CN105238716A - 一株摩根菌及其在微生物燃料电池中的应用 - Google Patents

Abstract

一株摩根菌及其在微生物燃料电池中的应用，涉及海洋微生物。摩根菌(Morganella？sp.)DS4020，保藏中心登记入册编号为CCTCC？NO：M？2015584。摩根菌(Morganella？sp.)DS4020可在制备微生物燃料电池中应用。摩根菌(Morganella？sp.)DS4020是来自深海的产电菌，该菌株具有较强的电化学活性，能在较宽的pH(5～10)、温度(4～40℃)、NaCl浓度(0～9％)范围生长，并且利用多种碳源产电。摩根菌(Morganella？sp.)DS4020有着很强的环境适应性，能在高盐、低温条件下降解有机废水并产生清洁的电能。

Description

一株摩根菌及其在微生物燃料电池中的应用

技术领域

本发明涉及海洋微生物，尤其是涉及来自深海的具有产电能力的一株摩根菌及其在微生物燃料电池中的应用。

背景技术

微生物代谢有机物产生的电子，由于受到细胞膜的阻隔，无法直接传递给电极，因此传统的微生物燃料电池，需要添加人工电子介体，通过介体在细胞和电极之间的穿梭传递电子，实现微生物燃料电池产电。但是，人工电子介体价格昂贵、容易流失并且大部分人工电子介体有生物毒性，因此，微生物燃料电池的性能受到极大限制。

产电微生物大约在2000年由韩国科学家Kim等首次被发现，是一种功能性的微生物。它具有独特的胞外电子传递途径，不需添加人工电子介体，能实现有机物的化学能直接转化为电能。这种以产电微生物为催化剂的新型微生物燃料电池，在清洁能源生产、污染治理、环境修复等方面有重要的应用。

与其他燃料电池相比，如氢燃料电池，微生物燃料电池其特点在于：阳极是生物催化反应，微生物作为催化剂；而阴极通常与氢燃料电池类似，其化学反应为，氧气作为还原剂的非生物催化反应。因此，高活性的产电微生物是新一代微生物燃料电池的关键。

目前人类获得的产电微生物，主要属于Geobacter、Shewanella等细菌属。并且，主要来源于陆地环境；来自海洋的，特别是来自深海的产电微生物比较稀缺。海洋占地球表面积的70％以上，目前人类探明的生物菌种资源，只占海洋生物资源的千分之一，陆地生物资源的百分之一左右。也就是说，海洋生物资源开发是人类获取新的生物资源的重要发展方向。关于深海产电微生物资源开发利用，目前在国内还处于起步阶段。

发明内容

本发明的目的在于针对目前大多数产电菌来自于陆地以及近海的现状，提供来自深海的一株摩根菌及其在微生物燃料电池中的应用。

所述摩根菌(Morganellasp.)DS4020已于2015年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏中心登记入册编号为CCTCCNO：M2015584。

所述摩根菌(Morganellasp.)DS4020来自印度洋4020m的深海沉积物。经过微生物燃料富集和厌氧滚管技术分离得到。该菌株为兼性厌氧菌、杆状、长约2μm、宽0.7～0.8μm、有鞭毛、革兰氏阴性。有较宽的pH(5～10)、温度(4～40℃)、NaCl浓度(0～9％)生长范围。该菌的显著特征为具有电催化活性，即还原微生物燃料电池的阳极。它的GenBank的16SrRNA登录号为HQ876209。

摩根菌是一种革兰氏阴性、兼性厌氧或者好氧生物的细菌。目前，Morganella属经系统命名的种，只有两个种，分别为Morganellamorganii(典型株：ATCC25830)和Morganellapsychrotolerans(典型株：DSM17886)。到目前为止，未有能产电的摩根菌的报道。该菌具有独特的胞外电子传递途径，能将代谢有机物或有机废物产生的电子传递给微生物燃料电池的阳极，实现有机物的降解并产生电能。所述摩根菌(Morganellasp.)DS4020能在0～8％NaCl浓度下产电。

