CN112111418B

CN112111418B - 琥珀酰多糖高产菌株及琥珀酰多糖的制备和应用

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Publication number: CN112111418B
Application number: CN201910536858.2A
Authority: CN
Inventors: 高红亮; 杨丽; 金明飞; 蒋德明; 牛延宁; 常忠义
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2039-06-20
Also published as: CN112111418A

Abstract

本发明公开了一株新的琥珀酰多糖高产菌株AT311‑15及其制备方法和应用，所述琥珀酰多糖高产菌株AT311‑15经NTG化学诱变得到，为根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.15169。将该菌株所产胞外多糖结构琥珀酰多糖应用于面条制作中，显著改善面条的蒸煮特性及质构特性。本发明具广泛应用前景。

Description

琥珀酰多糖高产菌株及琥珀酰多糖的制备和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种琥珀酰多糖高产菌株及其制备方法和应用。。

背景技术

细菌普遍合成并分泌胞外多糖，胞外多糖是细菌的次级代谢产物,是细菌生长过程中分泌到细胞壁外形成与菌体分离的可溶性多糖复合物。琥珀酰多糖是一种酸性的水溶性杂多糖，由于含有10％琥珀酸而被称为琥珀酰多糖(succinoglycan)，琥珀酰多糖的重复单元是一个支化八糖，包括七个β-1-3-，1-4-，以及1-6-连接的葡萄糖残基和一个β-1-3-连接的半乳糖糖残基，并且还有一些非碳水化合物取代基即丙酮酸，琥珀酸和乙酸。琥珀酰多糖一般由根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、草木栖剑菌(Ensifermeliloti)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)。

琥珀酰多糖具有独特的流变学性质，结构简单，可作为增粘剂、乳化剂、交联剂、稳定剂等广泛应用于食品、化妆品、生物医药等领域，具有极好的市场应用前景。目前关于琥珀酰多糖的发酵条件的优化已经有所报道，但是产量仅为18g/L,远远没有达到工业化生产的产量要求，菌株问题是限制琥珀酰多糖生产的因素之一。此外，关于琥珀酰多糖结构鉴定，尤其是单糖组成成分和取代基含量的检测技术都没有明确的技术方案，使得琥珀酰多糖的研究远远落后于黄原胶等微生物多糖。

发明内容

本发明提供了一株琥珀酰多糖高产菌株，及其制备琥珀酰多糖的方法，并提供了分析琥珀酰多糖结构特性的方法，提供了琥珀酰多糖在用于面条制作中应用。

本发明提出了一种琥珀酰多糖高产菌株，以能够生产琥珀酰多糖的菌株为出发菌株，如以放射形根瘤菌Rhizobium radiobacter(又名根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens))CGMCC 1.2557为出发菌株，采用NTG化学诱变方法得到琥珀酰多糖高产菌株即根瘤土壤杆菌AT311-15(Agrobacterium tumefaciens)，利用此菌株发酵制备琥珀酰多糖。本发明还提出了对所述琥珀酰多糖结构包括官能团、单糖组成、取代基含量的鉴定方法，用于分析琥珀酰多糖的物理化学特性。本发明还提出了所述琥珀酰多糖在面条制作中的应用。

本发明提出了一种琥珀酰多糖高产菌，所述菌株为根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株AT311-15，于2018年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路l号院3号，保藏日期2018年1月11日，其保藏编号为CGMCC No.15169；分类命名：根瘤土壤杆菌，革兰氏阴性菌，好氧菌，氧化酶阳性，能够利用大部分单糖和二糖，不能利用肌醇、木糖、棉子糖、山梨醇、鼠李糖；AT311-15菌株不能利用硫化氢、不能水解淀粉和液化明胶，不能产生苯丙氨酸脱氢酶；能利用甘油，不能以丙二酸盐、柠檬酸盐作为唯一碳源。

本发明还提出了所述琥珀酰多糖高产菌株即菌株AT311-15的制备方法，采用琥珀酰多糖高产菌株的诱变筛选，以能够生产琥珀酰多糖的菌株为出发菌株，如以放射形根瘤菌Rhizobium radiobacter CGMCC 1.2557为出发菌株，进行NTG诱变，经初筛、复筛，得到所述琥珀酰多糖高产菌株；其中，所述复筛中，筛选得到琥珀酰多糖产量高于出发菌株20％以上的菌株作为所述琥珀酰多糖高产菌株。制备得到的所述菌株为根瘤土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens菌株AT311-15，于2018年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15169。

