CN111979254A

CN111979254A - 不动杆菌苯酚羟化酶基因、其编码蛋白及其克隆方法

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Publication number: CN111979254A
Application number: CN202010606292.9A
Authority: CN
Inventors: 朱晨光; 王炼; 马文; 霍真真
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2040-06-29
Also published as: CN111979254B

Abstract

本发明涉及一种不动杆菌苯酚羟化酶基因、其编码蛋白及其克隆方法。本发明基因来源于不动杆菌属细菌，为SEQ ID NO1所示的碱基序列。该基因编码苯酚羟化酶，能够在大肠杆菌中发挥苯酚羟化酶的功能，能使大肠杆菌实现降解苯酚的能力，同时也预示了它在其他生物降解苯酚利用方面的应用价值。

Description

不动杆菌苯酚羟化酶基因、其编码蛋白及其克隆方法

技术领域

本发明涉及一种不动杆菌苯酚羟化酶基因、其编码蛋白及克隆方法，应用于好氧降酚微生物及酚类化合物有机污染物治理技术领域。

背景技术

酚类化合物是一种常见的水溶性有机污染物，广泛存在于石油、化工、煤气、焦化、钢铁及酚类生产厂排放的废水中，有毒且难降解。含酚污水不经过处理而任意排放会污染生态环境。因此，酚类化合物及其衍生物被我国等一些国家列入优先控制的污染物。

苯酚是典型的酚类有机物之一。苯酚的微生物降解法在效率、投资和二次污染等方面相对化学降解法有明显的优越性。从自然和人工环境中已鉴定并分离到大量的好氧降酚微生物，它们的多样性非常广泛，包括假单胞菌属、芽胞杆菌属、产碱杆菌属、酵母菌属、丛毛单胞菌属、罗尔斯通菌属、不动杆菌属、伯克雷氏菌属等，关于这些菌降解苯酚的生理生化特性已有不少的研究报道。

细菌对苯酚好氧降解的代谢途径目前已有完整解析，第一步是苯酚加氧生成邻苯二酚，由苯酚羟化酶(phenol hydroxylase)负责催化，然后邻苯二酚再分别经邻位和间位开环裂解，进一步生成β-酮基己二酸和α-酮基己二酸等中间产物，该两类化合物均为生物体内三羧酸循环过程的中间产物。整个好氧降解苯酚途径中，第一步反应是限速步骤。因此，苯酚羟化酶的活性将决定细菌对苯酚的降解利用能力，其编码基因是整个降酚基因簇上的关键基因，研究该基因的结构和功能具有重要的理论和应用双重价值。

不动杆菌(Acinetobactersp.)是一种常见的土壤细菌，在富含酚类废水污染的河道污泥中广有分布，表明其具有良好的苯酚利用能力。对这类细菌进行苯酚羟化酶基因的克隆及功能鉴定，将有助于发现新型降酚基因并应用于微生物代谢工程，指导生物强化和生物修复策略，为今后改善环境污染问题提供良好的科学依据，这成为亟待了解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种不动杆菌苯酚羟化酶基因。

本发明的目的之二在于提供该不动杆菌苯酚羟化酶基因的编码蛋白。

本发明的目的之三在于提供含有该不动杆菌苯酚羟化酶基因的质粒。

本发明的目的之四在于提供含有该不动杆菌苯酚羟化酶基因的宿主细胞。

本发明的目的之五在于提供该不动杆菌苯酚羟化酶基因的克隆方法。

本发明的目的之六在于提供该不动杆菌苯酚羟化酶基因在生物降解苯酚中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种不动杆菌苯酚羟化酶基因，其特征在于该基因的序列为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

一种上述不动杆菌苯酚羟化酶基因编码的蛋白，其特征在于该编码蛋白为SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。

