CN101532021A - 苯酚降解调控基因及其作用的启动子 - Google Patents

苯酚降解调控基因及其作用的启动子 Download PDF

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CN101532021A CN200810101802A CN200810101802A CN101532021A CN 101532021 A CN101532021 A CN 101532021A CN 200810101802 A CN200810101802 A CN 200810101802A CN 200810101802 A CN200810101802 A CN 200810101802A CN 101532021 A CN101532021 A CN 101532021A
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张维
彭子欣
陈明
林敏�
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Abstract

本发明发现了一种苯酚降解调控蛋白以及编码该蛋白的核苷酸序列。本发明还发现了所述苯酚降解调控蛋白作用的苯酚羟化酶启动子，并进一步发现所述启动子序列中与苯酚降解调控蛋白的功能结合位点。本发明构建了包含上述基因的重组载体和苯酚羟化酶启动子测试表达载体，并将这两个载体共转入大肠杆菌。实验证实，本发明将所述调控基因在大肠杆菌中表达后，可以激活苯酚羟化酶启动子表达，作为全细胞生物感应器检测苯酚，邻苯二酚，邻甲酚和2－氯酚等酚类化合物。

Description

苯酚降解调控基因及其作用的启动子
技术领域：
本发明涉及苯酚降解调控基因及其作用的启动子。具体涉及一种苯酚降解调控蛋白的核苷酸编码序列和其作用的苯酚羟化酶启动子的核苷酸编码序列。本发明还涉及所述两个核苷酸编码序列在苯酚生物降解和酚类污染物的生物治理和监控中的应用。
背景技术：
苯酚等酚类化合物常发现于工业污水中，给环境造成巨大的直接和潜在危害。
生物降解是非常环保的处理苯酚等污染物的技术。中国专利021488142《苯酚羟化酶基因及其用途》筛选分离到有降解苯酚能力的醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)PHEA-2。该菌株能将苯酚转化为邻苯二酚，邻苯二酚进一步开环裂解可以转化成CO2和H2O，完全消除了废水中苯酚的污染。该专利还公开了构建菌株基因文库的方法，克隆了将苯酚转化为邻苯二酚的苯酚羟化酶(phenol hydroxylase)的编码基因。将该基因转入醋酸钙不动杆菌PHEA-2中，可以增强原菌降解苯酚的能力；转入甲苯降解菌Psudomonas sp.A5中可以使重组菌获得原菌不具备的苯酚降解能力。
总之，专利021488142的研究重点是苯酚降解功能基因(结构基因)的克隆，未涉及苯酚降解调控基因的克隆和调控机制的研究。
生物降解调控系统的研究非常重要，它对于深入探讨重要生命现象的内在本质，阐述细胞降解行为的分子机理，揭示降解过程中基因表达的时间和空间特异性及其网络体系，均具有重要意义。
自然环境中某些微生物可以降解苯酚污染物是因为生物体内具有遗传基因编码的相应降解酶。降解酶的表达一般受到调控蛋白的调控，当细胞生活在苯酚富集的生境时，调控蛋白识别苯酚分子信号并开启降解酶的表达，使细胞可以利用苯酚作为碳源生长，同时苯酚被转化成对环境无害的物质。目前发现的苯酚降解调控蛋白都属于NtrC/XylR型调控蛋白家族，这类调控蛋白作用的启动子是依赖σ54 RNA聚合酶的启动子，被称为σ54型启动子(Eduardo Díaz and María A Prieto，2000)。σ54型启动子具有-24(TGGC)/-12(TTGC)保守碱基，因此又被称为-24/-12启动子。(Eduardo Diaz and María A Prieto，2000)。NtrC/Xy1R型调控蛋白结合于σ54型启动子上游两个反向重复序列(IR)组成的上游激活序列(UAS)启动σ54型启动子的表达。
发明内容：
本发明的目的是得到一种苯酚降解调控蛋白的核苷酸编码序列和其作用的苯酚羟化酶启动子的核苷酸编码序列。
本发明的进一步目的是将所述两个核苷酸编码序列用于苯酚生物降解和酚类污染物的生物治理和监控。
本发明发现并克隆了苯酚降解调控基因，命名为mphR。该基因的DNA序列如SEQID NO：1所示。该DNA序列编码的苯酚降解调控蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID NO：3所示。
