JP2012521190A - 新規微生物コハク酸生産菌及びコハク酸の精製 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本明細書で用いる「細菌細胞」という用語は、原核生物、すなわち細菌を意味する。細菌は、その生化学的性質及び微生物学的性質、並びにその形態に基づいて分類することができる。これらの分類基準は当技術分野で周知である。
−ギャップオープン(ギャップを空けるペナルティー):10.0
−ギャップエクステンド(ギャップを伸張させるペナルティー):0.5
−データファイル(パッケージに含まれるマトリックスファイルを採点する):EDNAFUL
のデフォルトパラメータを用いるバイオインフォマティクスソフトウェアパッケージEMBOSS(バージョン5.0.0, http://emboss.sourceforgenet/what/)からのプログラム、ニードル(needle)を用いて、(かなり類似した配列について)計算される同一性を意味する。
本発明において記載される「細菌細胞」又は「細菌株」は、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、パスツレラ科(Pasteurellaceae)、バチルス綱(Bacilli)又は放線菌門(Actinobacteria)の科から選択される。
a)特に嫌気的条件下で、ショ糖からSAを生産する;
b)特に嫌気的条件下で、マルトースからコハク酸を生産する;
c)特に嫌気的条件下で、D-フルクトースからSAを生産する;
d)特に嫌気的条件下で、D-ガラクトースからSAを生産する;
e)特に嫌気的条件下で、D-マンノースからSAを生産する;
f)特に嫌気的条件下で、D-グルコースからSAを生産する;
g)特に嫌気的条件下で、D-キシロースからSAを生産する;
h)特に嫌気的条件下で、L-アラビノースからSAを生産する;
i)キシリトール、イノシトール及びソルビトールを利用しない;
j)好気的条件下及び嫌気的条件下の両方で増殖する;
k)75g/L以上の初期グルコース濃度で増殖する;
l)アンモニア耐性
のうち少なくとも1つを示す。
本発明の第一の実施形態は、SAの発酵生産のための炭素源としてグリセロールを利用できる細菌株であって、内在性ピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素活性の脱制御を備えるように遺伝子改変されている前記細菌株に関する。特に、該ピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素活性は低下しているか、又はスイッチオフされている。
a)ショ糖からコハク酸を生産する;
b)マルトースからコハク酸を生産する;
c)マルトデキストリンからコハク酸を生産する;
d)D-フルクトースからコハク酸を生産する;
e)D-ガラクトースからコハク酸を生産する;
f)D-マンノースからコハク酸を生産する;
g)D-グルコースからコハク酸を生産する;
h)D-キシロースからコハク酸を生産する;
i)L-アラビノースからコハク酸を生産する;
j)ラクトースからコハク酸を生産する;
k)ラフィノースからコハク酸を生産する;
l)グリセロールからコハク酸を生産する;
m)75g/l以上の初期グルコース濃度で増殖する;
n)70g/l以上の初期グリセロール濃度で増殖する
のうち少なくとも1つを、例えば前記特性の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13個又は全ての組み合わせとして、特徴l)(グリセロールからSA)を各組み合わせの必須要素として備え、さらに示す。
a)少なくとも25g/Lのグリセロールを少なくとも25.1g/Lのコハク酸に、少なくとも1.01g/gの収率係数YP/Sで変換する;
b)ショ糖、マルトース、マルトデキストリン、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、ラフィノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも0.58 g g DCW-1 h-1コハク酸の比生産収率で変換する;
c)ショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも2.2g/(L h)コハク酸のコハク酸に対する空時収率で変換する;
d)少なくとも25g/Lのショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも2.2g/(L h)のコハク酸に対する空時収率で変換する;
e)ショ糖、マルトース、マルトデキストリン、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、ラフィノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも0.58 g g DCW-1 h-1コハク酸の比生産収率で、かつ少なくとも2.2g/(L h)のコハク酸に対する空時収率で変換する
のうち少なくとも1つを示す。
a)同化性炭素源を含有する培地中で上に記載の細菌株をインキュベートし、所望の有機酸の形成に有利な条件下で該株を培養するステップ;並びに
