KR20110127690A - 신규 미생물 숙신산 생산자 및 숙신산의 정제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 내인성 피루베이트-포르메이트-리아제 효소 활성의 탈조절을 포함하도록 유전적으로 변형된, 숙신산의 발효적 생산을 위한 탄소원으로서 글리세롤을 이용할 수 있는 박테리아 균주, 뿐만 아니라 이러한 미생물을 이용함으로써 유기 산, 특히 숙신산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 생산된 유기 산의 하류 공정에 관한 것이다.

Description

신규 미생물 숙신산 생산자 및 숙신산의 정제{NOVEL MICROBIAL SUCCINIC ACID PRODUCERS AND PURIFICATION OF SUCCINIC ACID}
본 발명은 내인성 피루베이트-포르메이트-리아제 효소 활성의 탈조절을 포함하도록 유전적으로 변형된, 숙신산의 발효적 생산을 위한 탄소원으로서 글리세롤을 이용할 수 있는 박테리아 균주, 뿐만 아니라 이러한 미생물을 이용함으로써 유기 산, 특히 숙신산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
바이오매스로부터 숙신산 (SA)을 발효적으로 생산하는 것은 이미 상당한 관심을 끌어 왔었는데, 이는 상기 산이 합성 수지의 중요한 구성성분을 나타내거나 또는 유용한 추가의 저분자 화합물, 특히 테트라히드로푸란 (THF), 1,4-부탄디올 (BDO), 감마-부티로락톤 (GBL) 및 피롤리돈의 공급원이기 때문이다 (WO-A-2006/066839).
소의 반추위로부터 단리된 SA-생산 박테리아는 문헌 [Lee et al., (2002a)]에 기재되어 있다. 이러한 박테리아는 비-운동성이고, 비-포자 형성성이며, 중온성이고, 호이산화탄소성인 그람-음성 간균 또는 구간균이다. 16S rRNA 서열에 기초한 계통발생학적 분석 및 생리학적 분석 결과, 상기 균주는 신규 종으로서 만헤이미아(Mannheimia) 속에 속하는 것으로 나타났고, 만헤이미아 숙시니시프로두센스(Mannheimia succiniciproducens) MBEL55E로 명명되었다. 100％ CO2 조건 하에서는, 6.0 내지 7.5의 pH 범위에서 잘 성장하고, SA, 아세트산 및 포름산을 2:1:1의 일정 비로 생산한다. 엠. 숙시니시프로두센스 MBEL55E를 탄소원으로서 글루코스를 이용하여 CO2-포화 하에 혐기적으로 배양한 경우에는, 7.5 시간의 인큐베이션에서 19.8 g/L의 글루코스가 소모되었고 13.3 g/L의 SA가 생산되었다. 또한, 이 미생물에서 SA의 생산은 대사성 유전자의 돌연변이/결실에 의해 개선되었다. 유전자 락테이트 데히드로게나제 ldhA, 피루베이트-포르메이트-리아제 pflB, 포스포트랜스아세틸라제 pta 및 아세테이트 키나제 ackA 유전자의 조합된 돌연변이/결실이 첨가된 탄소원 1 g당 0.6 g의 SA의 수율 (YP/S)로 탄소를 SA로 전환시키는 균주를 생성하였다. SA의 생산을 위한 공간-시간 수율은 1.8 g/리터/h인 것으로 확인되었다. (문헌 [Lee 2006])
문헌 [Lin et al., 2005]은 SB202로 기재된, ldh에서 뿐만 아니라 pfl 유전자에서 돌연변이를 보유한 이. 콜라이의 돌연변이체 균주를 기재한다. 그러나, 이 균주는 혐기성 조건 하에 느린 성장 및 사카라이드를 완전히 발효시키지 못하는 능력을 특징으로 했다. 불활성 ldh 및 pfl은 탄소 플럭스를 피루베이트 노드에서 보류시켜, 피루베이트가 주요 생성물로서 축적되도록 유도하였다. 이러한 점에서, 탄소원에 대한 숙시네이트의 탄소 수율 (YP/S)은 0.15 g/g SA/탄소보다 적은 것으로 확인되었다.
문헌 [Sanchez et al., 2005]은 ldh, adhE, ack-pta 및 iclR 유전자에서 돌연변이를 보유하는 이. 콜라이 균주를 기재한다. 이들 실험에서, 세포를 복합 배지에서 호기적으로 성장시키고, 수확하고, 농축시키고, 혐기성 조건 하에 탄소원과 함께 인큐베이션하였다. 탄수화물에서 SA로의 직접적인 전환을 위한 이들 구체적인 조건 하에, 탄소원 1 g당 0.98 내지 1.13 g SA의 탄소 수율 YP/S이 0.79 g/l h SA의 공간-시간 수율과 함께 확인되었다. 혐기적 전환 상 이전의 바이오매스 생성을 위한 탄소 이용이 상기 계산에 명확하게 포함되지 않았고, 추가로 기재되지 않는다.
문헌 [Hong and Lee (2001)]은 ldh 및 pfl 유전자에서 돌연변이를 보유하는 이. 콜라이 균주를 기재한다. 그러나, 이들 균주는 탄수화물 탄소원 글루코스로부터 SA의 느린 탄수화물 이용 및 낮은 공간-시간 및 탄소 수율 (YP/S)로 탄수화물의 발효로부터 SA를 생산한다. 숙신산 이외에, 아세트산 및 락트산이 1:0.034:1.6의 비율로 생산되었다. 이 분석에서 ldh 및 pfl 유전자에서 돌연변이를 보유하는 균주의 성장은 돌연변이되지 않은 모 균주와 비교해서 지연되었다.
문헌 [Zhu et al., 2005]은 이. 콜라이 균주를 기술하고, 숙신산이 아니라 락테이트를 생산하고, 단독 기질로서 글루코스 상에서 성장시 불량한 성장을 나타내는, pfl 유전자에서 돌연변이된 이. 콜라이 균주를 기재한다.
그러나, 유기체 만헤이미아 숙시니시프로두센스의 중요한 단점은 트리아실 글리세롤 (TAG)의 구성성분으로서, 예를 들어 바이오디젤 생산의 에스테르교환 반응에서 부산물로서 용이하게 이용가능한 글리세롤을 대사시킬 수 없다는 것이다 (문헌 [Dharmadi et al., 2006]).
글리세롤로부터의 SA의 발효적 생산은 과학 문헌 [Lee et al., 2001]; [Dharmadi et al., 2006]에 보고되었는데, 글리세롤을 이용한 경우에는 글루코스와 같은 통상의 당을 이용한 경우에 달성된 것보다 더 높은 수율 [생산된 SA의 질량/소모된 원료의 질량]이 달성되었다 (문헌 [Lee et al., 2001]). 그러나, 글리세롤을 이용한 경우에 수득된 공간-시간 수율은 글루코스를 이용한 경우보다 실질적으로 더 낮았다 (0.14 대 1.0 g SA/[L h]).
단지 몇 가지 경우에서는, 글리세롤이 혐기적으로 대사하여 발효 생성물을 생산하는 것으로 기재되었다. 이. 콜라이는 발효 기체 수소가 축적되지 못하게 하는 산성 pH, 및 적당한 배지 조성과 같은 매우 특이적 조건 하에서 글리세롤을 발효시킬 수 있다 (문헌 [Dharmadi et al., 2006], [Yazdani and Gonzalez 2007]). 많은 미생물이 외부 전자 수용자의 존재 하에서 글리세롤을 대사시킬 수 있지만 (호흡 대사), 발효적으로 (즉, 전자 수용자의 부재 하에서) 이렇게 대사시킬 수 있는 것은 거의 없다. 글리세롤의 발효적 대사는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과, 예를 들어 시트로박터 프레운디이(Citrobacter freundii) 및 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)의 몇 가지 종에서 상당히 상세히 연구되어 왔다. 이들 유기체에서 글리세롤을 이화시키는 것은 고도로 환원된 생성물 1,3-프로판디올 (1,3-PDO)을 합성할 수 있는 그의 능력과 절대적으로 관련이 있다 (문헌 [Dharmadi et al., 2006]). 아네로비오스피릴룸속 숙시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens)를 이용하여 글리세롤을 SA로 전환시키는 것이 보고되었다 (문헌 [Lee et al., 2001]). 이러한 연구 결과는 탄소원으로서 글리세롤을 사용함으로써 부산물 아세트산은 거의 형성되지 않으면서 SA가 생산될 수 있으므로, SA의 정제를 촉진시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 가장 높은 수율은 글리세롤 및 효모 추출물을 간헐적으로 공급함으로써 수득하였는데, 이는 약 19 g/L의 SA를 생산하는 전략이다. 그러나, 효모 추출물에 존재하는 미확인 영양 성분들이 글리세롤 발효가 일어나는 데 필요한 것으로 인지되었다. 그러나, 사카라이드는 이론적으로, 폴리올 글리세롤과 비교해서 사카라이드의 환원 상태가 보다 낮기 때문에 글리세롤 보다 상당히 더 낮은 수율로 숙신산으로 전환될 수 있다. 사카라이드를 글리세롤과 조합한 것이 SA 생산 혐기성 유기체에서 기능적인 것으로 밝혀졌지만 (문헌 [Lee et al., 2001]), SA 역가는 29 g/l를 넘어서지 못하였다. 또한, 탄소 수율 YP/S이 단지 92％인 것으로 확인되었고, SA/AA 관계가 4.9:1인 것으로 확인되었다. 단지 4 g/l의 글리세롤이 기껏해야 숙신산으로 전환되었다.
효소 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 (PEPC), 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 (PEPCK) 및 피루베이트 카르복실라제 (PycA)에 의해 촉매된 옥살로아세테이트의 카르복시화 반응은 CO2 공급원으로서 HCO3 -를 이용하고 있다 (문헌 [Peters-Wendisch, PG et al., 1996, 1998]). 따라서, 히드로겐카르보네이트 공급원, 예를 들어 NaHCO3, KHCO3, NH4HCO3 등을 발효 및 배양 배지에 적용하여, 기질을 SA로 대사시키는 데 있어서 HCO3 -의 이용 효율을 개선시킬 수 있다. 글루코스로부터 SA를 생산하는 것은 지금까지의 종래 기술에서는 HCO3 -의 첨가에 의존적인 것으로 확인되지 않았었다.
혐기성 유기체에 의한 바이오매스 생산은 발효적 경로로부터 생산된 ATP의 양에 의해 제한된다. 혐기성 유기체에서의 글리세롤의 바이오매스 수율은 사카라이드, 예를 들어 헥소스, 예를 들어 글루코스, 프룩토스, 펜토스, 예를 들어 크실로스, 아라비노스 또는 디사카라이드, 예를 들어 수크로스 또는 말토스보다 더 낮다 (문헌 [Lee et al., 2001], [Dharmadi 2007]).
더욱 초기의 특허 출원 PCT/EP2008/006714 (그 내용은 본원에 참고로 포함됨)는, 파스튜렐라세아에(Pasteurellaceae) 과의 구성원이며, 원래 반추위에서 단리되고, 탄소원으로서 글리세롤을 이용할 수 있는 박테리아 균주, 및 상기 능력을 보유하는 그로부터 유래된 변이체 및 돌연변이체 균주, 특히 숙신산을 생산하는 능력을 가진, DSMZ (도이치 삼룽 폰 미크루르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하, 독일 데-38124 브라운슈바이크 인호펜스트라쎄 7베)에 기탁 번호 DSM 18541 (ID 06-614)로 기탁된, DD1로 지칭되는 박테리아 균주, 및 숙신산을 생산하는 상기 능력을 적어도 보유하는 그로부터 유래된 변이체 또는 돌연변이체 균주를 개시한다. DD1 균주는 문헌 [Kuhnert et al., 2010]에 의해 분류된 바와 같이 바스피아 숙시니시프로두센스 종 및 파스튜렐라세아에 과에 속한다.
따라서, 글리세롤로부터 유기 산, 특히 SA를 생산할 수 있는 능력을 가진 신규 박테리아 균주가 요구된다. 특히 예를 들어 바이오 디젤 생산으로부터의 조 글리세롤이 사전 정제 없이 이용될 수 있다면, 특히 이러한 균주는 높은 생산성으로 글리세롤로부터 상기 산을 생산하여야 한다. 본 발명의 목적은 이러한 신규 균주 및 생산 방법을 제공하는 것이다.
발명의 개요
DD1로 지칭되는 박테리아 균주를 단리하였던 본 발명자들은 놀랍게도, 상기 균주를 돌연변이시켜, PFL 단백질의 활성을 상기 균주가 목적하는 대사 특성을 갖도록 감소시킴으로써 상기 목적을 해결하였다. 따라서, 그들은 숙신산의 발효적 생산을 위한 탄소원으로서 글리세롤을 이용할 수 있는 신규 유형의 박테리아 균주를 제공하였으며, 상기 균주는 그의 내인성 PFL 효소 활성의 탈조절을 포함하도록 유전적으로 변형된다.
본 발명자들은 놀랍게도, 목적하는 대사 특성을 갖는 그러한 돌연변이된 박테리아 균주가 SA의 발효에서 개선된 기술적 거동을 주로 나타내었음을 확인하였다.
도면의 간단한 설명
도 1은 플라스미드 pSacB (서열 3)의 개략적 맵을 도시한다.
도 2는 플라스미드 pSacB (델타 pfl) (서열 4)의 개략적 맵을 도시한다.
도 3은 플라스미드 pSacB (델타 ldh) (서열 5)의 개략적 맵을 도시한다.
발명의 상세한 설명
a) 특정 용어의 일반적 정의:
본원에서 사용된 용어 "박테리아 균주"는 원핵 유기체, 즉 박테리아를 지칭한다. 박테리아는 그들의 생화학적 및 미생물학적 특성, 뿐만 아니라 그들의 형태학을 기초로 하여 분류될 수 있다. 이들 분류 기준은 당업계에 널리 공지되어 있다.
용어 "산" (본원에서 지칭된 바와 같은 유기 모노 또는 디카르복실산, 즉 아세트산, 락트산 및 숙신산의 맥락에서)은 그의 가장 광범위한 의미로 이해되어야 하고, 이에는 또한 그의 염, 예를 들어 알칼리 금속 염 (예: Na 및 K 염), 또는 알칼리 토금속 염 (예: Mg 및 Ca 염), 또는 암모늄 염; 또는 상기 산의 무수물이 포괄된다.
두 뉴클레오티드 서열 간의 "동일성" 또는 "상동성"은 정렬된 서열의 전체 길이에 걸친 잔기의 동일성을 의미하는데, 예를 들어 동일성은 하기 디폴트 파라미터를 이용하는 생물 정보학 소프트웨어 패키지 EMBOSS (Version 5.0.0, http://emboss.sourceforge.net/what/)로부터의 프로그램 지침 하에 계산하였다 (약간 유사한 서열에 대한 동일성):
- 갭 개방 (갭 개방에 대한 페널티): 10.0
- 갭 연장 (갭 연장에 대한 페널티): 0.5
- 데이터 파일 (패키지에 포함된 스코어링 매트릭스 파일): EDNAFUL
용어 "감소된 활성을 갖는 피루베이트-포르메이트-리아제 효소를 코딩하는 돌연변이된 유전자를 함유하는 박테리아 균주"는 감소된 활성 또는 심지어 검출 불가능한 PFL 활성을 갖는 변형된 박테리아 세포를 포함한다. PFL 활성을 검출 및 측정하는 방법은 문헌 [Knappe et al., 1990] 및 [Knappe 1993] 및 그에 인용된 참고문헌에서 확인할 수 있다. 게다가, 상기 용어는 생리학적 피루베이트-포르메이트-리아제 활성 수준을 나타내는 박테리아 세포와 비교해서 유의하게 감소된 PFL 활성을 갖는 박테리아 세포를 포함한다. 감소가 유의한지 여부는 당업자에게 널리 공지된 통계적 방법에 의해 측정될 수 있다. PFL 활성이 결여된 박테리아 세포는 자연적으로, 즉 자발적 돌연변이로 인해 발생할 수 있다. 박테리아 세포는 다양한 기술에 의해 유의하게 감소된 PFL 활성이 결여되거나 이를 갖도록 변형될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 박테리아 세포는 화학적 처리 또는 방사선에 의해 수득가능하다. 이를 위해, 박테리아 세포를 예를 들어 돌연변이화 화학적 작용제, X선, 또는 UV 광으로 처리할 수 있다. 후속 단계에서, PFL이 결여되었거나 또는 적어도 감소된 PFL 활성을 갖는 이들 박테리아 세포가 선택될 것이다. 박테리아 세포는 또한 상동성 재조합 기술에 의해 수득가능하며, 이는 박테리아 세포의 게놈에서 PFL을 돌연변이, 교란 또는 결실시키거나, 또는 감소된 활성으로 단백질을 코딩하는 돌연변이된 유전자를 유도할 돌연변이를 도입하는 것을 목적으로 한다. 재조합, 특히 돌연변이 도입 또는 서열 결실을 위해 바람직한 기술이 하기 기재된다.