所述苯酚降解调控基因mphR发现于醋酸钙不动杆菌PHEA-2的苯酚羟化酶基因的上游。通过反向PCR方法克隆到苯酚羟化酶上游的约3kb片段。核苷酸序列测定结果表明，SEQ ID NO：1序列中包含了一段长1671bp的阅读框，编码全长为556个氨基酸的SEQ ID NO：3序列。经序列比较分析(见图1)，显示该蛋白属于NtrC/Xy1R调控蛋白家族。当醋酸钙不动杆菌PHEA-2中SEQ ID NO：1序列缺失突变后，该菌株失去降解苯酚和激活苯酚羟化酶启动子表达的能力。
本发明还发现了所述苯酚降解调控基因mphR作用的苯酚羟化酶启动子，其序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明进一步发现：在SEQ ID NO：2序列中，170～230位是启动子上的上游激活序列(UAS)。实验证实：当170到230位碱基缺失后，调控蛋白不能结合于SEQ ID NO：2序列上，使得SEQ ID NO：2序列失去启动子的功能。
因此，本发明还确定了SEQ ID NO：3蛋白与SEQ ID NO：2序列有功能的结合位点是SEQ ID NO：2的170～230位的两个反向重复序列上。
本发明检测了所述调控蛋白可以识别的酚类化合物。当有酚类化合物存在时，该苯酚降解调控蛋白SEQ ID NO：3可以作用于SEQ ID NO：2所示的所述苯酚羟化酶基因的启动子，启动苯酚羟化酶的表达，以降解苯酚，邻苯二酚，邻甲酚和2-氯酚等酚类化合物。
本发明还构建了可以利用生物信号检测工业污染物的大肠杆菌菌株。构建了包含SEQ ID NO：1序列的原核表达重组载体和包含SEQ ID NO：2序列的苯酚羟化酶启动子测试表达重组载体。
可用上述重组载体转化宿主细胞，这些宿主包括原核细胞，也包括真核细胞。常用的原核宿主细胞包括DH5α，常用的真核宿主细胞包括酵母细胞和其它植物细胞。在本发明举出的应用实例中，宿主细胞是大肠杆菌DH5α。
本发明利用转基因技术将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2同时转化入大肠杆菌，得到共转化大肠杆菌PEMRP-14，以研究苯酚降解调控系统的特点和构建全细胞生物感应器，其步骤如下：
(1)将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列可操作地连于相应载体上，形成重组载体；
(2)将步骤(1)中的两个重组载体同时转入大肠杆菌细胞；
(3)经筛选获得转化细胞。
本发明提供了检测苯酚降解调控蛋白和苯酚羟化酶启动子活性的方法。通过测定苯酚诱导下SEQ ID NO：1编码蛋白的活性，发现只有在苯酚诱导时，苯酚降解调控蛋白有活性，可以激活苯酚羟化酶启动子启动的lacZ基因表达。无苯酚诱导时，调控蛋白没有活性，lacZ基因不表达(见图2)。通过测定28种酚类化合物发现除了苯酚，SEQID NO：1编码蛋白还可以识别苯酚的结构类似物邻苯二酚，邻甲酚和2-氯酚(见图3)。
本发明确定了SEQ ID NO：1编码蛋白和SEQ ID NO：2序列发生结合作用以启动苯酚羟化酶启动子的表达。SEQ ID NO：1编码蛋白结合于SEQ ID NO：2序列上的位置是苯酚羟化酶起始密码子ATG上游-130到-190位的序列。凝胶阻滞实验证明了SEQ ID NO：1编码蛋白和SEQ ID NO：2序列的结合(见图4)。
本发明的另一方面，还提供了一种产生具有SEQ ID NO：1蛋白质活性的多肽的方法，其步骤如下：
(1)将SEQ ID NO：1可操作地连于表达调控序列，形成SEQ ID NO：1蛋白表达载体；
(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成重组细胞；
(3)在适合表达SEQ ID NO：1蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；
(4)分离出具有SEQ ID NO：1蛋白活性的基本纯的多肽，序列为SEQ ID NO：3，大小为63kDa(见图5)。
上述“可操作地连于”表示如下情况：即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
上述载体可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。