b)該有機酸、特にSA、又はその塩若しくは誘導体を培地から得るステップ
を含む、前記方法に関する。
a)少なくとも1種の同化性炭素源を含有する培地中で細菌株をインキュベートし、所望の有機酸の形成に有利な条件下で該株を培養するステップ;
b)該有機酸又はその塩若しくは誘導体を培地から得るステップ;
を含み、以下の特徴:
c)少なくとも25g/Lのグリセロールを少なくとも25.1g/Lのコハク酸に、少なくとも1.0g/gの収率係数YP/Sで変換する;
d)ショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、D-マンノース、ラフィノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも0.58g gDCW-1 h-1 コハク酸の比生産収率で変換する;
e)ショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、ラフィノース及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも2.2g/(L h) コハク酸のコハク酸に対する空時収率で変換する;
f)少なくとも25g/Lのショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、ラフィノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも2.2g/(L h)のコハク酸に対する空時収率で変換する;
g)ショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、ラフィノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも0.6g gDCW-1 h-1 コハク酸の比生産収率で、かつ少なくとも2.2g/(L h)のコハク酸に対する空時収率で変換する;
h)コハク酸(SA)及び副産物(SSP)を、>10:1、又は>12.5:1、又は>15:1、又は>17.5:1、又は>20:1、又は>25:1、又は>30:1、又は>33:1のSA/SSP比で生産し、ここでSSPは、副産物である乳酸(LA)、ギ酸(FA)、酢酸(AA)、及びリンゴ酸(MA)の各量をg/Lで表した場合の合計を表す;
i)コハク酸(SA)及び副産物である酢酸(AA)を、各量をg/Lで表した場合、>10:1、又は>12.5:1、又は>15:1、又は>17.5:1、又は>20:1、又は>25:1、又は>30:1、又は>50:1、又は>75:1、又は>90:1のSA/AA比で生産する
のうち少なくとも1つをさらに特徴とする、前記方法をさらに提供する。
ろ過及び/若しくは遠心、
陽イオン交換クロマトグラフィー並びに/又は
結晶化
によってさらに単離及び/又は精製される。
ろ過、その後の
陽イオン交換クロマトグラフィー、その後の
結晶化
によってさらに単離及び/又は精製される。
別の実施形態において、本発明は、SA又はその塩若しくは誘導体を発酵生産する方法であって、以下のステップ:
a. 少なくとも1種の同化性炭素源を含有する培地中で細菌株をインキュベートし、所望の有機酸の形成に有利な条件下で該株を培養するステップ;
b. 該有機酸又はその塩若しくは誘導体を培地から得るステップ;
を含み、かつ
少なくとも50g/Lのグリセロールを少なくとも50g/LのSAに、少なくとも1.0g/g、又は>1.0g/g、又は>1.05g/g、又は>1.1g/g、又は>1.15g/g、又は>1.20g/g、又は>1.22g/g、又は>1.24g/g、最大約1.28g/gの収率係数YP/Sで、例えば少なくとも0.6g/g、少なくとも0.7g/g、少なくとも0.75g/g、少なくとも0.8g/g、少なくとも0.85g/g、少なくとも0.9g/g、少なくとも0.95g/g、少なくとも1.0g/g、少なくとも1.05g/g、少なくとも1.1g/g、少なくとも1.15g/g、少なくとも1.20g/g、少なくとも1.22g/g、又は少なくとも1.24g/gの収率係数YP/Sで変換すること
をさらに特徴とする、前記方法を提供する。例えば、50g/Lのグリセロールは、最大約65、又は最大62.5g/LのSA、又は最大60g/LのSAに変換され得る。
別の実施形態において、本発明は、SA又はその塩若しくは誘導体を発酵生産する方法であって、以下のステップ:
a. 少なくとも1種の同化性炭素源を含有する培地中で、低下した活性を有するピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素を有する細菌株をインキュベートし、所望の有機酸の形成に有利な条件下で該株を培養するステップ;
b. 該有機酸又はその塩若しくは誘導体を培地から得るステップ;
を含み、かつ
ショ糖、マルトース、マルトデキストリン、ラフィノース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、D-マンノース、及び/又はグリセロールから選択される炭素源をSAに、少なくとも0.42g gDCW-1 h-1 SA、又は少なくとも0.45、又は少なくとも0.47g g DCW-1 h-1 SA、又は少なくとも0.49g gDCW-1 h-1 SAの比生産収率で変換すること