在一具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：

步骤(1)出发菌株为一株产琥珀酰多糖的放射形根瘤菌Rhizobium radiobacterCGMCC1.2557，显微镜下为短杆状形态(如图1-B)，革兰氏阴性好氧菌，菌落形状为凸起，粘滑，湿润，白色半透明(如图2-B)。适宜生长温度为28℃左右。

步骤(2)NTG诱变条件：将培养12～24h的种子液离心，收集菌体然后用缓冲液重悬菌体，加入与种子液等体积的浓度为0.5～2mg/mL的NTG溶液，进行诱变20～40min；之后离心，采用生理盐水清洗并重悬菌体，制成菌悬液，涂布再生培养2～4d。

其中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，优选为pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液。

优选地，所述种子液的培养时间为16h。

优选地，所述NTG溶液的浓度为0.5mg/mL。

优选地，所述诱变的时间为30min。

其中，诱变时，摇床的转速为200r/min、30℃。

步骤(3)菌株初筛：选择生长速度较快、表面湿润、粘滑，以及直径较大的菌落进行培养。

步骤(4)复筛：将出发菌株和诱变菌株进行液体摇瓶发酵，以出发菌株为对照，发酵结束后以琥珀酰多糖产量为指标，选择产量明显高于出发菌株20％以上的菌株保存。

进一步地，还包括步骤(5)遗传稳定性试验：将新菌株连续传代培养5代，每代菌株进行摇瓶发酵发酵，并测定琥珀酰多糖产量，若每代的产量之间变异系数小于10％，即为遗传稳定性良好的菌株，选择其作为最终的目标菌株，即琥珀酰多糖高产菌株。

步骤(4)、(5)中，对琥珀酰多糖的产量进行测定，取一定量发酵液V(L)，9000r/min离心10min，除去沉淀；向上清中加入80％～95％酒精，充分搅拌均匀，静置后离心，最后将固形物取出于烘箱中干燥至恒重，称其质量W(g)；其中，所述产量的计算方式为：产量(g/L)＝W/V。

本发明还提出了一种利用所述琥珀酰多糖高产菌株得到琥珀酰多糖的制备方法。所述琥珀酰多糖的单糖组成为葡萄糖86.59％、半乳糖12.47％，甘露糖0.94％、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为6.94，琥珀酸取代基含量为71.2mg/g，乙酸取代基含量为0.34mg/g，丙酮酸取代基含量为51.8mg/g。

(1)种子制备：将上述琥珀酰多糖高产菌株接种于装有50mL种子培养基的250mL三角摇瓶中，并将其置于恒温振荡摇床中培养16～24h，温度30℃，转速250r/min；

(2)摇瓶发酵：按1％(V/V)的接种量将种子液转接入已灭菌的装有50mL发酵培养基的250mL锥形瓶中培养72～96h，温度30℃，转速250r/min，琥珀酰多糖产量可达36g/L；

(3)琥珀酰多糖分离提取：将摇瓶发酵所得发酵液进行离心分离，收集上清液，向上清液中加入3倍体积80％～95％酒精，搅拌至多糖析出后，过滤除去酒精，将所得沉淀真空冷冻干燥，粉碎后即得琥珀酰多糖粉末。

在一具体实施方案中，摇瓶发酵法制备琥珀酰多糖，包括以下步骤：

将高产菌株从斜面接种于种子培养基中。其中，种子培养基的组成成分及质量百分比(W/V)为：多聚蛋白胨0.5～1.0％(W/V)，酵母粉0.3～0.5％(W/V)，氯化钠0.3～0.5％(W/V)，pH＝7.0～7.2。优选地，所述种子培养基配方为：多聚蛋白胨1％(W/V)，酵母粉0.5％(W/V)，氯化钠0.5％(W/V)，pH＝7.2。