一种质粒，其特征在于该质粒含有上述不动杆菌苯酚羟化酶基因。

一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有上述的不动杆菌苯酚羟化酶基因。

一种上述不动杆菌苯酚羟化酶基因的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：参考NCBI数据库中的不动杆菌属细菌的苯酚羟化酶基因的序列，设计了特异引物，从不动杆菌细菌菌株基因组DNA中扩增，得到不动杆菌苯酚羟化酶基因；所述的特异引物为：

BP5F:5’-ATGAGCTATCAAGTCACCAT-3’；

BP5R:5’-TTAGATATGTCTAAACAACG-3’。

上述PCR扩增的条件为：94℃，5分钟；94℃，50秒，52℃，50秒，72℃，1分10秒，28个循环；72℃8分钟。

一种上述的不动杆菌苯酚羟化酶基因在生物降解苯酚中的应用。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1.本发明降酚实验验证了不动杆菌苯酚羟化酶基因HGBP5所编码的苯酚羟化酶能够在大肠杆菌中发挥苯酚羟化酶的功能，能实现大肠杆菌降解苯酚的能力，同时也预示了它在其他生物降解苯酚利用方面的应用价值；

2.本发明降酚基因并应用于微生物代谢工程，指导生物强化和生物修复策略，为今后改善环境污染问题提供良好的科学依据。

附图说明

图1为本发明苯酚羟化酶基因编码的蛋白亚细胞定位预测图，表明该编码蛋白定位在细胞质的可能性很大。

图2为本发明苯酚羟化酶基因编码的蛋白的进化分析图，表明该编码蛋白属于细菌苯酚羟化酶家族。

图3为本发明不动杆菌苯酚羟化酶基因在大肠杆菌DH5α(Genotype:F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1)中的实现降酚功能分析图。培养基中添加苯酚作为唯一碳源，转入HGBP5的大肠杆菌菌株可以降解苯酚，未转入HGBP5的菌株则不能降解苯酚。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.)》，或按照制造厂商所建议的条件。

以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：

实施例一：

在本实施例中，HGBP5基因全长编码区的克隆与分析：

将不动杆菌(Acinetobacter spp.)菌株接种至LB液体培养基，30℃恒温摇床培养12小时，取3mL培养菌液，抽提其基因组DNA。通过分析NCBI数据库中的不动杆菌属细菌的苯酚羟化酶基因序列，设计了特异引物，该引物为：BP5F:5’-ATGAGCTATCAAGTCACCAT-3’和BP5R:5’-TTAGATATGTCTAAACAACG-3’。用这对引物从所抽提的不动杆菌基因组DNA中PCR扩增出了一个苯酚羟化酶基因，命名为HGBP5。其碱基序列为：

将该基因插入克隆载体pMD18-T，挑选相应的阳性克隆，对该基因进行了全长DNA测序，获得了含有该基因完整ORF的DNA序列。

测序结果表明：HGBP5的ORF全长1059bp。DNAstar软件的分析结果显示：该基因编码一个含352个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小约为39kDa，等电点为4.41。利用Cell-PLoc网站的Gneg-PLoc 2.0以及Softberry网站的ProtComp Version 9.0软件对HGBP5基因编码的蛋白进行亚细胞定位预测，预测数据显示该蛋白定位在细胞质，参见图1，这与其它物种中的苯酚羟化酶的定位信息相符。进化分析表明，HGBP5基因编码的蛋白属于细菌苯酚羟化酶家族，其编码蛋白的氨基酸序列为：

实施例二：在本实施例中，HGBP5在大肠杆菌DH5α中的功能分析：

通过DNA测序分析，挑选HGBP5基因ORF转录方向与载体pMD18-T上乳糖启动子lacZ转录方向一致的克隆，抽提该克隆的质粒，并转入大肠杆菌DH5α(Genotype:F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1)中。