상기 정의는 또한 조절될, 특히 활성이 감소, 저하 또는 스위치-오프될, 본원에 언급된 또 다른 효소를 코딩하는 다른 유전자에 적용된다.
용어 "감소된 활성"은 예를 들어 미생물의 조작 이전에 발현된 것에 비해 낮은 수준에서 유전적으로 조작된 (예를 들어, 유전적으로 처리된) 상기 미생물에 의한 유전자 생성물 (예를 들어 피루베이트-포르메이트-리아제 (pfl), 락테이트 데히드로게나제 (ldh) 등)의 발현을 포함한다. 유전자 조작은, 이들로 한정되지는 않지만, 특정 유전자의 발현과 관련있는 조절 서열 또는 부위를 변경 또는 수정하는 것 (예를 들어, 강성 프로모터, 유도성 프로모터 또는 다중 프로모터를 제거함으로써), 특정 유전자의 염색체 위치를 변경시키는 것, 특정 유전자에 인접한 핵산 서열, 예컨대 프로모터 활성에 중요한 조절 서열을 포함하는 프로모터 영역에서의 서열, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자를 변경시키는 것, 특정 유전자의 카피 수를 감소시키는 것, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 생성물의 번역과 관련된 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성화제 등)을 변형시키는 것, 또는 당업계에 통상적인 특정 유전자의 발현을 감소시키는 임의의 다른 통상적인 수단 (예컨대 이들로 한정되지는 않지만, 안티센스 핵산 분자의 사용, 또는 표적 단백질의 발현을 녹아웃 또는 차단하기 위한 다른 방법)을 포함할 수 있다.
특히, 상기 유전자는 하나 이상의 뉴클레오티드가 숙주 유기체의 염색체로부터 결실되도록 조작될 수 있다. 유전자 생성물, 예를 들어 피루베이트-포르메이트-리아제 분자의 감소된 활성은 또한 유전자 생성물의 감소된 활성을 유도하는 하나 이상의 유전자 돌연변이를 도입함으로써 얻을 수 있다. 감소된 활성은 돌연변이되지 않은 또는 변경되지 않은 효소 활성의 ≥50％ 만큼 효소 활성의 감소, 또는 ≥90％ 만큼 효소 활성의 감소, 또는 보다 바람직하게는 ≥95％ 만큼 효소 활성의 감소, 또는 보다 바람직하게는 ≥98％ 만큼 효소 활성의 감소, 또는 더욱 보다 바람직하게는 ≥99％ 만큼 효소 활성의 감소 또는 더욱 보다 바람직하게는 ≥99.9％ 만큼 효소 활성의 감소일 수 있다.
용어 "재조합" 미생물은 그가 유래된 자연 발생 미생물과 비교해서 변경된, 변형된 또는 상이한 유전자형 및/또는 표현형 (예를 들어, 유전자 변형이 미생물의 코딩 핵산 서열에 영향을 미칠 때)을 나타내도록 유전적으로 변경된, 변형된 또는 조작된 (예를 들어 유전적으로 조작된) 미생물 (예를 들어, 박테리아, 효모 세포, 진균 세포 등)을 포함한다. 용어 "프로모터"는 mRNA를 생산하기 위해 구조 유전자의 전사를 지시하는 DNA 서열을 지칭한다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 출발 코돈에 인접한 유전자의 5' 영역에 위치한다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우에는, 전사율이 유도제에 대한 반응으로 증가한다. 반대로, 프로모터가 구성적 프로모터인 경우에는 전사율은 유도제에 의해 조절되지 않는다.
용어 "인핸서"는 프로모터 성분을 지칭한다. 인핸서는, 특정 유전자가 전사의 출발 부위에 대한 인핸서의 거리 또는 배향과는 무관하게 mRNA로 전사되어 효율을 증가시킬 수 있다.
용어 "클로닝 벡터"는 숙주 세포에서 자율적으로 복제하는 능력을 갖고 있으며, 유전자 조작을 위해 세포를 형질전환시키는데 사용되는, DNA 분자, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 또는 박테리오파지를 지칭한다. 클로닝 벡터는 전형적으로 외래 DNA 서열이 벡터의 필수적인 생물학적 기능을 손실하지 않고 측정가능한 방식으로 삽입될 수 있는 1개의 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위, 뿐만 아니라 클로닝 벡터에 의해 형질전환된 세포의 확인 및 선택에 사용하는데 적합한 마커 유전자를 함유한다. 마커 유전자는 전형적으로 테트라시클린 내성 또는 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.
용어 "벡터"는 재조합 숙주에서 유전자를 제공하는 외래 단백질을 코딩하는 클로닝된 구조 유전자를 포함하는 DNA 분자를 지칭한다. 전형적으로, 숙주 게놈에 일체화되도록 예정된 벡터의 경우에는, 클로닝된 유전자가 숙주 유전자 서열과 상동성 또는 동일성인 특정 상류 및 하류 서열에 위치하거나 그와 작동가능하게 연결된다.
용어 "재조합 숙주"는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 함유하는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있는 숙주를 지칭한다. 이 용어는 또한 숙주 세포의 염색체 또는 게놈에서 클로닝된 유전자(들)을 함유하도록 유전적으로 조작된 이들 원핵 또는 진핵 세포를 포함하는 것을 의미한다 (적합한 숙주의 예에 대해서는 문헌 [Sambrook et al., 1989] 참조).
용어 "발현하다", "발현하는", "발현된" 및 "발현"은, 코딩된 단백질의 생성된 효소 활성, 또는 그와 관련된 경로 또는 반응이 상기 유전자/경로가 발현되는 유기체에서 상기 경로 또는 반응을 통해 대사 플럭스를 허용하는 수준에서 유전자 생성물 (예를 들어, 본원에 정의되고 기재된 경로 또는 반응의 유전자의 생합성 효소)의 발현을 지칭한다. 발현은 출발 유기체로서 사용되는 미생물의 유전적 변경에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 미생물은 출발 미생물에 의해 또는 변경되지 않은 비교 미생물에서 생산된 것에 비해 증가된 수준으로 유전자 생성물을 발현하도록 유전적으로 변경 (예를 들어, 유전적으로 조작)될 수 있다. 유전자 변경은, 이들로 한정되지는 않지만, 특정 유전자의 발현과 관련있는 조절 서열 또는 부위를 변경 또는 변형시키는 것 (예를 들어, 강성 프로모터, 유도성 프로모터 또는 다중 프로모터를 첨가함으로써 또는 발현이 구성적이도록 조절 서열을 제거함으로써), 특정 유전자의 염색체 위치를 변경시키는 것, 특정 유전자에 인접한 핵산 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자를 변경시키는 것, 특정 유전자의 카피 수를 증가시키는 것, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 생성물의 번역과 관련된 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성화제 등)을 변형시키는 것, 또는 당업계에 통상적인 특정 유전자의 발현을 탈조절시키는 임의의 다른 통상적인 수단 (예컨대 이들로 한정되지는 않지만, 예를 들어 리프레서 단백질의 발현을 차단하기 위한 안티센스 핵산 분자의 사용)을 포함한다.
미생물은 출발 미생물에 의한 유전자 생성물의 발현 수준에 비해 증가된 또는 감소된 수준으로 유전자 생성물을 발현하도록 물리적으로 또는 환경적으로 "변경" 또는 "변형"될 수 있다. 예를 들어, 미생물은 전사 및/또는 번역이 증가 또는 감소되도록, 특정 유전자의 전사 및/또는 번역, 및/또는 특정 유전자 생성물의 번역을 증가 또는 감소시키는 것으로 공지된 또는 의심되는 작용제 (화학적 또는 유전적)로 처리되거나 또는 그의 존재 하에 배양될 수 있다. 대안적으로, 미생물을 전사 및/또는 번역이 증가 또는 감소되도록, 특정 유전자의 전사 및/또는 번역, 및/또는 특정 유전자 생성물의 번역을 증가 또는 감소시키도록 선택된 온도에서 배양할 수 있다. "유전적으로 변형된"은 당업계에서 이용가능한 유전자 조작 기술, 예를 들어 형질전환, 돌연변이, 상동성 재조합에 의해 상기 측면에서 변경된 미생물을 지칭한다.
용어 "탈조절시키다", "탈조절된" 및 "탈조절"은, 변경 또는 변형의 부재 하에서의 SA 생산에 비해 변경 또는 변형으로 인해 미생물에서의 SA의 효율이 증가된, 미생물에서의 하나 이상의 유전자에서의 변경 또는 변형을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변경 또는 변형된 유전자는 생합성 경로의 효소 또는 수송 단백질을 코딩하며, 이로써 미생물에서 생합성 효소의 수준 또는 활성이 변경 또는 변형되고, 수송 특이성 또는 효율이 변경 또는 변형된다. 일부 실시양태에서, 생합성 경로의 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자는 효소의 수준 또는 활성이 변경되지 않은 또는 야생형 유전자의 존재 하에서의 수준에 비해 향상 또는 개선되도록 변경 또는 변형된다. 탈조절은 또한 예를 들어 피드백 내성이거나 또는 보다 높거나 낮은 특이적 활성을 갖는 효소를 수득하도록 하나 이상의 유전자의 코딩 영역을 변경시키는 것을 포함한다. 또한, 탈조절은 추가로 효소 또는 수송 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자 (예를 들어, 활성화제, 리프레서)를 코딩하는 유전자의 유전적 변경을 포함한다. 보다 구체적으로는, 탈조절은 "감소된" 효소 활성을 생성할 수 있고, (여기서 생성된 효소 활성은 탈조절되지 않은 상태에서 관찰된 바와 같이 효소 활성의 100％ 미만이며), "스위치-오프", 즉 가역적으로 또는 비가역적으로, 더이상 존재하지 않거나, 또는 효소 활성 검정과 같은 통상의 분석 수단에 의해 적어도 더이상 검출되지 않는다.
용어 "이용할 수 있는"은 본 발명의 미생물이 예를 들어 글리세롤로서의 기질을 하나 이상의 구조적으로 및/또는 입체적으로 상이한 화학적 생성물로 전환시키는 능력을 지칭한다.
"글리세롤의 숙시네이트로의 발효적 전환과 관련있거나 또는 그와 연관된 효소 활성"은 본원에서 하기 정의된 바와 같은 파라미터의 집합 중 어느 하나에 의해 측정될 수 있는 바와 같이, 글리세롤의 숙시네이트 및 또는 부산물로의 전환에 영향을 미치는 효소의 임의의 촉매적 또는 조절적 활성을 의미한다. .
본원에서 기재된 바와 같은 상이한 수율 파라미터 ("수율" 또는 YP/S; "비생산성 수율"; 또는 공간-시간 수율 (STY))는 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Song and Lee, 2006]에 기재된 바와 같이 결정된다.
"수율" 및 "YP/S" (각각은 생산된 생성물 질량/소모된 물질 질량으로 표현된다)은 본원에서 동의어로 사용된다.
비생산성 수율은 건조 바이오매스 1 g당 발효 브로쓰 1 L 및 시간당 생산되는 SA와 같은 생성물의 양을 나타낸다. DCW로서 기재된 건조 세포 중량의 양은 생화학적 반응에서 생물학적 활성 미생물의 양을 기재한다. 그 값은 시간당 DCW 1 g당 생성물 g으로서 제공된다 (즉, g/gDCW-1 h-1).
용어 "발효적 생산" 또는 "발효"는 미생물이 인큐베이션에 첨가된 하나 이상의 탄소원을 이용하는 세포 배양물에서 화학적 화합물을 생산하는 능력 (미생물에 함유되거나 그에 의해 생성되는 효소 활성에 의해 보조됨)을 지칭한다.
용어 "발효 브로쓰"는 발효적 공정에 기초한 수용액을 의미하고, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 후처리되지 않거나 후처리되었다.
b) 상이한 미생물에 대한 일반적 정의
"박테리아 세포" 또는 "박테리아 균주"는 본 발명에 따르면 엔테로박테리아세아에, 파스튜렐라세아에, 바실루스(Bacilli) 또는 악티노박테리아(Actinobacteria) 과로부터 선택된다.
"엔테로박테리아세아에"는 더욱 친숙한 여러 박테리아, 예컨대 살모넬라 및 에스케리키아 콜라이를 비롯한 거대 과의 박테리아를 나타낸다. 여기에는 프로테오박테리아가 속하고, 이들은 그들 자신의 목 (엔테로박테리알레스)이 주어진다. 엔테로박테리아세아에의 구성원은 막대형이다. 다른 프로테오박테리아와 마찬가지로, 이들은 그람-음성 염색을 가지며, 이들은 통상 혐기성균이고, 당을 발효시켜 락트산 및 다양한 다른 최종 생성물, 예컨대 숙신산을 생산한다. 또한, 대부분은 니트레이트를 니트라이트로 환원시킨다. 대부분의 유사한 박테리아와는 달리, 엔테로박테리아세아에는 일반적으로 시토크롬 C 옥시다제가 결여되어 있다. 대부분은 이동에 사용되는 많은 편모를 갖지만, 몇몇 속은 비-이동성이다. 이들은 비-포자 형성성이고, 대부분 카탈라제-양성이다. 이 과의 많은 구성원은 인간 및 다른 동물의 장에서 발견되는 장 세균군의 일반적인 부분인 반면에, 다른 것들은 물 또는 토양에서 발견되거나, 또는 다양한 상이한 동물 및 식물에 대한 기생충이다. 이. 콜라이로 더 공지되어 있는 에스케리키아 콜라이는 가장 중요한 모델 유기체 중 하나이며, 그의 유전학 및 생화학이 밀접하게 연구되었다. 엔테로박테리아세아에의 대부분의 구성원은 그들의 숙주에 대한 박테리아 세포의 부착과 관련하여 주모성 유형 I 핌브리아를 갖는다. 엔테로박테리아세아에의 예는 이. 콜라이, 프로테우스, 살모넬라, 클레브시엘라이다.
"파스튜렐라세아에"는 헤모필루스 인플루엔자에와 같은 박테리아에서 동물 및 인간 점막의 공생 생물에까지 이르는 구성원을 가진 그람-음성 프로테오박테리아의 다양한 거대 과를 포함한다. 대부분의 구성원은 조류 및 포유동물의 점막 표면, 특히 상기도에서 공생 생물로서 산다. 파스튜렐라세아에는 전형적으로 막대형이고, 통성 혐기성균의 주목할만한 군이다. 이들은 옥시다제의 존재에 의해 관련 엔테로박테리아세아에와 구별될 수 있고, 편모의 부재에 의해 다른 유사한 박테리아와 구별될 수 있다. 파스튜렐라세아에 과의 박테리아는 대사 특성 및 16S 및 23SRNA의 서열에 기초하여 수많은 속으로 분류되었다. 파스튜렐라세아에 대한 더욱 정확한 정의는 문헌 [Dousse et al., 2008] 및 [Kuhnert, P., 2008] 및 그에 인용된 문헌에서 확인될 수 있다. 대부분의 파스튜렐라세아에는 피루베이트-포르메이트-리아제 유전자를 함유하며, 탄소원을 유기 산으로 혐기적으로 발효시킬 수 있다.
용어 "바실루스"는 박테리아의 분류학상 부류를 지칭한다. 여기에는 2가지 목 바실랄레스 및 락토바실랄레스가 포함된다. 바실루스 종은 37℃에서 호기성 조건 하에 성장할 수 있는 큰 (~4-8 x 1.5 im) 원통형 박테리아를 나타낸다. 이들은 전형적으로 비병원성이다. 바실랄레스 속은 알리시클로바실라세아에, 바실라세아에, 카리오파나세아에, 리스테리아세아에, 파에니바실라세아에, 플라노콕카세아에, 스포로락토바실라세아에, 스타필로콕카세아에, 써모악티노미세타세아에, 투리시박테라세아에 종을 함유한다. 많은 바실루스는 피루베이트-포르메이트-리아제 유전자를 함유하고, 탄소원을 유기 산으로 혐기적으로 발효시킬 수 있다.
용어 "악티노박테리아" 또는 "악티노미세테스"는 높은 G+C 비율을 갖는 그람-양성 박테리아의 군이다. 이들은 유기 물질의 분해에서 중요한 역할을 하는, 가장 흔한 토양 생명체의 일부를 포함한다. 다른 악티노박테리아는 식물 및 동물에서 서식하며, 그 예는 미코박테리움, 코리네박테리움, 노카르디아, 로도코쿠스 및 스트렙토미세스이다. 일부 악티노박테리아는 관련이 없는 진균의 균사체와 다소 닯은 분지형 필라멘트를 형성하고, 이들은 더욱 오래된 명칭인 악티노미세테스 하에 원래 분류되었다. 대부분의 구성원은 호기성이지만, 몇몇은 혐기성 조건 하에 성장할 수 있다. 그람-양성 박테리아의 다른 주요 군인 피르미쿠테스와는 달리, 이들은 높은 GC-함량의 DNA를 갖는다.