をさらに特徴とする、前記方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、SA又はその塩若しくは誘導体を発酵生産する方法であって、以下のステップ:
a. 少なくとも1種の同化性炭素源を含有する培地中で、低下した活性を有するピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素を有する細菌株をインキュベートし、所望の有機酸の形成に有利な条件下で該株を培養するステップ;
b. 該有機酸又はその塩若しくは誘導体を培地から得るステップ;
を含み、かつ
ショ糖、マルトース、マルトデキストリン、ラフィノース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、D-マンノース、及び/又はグリセロールから選択される炭素源をSAに、少なくとも2.22g/(L h)、又は少なくとも2.5、少なくとも2.75、少なくとも2.9g/(L*h) SAのSAに対する空時収率で変換すること
をさらに特徴とする、前記方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、SA又はその塩若しくは誘導体を発酵生産する方法であって、以下のステップ:
a. 少なくとも1種の同化性炭素源を含有する培地中で細菌株をインキュベートし、所望の有機酸の形成に有利な条件下で該株を培養するステップ;
b. 該有機酸又はその塩若しくは誘導体を培地から得るステップ;
を含み、かつ
少なくとも50g/Lのショ糖、マルトース、マルトデキストリン、ラフィノース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、D-マンノース、及び/又はグリセロールから選択される炭素源をSAに、少なくとも2.2g/(L h)、又は少なくとも2.5、少なくとも2.75、少なくとも3、少なくとも3.25、少なくとも3.5又は少なくとも3.7g/(L*h)のSAに対する空時収率で変換すること
をさらに特徴とする、前記方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、SA又はその塩若しくは誘導体を発酵生産する方法であって、以下のステップ:
a. 少なくとも1種の同化性炭素源を含有する培地中で細菌株をインキュベートし、所望の有機酸の形成に有利な条件下で該株を培養するステップ;
b. 該有機酸又はその塩若しくは誘導体を培地から得るステップ;
を含み、かつ
ショ糖、マルトース、マルトデキストリン、ラフィノース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、D-マンノース、及び/又はグリセロールから選択される炭素源をSAに、少なくとも0.6g gDCW-1 h-1 SA、又は少なくとも0.65、又は少なくとも0.7g gDCW-1 h-1 SA、又は少なくとも0.75g gDCW-1 h-1 SA、又は少なくとも0.77g gDCW-1 h-1 SAの比生産収率で、かつ少なくとも2.2g/(L h)、又は少なくとも2.5、少なくとも2.75、少なくとも3、少なくとも3.25、少なくとも3.5又は少なくとも3.7g/(L*h)のSAに対する空時収率で変換すること
をさらに特徴とする、前記方法を提供する。
炭素源:グルコース、キシロース、マルトース若しくはマルトデキストリン、ラフィノース及び/又はグリセロール(粗グリセロールを含む)
温度:30〜45℃
pH:5.5〜7.0、上記の塩基、好ましくはHCO3 -源、例えばNa2CO3、NaHCO3、Mg(HCO3)2、Ca(HCO3)2、又はMg(OH)2、MgCO3、Ca(OH)2、CaCO3によって調整される
供給気体:CO2
a)上に定義されるコハク酸及び/又はコハク酸塩の発酵生産、並びに
b1)得られた遊離酸のTHF及び/又はBDO及び/又はGBLへの直接接触水素化、あるいは
b2)得られた遊離コハク酸及び/又はコハク酸塩の対応するジ-低級アルキルエステルへの化学的エステル化、及び続く該エステルのTHF及び/又はBDO及び/又はGBLへの接触水素化
を含む、前記方法を提供する。
a)上に定義されるコハク酸アンモニウム塩の発酵生産、及び
b)それ自体公知の方法での、コハク酸アンモニウム塩のピロリドン類への化学的変換
を含む、前記方法を提供する。
d1)遺伝子操作
さらなる別の実施形態によると、本発明の細菌株は、酵素活性がEC番号EC 2.3.1.54によって定義されるピルビン酸ギ酸リアーゼ(pfl)酵素の突然変異型酵素をコードする遺伝子を含有する。例えば、pfl酵素活性は、pflA遺伝子における突然変異によって、又はpflA遺伝子の発現調節に影響を及ぼすことによって、負の影響を受ける。pflA遺伝子及びpflA遺伝子産物の配列は、以下のアクセッション番号、GeneID:6268899、YP_001880903に見出すことができる。この遺伝子のホモログは、アクセッション番号:NCBI-GeneID 945514、945444、947623、948454、3075405で知られ、各タンパク質はアクセッション番号:UniProt: P09373、P75793、P42632、P32674、Q65VK2で知られる。