摇床250r/min，30℃培养16～24h。

将种子液以1％(V/V)接种量接种于发酵培养基中。其中，发酵培养基的组成成分及质量百分比(W/V)为：蔗糖5％～7％(W/V)，酵母粉0.3％～0.5％(W/V)，K₂HPO₄0.1％～0.2％(W/V)，碳酸钙0.5％～1.0％(W/V)，pH＝7.0～7.2。优选地，所述发酵培养基配方为：蔗糖7％(W/V)，酵母粉0.5％(W/V)，K₂HPO₄0.975％(W/V)，碳酸钙0.5％(W/V)，pH＝7.2。

摇床250r/min，30℃培养72～96h。

而后对发酵液进行9000r/min离心10min，弃去菌体和碳酸钙沉淀，上清液中加入3倍体积80％～95％乙醇，持续搅拌至琥珀酰多糖析出，过滤除去乙醇，然后将琥珀酰多糖进行真空冷冻干燥后粉碎，即得琥珀酰多糖样品。

采用上述方法得到的琥珀酰多糖的产量达到36g/L，达到了工业化水平。

本发明还提出一种琥珀酰多糖结构的鉴定方法，其中，所述琥珀酰多糖通过所述琥珀酰多糖高产菌株制备得到。所述鉴定方法中，将所述琥珀酰多糖进行红外光谱、核磁共振分析以获得化学结构和官能团的信息；通过PMP柱前衍生高效液相色谱法检测琥珀酰多糖的单糖组成；通过高线凝胶过滤色谱法检测琥珀酰多糖的相对分子质量；通过反相高效液相色谱法检测琥珀酰多糖的琥珀酸、乙酸、丙酮酸取代基含量。

在一具体实施方案中，一种琥珀酰多糖的结构鉴定方法，包括以下步骤：

(1)将制备的琥珀酰多糖样品与KBr压片，使用傅立叶红外拉曼光谱仪进行红外光谱扫描，光谱区域为400～4000cm^-1，分辨率为2cm^-1。

(2)取100mg琥珀酰多糖样品进行¹³C NMR光谱分析。

(3)琥珀酰多糖单糖组成成分的检测方法如下：

a将琥珀酰多糖样品配制成5g/L的溶液，再配制4mol/L TFA溶液，各取1mL琥珀酰多糖溶液和TFA溶液加入10mL的具塞刻度试管，用N₂封管，110℃水解2h。然后加3mL甲醇并用旋转蒸发仪蒸干，重复3～4次以完全除去TFA。

b配制混合单糖标准液，取2mL于10mL具塞刻度试管，再加入2mL的2.4％的NaOH溶液并混匀，另取一10mL的具塞试管，分别加入1mL上述混合液、8.71％的PMP甲醇溶液并混匀，70℃反应100min后取出冷却至室温，用HCl中和后加水至5mL，再加等体积的氯仿萃取3次，最后将水相0.45μm水相滤膜过滤后进行高效液相分析

c检测条件为Agilent 1100高效液相色谱仪；色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18,250mm×4.6mm i.d.，5μm，流动相：超纯水-乙腈(体积比为87：13)，柱温30℃，检测波长250nm，流速0.9mL/min，进样量20μL。

(4)琥珀酰多糖样品中取代基含量的检测方法如下：

色谱条件为：Agilent 1100高效液相色谱仪，色谱柱为CAPECELLPAK MGS5C18柱，4.6mm×250mm，5μm；首先使用0.2％磷酸溶液-甲醇(体积比为97：3)等度洗脱10min，然后在较短时间内使甲醇相达到100％并缓冲5min，再将流动相调整至和第一次相同，同样缓冲5min。柱温45℃，进样量20μL，检测波长210nm。将琥珀酰多糖溶液用强阴离子交换固相萃取柱纯化，然后用反相色谱柱分离，分析取代基含量。

所述鉴定方法中，所述检测琥珀酰多糖的单糖组成时，先用2～6mol/L的三氟乙酸对琥珀酰多糖溶液进行水解。

所述鉴定方法中，所述检测的琥珀酰多糖样品包括出发菌株产琥珀酰多糖(SG-A)和高产菌株产琥珀酰多糖(SG-N)。

本发明还提出了一种所述琥珀酰多糖高产菌株、所述琥珀酰多糖在面条制作中的应用，将所述琥珀酰多糖加入面粉中制成面条。

优选地，所述琥珀酰多糖以溶液的方式加入面粉，所述面粉中琥珀酰多糖的添加量为0.1％～1％。

本发明还提出了一种含琥珀酰多糖的面条的制备方法，所述面条的制作流程为：和面—醒发—压面，面条宽4mm、厚1mm。在一具体实施方案中，称取高筋小麦粉，以0.1％～1％的比例加入琥珀酰多糖，加水和面后醒发1～30min，压面机碾成宽4mm、厚1mm的面条，煮面至面条中间白芯消失，以不加琥珀酰多糖的面条作为对照，分析其蒸煮特性及质构特性的变化。