在本发明中，SEQ ID NO：3蛋白或多肽指具有SEQ ID NO：1编码的蛋白活性多肽。该术语还包括具有与天然SEQ ID NO：3的相同功能的变异形式。这些变异形式包括但并不限于若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SEQ IDNO：3蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的SEQ ID NO：3多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与SEQ ID NO：1杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用SEQ ID NO：3多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含SEQ ID NO：3多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括SEQ ID NO：3多肽的可溶性片段。通常，该片段具有SEQ ID NO：3多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“SEQ ID NO：3保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1 氨基酸替换表
 
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) le；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
发明还包括SEQ ID NO：3蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO：3多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
此外，根据本发明的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3同源基因或同源蛋白。
附图说明
图1是SEQ ID NO：1序列编码的蛋白与已报道的NtrC/Xy1R家族成员的同源关系树图。
图2是β-半乳糖苷酶酶活图。表示共转化菌PEMRP-14在苯酚诱导和无苯酚诱导下，苯酚羟化酶启动子测试表达载体上lacZ基因表达的β-半乳糖苷酶酶活情况。
图中纵坐标表示β-半乳糖苷酶酶活量，横坐标代表构建的基因工程菌PEMRP-14和对照菌株PEMRP-0。灰色柱代表没有苯酚诱导时的酶活，黑色柱代表有苯酚诱导时的酶活。
图3是β-半乳糖苷酶酶活图。
图中纵坐标表示β-半乳糖苷酶酶活量，横坐标代表28种不同的酚类化合物，从左到右为：4-甲氧基酚，对甲酚，间甲酚，邻甲酚，对氯酚，对苯二酚，2-甲氧基酚，2，4，6-三[(二甲氨基)甲基]苯酚，2-萘酚，2，5-二硝基酚，3-硝基酚，3-氯酚，4-氨基酚，2-氨基酚，2，3-二甲基酚，2，4-二氯酚，间苯三酚，1-萘酚，4-硝基酚，间苯二酚，2，6-二硝基酚，邻氯苯酚，邻硝基酚，邻苯二酚，对甲氨基酚，3-氨基酚，二甲基亚砜，苯酚，对照样品。
图中可看出，除苯酚外，SEQ ID NO：1编码蛋白还可以识别苯酚结构类似物，包括邻苯二酚，邻甲酚和2-氯酚等酚类化合物。
图4是SDS-PAGE蛋白电泳图。
图中显示了SEQ ID NO：1序列的蛋白表达情况。1和3道是作为对照的原核表达空载体，2，4道是连有SEQ ID NO：1序列的原核表达载体。表达出的蛋白大小约为63kDa。
图5是凝胶阻滞试验证明SEQ ID NO：1编码蛋白可以和SEQ ID NO：2序列结合。
1道是加入SEQ ID NO：3表达蛋白多肽，2道无蛋白。可以看出1道出现明显阻滞带，说明SEQ ID NO：3蛋白和SEQ ID NO：2序列发生结合。
图6是在SEQ ID NO：2序列上逐段截短启动子的示意图。1-357序列所示是SEQ IDNO：2序列。P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10三角图标所指碱基代表逐段截短启动子的起始碱基。
图7是β-半乳糖苷酶酶活图。图中纵坐标表示β-半乳糖苷酶酶活量，横坐标代表大肠杆菌内截短的启动子序列P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，它们序列的起始位置如图6所示。CK代表没有启动子序列的对照菌。灰色柱代表没有苯酚诱导时的酶活，黑色柱代表有苯酚诱导时的酶活。
图8、图9是凝胶阻滞实验检测启动子序列与SEQ ID NO：1编码蛋白的结合效率。P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10代表用于凝胶阻滞检测的启动子序列，它们序列的起始位置如图6所示。CK代表一段与启动子无关的序列和SEQ ID NO：1编码蛋白结合作为对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1  醋酸钙不动杆菌PHEA-2中SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆和序列分析。