本発明において用いる発酵は、例えば、撹拌発酵槽、気泡塔及びループ反応器中で行うことができる。撹拌機の種類及び幾何学的設計を含む可能な方法の種類の包括的概観は、「Chmiel: Bioprozesstechnik: Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik, Band 1」に見出すことができる。本発明の方法において、利用できる典型的な変形は、当業者に公知の、又は例えば「Chmiel, Hammes and Bailey: Biochemical Engineering」中に説明されている以下の変形、例えば、バイオマスの再循環を伴う又は伴わない、バッチ発酵、フェドバッチ(fed-batch)発酵、反復フェドバッチ発酵、又は他の連続的発酵である。生産株に応じて、空気、酸素、二酸化炭素、水素、窒素又は適切な気体混合物の注入を、優れた収率(YP/S)を達成するために行ってよい。
化学的エステル化、その後の直接接触水素化を行うのに適した実験条件は、周知であり、例えば欧州特許出願第06007118.0号に記載され、これは参照により本明細書に援用される。
反応蒸留を含み得るエステル化法は、様々な設計でそれ自体公知の装置を用いて行うことができる。
カラム温度:0〜300℃、特に40〜250℃、又は70〜200℃
圧力:0.1〜6bar、特に標準圧力
滞留時間:数秒(例えば1〜60)から数日(例えば1〜5)、特に数分(例えば1〜60)から数時間(例えば1〜15)、より好ましくは数分(例えば5〜20)から2時間。
本発明に従って調製されるSAエステル又はSA自体は、当業者に周知な方法、装置及び補助剤、例えば触媒を用いるそれ自体公知の方法で、水素化される。
突然変異/欠失プラスミドを、ベクターpSacB(配列番号3)を基に構築した。図1は、プラスミドpSacBの略図を示す。欠失されるべき染色体断片の5'−及び3'−隣接領域を、LU13843の染色体DNAからPCRによって増幅し、標準的技術を用いて該ベクターに導入した。通常、ORFの少なくとも80%を欠失のために標的化した。この方法で、ピルビン酸ギ酸リアーゼpflについての欠失プラスミド、pSacB(Δpfl)(配列番号4)及び乳酸脱水素酵素ldhAについての欠失プラスミド、pSacB(ΔldhA)(配列番号5)を構築した。図2及び3は、プラスミドpSacB(Δpfl)及びpSacB(ΔldhA)の略図を示す。
a)LU13843に、上記のようにpSacB(Δpfl)を形質転換し、「キャンベルドイン」させて「キャンベルイン」株を得た。形質転換及びLU13843ゲノム内への組み込みを、LU13843のゲノム内へのプラスミドの組み込み事象に対するバンドをもたらすPCRによって確認した。
個々の実験の接種のためのマスター細胞バンク(MCB)を以下のように行った。2枚の寒天プレートに所望の株を新たに接種し、嫌気的容器(Anaerocult A, Merck)中で37℃で一晩インキュベートした。バイオマスをプレートから掻き取り、20g/lグルコースを含有するMgCO3非含有液体培地中にOD600約1.0に調整するように再懸濁した。0.5mlのこの細胞懸濁液を用いて接種を行った。20g/lのグルコース及び30g/lのMgCO3を有する50mlの液体培地を含有する100mlの血清ボトル(気密性ブチルゴム栓付き)(Ochs GmbH, Bovenden/Lenglern, Germany)中で、0.8bar過圧のCO2環境中で、培養を行った。血清ボトル(計10個)を37℃、160rpmの回転速度、及び振とう直径2.5cmでインキュベートした。
炭素源としてグリセロール又はグリセロール及びマルトースの存在下における突然変異株DD1Δpfl(LU15348)及びDD1Δpfl Δldh(LU15224)の生産性を、以下の培地及びインキュベーション条件を用いてさらに解析した。
下流処理を改善し、費用効率の高い発酵のための合成増殖培地を設計するために、複雑な成分の無い発酵用合成増殖培地を使用することは好ましい。
合成増殖培地を、第一胃細菌用の他の合成増殖培地(Nili and Brooker, 1995, McKinlayら, 2005)、他の細菌を用いた以前の社内の経験に関連して、及び単一省略実験を行うことによって開発した。最終的に、培地は、50g/L グルコース、1g/L (NH4)2SO4、0.2g/L CaCl2*2H2O、0.2g/L MgCl2*6H2O、1g/L NaCl、3g/L K2HPO4、1mg/L ニコチン酸、1.5mg/L パントテン酸、5mg/L ピリドキシン、5mg/L リボフラビン、5mg/L ビオチン、1.5mg/L チアミンHCl、0.26g/L リジン、0.15g/L トレオニン、0.05g/L メチオニン、0.71g/L グルタミン酸、0.06g/L ヒスチジン、0.07g/L トリプトファン、0.13g/L フェニルアラニン、0.06g/L チロシン、0.5g/L セリン、0.5g/L グリシン、0.5g/L システイン、0.1g/L β-アラニン、0.27g/L アラニン、0.19g/L バリン、0.23g/L ロイシン、0.16g/L イソロイシン、0.33g/L アスパラギン酸、0.1g/L アスパラギン、0.13g/L プロリン、0.15g/L アルギニン及び/又は0.1g/L グルタミンを含有していた。
