糊精”(Maldex150，货号：50499，Boom，7942JE Meppel，The Netherlands)。由于具有不同长度的糖链未定义的的混合物，没有通过HPLC分析完全的分析麦芽糊精的浓度。因此，在加入到培养基之前，量重的确定麦芽糊精含量。为了计算所获得的理论产量(YP/S)的下限，假设加入到发酵中的所有麦芽糊精都被消耗了，应了解这只允许用于计算SA发酵后的碳产量(YP/S)的下限。更可能的是，由于未检测到的、底物麦芽糊精潜在的不完全消耗，更精确的碳产量(YP/S)的值将高于描述的值。
2、结果
LU 15348的培养实验的结果显示在表7中，底物为甘油和各种碳水化合物的共发酵，例如麦芽糖、麦芽糊精或棉籽糖。
表7：LU 15348在甘油和各种碳水化合物上的共发酵培养
Figure BDA0000083666060000401
a培养时间。
b消耗的底物(甘油、麦芽糖)。
c形成的琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸和苹果酸。
d副产物乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸和苹果酸的总量。
e SA与副产物总量的比例。
f SA与副产物的比例(FA＝甲酸；AA＝乙酸)。
g时空产量和SA产量(YP/S)。
i在给定的HPLC方法中，乙酸、乳酸、苹果酸和甲酸的检测下限为低于0.01g/l。
*由于未分析的剩余麦芽糊精的未知浓度的产量下限(YP/S)。
培养菌株LU 15348，共发酵甘油和不同的糖类，例如麦芽糖、高分子糖类的混合物如麦芽糊精或仍另一种糖类棉籽糖，获得相似的结果，表明同时发酵包括甘油作为一种碳源在内的多种碳源，导致相对于之前描述过的现有技术，对SA生产的多种技术相关改善。实例是相比现有技术，所述方法增加的甘油消耗速率和改善的甘油消耗总量，获得更高的SA滴度。此外，STY比不含糖类的对照增加。副产物浓度一般减少，除了在以麦芽糖为共同底物的情况下，其中相比单甘油培养，乳酸是增加的副产物。SA产量(YP/S)与甘油作为唯一底物相比是相似的或仅轻微减少的。
实验概述
具有减少的pfl活性的微生物表现出比现有技术改善的甘油发酵
不同碳源的组合有效的转化为琥珀酸
具有减少的pfl活性的微生物表现出比现有技术改善的甘油和糖类混合物的发酵
总结：用于生产琥珀酸(SA)的新方法对生产SA和/或SA盐具有优秀的潜力，具有高的碳产量(YP/S)和时空产量，以及非常低的副产物。
在本发明的上下文中，细菌菌株DD1(ID 06-614)于2006年8月11日保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心，D-38124不伦瑞克，因霍芬路7B，德国)，具有保藏编号DSM 18541。在上下文中，要求在先欧洲专利申请号EP 09152959.4和EP 09171250.5的优先权，其中保藏是首次在本发明的上下文中提及的。此外，参考WO 2009/024294，其中首次描述了DD1菌株，包括于2006年8月11日保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心，D-38124不伦瑞克，因霍芬路7B，德国)中。
本文引用的文件内容通过引用整合到本文中。
实施例--下游加工
实施例7：通过阳离子交换树脂从发酵液中分离琥珀酸的方法
过滤在发酵过程中用NH4OH(基于NH4OH溶液的总重计算，25重量％)中和的发酵液。将含有15％(w/w)琥珀酸(中和为盐)的含水无细胞发酵液用于下游过程。
用阳离子交换树脂(Lanxess的Lewatit Monoplus SP 112型；471ml)作为静止相填充在受控温度(50℃)下的玻璃柱(柱床高度：24cm)，并用水洗涤。在该洗涤步骤后，用含水的琥珀酸溶液(156ml，含有25g琥珀酸，密度：1.069kg/l)以从上到下的方式充满树脂。
溶液的流速平均为33ml/min，对应每小时4.2倍柱床体积(BV)的速度。
因而，在第一级分(453ml)中获得了含有约24.9g游离琥珀酸的清澈无色的溶液。该级分的琥珀酸浓度平均为5.38重量％。
除折射率外，测量了从柱流出的溶液的pH值和吸收值(350nm)。
所使用的强酸型阳离子交换树脂获得的结合能力平均约0.89当量(eq)/升树脂。
在结合过程后，用水(546ml)洗涤树脂，并最终用5％盐酸(919ml；流速：66ml/min)从下到上充满树脂而再生阳离子形式。作为最后一步，用水(889ml)再次洗涤树脂。