바람직한 박테리아 균주는 "파스테우렐라" 속이다. 파스테우렐라 속의 박테리아는 그람-음성이고, 통성 혐기성균이다. 파스테우렐라 종은 비-운동성, 다형성 및 가장 흔하게는 카탈라제- 및 옥시다제-양성이다 (문헌 [Kuhnert and Christensen, 2008, ISBN 978-1-904455-34-9]). 바람직하게는, 상기 박테리아 세포는 파스테우렐라 박테리아 세포이고, 보다 바람직하게는 파스테우렐라 균주 DD1 세포이다.
가장 바람직하게는, 파스테우렐라 균주 DD1은 부다페스트 조약 하에 DSMZ (도이치 삼룽 폰 미크루르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하, 독일)에 기탁 번호 DSM 18541로 기탁된 박테리아 균주이다. 이 균주는 원래 독일 기원의 소의 반추위로부터 단리되었다.
파스테우렐라 박테리아는 동물, 바람직하게는 포유동물의 위장관으로부터 단리될 수 있다. 박테리아 균주 DD1은 특히 소의 반추위로부터 단리될 수 있고, 탄소원으로서 글리세롤 (예컨대 조 글리세롤)을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 균주는 특히 혐기성 조건 하에 글리세롤 (예컨대 조 글리세롤)로부터 SA를 생산하는 능력을 갖는다. 게다가, 파스테우렐라 균주 DD1은 하기의 추가의 대사 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
a) 특히 혐기성 조건 하에, 수크로스로부터 SA의 생산;
b) 특히 혐기성 조건 하에, 말토스로부터 숙신산의 생산;
c) 특히 혐기성 조건 하에, D-프룩토스로부터 SA의 생산;
d) 특히 혐기성 조건 하에, D-갈락토스로부터 SA의 생산;
e) 특히 혐기성 조건 하에, D-만노스로부터 SA의 생산;
f) 특히 혐기성 조건 하에, D-글루코스로부터 SA의 생산;
g) 특히 혐기성 조건 하에, D-크실로스로부터 SA의 생산;
h) 특히 혐기성 조건 하에, L-아라비노스로부터 SA의 생산;
i) 크실리톨, 이노시톨 및 솔비톨의 비활용;
j) 호기성 조건 및 혐기성 조건 둘 다에서의 성장;
k) 초기 글루코스 농도 적어도 75 g/L에서의 성장;
l) 암모니아 내성
특히, 상기 균주는 상기 추가의 특징 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11가지 이상 또는 전부를 나타낸다.
균주 DD1을 사카라이드 및 폴리올 글리세롤을 동시 대사시키는 능력에 대해 분석하였다 (PCT/EP2008/006714). DD1이 말토스 및 글리세롤을 동시 대사시켜 바이오매스 형성, SA 형성 및 말토스 및 글리세롤의 동시 이용을 나타내는 것으로 확인되었다.
c) 바람직한 실시양태
본 발명의 제1 실시양태는 내인성 피루베이트-포르메이트-리아제 효소 활성의 탈조절을 포함하도록 유전적으로 변형된, SA의 발효적 생산을 위한 탄소원으로서 글리세롤을 이용할 수 있는 박테리아 균주에 관한 것이다. 특히, 상기 피루베이트-포르메이트-리아제 효소 활성이 감소되거나 스위치-오프된다.
감소된 활성을 갖는 피루베이트-포르메이트-리아제를 함유하는 상기 돌연변이된 박테리아는 유전적 수단에 의해, 뿐만 아니라 당업계의 문헌에 널리 공지된 돌연변이 방법을 적용하여 돌연변이를 유도함으로써 구축될 수 있으며 (박테리아 게놈의 변형에 대한 예 및 기재는 문헌 [Saier, Milton H Jr 2008], [Foster, Patricia L, 2007], [Witkin, E M 1969], [Eisenstark, A 1971], [Walker, G C et al., 1983 and 1984], [Botstein, D, and Shortle, D 1985] 및 그에 인용된 참고문헌에서 확인될 수 있음), 상이한 탄소원, 예컨대 사카라이드 및 글리세롤의 혼합물을 사용할 수 있거나, 또는 글리세롤만을 이용할 수 있다. pfl 유전자에서 돌연변이를 갖는 균주를 단리하는 방법은 문헌 [Varenne S et al., 1975] 및 [Pascal, M et al., 1981]에서 확인될 수 있다.
바람직하게, 상기 균주는 특히 혐기성 조건 하에 상이한 탄소원 (예컨대 조 글리세롤)로부터 SA를 생산할 수 있는 능력을 갖는다.
상기 균주의 또 다른 실시양태에서, 글리세롤의 숙시네이트로의 발효적 전환과 관련있거나 또는 그와 연관된 하나 이상의 추가의 효소 활성이 탈조절된다.
특히, 상기 균주는 엔테로박테리아세아에, 파스튜렐라세아에, 바실러스 또는 악티노박테리아 과의 미생물로부터 선택된 미생물로부터 유래된다.
특히, 상기 균주는 서열 1의 16S rDNA, 또는 적어도 96, 97, 98, 99 또는 99.9％의 서열 상동성을 나타내는 서열을 갖는, 및/또는 서열 2의 23S rDNA, 또는 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.9％의 서열 상동성을 나타내는 서열을 갖는 파스튜렐라세아에 과의 미생물로부터 유래된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 박테리아 균주는 파스튜렐라세아에 과의 미생물로부터 유래되고, 바스피아 숙시니시프로두센스 종에 속한다. 바스피아 숙시니시프로두센스 종은 본원에 참고로 포함된 문헌 [Kuhnert et al., 2010]에서 확인된다.
본 발명의 균주는 추가로 하기 추가의 대사 특징 중 하나 이상을 나타낸다:
a) 수크로스로부터 숙신산의 생산;
b) 말토스로부터 숙신산의 생산;
c) 말토덱스트린으로부터 숙신산의 생산;
d) D-프룩토스로부터 숙신산의 생산;
e) D-갈락토스로부터 숙신산의 생산;
f) D-만노스로부터 숙신산의 생산;
g) D-글루코스로부터 숙신산의 생산;
h) D-크실로스로부터 숙신산의 생산;
i) L-아라비노스로부터 숙신산의 생산;
j) 락토스로부터 숙신산의 생산;
k) 라피노스로부터 숙신산의 생산;
l) 글리세롤로부터 숙신산의 생산;
m) 초기 글루코스 농도 적어도 75 g/L에서의 성장;
n) 초기 글리세롤 농도 적어도 70 g/L에서의 성장.
예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13가지 또는 상기 모든 특징과 특징 l) (글리세롤->SA)의 조합 (각각의 상기 조합의 의무적인 구성성분으로서).
추가의 실시양태에서, 본 발명의 균주는 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤을 0.5 g/g 이상, 바람직하게는 약 1.28 g/g 이하의 수율 계수 YP/S; 예를 들어 0.6 g/g 이상, 0.7 g/g 이상, 0.75 g/g 이상, 0.8 g/g 이상, 0.85 g/g 이상, 0.9 g/g 이상, 0.95 g/g 이상, 1.0 g/g 이상, 1.05 g/g 이상, 1.07 g/g 이상, 1.09 g/g 이상, 1.10 g/g 이상, 1.11 g/g 이상, 1.22 g/g 이상, 또는 1.24 g/g 이상의 수율 계수 YP/S로 숙신산으로 전환시킨다.
추가 실시양태에서 본 발명의 균주는 하기 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
a) 적어도 25 g/L의 글리세롤을 적어도 1.01 g/g의 수율 계수 YP/S로 적어도 25.1 g/L의 숙신산으로 전환시키는 것;
b) 수크로스, 말토스, 말토덱스트린, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 적어도 0.58 g gDCW-1 h-1 숙신산의 비생산성 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
c) 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 적어도 2.2 g/(L h)의 숙신산에 대한 공간-시간 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
d) 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원 적어도 25 g/L를, 적어도 2.2 g/(L h)의 숙신산에 대한 공간-시간 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
e) 수크로스, 말토스, 말토덱스트린, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 적어도 0.58 g gDCW-1 h-1 숙신산의 비생산성 수율 및 적어도 2.2 g/(L h)의 숙신산에 대한 공간-시간 수율로 숙신산으로 전환시키는 것.
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명의 박테리아 균주는 28 g/L 이상의 글리세롤을 1.0 g/g 이상, 또는 >1.0 g/g, 또는 >1.05 g/g, 또는 >1.1 g/g, 또는 >1.15 g/g, 또는 >1.20 g/g, 또는 >1.22 g/g, 또는 >1.24 g/g, 또는 약 1.28 g/g 이하의 수율 계수 YP/S로 28.1 g/L 이상의 숙신산으로 전환시킨다. 예를 들어, 28 g/L의 글리세롤은 약 40 g/L 이하 또는 약 35 g/L 이하의 숙신산으로 전환될 수 있다.
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명의 박테리아 균주는 수크로스, 말토스, 라피노스, 말토덱스트린, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스, 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 0.6 g gDCW-1 h-1 SA 이상 또는 0.65 g gDCW-1 h-1 이상 또는 0.7 g gDCW-1 h-1 이상 또는 0.75 g gDCW-1 h-1 이상, 또는 0.77 g gDCW-1 h-1 SA 이상의 비생산성 수율로 SA로 전환시킨다.
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명의 박테리아 균주는 수크로스, 말토스, 라피노스, 말토덱스트린, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스, 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 2.2 g/(L h) 이상 또는 2.5 이상, 2.75 이상, 3 이상, 3.25 이상, 3.5 이상, 또는 3.7 g/(L*h) 이상의 SA에 대한 공간-시간 수율로 SA로 전환시킨다.
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명의 박테리아 균주는 수크로스, 말토스, 라피노스, 말토덱스트린, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스, 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원 28 g/L 이상을, 2.2 g/(L h) 이상 또는 2.5 이상, 2.75 이상, 3 이상, 3.25 이상, 3.5 이상, 또는 3.7 g/(L*h) 이상의 SA에 대한 공간-시간 수율로 SA로 전환시킨다.
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명의 박테리아 균주는 수크로스, 말토스, 라피노스, 말토덱스트린 , D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스, 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 0.6 g gDCW-1 h-1 이상 또는 0.65 이상 또는 0.7 g gDCW-1 h-1 SA 이상, 또는 0.77 g gDCW-1 h-1 SA 이상의 비생산성 수율, 및 2.2 g/(L h) 이상 또는 2.5 이상, 2.75 이상, 3 이상, 3.25 이상, 3.5 이상, 또는 3.7 g/(L*h) 이상의 SA에 대한 공간-시간 수율로 SA로 전환시킨다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 균주는 DSMZ에 기탁 번호 DSM 18541로 기탁된 박테리아 균주 DD1로부터 유래될 수 있거나, 또는 숙신산을 생산할 수 있는 능력을 가진 DD1의 변이체 또는 돌연변이체 균주로부터 유래될 수 있거나 유래된다.
본 발명의 특정 균주는 숙신산 (SA) 및 부산물 (SSP)을 >10:1, 또는 >12.5:1, 또는 >15:1, 또는 >17.5:1, 또는 >20:1, 또는 >25:1, 또는 >30:1, 또는 >33:1의 SA/SSP 비율로 생산하고, 여기서 SSP는 부산물 락트산 (LA), 포름산 (FA), 아세트산 (AA), 및 말산 (MA)의 합계를 나타내고, 각각의 양은 g/L로 표현된다.
추가로 특정 균주는 숙신산 (SA) 및 부산물 아세트산 (AA)을 >10:1, 또는 >12.5:1, 또는 >15:1, 또는 >17.5:1, 또는 >20:1, 또는 >25:1, 또는 >30:1, 또는 >40:1 또는 >50:1, 또는 >75:1, 또는 >90:1의 SA/AA 비율로 생산하고, 각각의 양은 g/L로 표현된다.
추가로 특정 균주는 숙신산 (SA) 및 부산물 포름산 (FA)을 >90:1, 또는 >100:1의 SA/FA 비율로 생산하고, 각각의 양은 g/L로 표현된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는
a) 청구항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 박테리아 균주를 동화가능한 탄소원을 함유하는 배지에서 인큐베이션하고, 상기 균주를 목적하는 유기 산의 형성을 선호하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
b) 상기 배지로부터 상기 유기 산, 특히 SA, 또는 그의 염 또는 유도체를 수득하는 단계
를 포함하는, 유기 산 또는 그의 염 또는 유도체의 발효적 생산 방법에 관한 것이다.
특정 방법에 따라, 발효는 약 10 내지 60℃, 예를 들어 20 내지 50℃, 30 내지 45℃, 또는 25 내지 35℃ 범위의 온도에서, 및 5.0 내지 9.0, 예를 들어 5.5 내지 8, 또는 6 내지 7의 pH에서, 및 이산화탄소의 존재 하에 수행한다. pH는 NH4HCO3, (NH4)2CO3, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, KHCO3, Mg(OH)2, MgCO3, MgH(CO3)2, Ca(OH)2, CaCO3, Ca(HCO3)2, CaO, CH6N2O2, C2H7N 및/또는 이들의 혼합물을 첨가함으로서 조절할 수 있다.
특히, 상기 동화가능한 탄소원은 글리세롤, 수크로스, 말토스, 말토덱스트린, D-프룩토스, D-갈락토스, D-만노스, 락토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, 라피노스; 전분, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그노셀룰로스의 분해 생성물; 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.
특히, 상기 탄소원은 글리세롤, 또는 글리세롤과 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, D-글루코스, D-크실로스, 라피노스 및 L-아라비노스로부터 선택된 하나 이상의 추가의 탄소원의 혼합물이다.
상기 방법의 특정 실시양태에 따르면, 동화가능한 탄소원의 농도는 5 내지 80 g/l, 예를 들어 10 내지 60 g/l 범위의 값으로 조정된다.
본 발명은 추가로
a. 박테리아 균주를 하나 이상의 동화가능한 탄소원을 함유하는 배지에서 인큐베이션하고, 상기 균주를 목적하는 유기 산의 형성을 선호하는 조건 하에 배양하는 단계;
b. 상기 배지로부터 유기 산 또는 그의 염 또는 유도체를 수득하는 단계
를 포함하며;
추가로
c. 적어도 25 g/L의 글리세롤을 적어도 1.0 g/g의 수율 계수 YP/S로 적어도 25.1 g/L의 숙신산으로 전환시키는 것;
d. 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 적어도 0.58 g gDCW-1 h-1 숙신산의 비생산성 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
e. 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 적어도 2.2 g/(L h)의 숙신산에 대한 공간-시간 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
f. 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원 적어도 25 g/L를, 적어도 2.2 g/(L h)의 숙신산에 대한 공간-시간 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
g. 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 적어도 0.6 g gDCW-1 h-1 숙신산의 비생산성 수율 및 적어도 2.2 g/(L h)의 숙신산에 대한 공간-시간 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
h. 숙신산 (SA) 및 부산물 (SSP)을 >10:1, 또는 >12.5:1, 또는 >15:1, 또는 >17.5:1, 또는 >20:1, 또는 >25:1, 또는 >30:1, 또는 >33:1의 SA/SSP 비율로 생산하며, 여기서 SSP가 부산물 락트산 (LA), 포름산 (FA), 아세트산 (AA), 및 말산 (MA)의 합계를 나타내고, 각각의 양이 g/L로 표현되는 것;
i. 숙신산 (SA) 및 부산물 아세트산 (AA)을 >10:1, 또는 >12.5:1, 또는 >15:1, 또는 >17.5:1, 또는 >20:1, 또는 >25:1, 또는 >30:1, 또는 >50:1, 또는 >75:1, 또는 >90:1의 SA/AA 비율로 생산하고, 각각의 양이 g/L로 표현되는 것
중 하나 이상을 특징으로 하는, 숙신산 또는 그의 염 또는 유도체의 발효적 생산 방법을 제공한다.
상기 방법의 특정 실시양태에 따르면, 상기 박테리아 균주는 상기에 정의된 바와 같은 유전적으로 변형된 균주이다.
본 발명의 방법은 불연속적으로 또는 연속적으로 수행될 수 있다. 산 생산 과정은 예를 들어 HPLC 또는 GC 분석과 같은 통상의 수단에 의해 모니터링될 수 있다.
바람직하게는 SA는 혐기성 조건 하에 생산된다. 혐기성 조건은 통상의 기술에 의해서, 예를 들어 반응 배지의 구성성분을 탈기시키고, 이산화탄소 또는 질소 또는 이들의 혼합물 및 임의로 수소를 예를 들어 0.1 내지 1 또는 0.2 내지 0.5 vvm의 유속으로 도입하여 혐기성 조건을 유지함으로써 수립될 수 있다.