種培養を増殖させるために、1本のバイアルのWCBを用いて、20g/lのグルコースを有する表2に記載される50mlの液体培地を含有する100mlの血清ボトル(気密性ブチルゴム栓付き)(上を参照)に、0.8bar過圧のCO2環境中で、接種した。37℃及び160rpm(振とう直径:2.5cm)で、変異体特異的な時間(表4)、インキュベーションを行った。細胞懸濁液を5000gで5分間遠心し(Biofuge primo R, Heraeus)、細胞ペレットを洗浄し、その後、炭素源を有さず、かつMgCO3を有さない50ml培地中に再懸濁し、グルコース非含有接種材料を生成した(全てのステップは室温かつ嫌気的チャンバー中で行った)。
炭素源としてのグリセロール及び様々な炭水化物の存在下における突然変異株LU15348の生産性を、以下の培地及びインキュベーション条件を用いて解析した。
培養培地の組成及び調製は、実施例5の表3に記載される通りである。培養及び解析は実施例5に記載される通りである。
−低下したpfl活性を有する微生物は、先行技術に対して、グリセロール上での改善した発酵を示す。
陽イオン交換樹脂による発酵ブロスからのコハク酸の単離方法
発酵過程中にNH4OH(25重量%、NH4OH溶液の総重量について計算)により中和された発酵ブロスをろ過した。15%(w/w)コハク酸(塩として中和された)を含有する、水性、細胞非含有発酵ブロスを下流処理に使用した。
15%(w/w)コハク酸(塩として中和された)を含有する、水性、細胞非含有発酵ブロスを、ろ過後、下流処理に使用した。
2つのサンプルを結晶化ステップに使用し、実施例7に記載されるのと同様に得た。
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Claims (37)
- 内在性ピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素活性の脱制御を備えるように遺伝子改変された、コハク酸の発酵生産のための炭素源としてグリセロールを利用することができる細菌株。
- 前記ピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素活性が低下しているか、又はスイッチオフされている、請求項1に記載の株。
- グリセロールのコハク酸塩への発酵変換に関与する又は関連する少なくとも1つのさらなる酵素活性が脱制御されている、請求項1又は2に記載の株。
- 腸内細菌科、パスツレラ科、バチルス綱又は放線菌門の科の微生物から選択される微生物に由来する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の株。
- 配列番号1の16S rDNA又は少なくとも96、97、98、99若しくは99.9%の配列相同性を示す配列を有する、パスツレラ科の微生物に由来する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の株。
- 配列番号2の23S rDNA又は少なくとも95、96、97、98、99若しくは99.9%の配列相同性を示す配列を有する、請求項5に記載の株。
- 腸内細菌科の微生物に由来する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の株。
- パスツレラ科の微生物に由来する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の株。
- バチルス綱の科の微生物に由来する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の株。
- 放線菌門の科の微生物に由来する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の株。
- 以下のさらなる代謝特性:
a)ショ糖からコハク酸を生産する;
b)マルトースからコハク酸を生産する;
c)マルトデキストリンからコハク酸を生産する;
d)D-フルクトースからコハク酸を生産する;
e)D-ガラクトースからコハク酸を生産する;
f)D-マンノースからコハク酸を生産する;
g)D-グルコースからコハク酸を生産する;
h)D-キシロースからコハク酸を生産する;
i)L-アラビノースからコハク酸を生産する;
j)ラクトースからコハク酸を生産する;
k)ラフィノースからコハク酸を生産する;
l)グリセロールからコハク酸を生産する;
m)75g/l以上の初期グルコース濃度で増殖する;
n)70g/l以上の初期グリセロール濃度で増殖する
のうち少なくとも1つを示す、請求項1〜10のいずれか1項に記載の株。 - ショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、ラフィノース及び/又はグリセロールをコハク酸に、少なくとも0.5g/gの収率係数YP/Sで変換する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の株。