本发明用反向PCR方法克隆到位于苯酚羟化酶基因上游的SEQ ID NO：1序列，具体过程如下。用EcoRI(Takala公司)酶切消化5ug醋酸钙不动杆菌PHEA-2染色体DNA，酶切产物T4DNA连接酶(NEB公司)10℃过夜自连，根据已克隆的苯酚羟化酶基因序列设计反向引物，以自连产物为模板扩增出一条3kb的片段，将其回收连入T载体(Takala公司)。测序发现克隆的序列使已知苯酚羟化酶基因序列向上游延伸了1961bp，包含一个完整的开放阅读框1671bp，编码556个氨基酸。通过序列比对发现序列SEQ ID NO：1编码的蛋白SEQ IDNO：3是NtrC/Xy1R家族调控蛋白(见图1)。
实施例2  在大肠杆菌中表达SEQ ID NO：3多肽和全细胞生物感应器的构建。
(一)构建SEQ ID NO：1的原核表达载体。
将SEQ ID NO：1序列两端通过PCR方法导入NdeI和SalI酶切位点，将扩增所得序列用NdeI和SalI(Takala公司)酶切后与相同酶切的表达载体pET28a(NEB公司)连接得到重组表达载体pEMR。
(二)构建SEQ ID NO：2的测试表达载体。
将SEQ ID NO：2序列两端通过PCR方法导入XhoI和PstI酶切位点。将扩增所得序列用XhoI和PstI(Takala公司)酶切后连入用相同酶消化的启动子检测载体pPR9Tt(Pedro Miguel Santos，2001)无启动子的lacZ基因上游，构建得到苯酚羟化酶启动子测试表达载体pPR9P。
(三)全细胞苯酚生物感应器的构建。
将含有SEQ ID NO：1序列的原核表达载体pEMR和含有SEQ ID NO：2的测试表达载体pPR9P共转化入大肠杆菌DH5α(Takala公司)，在含有Km，Ap和Cm的抗性板上筛选同时含有这两个载体的重组子，命名为pEMRP—14。分别在2mM苯酚诱导和无苯酚诱导条件下测定重组子的β-半乳糖苷酶活性，测定方法参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)。转入原核表达空载体的共转化菌(pEMRP—0)作为对照菌株。从图2上可以看出有苯酚比无苯酚诱导时，PEMRP-14β-半乳糖苷酶酶活高约20倍，这说明序列SEQ ID NO：1编码蛋白只有在苯酚诱导时才有活性。PEMRP-0是没有连入SEQ ID NO：1序列的对照菌株，可以看出没有SEQ ID NO：1序列时无论有没有苯酚诱导，β-半乳糖苷酶酶活只有本底表达(详见图2)。这说明SEQ ID NO：2序列的表达依赖SEQ ID NO：1序列和苯酚诱导物的同时存在。该共转化菌可以用作苯酚生物信号感应菌快速检测废水中是否有苯酚污染物存在。
实施例3  共转化菌PEMRP—14感应酚类化合物的范围。
用28种不同的酚类化合物分别作为诱导物诱导PEMRP—14菌，测定β-半乳糖苷酶活性发现苯酚，邻苯二酚，邻甲酚和2-氯酚可以被SEQ ID NO：1编码蛋白识别(图3)。
具体方法如下，挑取新鲜培养的菌落，过夜37度摇菌，次日以1％接种量接入29根LB培养基的试管中，摇到OD600达到0.6左右，每管接入不同的酚类化合物，终浓度0.3mM，继续培养2个小时，取出29种不同样品测β-半乳糖苷酶酶活，测定方法参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)。测定结果显示MphR可以识别苯酚，邻苯二酚，邻甲酚和2-氯酚四种化合物，酶活分别为300U，112U，132U，120U。
实施例4  SEQ ID NO：1编码蛋白的表达。
将表达载体pEMR转化大肠杆菌BL21(DE3)(Promega公司)。将转化子先在LB+Kmr培养基中37℃，200rpm培养至OD600值约0.5，加入IPTG(Sigma公司)(终浓度为0.75mmol/L)后转入15℃诱导蛋白表达，SDS-PAGE电泳检测。
经SDS-PAGE电泳检测，含有pEMR的大肠杆菌BL21(DE3)(Promega公司)在15℃经IPTG诱导10小时后表达出的目的蛋白多数为可溶性蛋白；大小约63kDa，与预测值相符(见图4)。
实施例5 SEQ ID NO：1编码蛋白结合于SEQ ID NO：2序列上。