호기성 조건은 통상적인 기술에 의해, 예를 들어 공기 또는 산소를 예를 들어 0.1 내지 1 또는 0.2 내지 0.5 vvm의 유속으로 도입함으로써 수립될 수 있다.
적합한 경우, 본 발명에 따라 0.1 내지 1.5 bar의 약간 과압력을 적용할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 정의된 숙신산을 발효적으로 생산하는 단계; 및 추가로 염기 암모니아 또는 그의 수용액, 또는 NH4HCO3, (NH4)2CO3, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, KHCO3, Mg(OH)2, MgCO3, MgH(CO3)2, Ca(OH)2, CaCO3, Ca(HCO3)2, CaO, CH6N2O2, C2H7N 및 이들의 혼합물을 이용하여 pH를 조절하는 단계를 포함하는, 숙신산 및/또는 숙신산 암모늄 염의 생산 방법을 제공한다. 일반적으로, 염기의 물리적 조건은 수용액, 수성 현탁액, 기체 또는 고체일 수 있다.
한 실시양태에서, 유기 산, 특히 숙신산, 및/또는 그의 염은 상기 및 하기 언급된 방법 중 하나에 의해 생산되며, 추가로 여과 및/또는 원심분리, 양이온 교환 크로마토그래피 및/또는 결정화에 의해 단리 및/또는 정제된다.
바람직하게는, 유기 산 및/또는 그의 염은 여과 단계, 후속적으로 양이온 교환 크로마토그래피 단계, 후속적으로 결정화 단계에 의해 추가로 단리 및/또는 정제된다.
여과를 이용하여, 숙신산 함유 액체로부터 박테리아 세포를 분리할 수 있다. 여과는 정용여과, 횡류-여과 및/또는 한외여과일 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 물질은 강산 양이온 교환 수지일 수 있다. 강산 양이온 교환 수지는 예를 들어 술폰산 기를 보유한다. 특히, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 물질은 H+-형태의 술폰산 기를 보유하는 스티롤-디비닐 벤졸-공중합물일 수 있다. H+-형태는 술폰산 기가 산-형태로 존재하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 평균 입자 크기는 0.3 내지 1.5, 보다 바람직하게는 0.55 내지 0.75 mm이고/이거나, 벌크 밀도는 700 내지 800 g/l이다. 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 거대다공성일 수 있다. 거대다공성은 바람직하게는 양이온 교환 수지의 평균 기공 직경이 20 내지 120 nm, 바람직하게는 20 내지 100 nm, 보다 바람직하게는 20 내지 40 nm임을 의미한다. 입자 분포는 바람직하게는 일분산형이다. 바람직하게는, 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 총 용량은 0.5 내지 2.0, 보다 바람직하게는 0.8 내지 1.7, 보다 바람직하게는 1.0 내지 1.5, 보다 바람직하게는 1.4 내지 1.9 분 eq./l이다. x eq./l은 1 리터의 양이온 교환 수지가 x 몰의 술폰산 기를 보유한다는 것을 의미한다. 따라서, eq./l은 단일 하전된 분자에 대한 계산된다. 정제하고자 하는 숙신산 염은 Na, K, Ca, Mg 및/또는 암모늄 염일 수 있다. 예를 들어 강산 양이온 교환 수지는 란세스(Lanxess)로부터의 유형 레바티트 모노플러스(Lewatit Monoplus) SP 112일 수 있다.
바람직하게는, 양이온 교환 크로마토그래피는 20 내지 60℃, 보다 바람직하게는 45 내지 60℃의 온도에서 수행된다.
SA를 생산하는 추가의 바람직한 방법은 아래 기술된다:
방법 1:
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
a. 박테리아 균주를 하나 이상의 동화가능한 탄소원을 함유하는 배지에서 인큐베이션하고, 상기 균주를 목적하는 유기 산의 형성을 선호하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
b. 상기 배지로부터 상기 유기 산 또는 그의 염 또는 유도체를 수득하는 단계
를 포함하며,
추가로, 50 g/L 이상의 글리세롤을, 1.0 g/g 이상, 또는 >1.0 g/g, 또는 >1.05 g/g, 또는 >1.1 g/g, 또는 >1.15 g/g, 또는 >1.20 g/g, 또는 >1.22 g/g, 또는 >1.24 g/g; 약 1.28 g/g 이하의 수율 계수 YP/S; 예를 들어, 0.6 g/g 이상, 0.7 g/g 이상, 0.75 g/g 이상, 0.8 g/g 이상, 0.85 g/g 이상, 0.9 g/g 이상, 0.95 g/g 이상, 1.0 g/g 이상, 1.05 g/g 이상, 1.1 g/g 이상, 1.15 g/g 이상, 1.20 g/g 이상, 1.22 g/g 이상, 또는 1.24 g/g 이상의 수율 계수 YP/S로 50 g/L 이상의 SA로 전환시키는 것을 특징으로 하는, SA 또는 그의 염 또는 유도체의 발효적 생산 방법을 제공한다. 예를 들어, 50 g/L의 글리세롤은 약 65 g/L 이하 또는 62.5 g/L 이하의 SA 또는 60 g/L 이하의 SA로 전환될 수 있다.
방법 2:
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
a. 박테리아 균주를 하나 이상의 동화가능한 탄소원을 함유하는 배지에서 감소된 활성을 갖는 피루베이트-포르메이트-리아제 효소와 함께 인큐베이션하고, 상기 균주를 목적하는 유기 산의 형성을 선호하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
b. 상기 배지로부터 상기 유기 산 또는 그의 염 또는 유도체를 수득하는 단계
를 포함하며,
추가로, 수크로스, 말토스, 말토덱스트린, 라피노스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 탄소원을, 0.42 g gDCW-1 h-1 SA 이상 또는 0.45 이상 또는 0.47 g gDCW-1 h-1 SA 이상, 또는 0.49 g gDCW-1 h-1 SA 이상의 비생산성 수율로 SA로 전환시키는 것을 특징으로 하는, SA 또는 그의 염 또는 유도체의 발효적 생산 방법을 제공한다.
방법 3:
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
a. 박테리아 균주를 하나 이상의 동화가능한 탄소원을 함유하는 배지에서 감소된 활성을 갖는 피루베이트-포르메이트-리아제 효소와 함께 인큐베이션하고, 상기 균주를 목적하는 유기 산의 형성을 선호하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
b. 상기 배지로부터 상기 유기 산 또는 그의 염 또는 유도체를 수득하는 단계
를 포함하며,
추가로, 수크로스, 말토스, 말토덱스트린, 라피노스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 탄소원을, 2.22 g/(L h) 이상, 또는 2.5 이상, 2.75 이상, 2.9 g/(L*h) SA 이상의 SA에 대한 공간-시간 수율로 SA로 전환시키는 것을 특징으로 하는, SA 또는 그의 염 또는 유도체의 발효적 생산 방법을 제공한다.
방법 4:
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
a. 박테리아 균주를 하나 이상의 동화가능한 탄소원을 함유하는 배지에서 인큐베이션하고, 상기 균주를 목적하는 유기 산의 형성을 선호하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
b. 상기 배지로부터 상기 유기 산 또는 그의 염 또는 유도체를 수득하는 단계
를 포함하며,
추가로, 수크로스, 말토스, 말토덱스트린, 라피노스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 탄소원 50 g/L 이상을, 2.2 g/(L h) 이상, 또는 2.5 이상, 2.75 이상, 3 이상, 3.25 이상, 3.5 이상 또는 3.7 g/(L*h) 이상의 SA에 대한 공간-시간 수율로 SA로 전환시키는 것을 특징으로 하는, SA 또는 그의 염 또는 유도체의 발효적 생산 방법을 제공한다.
방법 5:
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
a. 박테리아 균주를 하나 이상의 동화가능한 탄소원을 함유하는 배지에서 인큐베이션하고, 상기 균주를 목적하는 유기 산의 형성을 선호하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
b. 상기 배지로부터 상기 유기 산 또는 그의 염 또는 유도체를 수득하는 단계
를 포함하며,
추가로, 수크로스, 말토스, 말토덱스트린, 라피노스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 탄소원을, 0.6 g gDCW-1 h-1 SA 이상 또는 0.65 이상 또는 0.7 g gDCW-1 h-1 SA 이상, 또는 0.75 g gDCW-1 h-1 SA 이상, 또는 0.77 g gDCW-1 h-1 SA 이상의 비생산성 수율, 및 2.2 g/(L h) 이상, 또는 2.5 이상, 2.75 이상, 3 이상, 3.25 이상, 3.5 이상 또는 3.7 g/(L*h) 이상의 SA에 대한 공간-시간 수율로 SA로 전환시키는 것을 특징으로 하는, SA 또는 그의 염 또는 유도체의 발효적 생산 방법을 제공한다.
상기 확인된 SA의 생산 방법 1 내지 5의 또 다른 실시양태에서는, 탄소원이 글리세롤, 또는 글리세롤과 수크로스, 말토스, 라피노스, 말토덱스트린, D-프룩토스, D-갈락토스, D-만노스, D-글루코스, D-크실로스 및 L-아라비노스로부터 선택된 하나 이상의 추가의 탄소원의 혼합물이다.
SA를 생산하는데 특히 바람직한 조건은 다음과 같다:
탄소원: 글루코스, 크실로스, 말토스 또는 말토덱스트린, 라피노스 및/또는 글리세롤 (예컨대 조 글리세롤)
온도: 30 내지 45℃
pH: 5.5 내지 7.0, 상기 언급된 바와 같은 염기, 바람직하게 HCO3 - 공급원, 예를 들어 Na2CO3, NaHCO3, Mg(HCO3)2, Ca(HCO3)2 또는, Mg(OH)2, MgCO3, Ca(OH)2, CaCO3에 의해 제어됨.
공급 기체: CO2
생산된 SA 및/또는 SA 염은 당업계에 공지된 통상의 방법, 예를 들어 결정화, 여과, 전기투석, 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 이들은 침전물의 중화 및 여과를 위해 칼슘 히드록시드, - 옥시드, - 카르보네이트 또는 히드로겐카르보네이트를 사용하여 발효시키는 동안 발효기에서 칼슘 숙시네이트 생성물로서 침전시킴으로써 단리될 수 있다. 목적하는 SA 생성물은 황산에 의해 숙시네이트를 산성화시킨 후, 여과에 의해 황산칼슘 (석고) 및 침전물을 제거함으로써, 침전된 칼슘 숙시네이트로부터 회수된다. 생성된 용액은 추가로 바람직하지 않은 잔류 이온을 제거하기 위해 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
또 다른 실시양태는에서, 본 발명은
b) 상기 정의된 바와 같이 숙신산 및/또는 숙신산 염을 발효적으로 생산하는 단계, 및
b1) 수득된 유리 산을 직접적으로 촉매적 수소화하여 테트라히드로푸란 (THF) 및/또는 1,4-부탄디올 (BDO) 및/또는 감마-부티로락톤 (GBL)을 수득하는 단계, 또는
b2) 수득된 유리 숙신산 및/또는 숙신산 염을 화학적으로 에스테르화하여 그의 상응하는 디-저급알킬 에스테르를 수득하고, 후속적으로 상기 에스테르를 촉매적 수소화하여 THF 및/또는 BDO 및/또는 GBL을 수득하는 단계
를 포함하는, THF 및/또는 BDO 및/또는 GBL의 생산 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서 본 발명은
a) 상기 정의된 바와 같이 숙신산 암모늄 염을 발효적으로 생산하는 단계; 및
b) 자체 공지된 방식으로 숙신산 암모늄 염을 피롤리돈으로 화학적으로 전환시키는 단계
를 포함하는, 피롤리돈의 생산 방법을 제공한다.
상기 방법의 특정 실시양태에서, 동화가능한 탄소원으로서 사용되는 상기 글리세롤은 특히 트리아실글리세리드의 에스테르 절단에 의해 수득된 조 글리세롤이다. 예를 들어, 글리세롤은 바이오 디젤의 제조로부터 수득되는 폐기물이다.
본 발명은 또한 유기 정제 화학물질, 예를 들어 숙신산 또는 그의 염 또는 유도체의 발효적 생산에서의, 상기 정의된 바와 같은 박테리아 균주의 용도에 관한 것이다.
d) 추가의 특정 실시양태
d1) 유전자 조작
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명의 박테리아 균주는, 그의 효소 활성이 EC 번호 EC 2.3.1.54로 정의되는, 피루베이트-포르메이트-리아제 (pfl) 효소의 돌연변이된 효소를 코딩하는 유전자를 함유한다. 예를 들어, pfl 효소 활성은 pflA 유전자에서의 돌연변이에 의해 또는 pflA 유전자의 발현 조절에 영향을 미침으로써 부정적인 영향을 받는다. pflA 유전자의 서열 및 pflA 유전자 생성물은 기탁 번호 GeneID:6268899, YP_001880903 하에 확인될 수 있고, 이 유전자의 상동체는 기탁 번호 NCBI-GeneID 945514, 945444, 947623, 948454, 3075405 하에 공지되어 있으며, 각각의 단백질은 기탁 번호 UniProt: P09373, P75793, P42632, P32674, Q65VK2 하에 공지되어 있다.
또한, EC 번호 EC 1.97.1.4로 정의되며, 감소된 또는 탈조절된 활성을 갖는 것으로 문헌 [Knappe et al., 1990 and 1993]에 기재된, 피루베이트-포르메이트-리아제 활성화 효소를 코딩하는 유전자가 본 발명의 범위 내에 있다. 이는 본 발명에 기재된 방법에 의해 돌연변이 또는 유전자 결실을 도입함으로써 수행될 수 있다. 활성이 감소될 수 있거나 또는 코딩 유전자가 돌연변이 또는 탈조절될 수 있는 이 효소에 대한 예는 pfl 활성화 효소 유전자 pflA 및 yfiD 유전자, 기탁 번호 GeneID: 947068 하에 공지된 이. 콜라이 K12 유전자, 기탁 번호 NCBI-GeneID: 945445를 갖는 유전자 ybiY, 및 기탁 번호 GeneID: AAU37008 하에 공지된 각각의 단백질 NP_415345 만헤이미아 숙시니프로두센스 유전자, 기탁 번호 YP_087593, NP_417074 및 YP_087564 하의 각각의 단백질, 뿐만 아니라 상기 유전자의 상동체에 의해 코딩된다. 본 발명에 기재된 돌연변이 또는 결실이 적용되는 돌연변이되지 않은 유전자 서열의 기탁 번호가 기재된다.
또한, 각각의 유전자에 대한 유전자 돌연변이를 보유함으로써 단백질 arcA, 예를 들어 기탁 번호: ECK4393 (또한, 하기 기재 하에 공지됨: cpxC, fexA, sfrA, msp) 또는 fnr의 감소된 활성을 나타내는 균주 (arcA의 경우 기탁 번호 NCBI-GeneID: 948874 하에 공지되어 있고, fnr의 경우 NCBI-GeneID: 945908 하에 공지되어 있음)가 본 발명의 범위내에 있다. 각각의 단백질 서열은 기탁 번호 P0A9E5 하에 확인될 수 있다. 다른 유기체, 예컨대 만헤이미아 숙시니프로두센스에 대해 유사한 유전자, 즉 NCBI-GeneID: 3076294 및 arcA의 경우 각각의 단백질 YP_088696 및 fnr의 경우 NCBI-GeneID:3075449 및 UniProt: Q65TM6이 공지되어 있다.
또한, D-락트산 또는 L-락트산 또는 이들 둘 다를 생산하는 특이성을 가진 효소를 코딩하는, EC 번호 EC 1.1.1.27 및 EC 1.1.1.28에 의해 정의된 락테이트 데히드로게나제의 감소된 활성을 나타내는 균주가 본 발명의 범위내에 있다. 그 예는 이. 콜라이 유전자 NCBI-GeneID: 946315 및 각각의 단백질 NP_415898 또는 엠 숙시니프로두센스 유전자 NCBI-GeneID: 3075603 및 각각의 단백질 YP_089271이다.
또 다른 실시양태에 따라, 본 발명의 박테리아 균주는 하기를 함유한다:
(1) EC 명명법에 의해 EC 2.3.1.54로 정의되며, 감소된 활성을 갖는 피루베이트-포르메이트-리아제 효소를 코딩하는 돌연변이된 유전자; 및/또는 (2) EC 명명법에 의해 EC 1.97.1.4로 정의되며, 감소된 활성을 갖는 피루베이트-포르메이트-리아제 활성화 효소를 코딩하는 돌연변이된 유전자; 및/또는 (3) arcA 단백질을 코딩하는 돌연변이된 유전자; 및/또는 (4) EC 명명법에 의해 EC 1.1.1.27 또는 EC 1.1.1.28로 정의되며, 감소된 활성을 갖는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 돌연변이된 유전자.