- 以下の特徴:
a)少なくとも25g/Lのグリセロールを少なくとも25.1g/Lのコハク酸に、少なくとも1.01g/gの収率係数YP/Sで変換する;
b)ショ糖、マルトース、マルトデキストリン、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、ラフィノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも0.58g g DCW-1 h-1コハク酸の比生産収率で変換する;
c)ショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも2.2g/(L h)コハク酸のコハク酸に対する空時収率で変換する;
d)少なくとも25g/Lのショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも2.2g/(L h)のコハク酸に対する空時収率で変換する;
e)ショ糖、マルトース、マルトデキストリン、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、ラフィノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも0.58g g DCW-1 h-1コハク酸の比生産収率で、かつ少なくとも2.2g/(L h)のコハク酸に対する空時収率で変換する
のうち少なくとも1つを有する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の株。 - 受託番号DSM 18541を有するDSMZに寄託されたDD1株に由来するか、又はコハク酸を生産する能力を有するDD1の変異株若しくは突然変異株に由来する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の株。
- コハク酸(SA)及び副産物(SSP)を、>10:1、又は>12.5:1、又は>15:1、又は>17.5:1、又は>20:1、又は>25:1、又は>30:1、又は>33:1のSA/SSP比で生産し、ここでSSPは、副産物である乳酸(LA)、ギ酸(FA)、酢酸(AA)、及びリンゴ酸(MA)の各量をg/Lで表した場合の合計を表す、請求項1〜14のいずれか1項に記載の株。
- コハク酸(SA)及び副産物である酢酸(AA)を、各量をg/Lで表した場合、>10:1、又は>12.5:1、又は>15:1、又は>17.5:1、又は>20:1、又は>25:1、又は>30:1、又は>40:1、又は>50:1、又は>75:1、又は>90:1のSA/AA比で生産する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の株。
- コハク酸(SA)及び副産物であるギ酸(FA)を、各量をg/Lで表した場合、>90:1、又は>100:1のSA/FA比で生産する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の株。
- 有機酸又はその塩若しくは誘導体の発酵生産方法であって、以下のステップ:
a)同化性炭素源を含有する培地中で請求項1〜17のいずれか1項に記載の細菌株をインキュベートするステップ、及び所望の有機酸の形成に有利な条件下で該株を培養するステップ;並びに
b)該有機酸又はその塩若しくは誘導体を培地から得るステップ
を含む、前記方法。 - 発酵を、二酸化炭素の存在下で、約10〜60℃の範囲の温度、pH5.0〜9.0で行う、請求項18に記載の方法。
- 前記有機酸がコハク酸である、請求項18又は19に記載の方法。
- 同化性炭素源が、グリセロール、ショ糖、マルトース、マルトデキストリン、D-フルクトース、D-ガラクトース、D-マンノース、ラクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、ラフィノース、デンプンの分解産物、セルロース、ヘミセルロース及びリグノセルロース、並びにそれらの混合物から選択される、請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 炭素源が、グリセロール若しくはグリセロールの混合物、並びにショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、D-グルコース、D-キシロース、ラフィノース及びL-アラビノースから選択される少なくとも1種のさらなる炭素源である、請求項21に記載の方法。
- 同化性炭素源の濃度が、5〜80g/lの範囲の値に調整される、請求項18〜22のいずれか1項に記載の方法。
- コハク酸又はその塩若しくは誘導体の発酵生産方法であって、以下のステップ:
a)少なくとも1種の同化性炭素源を含有する培地中で細菌株をインキュベートするステップ、及び所望の有機酸の形成に有利な条件下で該株を培養するステップ;
b)該有機酸又はその塩若しくは誘導体を培地から得るステップ;
を含み、以下の特徴:
c)少なくとも25g/Lのグリセロールを少なくとも25.1g/Lのコハク酸に、少なくとも1.0g/gの収率係数YP/Sで変換する;