本发明有益效果包括，通过NTG诱变方法选育筛选得到了一株根瘤土壤杆菌AT311-15(Agrobacterium tumefaciens)，利用该菌株摇瓶发酵后琥珀酰多糖的产量较高，琥珀酰多糖产量可达36g/L，远高于现有的报道，国内报道最高产量为郑素雅的18g/L，国外报道最高为22g/L)，达到了工业化水平，而现有技术中的已知水平并未达到工业化生产的要求。，并且增加了琥珀酰多糖生产菌株的来源；本发明还提供了琥珀酰多糖的发酵生产和制备方法，以及通过红外光谱、核磁共振、反相高效液相色谱法以及PMP柱前衍生高效液相色谱法对琥珀酰多糖结构进行了鉴定，从而为实验室研究及工业生产提供理论依据，弥补了国内琥珀酰多糖研究的匮乏。本发明首次提出，PMP柱前衍生高效液相色谱法用于琥珀酰多糖的单糖组成的检测，以及采用反相高效液相色谱法用于琥珀酰多糖取代基含量的检测。

采用本发明AT311-15菌株制备琥珀酰多糖的过程简单，易于操作，便于大规模工业化生产。另外本发明分析了琥珀酰多糖的化学结构，对于琥珀酰多糖日后的研究具有重要意义。本发明将琥珀酰多糖应用于面条制作，对面条品质的改善有显著作用，还可以用于其他面食/面制品的制作和改善。本发明为琥珀酰多糖在食品行业的应用提供参考依据，扩大琥珀酰多糖的应用范围。本发明具广泛应用前景。

生物材料样品保藏信息：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2018年1月11日；保藏编号CGMCC15169；分类命名：根瘤土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens。

附图说明

图1是本发明高产菌株AT311-15(A)和出发菌株(B)的简单染色菌体图。

图2是本发明高产菌株AT311-15(A)和出发菌株(B)的菌落形态图。

注：图中方格的大小为1mm×1mm

图3是本发明高产菌株AT311-15的遗传稳定性验证结果。

图4是本发明高产菌株AT311-15基于16S rRNA基因序列的进化树分析。

图5是出发菌株所产琥珀酰多糖(SG-A)和本发明高产菌株所产琥珀酰多糖(SG-N)的傅里叶变换红外光谱测定结果。

图6是出发菌所产琥珀酰多糖(SG-A)和本发明高产菌株所产琥珀酰多糖(SG-N)的¹³C核磁共振波谱测定结果。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1琥珀酰多糖高产菌株的分离

本发明通过对一株产琥珀酰多糖的根瘤土壤杆菌进行NTG化学诱变分离筛选琥珀酰多糖高产菌株。

NTG诱变流程：将培养16h的种子液离心，收集菌体，然后用缓冲液重悬菌体，加入与种子液等体积的浓度为0.5mg/mL的NTG溶液，进行诱变30min。之后离心，采用生理盐水清洗并重悬菌体，制成菌悬液，稀释涂布在平板上培养3d。挑选平板上生长速度较快、表面湿润、粘滑以及直径较大的菌株进行摇瓶复筛，通过测定测琥珀酰多糖的产量，最终筛选到一株琥珀酰多糖高产菌株AT311-15，经测定AT311-15发酵72h后发酵液中琥珀酰多糖产量可达36g/L。而相同条件下，出发菌株CGMCC 1.2557的琥珀酰多糖产量为12.8g/L。

AT311-15菌株遗传稳定性验证：将AT311-15菌株连续传代培养5代，每代用液体摇瓶发酵72h，比较每代之间的多糖产量，变异系数仅为2.3％(如图3)，即说明AT311-15菌株具有良好的遗传稳定性，故选择其作为最终的琥珀酰多糖高产菌株