由此可见，摩根菌(Morganellasp.)DS4020可在制备微生物燃料电池中应用。

所述微生物燃料电池是质子交换膜间隔的双室微生物燃料电池，阳极为碳毡，阴极为浸没式载铂阴极。或者单室微生物燃料电池，阳极为碳毡，阴极为载铂空气阴极。

所述摩根菌(Morganellasp.)DS4020在制备微生物燃料电池中的应用，具体包括如下步骤：

1)将摩根菌(Morganellasp.)DS4020接种于培养基中，再通入氮气排除培养基中的溶解氧，密闭后摇床培养，到对数期末期；

2)将步骤1)所述培养基高温灭菌后加入微生物燃料电池的阳极室，微生物燃料电池的阳极室包括阳极、电解液和摩根菌(Morganellasp.)DS4020，电解液为步骤1)所述培养基，摩根菌悬浮生长在电解液中，或附着在阳极表面；

3)接种后，通入无氧氮气排除阳极室内的氧气后密闭，进行厌氧培养。

在步骤1)中，所述摇床的转速可为100r/min，培养的温度可为30℃；所述培养基的组成包括有机物或有机废水，以及氮源、无机盐、pH缓冲液和微量元素，所述有机物可选自乳酸、甲酸、丙酮酸、葡萄糖、蔗糖等中的至少一种，有机物或有机废水的质量浓度可为100～30000mg/LCOD；所述氮源可为无机氮源或有机氮源，所述无机氮源的质量浓度可为0.2～5g/L，无机氮源可选自氯化铵、硫酸铵等中的一种，所述有机氮源的质量浓度可为0.2～5g/L，有机氮源可选自酵母膏、蛋白胨等中的一种；所述无机盐可选自钠盐、钾盐等中的一种，无机盐的质量浓度可为0.2～80g/L；所述pH缓冲液可采用磷酸缓冲盐或碳酸缓冲盐，pH缓冲液可采用摩尔浓度为20～100mmol/LpH7.0的磷酸缓冲当量；所述微量元素的体积浓度可为5～20ml/L，微量元素的组成包括(g/L)：FeSO₄·7H₂O0.1g/L；CoCl₂·6H₂O0.1g/L；CaCl₂·2H₂O0.1g/L；ZnSO₄·7H₂O0.1g/L；CuSO₄·5H₂O0.01g/L；AlK(SO₄)₂·12H₂O0.01g/L；H₃BO₃0.01g/L；Na₂MoO₄·2H₂O0.01g/L；Na₂SeO₃0.01g/L；NiCl₂·6H₂O0.01g/L；Na₂WO₄·2H₂O0.01g/L。

在步骤2)中，所述培养基的加入量按质量百分比可为步骤1)中的预培养物的1％～20％。

在步骤3)中，所述厌氧培养的温度可为30℃。

本发明与现有技术相比的优点是：摩根菌(Morganellasp.)DS4020是来自深海的产电菌，该菌株具有较强的电化学活性，能在较宽的pH(5～10)、温度(4～40℃)、NaCl浓度(0～9％)范围生长，并且利用多种碳源产电。这些特性表明摩根菌(Morganellasp.)DS4020有着很强的环境适应性，能在高盐、低温条件下降解有机废水并产生清洁的电能。这种应用既能获得清洁的电能，又能处理有机废水。

附图说明

图1为摩根菌(Morganellasp.)DS4020的菌落形态。

图2为摩根菌(Morganellasp.)DS4020的菌落形态电镜图。

图3为摩根菌(Morganellasp.)DS4020的产电能力验证。

图4为摩根菌(Morganellasp.)DS4020的产电机理(循环伏安分析)。

图5为摩根菌(Morganellasp.)DS4020的产电机理(重复产电分析)。

图6为摩根菌(Morganellasp.)DS4020利用不同碳源产电分析。

图7为摩根菌(Morganellasp.)DS4020在高盐下的产电分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体描述，但本发明的实施方式不限于此，对于为特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