将转入HGBP5和未转入HGBP5的大肠杆菌DH5α菌株在添加200mg/L苯酚的无机盐培养基(K₂HPO₄ 2.75克，KH₂PO₄ 2.25克，(NH₄)₂SO₄ 1克，MgCl₂·6H₂O 0.2克，NaCl 0.1克，FeCl₃·6H₂O 0.02克，CaCl₂ 0.01克，去离子水定容至1升，pH 6.8-7.0)中，30℃，200转/分钟的恒温摇床连续培养18小时。采用4-氨基安替比林法(Folsom等，Applied andEnvironmental Microbiology，1990,56(5):1279-1285)，每2小时测定一次培养液中残留苯酚的含量(OD₅₁₀值)，计算转HGBP5基因的大肠杆菌DH5α对苯酚的降解率。

由图3可以说明，HGBP5的表达使得大肠杆菌DH5α在以苯酚为唯一碳源的培养基培养条件下可以降解苯酚，而缺乏HGBP5的大肠杆菌DH5α不能在以苯酚为唯一碳源的培养基培养条件下降解苯酚。该实验在大肠杆菌中验证了基因HPBP5所编码的苯酚羟化酶能够发挥苯酚羟化酶的功能，证明该基因能够帮助大肠杆菌实现降解苯酚的能力，同时也预示了它在其他生物苯酚降解利用方面的应用价值。

上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明不动杆菌苯酚羟化酶基因、其编码蛋白及其克隆方法和载体、宿主细胞的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海大学

<120> 不动杆菌苯酚羟化酶基因、其编码蛋白及克隆方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1059

<212> DNA

<213> 不动杆菌属(Acinetobacter sp.)

<400> 1

atgagctatc aagtcaccat tgaaccgatt ggtaccacca ttgaagttga agaagatcaa 60

accatccttg atgctgcatt gcgtcaaggt gtttggttgc cctttgcttg tggtcacggc 120

acctgtggaa cctgtaaagt ccaagttact gatggttttt atgacctcgg tgatgcatca 180

ccttttgcac tcatggatat tgagcgtgaa gaaaacaaag tccttgcctg ctgctgtaaa 240

ccagaatcag acatggtcat tgaagctgat gttgatgaag acgaagactt cttaggctat 300

ttaatcgaag attaccaagc caaagtcatc gatatcacag atctttcgcc aacgattaaa 360

ggcatacgtc tagagatcga tcgtacgatg caattccaag caggccaata tattaacctg 420

caattgcctg gtattgaggg cacacgtgca ttctctattg ccaatgcacc aagtgaagaa 480

ggcattattg aactacatat ccgccaagta caaggcggtg ctgcaacaac ttatgttcat 540

gagcaactca gtgttggtga tgaattacag ctgactggac cttatggtca gttctttgtc 600

cgtaaatcgg atgagcaaga tgtcatcttt attgctggtg gttctggact ttctagtccg 660

caatcgatgg tccacgatct actcgatgaa ggtgatactc gtaccatcta cctgttccaa 720

ggggcacgtg atgttgctga gttatataac cgtgagttat ttgaaaattt agtgaagaag 780

catccaaact tccgctatat ccctgcactg aatgcaccta aagcagaaga tgcttggaca 840

ggtttcacag gttttgtaca tgaagccgtt gcaaattact ttgaaaataa gtgtgctggc 900

cataaagcat atttgtgtgg tccacctcct atgatcgatg ctgcgatttc aacattaatg 960

caaagtcgtt tatttgagcg tgatattcat acagaacgtt tcttaagtgc tgctgatggt 1020

gctggagagt ctcgttcagc gttgtttaga catatctaa 1059

<210> 2

<211> 352

<212> PRT

<213> 不动杆菌属(Acinetobacter sp.)