除所述树脂释放琥珀酸的事实外，树脂将培养液脱色并获得非常纯的和无色的琥珀酸溶液。
实施例8：用强酸型离子交换树脂测量临界点(break through)曲线的方法
含有15％(w/w)琥珀酸(中和为盐)的量的含水无细胞发酵液被用于过滤后下游过程。
用强酸型阳离子交换树脂(Lanxes s的Lewatit Monoplus SP 112型；689ml)填充在受控温度(50℃)下的玻璃柱(柱床高度：97.5cm)，并用水洗涤。在该洗涤步骤后，用含水的琥珀酸溶液(468ml，含有75g琥珀酸，密度：1.069kg/l)以从上到下的方式充满树脂。
溶液的流速平均为24ml/min，对应每小时2.1倍柱床体积(BV)的速度。
如实施例7，在第一级分中获得了含有约53.8g游离琥珀酸的清澈溶液(457ml)。该级分的琥珀酸浓度平均为11.53重量％。
与实施例7中的测定不同，在此情况下，第一级分的采样停止于阳离子突破(break through)之时。该时刻是通过测量pH值检测到的，所述pH值由于琥珀酸盐的突破而突然升高(值约1.4)。
在该含有琥珀酸盐的清澈溶液之后采集的级分具有与原始发酵液相似的棕色。
在该测定中，所使用的强酸型阳离子交换树脂获得的结合能力平均约1.32当量(eq)/升树脂。
在结合过程后，用水(678ml)洗涤树脂，并最终用5％盐酸(2034ml；流速：92ml/min)再生阳离子形式。最后，用水(824ml)再次洗涤树脂。
除所述树脂释放琥珀酸的事实外，树脂将培养液脱色并获得非常纯的和无色的琥珀酸溶液。
实施例9：从发酵液中纯化琥珀酸，然后将所获得的脱盐溶液浓缩和结晶的方法
结晶步骤使用2种样品，以如实施例7所述相同的方式获得。
在每种情况下，含有15％(w/w)琥珀酸(中和为盐)的量的含水无细胞发酵液被用于下游过程。通过使用阳离子交换树脂(Lanxess的LewatitMonoplus SP 112型)纯化脱盐的两种样品被用于结晶步骤。
下表显示了发酵液、树脂和化学品的体积，以及这些试验中获得的量和容积。
Figure BDA0000083666060000431
Figure BDA0000083666060000441
因而，作为第一级分获得了两份清澈无色的溶液，合并得到一份琥珀酸溶液(约76g游离琥珀酸；由于取样不同而有差异)。
通过蒸馏水分浓缩该溶液，获得琥珀酸浓度为20重量％的380.2g溶液。在浓缩步骤后，搅拌并冷却溶液。一旦溶液达到50℃的温度，则放入晶种。之后不久，开始结晶并沉淀出琥珀酸晶体。
在室温下搅拌琥珀酸悬浮液过夜，并在冰/水浴中冷却1小时。
在寒冷条件下滤出晶体，每次用20ml冰水洗涤两次。在洗涤步骤后，在氮气流中干燥晶体。因而获得65.2g无色的琥珀酸晶体，纯度为99.8％。
之后，在流化床干燥器(fluid bed dryer)中干燥琥珀酸结晶。
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Figure IDA0000083666180000011
Figure IDA0000083666180000021
Figure IDA0000083666180000031
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Figure IDA0000083666180000201

Claims (37)

1.能够利用甘油作为碳源发酵生产琥珀酸的细菌菌株，其中所述菌株是经过遗传修饰的，使其包含失调的内源性丙酮酸-甲酸-裂解酶活性。
2.权利要求1的菌株，其中所述丙酮酸-甲酸-裂解酶活性是减少或关闭的。
3.任一项前述权利要求的菌株，其中参与或关系到甘油发酵转化为琥珀酸的至少一种其它酶活性是失调的。
4.任一项前述权利要求的菌株，其源自选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)或放线菌科(Actinobacteria)微生物的微生物。
5.任一项前述权利要求的菌株，其源自巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的微生物，具有序列为SEQ ID NO：1的16S rDNA；或与其表现出至少96、97、98、99或99.9％的序列同源性的序列。
6.权利要求5的菌株，具有序列为SEQ ID NO：2的23S rDNA；或与其表现出至少95、96、97、98、99或99.9％的序列同源性的序列。
7.任一项前述权利要求的菌株，其源自肠杆菌科的微生物。
8.任一项前述权利要求的菌株，其源自巴斯德氏菌科的微生物。