一、摩根菌(Morganellasp.)DS4020的筛选

(1)预备接种物。中国大洋一号科考船在印度洋水深4020m处采集的深海沉积物。样品呈白色，有烟囱体碎片和珊瑚等大型生物的残体，筛选产电菌之前，样品冻存于-20℃冰箱。在超净台中，取少量海底污泥于50mL离心管中，加入适量的M6稀释污泥，超声混合均匀，离心去除固体颗粒，上清液为接种物。M6基础液，包括(g/L)：19.89NaCl,0.745KCl,0.35NaH₂PO₄,0.44Na₂HPO₄and0.188MgSO₄,微量元素10mL，pH6.8～7.0，微量元素成分如下(g/L)：FeSO₄·7H₂O0.1；CoCl₂·6H₂O0.1；CaCl₂·2H₂O0.1；ZnSO₄·7H₂O0.1；CuSO₄·5H₂O0.01；AlK(SO₄)₂·12H₂O0.01；H₃BO₃0.01；Na₂MoO₄·2H₂O0.01；Na₂SeO₃0.01；NiCl₂·6H₂O0.01；Na₂WO₄·2H₂O0.01。

(2)微生物燃料电池构造及电流采集系统，采用双室微生物燃料电池，阳极室、阴极室的体积为420mL，两室之间各有一带球形法兰的短侧管，内径20mm。法兰之间夹一Nafion117质子交换膜，用不锈钢平行夹夹紧。两室及侧管均为一体化的玻璃容器，顶部为螺纹接口，通过聚四氟乙烯盖密封。盖上有通气孔、导线孔以及取样孔。阳极、阴极均采用高纯石墨块作为电极，并用钛导线连接到阳极室外。外电路接一个510欧姆电阻，电阻两端连接到Kethley2700多通道电压测定仪。电脑控制Kethley2700数据采集的方式并保存采集到的数据，得到随时间变化的电压曲线。电流的计算方法：I＝U/R，其中U为采集到的电压，R为外电阻。

(3)微生物燃料电池法富集产电菌。阳极室、阴极室以及顶盖等高温灭菌后在无菌操作台上组装成为双室微生物燃料电池。加入高温灭菌后的M6溶液到阴极室、阳极室。加入浓度分别为乳酸钠、乙酸钠溶液到阳极室，他们的最终浓度均为20mmol/L；加入单独灭菌的氯化铵到阳极室，最终浓度为1.5g/L。给阴极室通适量空气，给阳极室通适量的高纯氮气除氧。运行两套完全相同的微生物燃料电池。向其中一套微生物燃料电池的阳极室加入10mL的步骤1准备的接种物。经过一段延滞期后，电压随时间不断上升并达到一个较稳定的数值。移动微生物燃料电池到无菌操作台，在高纯氮气的保护下，取出石墨阳极。石墨电极浸没于无氧的M6溶液，无氧气体保护下超声移除电极表面的微生物到溶液中。该溶液作为接种物，接种于新的微生物燃料电池的阳极室，进行新一轮的产电菌富集。

(4)厌氧滚管分离产电菌。用于滚管的培养基为1L的M6添加1.0g酵母膏，20mmol乳酸钠，20mmol乙酸钠，20mmol柠檬酸铁，琼脂1.5％，pH6.8按典型的厌氧滚管步骤，在厌氧条件下将培养基附着在厌氧管内壁，然后将富集物梯度稀释后，二次滚管涂布于厌氧管内壁。挑取单个菌落到滚管培养基，进一步分离纯化，一直到所有菌落的形态、颜色一致。结果得到多个纯培养物。其中一株具有高产电活性的摩根菌(Morganellasp.)DS4020，其形态如图1和2所示。

(5)菌种鉴定和产电活性验证分析。形态分析结果表明，该菌株为兼性厌氧菌、杆状、长约2μm、宽0.7～0.8μm、有鞭毛、革兰氏阴性。能利用乳酸、葡萄糖、蔗糖、甘露糖等多种碳源甚至有机废水。在pH5～10、温度4～40℃、NaCl浓度0～9％的条件下生长，体现了该菌来自海洋的特点。将摩根菌(Morganellasp.)DS4020纯培养物接种到步骤3的阳极室，进行产电测试。测试方法：微生物燃料电池，阳极、阴极为尺寸相同的高纯石墨电极，电极尺寸60mm×30mm×10mm。阴极室电解液为M6溶液，阳极室的电解液为M6溶液，外加20～50mmol的乳酸钠、1.5g/L的氯化铵。测试结果表明：在培养基中不添加任何的人工电子介体条件下，该菌能长期产电，如图3所示。该菌16SrRNA测序信息提交GenBank，登录号为HQ876209。通过16SrRNA的同源性分析表明，该菌与摩根菌的Morganellamorganii(ATCC25830)相似性达到100％。但是，目前摩根菌属只有两种经过系统命名的菌种，而且未见能具有产电能力的摩根菌报道。因此，暂时将该菌命名为摩根菌(Morganellasp.)DS4020。