本发明用凝胶阻滞试验验证了SEQ ID NO：1编码蛋白和SEQ ID NO：2序列的结合。将100ng SEQ ID NO：2序列用digoxigenin-11-ddUTP(DIG)(Roche公司)标记，和1ug纯化的SEQ ID NO：1编码蛋白反应，对照样品不加入蛋白。DNA序列的标记，DNA序列和蛋白的结合反应，非变性PAGE胶电泳，转膜，杂交，显影过程均按照地高辛标记凝胶阻滞试剂盒(DIG gel shift kit；Roche，Mannheim Germany)说明书操作。加入蛋白的样品DNA条带迁移速度明显滞后于无蛋白的DNA样品(1道)，这说明SEQ ID NO：1编码蛋白可以和SEQ ID NO：2序列结合(见图5)。
实施例6  SEQ ID NO：1编码蛋白在SEQ ID NO：2序列上的具体结合位置及其功能。
分析SEQ ID NO：2序列特征，根据NtrC/Xy1R家族调控蛋白结合于启动子上游100bp以上的两个反向重复序列(IR)上的特征，推测SEQ ID NO：1编码蛋白在SEQ IDNO：2序列上的结合位置大约在160到240位处。在启动子上设计引物扩增出不同长度的七个片段P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，起始位点如图6所示，终止位点是一样的，即这七个序列的起始位置不一样。按照实施例2所述方法构建共转化菌，并在苯酚诱导和没有苯酚诱导时测定菌株的β-半乳糖苷酶酶活，结果如图7所示，当启动子截到P6时β-半乳糖苷酶酶活迅速降低，到P7时几乎没有β-半乳糖苷酶酶活。而P6和P7已经截到反向重复序列(IR)内部，这说明SEQ ID NO：1编码蛋白结合区域的完整性对SEQ ID NO：2序列启动子活性影响很大。
图8和图9检测逐段截短的SEQ ID NO：2序列是否能和SEQ ID NO：1编码蛋白结合，将P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10序列分别和SEQ ID NO：1编码蛋白进行凝胶阻滞实验，具体方法如实施例5所述，从图8、图9中可以看出当反向重复序列逐段截短后SEQ ID NO：1编码蛋白和序列的结合能力逐渐降低，P9和SEQ ID NO：1编码蛋白完全不结合。这说明两个反向重复序列(IR1和IR2，170～230)是SEQ ID NO：1编码蛋白在SEQ ID NO：2序列上的结合位点，当IR1和IR2(170～230)缺失后SEQ ID NO：2序列和SEQ ID NO：1编码蛋白失去结合能力。
SEQUENCE LISTING
<110>中国农业科学院生物技术研究所
<120>苯酚降解调控基因及其作用的启动子
<130>08-01
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1671
<212>DNA
<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)PHEA-2
<400>1
Figure A200810101802D00151
<210>2
<211>357
<212>DNA
<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)PHEA-2
<400>2
<210>3
<211>556
<212>PRT
<213>醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)PHEA-2
<400>3
Figure A200810101802D00171
Figure A200810101802D00181
Figure A200810101802D00201

Claims (10)

1.一种调控苯酚降解的DNA序列，如SEQ ID NO：1所示。
2.一种苯酚降解调控蛋白，由权利要求1所述DNA序列编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.权利要求1所述的DNA序列或权利要求2所述的氨基酸序列在识别酚类化合物方面的应用。
4.一种苯酚羟化酶基因启动子的DNA序列，如SEQ ID NO：2所示。
5.一种苯酚羟化酶基因启动子的DNA序列，其序列为SEQ ID NO：2序列中的第170～230位。
6.权利要求4或5所述的DNA序列在酚类化合物的生物治理和监控方面的应用。
7.权利要求4所述的DNA序列在酚类化合物的生物治理和监控方面的应用，其特征为所述DNA序列中的第170～230位与SEQ ID NO：3的氨基酸序列有功能的结合。
8.包含SEQ ID NO：1所述的DNA和/或包含SEQ ID NO：4所述的DNA序列的重组载体。
9.用权利要求8所述的重组载体转化的宿主细胞。
10.权利要求8所述重组载体在构建全细胞酚类化合物生物感应器的应用。
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