본 발명의 유전적으로 변형된 박테리아 균주를 제조하기 위한 특별한 방법은, 본원에서 때때로 "캠벨 재조합"으로도 지칭되는 기술이다 (문헌 [Leenhouts et al., 1989, Appl Env Microbiol 55, 394-400]). 본원에 사용되는 "캠벨 인(Campbell in)"은 전체 환형 이중 가닥 DNA 분자 (예를 들어 플라스미드)가 상기 환형 DNA 분자의 선형화 버전을 상기 환형 DNA 분자의 제1 DNA 서열에 상동성인 염색체의 제1 DNA 서열 내로 효과적으로 삽입시키는 단일 상동성 재조합 사건 (크로스-인(cross-in) 사건)에 의해 염색체 내로 일체화되는, 원래의 숙주 세포의 형질전환체의 제조를 지칭한다. "캠벨드 인(Campbelled in)"은 "캠벨 인" 형질전환체의 염색체 내로 일체화된 선형화된 DNA 서열을 지칭한다. "캠벨 인"은 제1 상동성 DNA 서열의 복제물을 함유하고, 여기서 그의 각각의 카피는 상동성 재조합 교차점의 카피를 포함하며 이를 둘러싼다.
본원에 사용된 "캠벨 아웃(Campbell out)"은 "캠벨 인" 형질전환체에서 유래되는 세포를 지칭하며, 제2 상동성 재조합 사건 (크로스-아웃(cross out) 사건)은 "캠벨드 인" DNA의 선형화된 삽입된 DNA에 함유된 제2 DNA 서열과 상기 선형화된 삽입체의 제2 DNA 서열에 상동성인 염색체 기점의 제2 DNA 서열 사이에서 발생한다. 상기 제2 재조합 사건은 일체화된 DNA 서열의 일부의 결실 (제티스닝(jettisoning))을 일으키지만, 중요하게는 또한 일체화된 "캠벨드 인" DNA의 일부 (이는 단일 염기만큼 작을 수 있음)를 염색체 내에 남아있도록 하여, 원래의 숙주 세포에 비해 "캠벨 아웃" 세포가 염색체 내에 하나 이상의 의도적인 변화를 함유하게 한다 (예를 들어, DNA 서열의 결실, 단일 염기 치환, 다중 염기 치환, 이종성 유전자 또는 DNA 서열의 삽입, 상동성 유전자 또는 변형된 상동성 유전자의 추가의 카피 또는 카피들의 삽입, 또는 상기 나열된 하나 초과의 상기한 예를 함유하는 DNA 서열의 삽입).
"캠벨 아웃" 세포는 바람직하게는 "캠벨드 인" DNA 서열의 일부 (제티스닝되도록 요망되는 일부)에 함유되는 유전자, 예를 들어 약 5％ 내지 10％ 수크로스의 존재 하에 성장되는 세포 내에서 발현될 때 치명적인 바실러스 서브틸리스 sacB 유전자에 대한 역-선택에 의해 수득된다. 역-선택을 이용하거나 이용하지 않을 때, 목적하는 "캠벨 아웃" 세포는 비제한적으로 콜로니 형태, 콜로니 색상, 항생제 내성의 존재 또는 부재, 중합효소 연쇄 반응에 의한 주어진 DNA 서열의 존재 또는 부재, 영양요구성의 존재 또는 부재, 효소의 존재 또는 부재, 효소 활성의 존재 또는 부재, 예컨대 피루베이트 포르메이트 리아제 활성 또는 락테이트 데히드로게나제 활성, 콜로니 핵산 혼성화, 항체 스크리닝 등과 같은 임의의 스크리닝가능한 표현형을 사용하여 목적하는 세포에 대해 스크리닝함으로써 얻어지거나 확인될 수 있다. 용어 "캠벨 인" 및 "캠벨 아웃"은 또한 상기 설명된 방법 또는 공정을 나타내도록 다양한 시제의 동사로서 사용될 수 있다.
"캠벨 인" 또는 "캠벨 아웃"을 일으키는 상동성 재조합 사건은 상동성 DNA 서열 내에서 다양한 DNA 염기에 걸쳐 일어날 수 있음이 이해되고, 상동성 서열은 상기 범위의 적어도 일부에 대해 서로 동일할 것이므로, 교차 사건이 일어난 곳을 정확하게 명시하는 것은 대체로 가능하지 않다. 달리 말하면, 어떠한 서열이 삽입된 DNA로부터 기원하는지, 및 어떠한 서열이 염색체 DNA로부터 기원하는지를 정밀하게 명시하는 것은 가능하지 않다. 또한, 제1 상동성 DNA 서열 및 제2 상동성 DNA 서열은 대체로 부분적 비-상동성의 영역에 의해 분리되고, 비-상동성의 상기 영역은 "캠벨 아웃" 세포의 염색체 내에 퇴적되어 유지된다.
바람직하게는, 제1 및 제2 상동성 DNA 서열은 적어도 약 200 염기 쌍 길이이고, 수 천개 이하의 염기 쌍 길이일 수 있다. 그러나, 더 짧거나 더 긴 서열을 이용하여 절차를 수행할 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 상동성 서열에 대한 길이는 약 500 내지 2000 염기 범위일 수 있고, "캠벨 인"으로부터 "캠벨 아웃"을 수득하는 것은 대략 동일한 길이이고, 바람직하게는 200 염기쌍 미만의 차이를 갖고, 가장 바람직하게는 2개 중 더 짧은 것이 염기쌍이 더 긴 것의 길이의 적어도 70％인 제1 및 제2 상동성 서열을 배열함으로써 용이하게 된다.
유전자 변형의 상기 방법을 적용함으로써, 특정 SA 생산자 균주 (즉, DD1)의 돌연변이체 균주는 하기 실시예에 보다 상세히 기재된 바와 같이 내인성 피루베이트-포르메이트-리아제 효소 및/또는 락테이트 데히드로게나제 효소의 유전자를 결실시킴으로써 제조되었다.
d2) 발효 단계:
본 발명에 따라 이용되는 발효는 예를 들어 교반식 발효기, 버블 칼럼 및 루프 반응기에서 수행할 수 있다. 교반기 유형 및 기하학적 디자인을 비롯한 가능한 방법 유형의 포괄적인 개요는 문헌 ["Chmiel: Bioprozesstechnik: Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik, Band 1"]에서 확인될 수 있다. 본 공정에서, 이용 가능한 전형적인 변형은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 예를 들어 문헌 ["Chmiel, Hammes and Bailey: Biochemical Engineering"]에 설명된 다음 변형, 예를 들어 바이오매스의 재순환을 수반하거나 수반하지 않는 배치식, 공급 배치식, 반복형 공급 배치식, 또는 연속식 발효이다. 생산 균주에 따라서, 우수한 수율 (YP/S)을 달성하기 위해서는 공기, 산소, 이산화탄소, 수소, 질소 또는 적당한 기체 혼합물을 이용하여 살포할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 발효 브로쓰에서의 의도된 화학적 전환을 수행하기 전에, 발효 브로쓰를 예비-처리할 수 있는데, 예를 들어 상기 브로쓰의 바이오매스를 제거할 수 있다. 바이오매스를 제거하는 공정은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 여과, 침강 및 부유이다. 결과적으로, 바이오매스는 예를 들어 원심분리기, 분리기, 경사 제거기, 여과기를 이용하거나 또는 부유 장치에서 제거할 수 있다. 유용한 생성물을 최대로 회수하기 위하여, 바이오매스를 예를 들어 투석여과의 형태로 세척하는 것이 종종 바람직하다. 상기 방법의 선택은 발효기 브로쓰 내의 바이오매스 함량 및 바이오매스의 특성, 및 바이오매스와 유용한 생성물 간의 상호 작용에 따라 좌우된다. 한 실시양태에서는, 발효 브로쓰를 멸균 또는 저온 살균할 수 있다.
추가의 실시양태에서는, 발효 브로쓰를 농축시킨다. 필요에 따라, 이러한 농축을 배치식 또는 연속식으로 수행할 수 있다. 일차적으로는 생성물 손상이 일어나지 않아야 하고, 이차적으로는 최소한의 장치 및 에너지 사용이 필요하도록 압력 및 온도 범위를 선택해야 한다. 특히 다단계 증발을 위한 압력 및 온도 수준을 능숙하게 선택함으로써 에너지를 절감할 수 있다.
교반식 탱크, 유하 액막 증발기, 박막 증발기, 강제-섬광 순환 증발기 및 다른 증발기 유형이 자연 또는 강제 순환 방식에 이용될 수 있다.
d3) SA의 에스테르화 및 수소화:
화학적 에스테르화 반응에 이은 직접적인 촉매적 수소화 반응을 수행하는 데에 적합한 실험 조건은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 유럽 특허 출원 06007118.0 (본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.
a) 에스테르화 공정:
반응성 증류를 포함할 수 있는 에스테르화 공정은 자체 공지된 각종 디자인의 장치를 이용하여 수행할 수 있다.
예를 들어, 트레이 또는 팩킹을 설치함으로써 달성되는 적당한 수의 이론적 단을 갖는 정류 칼럼을 포함하는, 연속적인 방식으로 작동되는 에스테르화 플랜트를 사용할 수 있다. 칼럼의 웅덩이에 부착된 증발기 루프에서 증발되는 알칸올 급송에 따른 결과로서 칼럼에서 정지 상태 온도 프로파일이 형성되자 마자 SA의 암모늄 염을 포함하는 수성 충전물을 저장고 용기로부터 칼럼 상부 내로 공급한다. 이러한 반응으로 하행의 암모늄 염-함유 액체 및 축합물과 상행의 알칸올-함유 기상의 역류가 형성된다. 에스테르화 반응을 촉매하기 위하여, 균질한 촉매를 암모늄 염 초기 충전물에 첨가할 수 있다. 대안적으로, 불균질한 촉매를 칼럼 내부에 제공할 수 있다. 형성된 카르복실산 에스테르는 본 공정 조건 하에서는 액체이고, 칼럼의 하부 말단을 통하여 증류 칼럼의 웅덩이 내로 통과하며, 이러한 웅덩이로부터 지속적으로 회수된다. 기체 성분, 예를 들어 알칸올-물 및/또는 암모니아를 포함하는 공비 혼합물을 반응 칼럼으로부터 제거함으로써 칼럼 상부의 반응 평형으로부터 제거한다.
상기 언급된 구체적 실시양태의 추가의 변형은 허용 가능한 노력만으로도 당업자에 의해 실행될 수 있다.
본 발명에 따르는 에스테르화 공정에 적합한 공정 파라미터 범위는 사용된 장치의 형상, 예를 들어 사용된 칼럼 내부의 유형, 반응물의 유형 및 양, 적당한 경우 사용된 촉매의 유형 및 양에 따라서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 개별적 파라미터를 다음 파라미터 범위 내에서 설정할 수 있다:
칼럼 온도: 0-300℃, 특히 40-250℃ 또는 70-200℃
압력: 0.1 내지 6 bar, 특히 표준 압력
체류 시간: 수 초 (예를 들어, 1초 내지 60초) 내지 수 일 이하 (예를 들어, 1일 내지 5일), 특히 수 분 (예를 들어, 1분 내지 60분) 내지 수 시간 (예를 들어, 1시간 내지 15시간), 보다 바람직하게 수 분 (예를 들어, 5분 내지 20분) 내지 2시간.
b) 수소화 공정
본 발명에 따라서 제조된 SA 에스테르 또는 SA는 당업자에게 친숙한 공정, 장치 및 보조제, 예를 들어 촉매를 이용하여 자체 공지된 방식으로 수소화된다.
특히, 연속식 또는 배치식 기체상 수소화 반응을 에스테르 수소화에 적합한 불균질한 촉매의 존재 하에 수행한다. 허용 가능한 노력만으로도 당업자는 특별한 에스테르에 대한 최적의 공정 파라미터를 확립할 수 있다. 예를 들어, 반응 온도는 약 100 내지 약 300℃의 범위, 바람직하게 약 200 내지 280℃의 범위이고, 압력은 약 5 내지 100 bar, 예를 들어 10 내지 50 bar이다. 반응물 대 수소의 몰 비는 약 1:100 내지 약 1:2000, 예를 들어 1:800 내지 1:1500 범위 내로 설정된다.
수소화 반응에 유용한 촉매는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 각종 구리 촉매를 사용할 수 있다. 종래 기술에서는, 예를 들어 명칭 85/1 (다비 프로세스 테크놀로지 리미티드(Davy Process Technology Ltd.), 영국) 하에 수득가능한 환원된 구리 크로마이트 촉매를 사용하는 것을 기재한다. 그러나, 본 발명에 따라서 특히 적합한 촉매는 지지된 산화구리 촉매인데, 이러한 산화구리는 알루미나 또는 실리카 지지체 물질에 적용된다. 구리 촉매를 이용하여 숙신산 에스테르를 BDO (1,4-부탄디올)/GBL (감마-부티로락톤)/THF로 수소화시키는 것의 예가 또한 다음 논문에 기재되어 있다 (문헌 [Schlander, Jan., Feb. 2000, University of Karlsruhe, "Gasphasenhydrierung von Maleinsauredimethylester zu 1,4-Butandiol, gamma-Butyrolacton und Tetrahydrofuran an Kupfer-Katalysatoren"]).
본 발명은 다음 실시예에 의해 보다 상세히 기재될 것이다. 하기의 방법은 예시 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범주를 제한하려는 의도는 아니다.
<실시예>
실시예 - 유전자 변형 및 배양
실시예 1: DD1의 형질전환을 위한 일반적 방법
<표 1>
Figure pct00001
파스테우렐라 균주 LU13843 (야생형 DD1)은 하기 프로토콜을 사용하는 전기천공에 의해 DNA로 형질전환되었다:
사전-배양물을 제조하기 위해 LU 13843을 새로 성장한 BHI-한천 플레이트로부터 100 ml 진탕 플라스크 중의 40 ml BHI (뇌 심장 주입, 디프코(Difco))에 접종하였다. 인큐베이션은 30℃에서 밤새 200 rpm 하에 수행하였다.
주-배양물을 제조하기 위해 50 ml BHI를 100 ml 진탕 플라스크에 넣고, 0.4의 최종 OD (610nm)로 사전-배양물에 접종하였다. 인큐베이션은 30℃에서 대략 1.5 시간 동안 200 rpm 하에 수행하였다. 세포를 대략 1.3의 OD에서 수확하고, 펠릿을 4℃의 10％ 저온 글리세롤로 1회 세척하고, 1.7 ml 10％ 글리세롤 (4℃)에 재현탁시켰다.
100 ㎕의 수용성(competent) 세포를 5-10 ㎍ DNA (10-20 ㎕)와 혼합하고, 0.2 cm의 폭을 가진 전기천공 큐벳에서 얼음 상에 2 분 동안 두었다. 다음 조건 하에 전기천공하였다: 800 Ω; 25 μF; 2 kV (진 펄서(Gene Pulser), 바이오-래드(Bio-Rad)). 전기천공 직후에 1 mL의 BHI를 첨가하고, 인큐베이션을 30℃에서 2 시간 동안 수행하였다.
세포를 5 mg/L 클로람페니콜과 함께 BHI 상에 플레이팅하고, 형질전환체의 콜로니가 가시화될 때까지 30℃에서 2 내지 5일 동안 인큐베이션하였다. 클론을 단리하고, 클론의 순도가 얻어질 때까지 5 mg/l 클로람페니콜과 함께 BHI 상에 다시 스트리킹하였다.
실시예 2: 결실 구축물의 생성
돌연변이/결실 플라스미드는 벡터 pSacB (서열 3)를 기준으로 구축되었다. 도 1은 플라스미드 pSacB의 개략적 맵을 도시한다. 결실되어야 하는 염색체 단편의 5'- 및 3'-플랭킹 영역은 LU 13843의 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 증폭되었고, 표준 기술을 이용하여 상기 벡터로 도입하였다. 정상적으로, 80％ 이상의 ORF가 결실을 위해 표적화되었다. 이와 같은 방식으로, 피루베이트-포르메이트-리아제 pfl, pSacB (Δpfl) (서열 4) 및 락테이트 데히드로게나제 ldhA, pSacB (ΔldhA) (서열 5)에 대한 결실 플라스미드를 구축하였다. 도 2 및 3은 플라스미드 pSacB (Δpfl) 및 pSacB (ΔldhA)의 개략적 맵을 도시한다.
pSacB (서열 3)의 플라스미드 서열에서, sacB 유전자는 염기 5169-6590를 함유한다. 클로람페니콜 유전자는 염기 526-984를 함유한다. sacB 프로모터는 염기 3802-4264를 함유한다. 클로람페니콜 유전자는 염기 526-984를 함유한다. 이. 콜라이에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 1477-2337을 함유한다.
pSacB 델타 pfl (서열 4)의 플라스미드 서열에서, DD1의 게놈과 상동성인 pfl 유전자의 3' 플랭킹 영역은 염기 65-1533을 함유하는 반면에, DD1의 게놈과 상동성인 pfl 유전자의 5' 플랭킹 영역은 염기 1534-2956을 함유한다. sacB 유전자는 염기 5256-6677을 함유한다. sacB 프로모터는 염기 6678-7140을 함유한다. 클로람페니콜 유전자는 염기 3402-3860을 함유한다. 이. 콜라이에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 4353-5213을 함유한다.