实施例2

本实施例公开摩根菌(Morganellasp.)DS4020的胞外电子传递特性。如实施例1所陈述，将摩根菌(Morganellasp.)DS4020接种到微生物燃料电池的阳极室，运行微生物燃料电池一直到电压达到最大值并保持稳定。取出石墨阳极放入电解池进行循环伏安扫描分析。恒电位仪采用CHI660E)，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极(10mm×20mm)为辅助电极。扫描电压-0.6～0.8V，扫描速率100mV/s梯度扫描，结果如图4所示。图4中的阳极液的循环伏安测试方法如下：当微生物燃料电池的电压达到最大值并保持稳定，倒出阳极液，高速离心去除阳极液中的细胞，获得上清液，上清液加入到电解池，进行循环伏安测量。

根据文献报道，产电微生物主要包括三种电子传递方式：细胞外膜色素的胞外电子传递途径，细胞外膜上纳米导线的胞外电子传递途径，以及通过分泌可溶性电子介体，通过电子介体在细胞与阳极之间穿梭传递电子的途径。从图4看，阳极液没有明显氧化还原活性，说明摩根菌(Morganellasp.)DS4020主要通过外膜细胞色素或纳米导线传递电子。

图5公开了摩根菌(Morganellasp.)DS4020胞外电子传递的另外一种测试结果。按实施例1接种摩根菌(Morganellasp.)DS4020，并运行微生物燃料电池一直到电压达到最大值并保持基本恒定。在高纯氮气的保护下，将微生物燃料电池阳极室的电解液，彻底倒出来。并且，用高温灭菌M6溶液清洗阳极室。然后，加入高温灭菌M6，保持电压基线基本稳定后，加入5mmol的乳酸钠。结果表明，微生物燃料电池的电压迅速上升，达到电解液移除之前的电压并保持恒定。运行一段时间，再次移除阳极室的电解液，加入5mmol的乳酸，得到相同的结果。当阳极室的电解液倒出并加入新的M6溶液，分泌到电解液中的电子介体也被移除。移除电解液实验结果也证明，摩根菌(Morganellasp.)DS4020胞外电子传递，主要是由附着在阳极表面的细胞，通过细胞外膜色素以及纳米导线，实现胞外电子传递的。结合图4和5的结果，说明深海产电菌主要依赖直接电子传递方式，而非分泌电子介体的电子传递方式。

实施例3

本实施例公开深海产电菌利用不同碳源的产电特性。测试按实施例1中的步骤5。库伦效率的计算方法公式：其中，Cp表示一段时间内获得的总电量，Cn表示理论上氧化底物转移的总电。,其中，i为电流，N为底物氧化的电子转移数，n(mmol/L)为底物浓度，V(L)为阳极室溶液量。实验结果表明，摩根菌(Morganellasp.)DS4020能利用甲酸、葡萄糖、丙酮酸、乳酸、甘露糖、蔗糖等产电，但产电的库伦效率有差别。其中，以甲酸、乳酸效率最高，几乎达到100％，丙酮酸、甘露糖、蔗糖的转化效率比较低。本实施例公开的是摩根菌(Morganellasp.)DS4020在双室微生物燃料电池中的产电特性，旨在公开该菌利用多种碳源的产电能力。所使用的微生物燃料电池及其工艺不是最优化的，目前已经有很多公开报道展示了，通过改进电极、反应器结构，如采用单室微生物燃料电池，能显著提高产电菌的产电能力。