上述实施过程中琥珀酰多糖的产量的测定采用烘干称重法：取一定体积发酵液V(L)，9000r/min离心10min，除去沉淀；向沉淀中加入95％酒精，充分搅拌均匀，静置后离心，最后将固形物取出于烘箱中干燥至恒重，称其质量W(g)；其中，所述产量的计算方式为：产量(g/L)＝W/V；

实施例2琥珀酰多糖高产菌株的分类鉴定

按《伯杰氏细菌鉴定手册》对上述AT311-15菌株进行生理生化特性鉴定(见表1)，并对该菌株的16S rRNA的编码基因进行测序。

AT311-15菌株的生理生化鉴定结果与土壤杆菌属相似，基于对该菌株AT311-15的生理生化性质分析(如表1)和16S rRNA的编码基因序列比对(如图4)，鉴定为根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号：CGMCC15169。

表1菌株AT311-15的生理生化特性鉴定

注：+：反应阳性，-：反应阴性

菌株AT311-15的16S rRNA的基因编码序列

GAAGGAATAGGGGGCGGCTTACACATGCAGTCGAACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACATACCCTTTCCTGCGGAATAGCTCCGGGAAACTGGAATTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGATTTATCGGGGAAGGATTGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGAGAAGATAATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCAGAGCTCAACTCTGGAACTGCCTTTGATACTGGGTATCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCTCTTGACATTCGGGGTTTGGGCAGTGGAGACATTGTCCTTCAGTTAGGCTGGCCCCAGAACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACAGCGATGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGTAGTGCGCTAACCGCAAGGAGGCAGCTAACCACGGTAGTCAGCACCCTAAA

实施例3摇瓶发酵法制备琥珀酰多糖

(1)根瘤土壤杆菌AT311-15和出发菌株分别从斜面接种于种子培养基中，30℃，250r/min摇床培养18h。将两种菌株的种子液分别以1％接种量接种于发酵培养基中，30℃，250r/min摇床培养72h。

(2)种子培养基配方为：多聚蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，氯化钠0.5％，pH＝7.2。

(3)发酵液培养基配方为：蔗糖7％，酵母粉0.5％，碳酸钙0.5％，pH＝7.2。

(4)斜面培养基配方为：葡萄糖1.0％，牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％，玉米浆0.15％，琼脂2.0％，pH＝7.0；

(5)琥珀酰多糖提取：到达发酵终点后，分别将产菌株和出发菌株的发酵液进行9000r/min离心10min，弃去菌体和碳酸钙的沉淀，上清液中加入3倍体积95％乙醇，持续搅拌至琥珀酰多糖析出，过滤除去乙醇，然后将琥珀酰多糖进行真空冷冻干燥后粉碎，从而得到出发菌株产琥珀酰多糖(SG-A)和高产菌株产琥珀酰多糖样品(SG-N)。

实施例4琥珀酰多糖的结构鉴定：

对实施例3中的琥珀酰多糖样品进行傅里叶转换红外光谱扫描测试(FT-IR)，如图5所示，SG-A和SG-N样品的红外基本图谱基本一致。3355cm^-1处的吸收峰归因于糖骨架中O-H的伸缩振动。2890cm^-1是糖骨架中CH₃和CH₂的CH官能团的不对称振动。1722cm^-1是乙酰基C＝O的振动，1408cm^-1代表取代基中CH₃基团，1313cm^-1是COO-基团的伸缩振动，1159cm^-1、1070cm^-1分别为羧基、糖骨架中的C-O振动，896cm^-1则代表β-糖苷键，此外820cm^-1代表呋喃环中C1-H的变角振动。

对实施例3中的琥珀酰多糖样品进行核磁共振检测，如图6所示。由图6可知，SG-A和SG-N样品的¹³C NMR图谱基本一致。25.14ppm代表丙酮酸中的CH₃，30.61ppm、32.35ppm则分别为琥珀酸中的两个CH₂基团。69.07ppm、74.46ppm分别为糖骨架中所有的C2和C5，82.24ppm代表β-D半乳糖的C3，103.40ppm则是丙酮酸乙酰基中的C，174.95ppm、177.05ppm分别为丙酮酸、琥珀酸基团中的C＝O。