플라스미드 pSacB 델타 ldh (서열 5)에서, DD1의 게놈과 상동성인 ldh 유전자의 5' 플랭킹 영역은 염기 2850-1519를 함유하는 반면에, DD1의 게놈과 상동성인 ldh 유전자의 3' 플랭킹 영역은 염기 1518-63을 함유한다. sacB 유전자는 염기 5169-6590을 함유한다. sacB 프로모터는 염기 6591-7053을 함유한다. 클로람페니콜 유전자는 염기 3315-3773을 함유한다. 이. 콜라이에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 4266-5126을 함유한다.
실시예 3: 개선된 숙시네이트 생산 균주의 생성
a) LU 13843을 pSacB (Δpfl) 및 "캠벨드 인"에 의해 상기 기재한 바와 같이 형질전환시켜 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. LU 13843의 게놈으로의 형질전환 및 일체화는 LU 13843의 게놈 내로의 플라스미드의 일체화 사건을 위한 밴드를 제공하는 PCR에서 확인되었다.
이어서, "캠벨 인" 균주를 sacB 유전자의 손실 (기능의 손실)을 위해 선택된, 카운터 선택 배지로서 수크로스를 함유하는 한천 플레이트를 이용하여 "캠벨드 아웃"시켰다. 따라서, "캠벨 인" 균주를 37℃에서 220 rpm 하에 밤새 25-35 ml의 비-선택 배지 (항생제를 함유하지 않는 BHI)에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 밤새 배양물을 새로 제조된 BHI 함유 수크로스 플레이트 (10％, 항생제 무함유) 상에 스트리킹하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다 ("제1 수크로스 전송"). 제1 전송으로부터 수득된 단일 콜로니를 새로 제조된 BHI 함유 수크로스 플레이트 (10％) 상에 다시 스트리킹하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다 ("제2 수크로스 전송"). 이 절차는 수크로스에서 최소 5회 전송이 완료될 때까지 ("제3, 제4, 제5 수크로스 전송") 반복되었다. 용어 "제1 내지 제5 수크로스 전송"은 sacB 유전자 및 주위 플라스미드 서열의 손실을 갖는 균주를 선택하기 위한 목적으로, sacB 레반슈크라제 유전자를 함유하는 벡터의 염색체 일체화 이후 수크로즈 및 성장 배지 함유 한천 플레이트로 균주의 전송을 나타낸다. 제5 전송 플레이트로부터의 단일 콜로니를 25-35 ml의 비-선택 배지 (항생제를 함유하지 않는 BHI) 상에 접종하고, 37℃에서 220 rpm 하에 밤새 인큐베이션하였다. 밤새 배양물을 계열 희석하고, BHI 플레이트 상에 플레이팅하여, 단리된 단일 콜로니를 수득하였다.
pfl 유전자의 돌연변이/결실을 함유하는 "캠벨드 아웃" 균주는 클로람페니콜 감수성에 의해 확인되었다. 이들 균주 중 돌연변이/결실 돌연변이체를 식별하여, PCR 분석에 의해 확인하였다. 이는 pfl 돌연변이/결실 돌연변이체 DD1 델타 pfl LU 15348을 생성하였다.
b) LU15348을 pSacB (Δldh)에 의해 상기 기재한 바와 같이 형질전환시키고, "캠벨드 인"시켜, "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 형질전환 및 일체화는 PCR에서 확인되었다. 이어서, "캠벨 인" 균주를 상기 기재된 바와 같이 "캠벨드 아웃"시켰다. 이들 균주 중 결실 돌연변이체를 식별하여, PCR 분석에 의해 확인하였다. 이는 pfl ldhA 이중 결실 돌연변이체 LU15224를 생성하였다.
c) LU13843을 pSacB (Δldh)에 의해 상기 기재한 바와 같이 형질전환시키고, "캠벨드 인"시켜, "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 형질전환 및 일체화는 PCR에서 확인되었다. 이어서, "캠벨 인" 균주를 상기 기재된 바와 같이 "캠벨드 아웃"시켰다. 이들 균주 중 결실 돌연변이체를 식별하여, PCR 분석에 의해 확인하였다. 이는 ldhA 결실 돌연변이체 LU15050을 생성하였다.
실시예 4: 세포 은행 제조
1. 배지 제조
배양 배지의 조성은 표 2에 기재된다.
<표 2>
Figure pct00002
a 글루코스 농도는 15 g/l (플레이트의 경우) 및 20 또는 50 g/l (액체 배지의 경우)였다.
b MgCO3 (리델-드 핸(Riedel-de Haen), 제품 번호: 13117, 시그마-알드리치 라보르케미칼린 게엠베하(Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH)) 농도는 5 g/l (플레이트의 경우) 및 0 또는 30 g/l (액체 배지의 경우)였다.
5 g 효모 추출물, 5 g 펩톤, MgCO3 및 (고체 배지의 경우) 12 g 박토-한천을 900 ml 증류수에서 혼합하고 오토클레이빙하였다 (20분). 약 65℃로 냉각시킨 후, 누락된 성분을 멸균성 원액으로서 첨가하였다. 글루코스, 황산암모늄 및 K2HPO4를 모두 별도로 오토클레이빙하였다. Ca-, Mg- 및 Na-클로라이드를 함께 오토클레이빙하였다.
2. MCB 제조
개별 실험의 접종을 위한 마스터 세포 은행 (MCB)은 다음과 같이 수행되었다. 2개의 한천 플레이트에 목적하는 균주를 새로 접종하고, 혐기성 항아리 (안에어로컬트 에이(Anaerocult A), 머크(Merck))에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 바이오매스를 플레이트로부터 떼어내고, 20 g/L 글루코스를 갖는 MgCO3-무함유 액체 배지에 재현탁시켜, OD600을 대략 1.0으로 조정하였다. 이 세포 현탁액 0.5 mL를 이용하여 접종을 수행하였다. 20 g/L 글루코스 및 30 g/L MgCO3 및 0.8 bar 과압력의 CO2-분위기를 갖는 50 ml의 액체 배지를 함유하는 기밀 부틸 고무 마개 (오크스 게엠베하(Ochs GmbH), 독일 보펜덴/렌글렌)가 있는 100 mL-혈청 병에서 배양을 수행하였다. 이러한 혈청 병 (총 10개)을 37℃에서 160 rpm의 회전 속도 및 2.5 cm의 진탕 직경 하에 인큐베이션하였다.
글루코스 소모를 모니터링하기 위해, 1개 병의 배양을 중단하고, 0, 3, 4, 5, 7, 8 및 8.5 시간 후에 샘플링 및 HPLC 분석을 수행하였다. 8.5 시간 후 (글루코스 농도는 3.4 g/L임), 배양을 중단하였다. 0.5 mL 세포 현탁액 및 0.5 mL 멸균 글리세롤의 분취액을 냉동 바이알에 충전하고, 혼합한 다음, -20℃에서 13 시간 동안 저장한 후, MCB로서 -80℃에서 저장하였다. 오염 제어를 위해 마지막 냉동 바이알의 루프를 한천 플레이트 상에 스트리킹하고, 액체 배양물 (표 8에 기재된 바와 같은 배지)에서 생성물 스펙트럼을 검사하고, (현미경에 의해) 오염에 대해 검사함으로써, MCB를 순도에 대해 시험하였다.
글루코스의 소모 및 SA 및 부산물의 형성은 RI-검출을 이용하여 배양 브로쓰의 희석되지 않은 세포 무함유 상청액을 HPLC 분석함으로써 정량화하였다. 부틸 고무 플러그를 통하여 멸균 주사기를 이용하여 브로쓰 샘플을 취하고, 여과 (0.22 ㎛)에 의해 세포 분리를 수행하였다. 300 x 7.8 mm I. D. 칼럼 아미넥스 (Aminex) HPX-87 H (바이로라드) 및 5 mm H2SO4를 각각 정지 상 및 이동 상으로서 사용하였다. 칼럼 온도는 30℃이고, 유속은 0.5 mL 분-1이었다.
MCB의 1개 바이알을 사용하여, 50 g/L 글루코스를 갖는 50 ml의 액체 배지를 함유하는 기밀 부틸 고무 마개 (상기 참고)가 있는 100 mL-혈청 병에 접종하였다. 인큐베이션을 진탕 인큐베이터 (회전 속도: 180 rpm, 진탕 직경: 2.5 cm)에서 37℃에서 10시간 동안 수행하였다. 배양이 끝날 무렵, 글루코스 농도는 20 g/L였고 pH는 약 6.5였다. 0.5 mL 세포 현탁액 및 0.5 mL 멸균 글리세롤의 분취액을 냉동 바이알에 채우고, 혼합한 다음, WCB로서 -80℃에서 저장하였다. 순도 검사는 MCB에 대해서와 동일하였다. HPLC 조건은 상기 기재된 것과 동일하였다.
실시예 5: 글리세롤 또는 글리세롤 및 말토스 상에서 다양한 DD1 균주의 배양
탄소원으로서 글리세롤 또는 글리세롤 및 말토스의 존재 하에 돌연변이체 균주 DD1Δpfl (LU15348) 및 DD1ΔpflΔldh (LU15224)의 생산성을 하기 배지 및 인큐베이션 조건을 이용하여 추가로 분석하였다.
1. 배지 제조
배양 배지의 조성 및 제조는 하기 표 3에서 기재된 바와 같다.
<표 3>
Figure pct00003
대안적인 합성 성장 배지
하류 공정을 개선시키고 비용면에서 효율적인 발효를 위한 합성 성장 배지를 고안하기 위해, 발효를 위한 복합 성분이 없는 합성 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
배지 제조
합성 성장 배지는 반추위 박테리아에 대한 다른 합성 성장 배지 (문헌 [Nili and Brooker, 1995], [McKinlay et al., 2005]), 다른 박테리아를 이용하는 기존의 사내 실험 및 단일 누락 실험을 수행하는 것과 관련하여 개발하였다. 최종적으로, 배지는 50 g/L 글루코스, 1 g/L (NH4)2SO4, 0.2 g/L CaCl2*2H2O, 0.2 g/L MgCl2*6H2O, 1 g/L NaCl, 3 g/L K2HPO4, 1 mg/L 니코틴산, 1.5 mg/L 판토텐산, 5 mg/L 피리독신, 5 mg/L 리보플라빈, 5 mg/L 비오틴, 1.5 mg/L 티아민 HCl, 0.26 g/L 리신, 0.15 g/L 트레오닌, 0.05 g/L 메티오닌, 0.71 g/L 글루탐산, 0.06 g/L 히스티딘, 0.07 g/L 트립토판, 0.13 g/L 페닐알라닌, 0.06 g/L 티로신, 0.5 g/L 세린, 0.5 g/L 글리신, 0.5 g/L 시스테인, 0.1 g/L β-알라닌, 0.27 g/L 알라닌, 0.19 g/L 발린, 0.23 g/L 류신, 0.16 g/L 이소류신, 0.33 g/L 아스파르트산, 0.1 g/L 아스파라긴, 0.13 g/L 프롤린, 0.15 g/L 아르기닌 및/또는 0.1 g/L 글루타민을 함유하였다.
50 mL의 합성 성장 배지를 함유하는 혈청 병을 완충제 시스템으로서 물 및 30 g/L MgCO3과 함께 오토클레이빙하였다. 글루코스, 황산암모늄 및 인산칼륨을 별도로 멸균시켰다. Ca-, Mg- 및 Na-클로라이드를 함께 멸균시켰다. 비타민 및 아미노산을 각종 원액에 어셈블리하고 멸균 여과하였다. 혈청 병을 냉각시킨 후, 성분을 멸균성 원액으로서 첨가하였다.
2. 배양 및 분석
시드 배양물을 성장시키기 위해, WCB의 1개 바이알을 사용하여, 표 2에 기재된 50 ml의 액체 배지를 함유하지만, 20 g/L 글루코스 및 0.8 bar 과압력의 CO2-분위기를 갖는 기밀 부틸 고무 마개 (상기 참고)가 있는 100 mL-혈청 병에 접종하였다. 37℃에서 160 rpm 하에 (진탕 직경: 2.5 cm) 돌연변이체-특이적 시간 동안 (표 4) 인큐베이션하였다. 세포 현탁액을 5000 g 하에 5분 동안 원심분리하고 (바이오퓨즈 프리모 알(Biofuge primo R), 헤라우스(Heraeus)), 세포 펠릿을 세척한 다음, 탄소원 및 MgCO3가 없는 50 mL 배지에 재현탁시켜, 글루코스-무함유 접종물을 생성시켰다 (모든 단계는 실온에서 혐기성 챔버에서 수행하였음).
<표 4>
Figure pct00004
주 배양물은 50 g/l 글리세롤 또는 50 g/l 글리세롤 및 10 g/l D-말토스, 및 두 경우 모두 0.8 bar 과압력의 CO2-분위기를 갖는 10 ml 액체 배지를 함유하는 100 ml-혈청 병에서 성장시켰다. 품질 '글리세롤 99％, 퓨리스.' (리델-드 핸, 제품 번호: 15523-1L-R, 시그마-알드리치 라보르케미칼린 게엠베하, 독일 실즈)가 모든 실험에 사용되었다. 접종은 1.5 ml의 글루코스-무함유 접종물에 의해 수행되었다. 병을 37℃에서 160 rpm 하에 (진탕 직경: 2.5 cm) 인큐베이션하였다.
탄소원의 소모 및 카르복실산의 생산을 24 시간 후에 실시예 4에 기재된 바와 같이 HPLC를 통해 정량화하였다. 글리세롤이 측정된 바와 같이, 칼럼 온도는 유사한 체류 시간을 갖는 SA, 락트산 및 글리세롤의 충분한 분리를 달성하기 위해 50℃로 조정되었다.
분광광도계 (울트로스펙3000(Ultrospec3000), 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences), 스웨덴 웁살라)를 이용하여 660 nm에서의 흡광도 (OD600)를 측정함으로써 세포 성장을 측정하였다. 리터당 건조 세포 중량 그램 (DCW)으로서 정의되는 세포 농도는 OD600 및 DCW (1 OD600 = 0.27 g DCW l-1)에 관한 사전 측정된 표준 곡선으로부터 계산되었다.
3. 결과
상이한 DD1 균주를 이용한 배양 실험의 결과를 기질 글리세롤의 경우 표 5에 도시하고, 글리세롤 및 말토스의 기질 혼합물의 경우 표 6에 도시하였다.
<표 5>
Figure pct00005
a 배양 시간.
b 기질 (글리세롤, 말토스)의 소모.
c 숙신산, 락트산, 포름산, 아세트산, 피루브산 및 말산의 형성.
d 부산물 락트산, 포름산, 아세트산, 피루브산 및 말산의 합계.
e 부산물의 합계 당 SA의 비율.
f 부산물 당 SA의 비율 (FA = 포름산; AA = 아세트산).
g SA에 대한 공간-시간 수율 및 수율 (YP/S).
h 아세트산, 락트산, 말산 및 포름산에 대한 검출 한계가 주어진 HPLC 방법에서 0.01 g/l보다 적은 것으로 확인되었다.
글리세롤-배양 실험에서, DD1과 같은 SA 생산 유기체에서 피루베이트 포맷 리아제 유전자 pfl을 녹아웃시킴으로써, 기질로서 글리세롤 상에서 성장시 야생형의 경우보다 유의하게 더 높은 탄소 수율 (YP/S) 및 SA에 대한 STY가 생성된다. 탄소 수율 (YP/S)은 DD1 균주의 경우 1.12 g/g에서 Δpfl 돌연변이체 균주 LU15348의 경우 1.15 g/g까지 증가되었다.