<400> 2

Met Ser Tyr Gln Val Thr Ile Glu Pro Ile Gly Thr Thr Ile Glu Val

1 5 10 15

Glu Glu Asp Gln Thr Ile Leu Asp Ala Ala Leu Arg Gln Gly Val Trp

20 25 30

Leu Pro Phe Ala Cys Gly His Gly Thr Cys Gly Thr Cys Lys Val Gln

35 40 45

Val Thr Asp Gly Phe Tyr Asp Leu Gly Asp Ala Ser Pro Phe Ala Leu

50 55 60

Met Asp Ile Glu Arg Glu Glu Asn Lys Val Leu Ala Cys Cys Cys Lys

65 70 75 80

Pro Glu Ser Asp Met Val Ile Glu Ala Asp Val Asp Glu Asp Glu Asp

85 90 95

Phe Leu Gly Tyr Leu Ile Glu Asp Tyr Gln Ala Lys Val Ile Asp Ile

100 105 110

Thr Asp Leu Ser Pro Thr Ile Lys Gly Ile Arg Leu Glu Ile Asp Arg

115 120 125

Thr Met Gln Phe Gln Ala Gly Gln Tyr Ile Asn Leu Gln Leu Pro Gly

130 135 140

Ile Glu Gly Thr Arg Ala Phe Ser Ile Ala Asn Ala Pro Ser Glu Glu

145 150 155 160

Gly Ile Ile Glu Leu His Ile Arg Gln Val Gln Gly Gly Ala Ala Thr

165 170 175

Thr Tyr Val His Glu Gln Leu Ser Val Gly Asp Glu Leu Gln Leu Thr

180 185 190

Gly Pro Tyr Gly Gln Phe Phe Val Arg Lys Ser Asp Glu Gln Asp Val

195 200 205

Ile Phe Ile Ala Gly Gly Ser Gly Leu Ser Ser Pro Gln Ser Met Val

210 215 220

His Asp Leu Leu Asp Glu Gly Asp Thr Arg Thr Ile Tyr Leu Phe Gln

225 230 235 240

Gly Ala Arg Asp Val Ala Glu Leu Tyr Asn Arg Glu Leu Phe Glu Asn

245 250 255

Leu Val Lys Lys His Pro Asn Phe Arg Tyr Ile Pro Ala Leu Asn Ala

260 265 270

Pro Lys Ala Glu Asp Ala Trp Thr Gly Phe Thr Gly Phe Val His Glu

275 280 285

Ala Val Ala Asn Tyr Phe Glu Asn Lys Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr

290 295 300

Leu Cys Gly Pro Pro Pro Met Ile Asp Ala Ala Ile Ser Thr Leu Met

305 310 315 320

Gln Ser Arg Leu Phe Glu Arg Asp Ile His Thr Glu Arg Phe Leu Ser

325 330 335

Ala Ala Asp Gly Ala Gly Glu Ser Arg Ser Ala Leu Phe Arg His Ile

340 345 350

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 不动杆菌属(Acinetobacter sp.)

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 不动杆菌属(Acinetobacter sp.)

<400> 4

Claims

1.一种不动杆菌苯酚羟化酶基因，其特征在于该基因的序列为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

2.一种根据权利要求1所述不动杆菌苯酚羟化酶基因编码的蛋白，其特征在于该编码蛋白为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.一种质粒，其特征在于该质粒含有权利要求1所述不动杆菌苯酚羟化酶基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有权利要求1所述的不动杆菌苯酚羟化酶基因。

5.一种根据权利要求1所述不动杆菌苯酚羟化酶基因的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：参考NCBI数据库中的不动杆菌属细菌的苯酚羟化酶基因的序列，设计了特异引物，从不动杆菌细菌菌株基因组DNA中扩增，得到不动杆菌苯酚羟化酶基因；所述的特异引物为：

BP5F:5’-ATGAGCTATCAAGTCACCAT-3’；

BP5R:5’-TTAGATATGTCTAAACAACG-3’。

6.根据权利要求5所述的克隆方法，其特征在于所述PCR扩增的条件为：94℃，5分钟；94℃，50秒，52℃，50秒，72℃，1分10秒，28个循环；72℃8分钟。

7.一种根据权利要求1所述的不动杆菌苯酚羟化酶基因在生物降解苯酚中的应用。