对实施例3中的琥珀酰多糖样品进行单糖组成成分分析，所用方法为PMP柱前衍生高效液相色谱法，通过PMP柱前衍生是琥珀酰多糖带有特征紫外吸收峰，检测结果如下表2所示。表2是出发菌株所产琥珀酰多糖(SG-A)和高产菌株所产琥珀酰多糖(SG-N)的单糖组成成分检测结果。SG-N样品中葡萄糖和半乳糖所占百分比分别86.59％、12.47％，葡萄糖和半乳糖总摩尔比为6.94。SG-A样品中为葡萄糖85.93％、半乳糖12.92％，摩尔比为6.65。两种琥珀酰多糖中葡萄糖和半乳糖的百分比都在7左右。因此，出发菌株和高产菌株所产琥珀酰多糖主要单糖组成是一致的，且符合琥珀酰多糖是由八糖重复单元组成的结构特征。除主要的葡萄糖和半乳糖外，还检测到其他单糖。SG-N样品中只有0.94％的甘露糖，而SG-A样品中甘露糖为1.17％。

表2 琥珀酰多糖样品的单糖组成检测结果

对实施例3中的琥珀酰多糖样品进行取代基含量分析，首次通过反相高效液色谱法检测琥珀酰多糖中的取代基含量，结果如下表3所示。表3是出发菌所产琥珀酰多糖(SG-A)和高产菌株所产琥珀酰多糖(SG-N)的取代基含量检测结果。SG-A和SG-N样品中乙酸取代基含量很低，分别为0.28mg/g和0.34mg/g。SG-A样品中琥珀酸取代基的含量低于SG-N(分别为68.5mg/g、71.2mg/g)，丙酮酸含量略高于SG-N(分别为54.7mg/g、51.8mg/g)，取代基含量的不同会影响琥珀酰多糖的流变学行为。

表3 琥珀酰多糖样品的取代基含量检测结果

实施例5琥珀酰多糖在面条制作中的应用

称取50g高筋小麦粉，将实施例3中AT311-15产琥珀酰多糖样品按0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％的比例添加到面粉中，加水20mL，和面后醒发20min，压面机碾成宽4mm、厚1mm的面条，煮面至面条中间白芯消失。首先检测面条蒸煮后的干物质损失率和吸水率。再对面条进行TPA分析。

干物质损失率的测定方法：取10g生面条煮至最佳蒸煮时间，捞出后用自来水冲淋30s,将面条晾5min后将其烘干至恒重，然后称重，同时对10g生面条也烘干至恒重。干物质损失率＝(生面条干重-熟面条干重)/生面条干重。

吸水率的测定取10g生面条煮至最佳时间，捞出面条，控水10min后，称其质量。吸水率＝(煮后面条重-煮前面条重)/煮前面条重。

面条TPA性实验测定程序：探头型号，A/LKB-F轻型切刀。测试前速率1.0mm/sec，测试中速率和测试后速率均为0.8mm/sec，触发力5g，下压距离0.7mm。

面条蒸煮实验测定结果如表下4所示，表4是高产菌株所产琥珀酰多糖(SG-N)样品对面条蒸煮特性影响的检测结果。与未添加琥珀酰多糖的面条相比，添加琥珀酰多糖后面条的吸水率有所上升，而干物质损失率下降，其中以添加0.6％琥珀酰多糖的面条的蒸煮特性最佳，此时干物质损失最少，吸水率也比较高。

表4 面条蒸煮特性检测结果

面条TPA测定的结果如下表5所示，表5是高产菌株所产琥珀酰多糖(SG-N)样品对面条质构特性(TPA)特性影响的检测结果。与未添加琥珀酰多糖的面条相比，添加琥珀酰多糖后，面条的硬度表现出先升高后降低的趋势，弹性和粘聚性变化不大，但粘着性和咀嚼性要高于对照组。综合各因素，0.6％的琥珀酰多糖添加量效果对面条的TPA特性改善效果较好。