实施例4

本实施例公开摩根菌(Morganellasp.)DS4020在高盐浓度下的产电特性。采用实施例1的步骤5的方法和微生物燃料电池装置，只是M6溶液中的NaCl浓度发生改变。库伦效率采用实施例3中的计算方法，结果如图7所示。结果表明产电菌能在1％～8％NaCl浓度产电。随着NaCl浓度深奥，最高稳E定的产电电压、库伦效率，先逐渐升高然后下降。当M6的NaCl浓度为6％，乳酸作为碳源时，电压最高达到220mV左右，库伦效率98％。本实施例公开NaCl浓度对产电及库伦效率的影响。所使用的微生物燃料电池及其工艺不是最优化的，目前已经有很多公开报道，通过改进电极、反应器结构，如采用单室微生物燃料电池，能显著提高产电菌的产电能力。盐浓度可明显抑制微生物生长，来自海洋的或者其他咸水环境的微生物，能在较高的盐度生长。本实施例说明具有高盐度下生长并产电的特性，在高盐度废水并产电等方面有应用潜力。

Claims (10)

1.摩根菌(Morganellasp.)DS4020，已于2015年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心登记入册编号为CCTCCNO：M2015584。

2.如权利要求1所述摩根菌(Morganellasp.)DS4020在制备微生物燃料电池中应用。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述微生物燃料电池是质子交换膜间隔的双室微生物燃料电池，阳极为碳毡，阴极为浸没式载铂阴极；或者是单室微生物燃料电池，阳极为碳毡，阴极为载铂空气阴极。

4.如权利要求2所述应用，其特征在于所述摩根菌(Morganellasp.)DS4020在制备微生物燃料电池中的应用，具体包括如下步骤：

1)将摩根菌(Morganellasp.)DS4020接种于培养基中，再通入氮气排除培养基中的溶解氧，密闭后摇床培养，到对数期末期；

2)将步骤1)所述培养基高温灭菌后加入微生物燃料电池的阳极室，微生物燃料电池的阳极室包括阳极、电解液和摩根菌(Morganellasp.)DS4020，电解液为步骤1)所述培养基，摩根菌悬浮生长在电解液中，或附着在阳极表面；

3)接种后，通入无氧氮气排除阳极室内的氧气后密闭，进行厌氧培养。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于在步骤1)中，所述摇床的转速为100r/min，培养的温度为30℃。

6.如权利要求4所述应用，其特征在于在步骤1)中，所述培养基的组成包括有机物或有机废水，以及氮源、无机盐、pH缓冲液和微量元素。

7.如权利要求6所述应用，其特征在于在步骤1)中，所述有机物选自乳酸、甲酸、丙酮酸、葡萄糖、蔗糖中的至少一种，有机物或有机废水的质量浓度可为100～30000mg/LCOD。

8.如权利要求6所述应用，其特征在于在步骤1)中，所述氮源为无机氮源或有机氮源，所述无机氮源的质量浓度可为0.2～5g/L，无机氮源可选自氯化铵、硫酸铵中的一种，所述有机氮源的质量浓度可为0.2～5g/L，有机氮源可选自酵母膏、蛋白胨中的一种；所述无机盐可选自钠盐、钾盐等中的一种，无机盐的质量浓度可为0.2～80g/L；所述pH缓冲液可采用磷酸缓冲盐或碳酸缓冲盐，pH缓冲液可采用摩尔浓度为20～100mmol/LpH7.0的磷酸缓冲当量；所述微量元素的体积浓度可为5～20ml/L，微量元素的组成包括：FeSO₄·7H₂O0.1g/L；CoCl₂·6H₂O0.1g/L；CaCl₂·2H₂O0.1g/L；ZnSO₄·7H₂O0.1g/L；CuSO₄·5H₂O0.01g/L；AlK(SO₄)₂·12H₂O0.01g/L；H₃BO₃0.01g/L；Na₂MoO₄·2H₂O0.01g/L；Na₂SeO₃0.01g/L；NiCl₂·6H₂O0.01g/L；Na₂WO₄·2H₂O0.01g/L。

9.如权利要求4所述应用，其特征在于在步骤2)中，所述培养基的加入量按质量百分比为步骤1)中的预培养物的1％～20％。

10.如权利要求4所述应用，其特征在于在步骤3)中，所述厌氧培养的温度为30℃。