글루코스 상의 SA 생산 박테리아에 대한 문헌 [Lee et al., 2006] 또는 [Lin et al., 2005] 이외에, DD1 (LU15050)에서 락테이트 데히드로게나제 유전자 ldhA만을 녹아웃시킴으로써, 이 발효의 기술적 관련 특징, 예컨대 SA에 대한 STY에서 개선이 나타나지 않았고, 탄소 수율 (YP/S)에서 단지 적은 증가만이 나타났다. 그러나, 아세트산의 양은 락테이트 데히드로게나제 효소 활성이 감소된 경우에도 심지어 증가되었다. 놀랍게도 및 예상치못하게도, 단일 돌연변이를 가진 균주의 거동 분석의 결과로부터, 글리세롤의 SA로의 발효에서 pfl 및 ldh 유전자에서 유전자 돌연변이의 조합을 보유하는 돌연변이체 균주가, LU 15050 및 LU15348의 단일 돌연변이로부터 예상되었던 바와 같이 도달된 탄소 수율 (YP/S)로의 심지어 더 큰 비-상가적 개선을 나타내는 것으로 확인되었다. 관찰된 1.26 g/g의 탄소 수율 (YP/S)은 1 몰 글리세롤 + 1 몰 CO2 -> 1 몰 SA의 전환에 대한 1.28 g/g의 잠재적인 이론적 탄소 수율 (YP/S)에 거의 근접하였다.
또한, LU15348에서 생성된 부산물 (SSP)의 합계는 유의하게 감소된 반면에, 글리세롤에서 성장지 포름산은 생산되지 않고, 아세트산은 덜 생산되었다. 상기 언급된 바와 같이, SA 농도는 야생형 또는 LU15050과 비교해서 유의하게 증가되었다. 이 관찰은 부산물 (SSP)의 산술적 합계에 대한 SA의 비 SA:SSP g/g로 표현되며, LU13843 및 LU15050의 경우 10의 수준인 것이 비해, LU15348의 경우 40을 초과하고, LU15224의 경우 100을 초과하였다.
상기 언급된 실험에서, 글리세롤의 SA로의 발효의 STY가 pfl 및 ldh 유전자에서 돌연변이를 보유하는 균주의 경우 1.5 g/(l*h)를 초과하지 않은 것으로 확인되었다. 따라서, 혐기성 발효에서 SA의 생산에 대한 개선된 STY 값을 나타내는 개선된 방법이 개발되었다. 이 방법은 출원 PCT/EP2008/006714의 44-46면에 기재되어 있다. 이 방법은 유전자에서 돌연변이를 보유하는 균주를 이용하는 숙시네이트의 생산에 적합하였다.
<표 6>
Figure pct00006
a 배양 시간.
b 기질 (글리세롤, 말토스)의 소모.
c 숙신산, 락트산, 포름산, 아세트산, 피루브산 및 말산의 형성.
d 부산물 락트산, 포름산, 아세트산, 피루브산 및 말산의 합계.
e 부산물의 합계 당 SA의 비율.
f 부산물 당 SA의 비율 (FA = 포름산; AA = 아세트산).
g SA에 대한 공간-시간 수율 및 수율 (YP/S).
h 600 nm에서의 광학 밀도, 울트로스펙2000 (아머샴 바이오사이언시스, 스웨덴 웁살라)으로 측정하기 전에, 샘플을 1M HCl으로 1:20 희석시킴.
i 건조 세포 중량 (DCW)으로서의 바이오매스 g
h 비생산성: 시간당 바이오매스 g (건조 세포 중량)당 SA g
i 아세트산, 락트산, 말산 및 포름산에 대한 검출 한계가 주어진 HPLC 방법에서 0.01 g/l보다 적은 것으로 확인되었다.
또 다른 사카라이드 말토스와 동시에 글리세롤 상에서 DD1을 성장시키는 것은, 글리세롤을 유일한 기질로 사용하는 것과 비교하여 더 높은 SA STY 및 수율 (YP/S), 및 증가된 농도의 부산물을 허용하는 것으로 보였다 (PCT/EP2008/006714의 44-46면).
LU15348을 DD1 야생형과 비교하면, Pfl 효소의 활성이 감소된 경우 증가된 SA 양, STY 및 탄소 수율 (YP/S)이 나타난다. 놀랍게도, 종래에 기재된 다른 예와는 대조적으로 (문헌 [Lee et al., 2006], [Lin et al., 2005]), 돌연변이되지 않은 균주 DD1에 비해 돌연변이체 균주에서 성장 결함이 관찰되지 않았다. 이 관찰은, 균주의 양호한 성장이 기술적 생산 방법에서 필수적이기 때문에 기술적으로 중요한 관련이 있다. 세포 성장은 야생형에 비해 모든 돌연변이체에서 증가하였다. pfl 또는 ldh의 녹아웃은 돌연변이된 박테리아 균주의 성장에 대해 긍정적인 효과를 가졌다.
검출가능한 포름산의 결여, 감소된 양의 아세트산 및 증가된 SA 농도로 인해, SA/SSP 비율은 유전자 돌연변이에 의해 추론되는 Pfl의 감소된 효소 활성을 함유하는 돌연변이체 균주에서 증가하였다. 그러나, 부산물 락트산은 야생형에 비해 증가하였다. 이중 녹아웃 LU15224는 추가의 증가된 수율 (YP/S) 및 STY를 갖는 반면에, LU15050은 관찰된 탄소 수율 (YP/S), STY 또는 SSP에서 어떠한 개선도 나타나지 않았다.
pfl 돌연변이는 글리세롤의 대사에 기초하여 SA 공정에서 야생형 균주의 성능에 비해 제2 사카라이드 기질의 존재 및 부재하에 글리세롤의 발효를 개선시키는데 필수적이며 그에 충분함을 인식해야 한다. 종래 기술의 발견과는 대조적으로, 야생형 유래된 균주에서의 pfl 돌연변이는 SA의 발효를 유도하는 것으로 확인되지 않았다 (문헌 [Zhu 2005]). pfl 및 ldh를 비롯한 몇몇 돌연변이의 조합만이 감소된 성장 및 불량한 STY 성능에도 불구하고 측정가능한 숙신산 생성을 나타내었다 (문헌 [Lin 2005], [Lee 2006]). 이 작업의 결과는 종래 기술에 비해 우수한 성능을 갖는 공정을 수득하기 위해 돌연변이된 균주로 이루어진 SA의 발효적 생산을 위한 개선된 공정을 특정한 공정과 함께 구축하는 것을 교시한다.
놀랍게도, SA의 비생산성은 ldh 유전자에서 및 ldh 및 pfl 유전자 둘 다에서 돌연변이를 보유하는 LU15050 및 LU15224에 비해 pfl 돌연변이체 균주 LU15348에서 더 우수하였다. 당업계의 전문가에게는, 공정에 따라 생성물 형성의 높은 특이적 활성이 기술적 공정의 바람직한 특징임이 공지되어 있다. 명백하게, 락테이트 데히드로게나제 녹아웃의 부정적인 효과는 LU15348의 비생산성을 야생형의 값보다 낮게 저하시킨다.
실시예 6: 다양한 탄수화물을 이용하여 글리세롤의 혼합물 상에서 LU15348의 배양
탄소원으로서 글리세롤 및 다양한 탄수화물의 존재 하에 돌연변이체 균주 LU15348의 생산성을 하기 배지 및 인큐베이션 조건을 이용하여 분석하였다.
1. 배지 제조, 배양 및 분석
배양 배지의 조성 및 제조는 실시예 5의 표 3에 기재된 바와 같다. 배양 및 분석은 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다.
품질 '말토덱스트린' (말덱스150(Maldex150), 카탈로그 번호: 50499, 붐(Boom), 네덜란드 7942 JE 메펠)을 이 실험에서 사용하였다. 다양한 길이를 갖는 사카라이드 쇄의 정의되지 않은 혼합물로 인해, 말토덱스트린의 농도는 HPLC-분석에 의해 완전한 정도로 분석되지 않았다. 따라서, 말토덱스트린 함량은 배양 배지에 첨가하기 전에 중량 측정에 의해 정확하게 측정하였다. 달성된 이론적 수율 (YP/S)의 하한을 계산하기 위해, 발효에 첨가된 모든 말토덱스트린이 소모된 것으로 가정하였고, 이는 SA 발효 이후 탄소 수율 (YP/S)의 하한의 계산만을 허용할 것으로 인식되었다. 무엇보다도, 탄소 수율 (YP/S)의 더욱 정확한 값은 검출되지 않은 기질 말토덱스트린의 잠재적으로 불완전한 소모로 인해 기재된 값보다 더 높을 것이다.
2. 결과
LU15348에 대한 배양 실험의 결과를 기질 글리세롤을 다양한 탄수화물, 예컨대 말토스, 말토덱스트린 또는 라피노스와 동시발효시켜 표 7에 도시하였다.
<표 7>
Figure pct00007
a 배양 시간.
b 기질 (글리세롤, 말토스)의 소모.
c 숙신산, 락트산, 포름산, 아세트산, 피루브산 및 말산의 형성.
d 부산물 락트산, 포름산, 아세트산, 피루브산 및 말산의 합계.
e 부산물의 합계 당 SA의 비율.
f 부산물 당 SA의 비율 (FA = 포름산; AA = 아세트산).
g SA에 대한 공간-시간 수율 및 수율 (YP/S).
i 아세트산, 락트산, 말산 및 포름산에 대한 검출 한계가 주어진 HPLC 방법에서 0.01 g/l보다 적은 것으로 확인되었다.
* 분석되지 않은 미지의 잔류 말토덱스트린 농도로 인한 수율 (YP/S)의 하한.
균주 LU15348을 글리세롤 상에서 다양한 사카라이드, 예컨대 말토스, 고분자 사카라이드, 예컨대 말토덱스트린 또는 추가의 사카라이드 라피노스의 혼합물과 함께 동시발효시켜 유사한 결과가 나타났으며, 이는 탄소원으로서 글리세롤을 비롯한 다양한 탄소원의 동시 발효가 종래에 이전에 기재된 상태에 비해 SA 생산의 수많은 기술적으로 관련된 개선을 나타냄을 보여준다. 그 예는 상기 공정에 의해 소모된 글리세롤의 증가된 비율 및 개선된 총량이며, 이는 당업계의 상태와 비교해서 더 높은 SA 역가를 생성하였다. 추가로, STY는 사카라이드를 함유하지 않은 대조군에 비해 증가되었다. 부산물 농도는 공동 기질로서 말토스의 경우를 제외하고는 일반적으로 감소되었으며, 여기서 락트산은 글리세롤 단독 배양에 비해 증가된 부산물이다. SA 수율 (YP/S)은 단독 기질로서의 글리세롤에 비해 유사하거나 단지 약간 감소하였다.
실험의 개요
- 감소된 pfl 활성을 갖는 미생물은 당업계의 상태에 비해 글리세롤 상에서 개선된 발효를 나타내었다.
- 상이한 탄소원의 조합은 숙신산으로 효율적으로 전환되었다.
- 감소된 pfl 활성을 갖는 미생물은 당업계의 상태에 비해 글리세롤 및 사카라이드의 혼합물 상에서 개선된 발효를 나타내었다.
결론: 숙신산 (SA)의 신규 생산 방법은 높은 탄소 수율 (YP/S) 및 공간-시간 수율 뿐만 아니라 매우 낮은 부산물로 SA 및/또는 SA 염의 생산에 대한 우수한 효능을 갖는다.
본 발명의 문맥에서, 박테리아 균주 DD1 (ID 06-614)은 2006년 8월 11일에 DSMZ (도이치 삼룽 폰 미크루르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하, 독일 데-38124 브라운슈바이크 인호펜스트라쎄 7베)에 기탁 번호 DSM 18541로 기탁되었다. 이와 관련하여, 유럽 특허 출원 번호 EP 09152959.4 및 EP 09171250.5를 우선권으로 주장하며, 상기 기탁은 본 발명의 문맥 내에서 최초로 언급되었다. WO 2009/024294 또한 언급되며, 여기서 DD1 균주는 2006년 8월 11일에 DSMZ (도이치 삼룽 폰 미크루르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하, 독일 데-38124 브라운슈바이크 인호펜스트라쎄 7베)에 대한 기탁을 비롯하여 최초로 기재되었다.
본원에 인용된 문헌의 내용은 참고로 포함된다.
실시예 - 하류 공정
실시예 7: 양이온 이온 교환 수지에 의한 발효 브로쓰로부터의 숙신산의 단리 방법
발효 공정 동안 NH4OH (25 중량％, NH4OH-용액의 총 중량에 대해 계산됨)에 의해 중화된 발효 브로쓰를 여과하였다. 15％ (w/w) 숙신산 (염으로서 중화됨)을 함유하는 수성의 세포 무함유 발효 브로쓰를 하류 공정에 사용하였다.
양이온 교환 수지 (유형 레바티트 모노플러스 SP 112, 란세스로부터; 471 ml)를 정지 상으로서 온도 제어된 (50℃) 유리 칼럼 (층 표고: 24 cm)에 충전시키고, 물로 세척하였다. 이 세척 단계 이후, 수지를 수성 숙신산 용액 (156 ml, 25 g 숙신산 함유, 밀도: 1.069 kg/l)에 의해 상단을 하향시켜 범람시켰다.
용액의 유속은 평균 33 ml/분이었고, 이는 시간당 4.2 층 부피 (BV)의 속도에 상응하였다.
따라서, 대략 24.9 g의 유리 숙신산을 함유하는 깨끗한 무색 용액을 제1 분획 (453 ml)에서 수득하였다. 이 분획의 숙신산 농도는 평균 5.38 중량％이었다.
굴절률 이외에도, 칼럼으로부터의 용액의 pH 값 및 흡광도 (350 nm)를 측정하였다.
사용된 강산 양이온 교환 수지의 생성된 결합능은 평균 수지 1 리터당 대략 0.89 당량 (eq)이었다.
결합 공정 이후, 수지를 물 (546 ml)로 세척하고, 최종적으로 5％ 염산 (919 ml; 속도: 66 ml/분)에 의해 양이온 형태로 재생시키고, 이를 수지 바닥을 위로 하여 범람시켰다. 최종 단계로서, 수지를 다시 물 (889 ml)로 세척하였다.
수지가 숙신산을 방출시킨다는 사실 이외에도, 수지가 브로쓰를 탈색시켜, 매우 순수하고 무색인 숙신산 용액이 수득되었다.
실시예 8: 강산 이온 교환 수지에 의해 양이온 파과 곡선의 측정 방법
15％ (w/w) 양의 숙신산 (염으로서 중화됨)을 함유하는 수성의 세포 무함유 발효 브로쓰를 여과한 후에 하류 공정에 사용하였다.
강산 이온 교환 수지 (유형 레바티트 모노플러스 SP 112, 란세스로부터; 689 ml)를 온도 제어된 (50℃) 유리 칼럼 (층 표고: 97.5 cm)에 충전시키고, 물로 세척하였다. 이 세척 단계 이후, 수지를 수성 숙신산 용액 (468 ml, 75 g 숙신산 함유, 밀도: 1.069 kg/l)에 의해 상단을 하향시켜 범람시켰다.
용액의 유속은 평균 24 ml/분이었고, 이는 시간당 2.1 층 부피 (BV)의 속도에 상응하였다.
실시예 7에서와 같이, 대략 53.8 g의 유리 숙신산을 함유하는 투명한 용액 (457 ml)이 제1 분획에서 수득되었다. 이 분획의 숙신산 농도는 평균 11.53 중량％이었다.
실시예 7에서의 검정과는 단리, 이 경우에는 제1 분획의 샘플링을 양이온이 파과되는 순간에 중단하였다. 이 순간은 숙신산 염의 파과로 인해 (대략 1.4의 값으로부터) 갑자기 증가된 pH 값을 측정함으로써 검출되었다.
상기 투명한 용액 이후 샘플링된 분획은 숙신산 염을 함유하였고, 원래의 발효 브로쓰와 유사한 갈색을 가졌다.
이 검정에서, 사용된 강산 양이온 교환 수지의 생성된 결합능은 평균 수지 1 리터당 대략 1.32 당량 (eq)이었다.
결합 공정 이후, 수지를 물 (678 ml)로 세척하고, 5％ 염산 (2034 ml; 속도: 92 ml/분)에 의해 양이온 형태로 재생시켰다. 최종적으로 수지를 다시 물 (824 ml)로 세척하였다.
수지가 숙신산을 방출시킨다는 사실 이외에도, 수지가 브로쓰를 탈색시켜, 매우 순수하고 무색인 숙신산 용액이 수득되었다.
실시예 9: 발효 브로쓰로부터 숙신산을 정제한 후, 생성된 탈염 용액을 농축 및 결정화시키는 방법
두 샘플을 결정화 단계에 사용하였고, 실시예 7에 기재된 것과 동일한 방식으로 수득하였다.
각 경우에 15％ (w/w) 양의 숙신산 (염으로서 중화됨)을 함유하는 수성의 세포 무함유 발효 브로쓰를 하류 공정에 사용하였다. 양이온 교환 수지 (유형 레바티트 모노플러스 SP 112, 란세스로부터)를 사용하여 정제 및 탈염된 두 샘플을 결정화 단계에 사용하였다.
하기 표는 발효 브로쓰, 수지 및 화학물질의 부피와 함께 이들 실험에서 수득된 양 및 용량을 도시한다.