9.任一项前述权利要求的菌株，其源自芽孢杆菌科(Bacilli)的微生物。
10.任一项前述权利要求的菌株，其源自放线菌科的微生物。
11.任一项前述权利要求的菌株，其表现出至少一种下列额外的代谢特征：
a)从蔗糖生产琥珀酸；
b)从麦芽糖生产琥珀酸；
c)从麦芽糊精生产琥珀酸；
d)从D-果糖生产琥珀酸；
e)从D-半乳糖生产琥珀酸；
f)从D-甘露糖生产琥珀酸；
g)从D-葡萄糖生产琥珀酸；
h)从D-木糖生产琥珀酸；
i)从L-阿拉伯糖生产琥珀酸；
j)从乳糖生产琥珀酸；
k)从棉子糖生产琥珀酸；
l)从甘油生产琥珀酸；
m)在75g/l或更高的初始葡萄糖浓度下生长；
n)在70g/l或更高的初始甘油浓度下生长。
12.任一项前述权利要求的菌株，其将蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油转化为琥珀酸，产率系数YP/S为至少0.5g/g。
13.任一项前述权利要求的菌株，具有至少一种下列特征：
a)将至少25g/L的甘油转化为至少25.1g/L琥珀酸，产率系数YP/S为至少1.01g/g；
b)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.58g g DCW-1h-1琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；
c)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其时空产量为至少2.2g/(L h)琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖和/或甘油；
d)将至少25g/L的至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖和/或甘油；
e)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.58g g DCW-1h-1琥珀酸，且琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油。
14.任一项前述权利要求的菌株，其源自用保藏编号DSM 18541保藏在DSMZ的菌株DD1，或者源自具有生产琥珀酸能力的DD1的变体或突变菌株。
15.任一项前述权利要求的菌株，其生产琥珀酸(SA)和副产品(SSP)，SA/SSP的比值＞10∶1、或＞12.5∶1、或＞15∶1、或＞17.5∶1、或＞20∶1、或＞25∶1、或＞30∶1、或＞33∶1，其中SSP代表副产物乳酸(LA)、甲酸(FA)、乙酸(AA)和苹果酸(MA)的总和，每种量都按g/L表示。
16.任一项前述权利要求的菌株，其生产琥珀酸(SA)和副产品乙酸(AA)，SA/AA的比值＞10∶1、或＞12.5∶1、或＞15∶1、或＞17.5∶1、或＞20∶1、或＞25∶1、或＞30∶1、或＞40∶1、或＞50∶1、或＞75∶1、或＞90∶1，每种量都按g/L表示。
17.任一项前述权利要求的菌株，其生产琥珀酸(SA)和副产品甲酸(FA)，SA/FA的比值＞90∶1或＞100∶1，每种量都按g/L表示。
18.发酵生产有机酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤：
a)在含有可同化的碳源的培养基中孵育任一项前述权利要求定义的细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；和
b)从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物。
19.权利要求18的方法，其中发酵是在存在二氧化碳的条件下，在约10至60℃的温度范围内和pH 5.0-9.0实施的。
20.权利要求18或19的方法，其中所述有机酸是琥珀酸。
21.权利要求18至20的任一项的方法，其中可同化的碳源选自甘油、蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、棉籽糖、淀粉的降解产物、纤维素、半纤维素和木质纤维素，及其混合物。
22.权利要求21的方法，其中碳源是甘油或甘油与至少一种其它碳源的混合物，所述其它碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖、棉籽糖和L-阿拉伯糖。
23.权利要求18至22的任一项的方法，其中可同化的碳源的浓度调节至5-80g/L的范围内的值。