综上，本发明提供一株琥珀酰多糖高产菌株AT311-15，经鉴定为根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，利用该菌株制备琥珀酰多糖，且制备获得琥珀酰多糖的产量较高，可达36g/L，从而增加了琥珀酰多糖生产菌株的来源，有利于实现其工业化放大生产；且采用该菌株制备琥珀酰多糖的过程简单、易于操作。另外，本发明还提供了琥珀酰多糖结构鉴定的方法以及琥珀酰多糖在面条中应用的案例，能够为琥珀酰多糖的研究及应用带来参考依据。

表5 面条质构特性检测结果

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学

<120> 琥珀酰多糖高产菌株及琥珀酰多糖的制备和应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1399

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gaaggaatag ggggcggctt acacatgcag tcgaacgccc cgcaagggga gtggcagacg 60

ggtgagtaac gcgtgggaac ataccctttc ctgcggaata gctccgggaa actggaatta 120

ataccgcata cgccctacgg gggaaagatt tatcggggaa ggattggccc gcgttggatt 180

agctagttgg tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatcc atagctggtc tgagaggatg 240

atcagccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtggggaat 300

attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gagtgatgaa ggccttaggg 360

ttgtaaagct ctttcaccgg agaagataat gacggtatcc ggagaagaag ccccggctaa 420

cttcgtgcca gcagccgcgg taatacgaag ggggctagcg ttgttcggaa ttactgggcg 480

taaagcgcac gtaggcggat atttaagtca ggggtgaaat cccagagctc aactctggaa 540

ctgcctttga tactgggtat cttgagtatg gaagaggtaa gtggaattcc gagtgtagag 600

gtgaaattcg tagatattcg gaggaacacc agtggcgaag gcggcttact ggtccattac 660

tgacgctgag gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 720

cgtaaacgat gaatgttagc cgtcgggcag tatactgttc ggtggcgcag ctaacgcatt 780

aaacattccg cctggggagt acggtcgcaa gattaaaact caaaggaatt gacgggggcc 840

cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgcagaacct taccagctct 900

tgacattcgg ggtttgggca gtggagacat tgtccttcag ttaggctggc cccagaacag 960

gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1020

gcaaccctcg cccttagttg ccagcattta gttgggcact ctaaggggac tgccggtgat 1080

aagccgagag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg cccttacggg ctgggctaca 1140

cacgtgctac aatggtggtg acagtgggca gcgagacagc gatgtcgagc taatctccaa 1200

aagccatctc agttcggatt gcactctgca actcgagtgc atgaagttgg aatcgctagt 1260

aatcgcagat cagcatgctg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1320

caccatggga gttggtttta cccgaaggta gtgcgctaac cgcaaggagg cagctaacca 1380

cggtagtcag caccctaaa 1399

Claims

1.一种琥珀酰多糖高产菌株，其特征在于，所述菌株为根瘤土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens 菌株AT311-15，于2018年01月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15169。

2.一种琥珀酰多糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）种子制备：将权利要求1所述的琥珀酰多糖高产菌株接种于装有50 mL种子培养基的250 mL三角摇瓶中，并将其置于恒温振荡摇床中培养16～24 h，温度30℃，转速250 r/min；

（2）摇瓶发酵：按1% V/V的接种量将种子液转接入已灭菌的装有50 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中培养72～96 h，温度30℃，转速250 r/min，琥珀酰多糖产量可达36 g/L；

（3）琥珀酰多糖分离提取：将摇瓶发酵所得发酵液进行离心分离，收集上清液，向上清液中加入3倍体积80%～95%酒精离心洗涤，所得沉淀真空冷冻干燥，粉碎后即得琥珀酰多糖粉末。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中所用的种子培养基的组成成分及质量百分比W/V为：多聚蛋白胨0.5～1.0%，酵母粉0.3～0.5%，氯化钠0.3～0.5%，pH=7.0～7.2。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中所用发酵培养基的组成成分及质量百分比W/V为：蔗糖5%～7%，酵母粉0.3%～0.5%，K₂HPO₄ 0.1%~0.2%，碳酸钙0.5%～1.0%，pH=7.0～7.2。

5.如权利要求1所述的琥珀酰多糖高产菌株、如权利要求2所述的方法制备得到的琥珀酰多糖在制备面条中的应用，其特征在于，将所述琥珀酰多糖加入面粉中制成面条。

6.如权利要求5所述的应用中，其特征在于，所述琥珀酰多糖以溶液的方式加入面粉，添加量为0.2%～1%。