d)ショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、D-マンノース、ラフィノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも0.58g gDCW-1 h-1 コハク酸の比生産収率で変換する;
e)ショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、ラフィノース及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも2.2g/(L h) コハク酸のコハク酸に対する空時収率で変換する;
f)少なくとも25g/Lのショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、ラフィノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも2.2g/(L h)のコハク酸に対する空時収率で変換する;
g)ショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、ラクトース、D-マンノース、ラフィノース、及び/又はグリセロールから選択される少なくとも1種の炭素源をコハク酸に、少なくとも0.6g gDCW-1 h-1 コハク酸の比生産収率で、かつ少なくとも2.2g/(L h)のコハク酸に対する空時収率で変換する;
h)コハク酸(SA)及び副産物(SSP)を、>10:1、又は>12.5:1、又は>15:1、又は>17.5:1、又は>20:1、又は>25:1、又は>30:1、又は>33:1のSA/SSP比で生産し、ここでSSPは、副産物である乳酸(LA)、ギ酸(FA)、酢酸(AA)、及びリンゴ酸(MA)の各量をg/Lで表した場合の合計を表す;
i)コハク酸(SA)及び副産物である酢酸(AA)を、各量をg/Lで表した場合、>10:1、又は>12.5:1、又は>15:1、又は>17.5:1、又は>20:1、又は>25:1、又は>30:1、又は>50:1、又は>75:1、又は>90:1のSA/AA比で生産する
のうち少なくとも1つをさらに特徴とする、前記方法。 - 前記細菌株が請求項1〜17のいずれか1項に記載の株である、請求項24に記載の方法。
- 不連続的又は連続的に行う、請求項18〜25のいずれか1項に記載の方法。
- コハク酸及び/又はコハク酸アンモニウム塩の生産方法であって、該方法は、、請求項18〜26のいずれか1項に記載のコハク酸の発酵生産、及びアンモニア若しくはその水溶液、又はNH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、MgH(CO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N及びそれらの混合物でのpHの調整を含む、前記方法。
- 有機酸及び/又はその塩が、ろ過、結晶化、電気透析及び/又は陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに単離及び/又は精製される、請求項18〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 有機酸及び/又はその塩が、以下のステップ:
ろ過、その後の
陽イオン交換クロマトグラフィー、その後の
結晶化
によってさらに単離及び/又は精製される、請求項18〜28のいずれか1項に記載の方法。 - 陽イオン交換クロマトグラフィーに使用する材料が、0.5〜2.0等量/l 陽イオン交換樹脂の総キャパシティを有するスルホン酸基を有するH+形態の陽イオン交換樹脂である、請求項28又は29に記載の方法。
- 陽イオン交換クロマトグラフィーを45〜60℃の温度で行う、請求項28〜30のいずれか1項に記載の方法。
- テトラヒドロフラン(THF)及び/又は1,4-ブタンジオール(BDO)及び/又はγ-ブチロラクトン(GBL)の生産方法であって、以下:
a)請求項27に記載のコハク酸及び/又はコハク酸塩の発酵生産、並びに
b1)得られた遊離酸のTHF及び/又はBDO及び/又はGBLへの直接接触水素化、あるいは
b2)得られた遊離コハク酸及び/又はコハク酸塩の対応するジ-低級アルキルエステルへの化学的エステル化、及び続く該エステルのTHF及び/又はBDO及び/又はGBLへの接触水素化
を含む、前記方法。 - ピロリドン類の生産方法であって、以下:
a)請求項27に記載のコハク酸アンモニウム塩の発酵生産、及び
b)それ自体公知の方法での、コハク酸アンモニウム塩のピロリドン類への化学的変換
を含む、前記方法。 - 同化性炭素源として使用される前記グリセロールをトリアシルグリセリドのエステル開裂によって得る、請求項21〜33のいずれか1項に記載の方法。
- グリセロールがバイオディーゼルの製造から得られる廃棄物である、請求項34に記載の方法。
- 有機ファインケミカルの発酵生産のための、請求項1〜17のいずれか1項に記載の細菌株の使用。
- 有機ファインケミカルがコハク酸又はその塩若しくは誘導体である、請求項36に記載の使用。
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