Figure pct00008
따라서, 깨끗한 무색의 두 용액이 제1 분획으로서 수득되었고, 이들을 합하여 하나의 숙신산 용액 (대략 76 g의 유리 숙신산 함유; 샘플링으로 인한 차이)을 수득하였다.
이 용액을 물의 증류에 의해 농축시켜 20 중량％의 숙신산 농도를 갖는 380.2 g의 용액을 수득하였다. 농축 단계 이후, 용액을 교반하고, 냉각시켰다. 용액의 온도가 50℃일 때, 이를 시딩하였다. 그 직후, 결정화가 시작되었고, 숙식산 결정이 침전되었다.
숙신산 현탁액을 밤새 주위 온도에서 교반하고, 빙수조에서 1 시간 동안 냉각시켰다.
결정을 저온에서 여과하고, 케이크를 각각 20 ml의 빙수로 2회 세척하였다. 세척 단계 이후, 결정을 질소 기체 흐름 하에 건조시켰다. 따라서, 65.2 g의 무색 숙신산 결정이 99.8％의 순도로 수득되었다.
후속적으로, 숙신산 결정을 유체 층 건조기에서 건조시켰다.
참고문헌
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
DSMZ-도이치 사물룽 본 미크로오르가니즈먼 운드 젤쿨투어 게엠베하 DSMZ18541 20060811
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tcgatgtgtc atccgcattt ttaggatctc cggctaatgc 3480 aaagacgatg tggtagccgt gatagtttgc gacagtgccg tcagcgtttt gtaatggcca 3540 gctgtcccaa acgtccaggc cttttgcaga agagatattt ttaattgtgg acgaatcaaa 3600 ttcagaaact tgatattttt catttttttg ctgttcaggg atttgcagca tatcatggcg 3660 tgtaatatgg gaaatgccgt atgtttcctt atatggcttt tggttcgttt ctttcgcaaa 3720 cgcttgagtt gcgcctcctg ccagcagtgc ggtagtaaag gttaatactg ttgcttgttt 3780 tgcaaacttt ttgatgttca tcgttcatgt ctcctttttt atgtactgtg ttagcggtct 3840 gcttcttcca gccctcctgt ttgaagatgg caagttagtt acgcacaata aaaaaagacc 3900 taaaatatgt aaggggtgac gccaaagtat acactttgcc ctttacacat tttaggtctt 3960 gcctgcttta tcagtaacaa acccgcgcga tttacttttc gacctcattc tattagactc 4020 tcgtttggat tgcaactggt ctattttcct cttttgtttg atagaaaatc ataaaaggat 4080 ttgcagacta cgggcctaaa gaactaaaaa atctatctgt ttcttttcat tctctgtatt 4140 ttttatagtt tctgttgcat gggcataaag ttgccttttt aatcacaatt cagaaaatat 4200 cataatatct catttcacta aataatagtg aacggcaggt atatgtgatg ggttaaaaag 4260 gatcggcggc cgctcgattt aaatc 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tcaggatgag ctcgcttgga ctcctgttga tagatccagt aatgacctca gaactccatc 4200 tggatttgtt cagaacgctc ggttgccgcc gggcgttttt tattggtgag aatccaagca 4260 ctagcggcgc gccggccggc ccggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac 4320 cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 4380 cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 4440 aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 4500 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 4560 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 4620 agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 4680 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 4740 taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 4800 gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 4860 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 4920 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 4980 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cttttgccat agtatgcttt gttaaataaa gattcttcgc cttggtagcc atcttcagtt 5880 ccagtgtttg cttcaaatac taagtatttg tggcctttat cttctacgta gtgaggatct 5940 ctcagcgtat ggttgtcgcc tgagctgtag ttgccttcat cgatgaactg ctgtacattt 6000 tgatacgttt ttccgtcacc gtcaaagatt gatttataat cctctacacc gttgatgttc 6060 aaagagctgt ctgatgctga tacgttaact tgtgcagttg tcagtgtttg tttgccgtaa 6120 tgtttaccgg agaaatcagt gtagaataaa cggatttttc cgtcagatgt aaatgtggct 6180 gaacctgacc attcttgtgt ttggtctttt aggatagaat catttgcatc gaatttgtcg 6240 ctgtctttaa agacgcggcc agcgtttttc cagctgtcaa tagaagtttc gccgactttt 6300 tgatagaaca tgtaaatcga tgtgtcatcc gcatttttag gatctccggc taatgcaaag 6360 acgatgtggt agccgtgata gtttgcgaca gtgccgtcag cgttttgtaa tggccagctg 6420 tcccaaacgt ccaggccttt tgcagaagag atatttttaa ttgtggacga atcaaattca 6480 gaaacttgat atttttcatt tttttgctgt tcagggattt gcagcatatc atggcgtgta 6540 atatgggaaa tgccgtatgt ttccttatat ggcttttggt tcgtttcttt cgcaaacgct 6600 tgagttgcgc ctcctgccag cagtgcggta gtaaaggtta atactgttgc ttgttttgca 6660 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aattgtataa ttgctccatc 2820 ggtttgaatt tttccaccaa ggtataacga atattcgggc ggtcaaaact acctacatac 2880 aagtgcggtt cgttcaggct gacccgggat ttaaatcgct agcgggctgc taaaggaagc 2940 ggaacacgta gaaagccagt ccgcagaaac ggtgctgacc ccggatgaat gtcagctact 3000 gggctatctg gacaagggaa aacgcaagcg caaagagaaa gcaggtagct tgcagtgggc 3060 ttacatggcg atagctagac tgggcggttt tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag 3120 ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc 3180 cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gatctgatca agagacagga tgaggatcgt 3240 ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc 3300 tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc 3360 tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg 3420 aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag 3480 ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg 3540 ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg 3600 caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 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cctttttaat cacaattcag 7020 aaaatatcat aatatctcat ttcactaaat aatagtgaac ggcaggtata tgtgatgggt 7080 taaaaaggat cggcggccgc tcgatttaaa tc 7112

Claims (37)

  1. 내인성 피루베이트-포르메이트-리아제 효소 활성의 탈조절을 포함하도록 유전적으로 변형된, 숙신산의 발효적 생산을 위한 탄소원으로서 글리세롤을 이용할 수 있는 박테리아 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 피루베이트-포르메이트-리아제 효소 활성이 감소되거나 또는 스위치-오프된 것인 균주.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 글리세롤에서 숙시네이트로의 발효적 전환과 관련있거나 또는 그와 연관된 하나 이상의 추가의 효소 활성이 탈조절된 것인 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 파스튜렐라세아에(Pasteurellaceae), 바실루스(Bacilli) 또는 악티노박테리아(Actinobacteria) 과의 미생물로부터 선택된 미생물로부터 유래된 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 1의 16S rDNA, 또는 적어도 96, 97, 98, 99 또는 99.9％의 서열 상동성을 나타내는 서열을 갖는 파스튜렐라세아에 과의 미생물로부터 유래된 균주.
  6. 제5항에 있어서, 서열 2의 23S rDNA, 또는 적어도 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.9％의 서열 상동성을 나타내는 서열을 갖는 균주.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 엔테로박테리아세아에 과의 미생물로부터 유래된 균주.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 파스튜렐라세아에 과의 미생물로부터 유래된 균주.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 바실루스 과의 미생물로부터 유래된 균주.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 악티노박테리아 과의 미생물로부터 유래된 균주.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 수크로스로부터 숙신산의 생산;
    b) 말토스로부터 숙신산의 생산;
    c) 말토덱스트린으로부터 숙신산의 생산;
    d) D-프룩토스로부터 숙신산의 생산;
    e) D-갈락토스로부터 숙신산의 생산;
    f) D-만노스로부터 숙신산의 생산;
    g) D-글루코스로부터 숙신산의 생산;
    h) D-크실로스로부터 숙신산의 생산;
    i) L-아라비노스로부터 숙신산의 생산;
    j) 락토스로부터 숙신산의 생산;
    k) 라피노스로부터 숙신산의 생산;
    l) 글리세롤로부터 숙신산의 생산;
    m) 초기 글루코스 농도 적어도 75 g/l에서의 성장;
    n) 초기 글리세롤 농도 적어도 70 g/l에서의 성장
    의 추가의 대사 특징 중 하나 이상을 나타내는 균주.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤을 적어도 0.5 g/g의 수율 계수 YP/S로 숙신산으로 전환시키는 균주.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 적어도 25 g/L의 글리세롤을 적어도 1.01 g/g의 수율 계수 YP/S로 적어도 25.1 g/L의 숙신산으로 전환시키는 것;
    b) 수크로스, 말토스, 말토덱스트린, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 적어도 0.58 g gDCW-1 h-1 숙신산의 비생산성 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
    c) 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 적어도 2.2 g/(L h) 숙신산의 숙신산에 대한 공간-시간 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
    d) 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원 적어도 25 g/L를, 적어도 2.2 g/(L h)의 숙신산에 대한 공간-시간 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
    e) 수크로스, 말토스, 말토덱스트린, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 적어도 0.58 g gDCW-1 h-1 숙신산의 비생산성 수율 및 적어도 2.2 g/(L h)의 숙신산에 대한 공간-시간 수율로 숙신산으로 전환시키는 것
    의 특징 중 하나 이상을 갖는 균주.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, DSMZ에 기탁 번호 DSM 18541로 기탁된 균주 DD1로부터 유래되거나 또는 숙신산을 생산하는 능력을 가진 DD1의 변이체 또는 돌연변이체 균주로부터 유래된 균주.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 숙신산 (SA) 및 부산물 (SSP)을 >10:1, 또는 >12.5:1, 또는 >15:1, 또는 >17.5:1, 또는 >20:1, 또는 >25:1, 또는 >30:1, 또는 >33:1의 SA/SSP 비율로 생산하며, 여기서 SSP가 부산물 락트산 (LA), 포름산 (FA), 아세트산 (AA), 및 말산 (MA)의 합계를 나타내고, 각각의 양이 g/L로 표현되는 것인 균주.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 숙신산 (SA) 및 부산물 아세트산 (AA)을 >10:1, 또는 >12.5:1, 또는 >15:1, 또는 >17.5:1, 또는 >20:1, 또는 >25:1, 또는 >30:1, 또는 >40:1, 또는 >50:1, 또는 >75:1, 또는 >90:1의 SA/AA 비율로 생산하고, 각각의 양이 g/L로 표현되는 것인 균주.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 숙신산 (SA) 및 부산물 포름산 (FA)을 >90:1, 또는 >100:1의 SA/FA 비율로 생산하며, 각각의 양이 g/L로 표현되는 것인 균주.
  18. a) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 박테리아 균주를 동화가능한 탄소원을 함유하는 배지에서 인큐베이션하고, 상기 균주를 목적하는 유기 산의 형성을 선호하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
    b) 상기 배지로부터 상기 유기 산 또는 그의 염 또는 유도체를 수득하는 단계
    를 포함하는, 유기 산 또는 그의 염 또는 유도체의 발효적 생산 방법.
  19. 제18항에 있어서, 발효가 이산화탄소의 존재 하에 5.0 내지 9.0의 pH에서 약 10 내지 60℃ 범위의 온도에서 수행되는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 유기 산이 숙신산인 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 동화가능한 탄소원이 글리세롤, 수크로스, 말토스, 말토덱스트린, D-프룩토스, D-갈락토스, D-만노스, 락토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, 라피노스; 전분, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그노셀룰로스의 분해 생성물; 및 이들의 혼합물로부터 선택된 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 탄소원이 글리세롤, 또는 글리세롤과 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, D-글루코스, D-크실로스, 라피노스 및 L-아라비노스로부터 선택된 하나 이상의 추가의 탄소원의 혼합물인 방법.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 동화가능한 탄소원의 농도가 5 내지 80 g/l 범위의 값으로 조정되는 방법.
  24. a. 박테리아 균주를 하나 이상의 동화가능한 탄소원을 함유하는 배지에서 인큐베이션하고, 상기 균주를 목적하는 유기 산의 형성을 선호하는 조건 하에 배양하는 단계;
    b. 상기 배지로부터 상기 유기 산 또는 그의 염 또는 유도체를 수득하는 단계
    를 포함하며;
    추가로
    c. 적어도 25 g/L의 글리세롤을 적어도 1.0 g/g의 수율 계수 YP/S로 적어도 25.1 g/L의 숙신산으로 전환시키는 것;
    d. 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 적어도 0.58 g gDCW-1 h-1 숙신산의 비생산성 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
    e. 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 적어도 2.2 g/(L h) 숙신산의 숙신산에 대한 공간-시간 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
    f. 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원 적어도 25 g/L를, 적어도 2.2 g/(L h)의 숙신산에 대한 공간-시간 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
    g. 수크로스, 말토스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L-아라비노스, D-갈락토스, 락토스, D-만노스, 라피노스 및/또는 글리세롤로부터 선택된 하나 이상의 탄소원을, 적어도 0.6 g gDCW-1 h-1 숙신산의 비생산성 수율 및 적어도 2.2 g/(L h)의 숙신산에 대한 공간-시간 수율로 숙신산으로 전환시키는 것;
    h. 숙신산 (SA) 및 부산물 (SSP)을 >10:1, 또는 >12.5:1, 또는 >15:1, 또는 >17.5:1, 또는 >20:1, 또는 >25:1, 또는 >30:1, 또는 >33:1의 SA/SSP 비율로 생산하며, 여기서 SSP가 부산물 락트산 (LA), 포름산 (FA), 아세트산 (AA), 및 말산 (MA)의 합계를 나타내고, 각각의 양이 g/L로 표현되는 것;
    i. 숙신산 (SA) 및 부산물 아세트산 (AA)을 >10:1, 또는 >12.5:1, 또는 >15:1, 또는 >17.5:1, 또는 >20:1, 또는 >25:1, 또는 >30:1, 또는 >50:1, 또는 >75:1, 또는 >90:1의 SA/AA 비율로 생산하고, 각각의 양이 g/L로 표현되는 것
    중 하나 이상을 특징으로 하는, 숙신산 또는 그의 염 또는 유도체의 발효적 생산 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 균주인 방법.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 불연속적으로 또는 연속적으로 수행되는 방법.
  27. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따라 숙신산을 발효적으로 생산하는 단계; 및 암모니아 또는 그의 수용액, 또는 NH4HCO3, (NH4)2CO3, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, KHCO3, Mg(OH)2, MgCO3, MgH(CO3)2, Ca(OH)2, CaCO3, Ca(HCO3)2, CaO, CH6N2O2, C2H7N 및 이들의 혼합물을 이용하여 pH를 조절하는 단계를 포함하는, 숙신산 및/또는 숙신산 암모늄 염의 생산 방법.
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 산 및/또는 그의 염을 여과, 결정화, 전기투석 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 단리 및/또는 정제하는 방법.
  29. 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 산 및/또는 그의 염을 여과 단계, 후속적으로 양이온 교환 크로마토그래피 단계, 후속적으로 결정화 단계에 의해 추가로 단리 및/또는 정제하는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용된 물질이 0.5 내지 2.0 당량/l 양이온 교환 수지의 총 용량을 갖는 술폰산 기를 보유하는 H+-형태의 양이온 교환 수지인 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피를 45 내지 60℃의 온도에서 수행하는 방법.
  32. a. 제27항에 정의된 바와 같이 숙신산 및/또는 숙신산 염을 발효적으로 생산하는 단계, 및
    b1. 수득된 유리 산을 직접적으로 촉매적 수소화하여 테트라히드로푸란 (THF) 및/또는 1,4-부탄디올 (BDO) 및/또는 감마-부티로락톤 (GBL)을 수득하는 단계, 또는
    b2. 수득된 유리 숙신산 및/또는 숙신산 염을 화학적으로 에스테르화하여 그의 상응하는 디-저급알킬 에스테르를 수득하고, 후속적으로 상기 에스테르를 촉매적 수소화하여 THF 및/또는 BDO 및/또는 GBL을 수득하는 단계
    를 포함하는, THF 및/또는 BDO 및/또는 GBL의 생산 방법.
  33. a) 제27항에 정의된 바와 같이 숙신산 암모늄 염을 발효적으로 생산하는 단계; 및
    b) 자체 공지된 방식으로 숙신산 암모늄 염을 피롤리돈으로 화학적으로 전환시키는 단계
    를 포함하는, 피롤리돈의 생산 방법.
  34. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 동화가능한 탄소원으로서 사용되는 상기 글리세롤이 트리아실글리세리드의 에스테르 절단에 의해 수득되는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 글리세롤이 바이오 디젤의 제조시 수득되는 폐기물인 방법.
  36. 유기 정제 화학물질의 발효적 생산에서의, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 박테리아 균주의 용도.
  37. 제36항에 있어서, 유기 정제 화학물질이 숙신산 또는 그의 염 또는 유도체인 용도.
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