24.发酵生产琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤：
a)在含有至少一种可同化的碳源的培养基中孵育细菌菌株，并在有利于所需有机酸形成的条件下培养所述菌株；
b)从培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物；
另外具有至少一种下述特征；
c)将至少25g/L的甘油转化为至少25.1g/L琥珀酸，产率系数YP/S为至少1.01g/g；
d)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.58g g DCW-1h-1琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；
e)将至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(L h)琥珀酸，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；
f)将至少25g/L的至少一种碳源转化为琥珀酸，琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；
g)将至少一种碳源转化为琥珀酸，其比产出率为至少0.6g g DCW-1h-1琥珀酸，且琥珀酸的时空产量为至少2.2g/(L h)，所述碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、棉籽糖和/或甘油；
h)生产琥珀酸(SA)和副产品(SSP)，SA/SSP的比值＞10∶1、或＞12.5∶1、或＞15∶1、或＞17.5∶1、或＞20∶1、或＞25∶1、或＞30∶1、或＞33∶1，其中SSP代表副产物乳酸(LA)、甲酸(FA)、乙酸(AA)和苹果酸(MA)的总和，每种量都按g/L表示；
i)生产琥珀酸(SA)和副产品乙酸(AA)，SA/AA的比值＞10∶1、或＞12.5∶1、或＞15∶1、或＞17.5∶1、或＞20∶1、或＞25∶1、或＞30∶1、或＞50∶1、或＞75∶1、或＞90∶1，每种量都按g/L表示。
25.权利要求24的方法，其中所述细菌菌株是权利要求1-17的任一项定义的菌株。
26.权利要求18至25的任一项的方法，不连续或连续的实施。
27.生产琥珀酸和/或琥珀酸铵盐的方法，所述方法包括根据权利要求18-26的任一项发酵生产琥珀酸，和用氨水或其含水溶液、或NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、MgH(CO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N及其混合物来控制pH。
28.权利要求18至27的任一项的方法，其中通过过滤、结晶、电透析和/或阳离子交换层析进一步分离和/或纯化有机酸和/和其盐。
29.权利要求18至28的任一项的方法，通过下列步骤进一步分离和/或纯化有机酸和/和其盐：
过滤，然后
阳离子交换层析，然后
结晶。
30.权利要求28和29的任一项的方法，其中用于阳离子交换层析的材料是以H+形式携带磺酸基的阳离子交换树脂，总容量为0.5-2.0当量/l阳离子交换树脂。
31.权利要求28-30的任一项的方法，其中在从45至60℃的温度下实施阳离子交换层析。
32.生产四氢呋喃(THF)和/或1，4-丁二醇(BDO)和/或γ-丁内酯(GBL)的方法，包括：
a.如权利要求27定义的发酵生产琥珀酸和/或琥珀酸盐，和
b1.将获得的游离酸直接催化加氢为THF和/或BDO和/或GBL，或
b2.将获得的琥珀酸和/或琥珀酸盐化学酯化成其相应的二-低烷基酯，和之后将所述酯催化加氢为THF和/或BDO和/或GBL。
33.生产吡咯烷酮的方法，包括：
a)如权利要求27定义的发酵生产琥珀酸铵盐的，和
b)以本身已知的方式将琥珀酸铵盐化学转化成吡咯烷酮。
34.权利要求21-33的任一项的方法，其中所述用作可同化的碳源的甘油是通过酯切割三甘油酯(triacylglyceride)获得的。
35.权利要求34的方法，其中甘油是从生物柴油生产中获得的废弃产品。
36.权利要求1-17的任一项定义的细菌菌株的用途，用于发酵生产有机精细化学品。
37.权利要求36的用途，其中有机精细化学品是琥珀酸或其盐或衍生物。
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