CN102382785A - 摩氏摩根菌及在制备(s)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种摩氏摩根菌ZJB09203(Morganella morganii ZJB09203)及其在微生物转化制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，所述应用为：以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以摩氏摩根菌ZJB09203培养获得的酶为酶源，20～45℃下，调节pH值至6.5～9.0，于水中转化反应4～48h，转化液分离纯化制得(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸；本发明摩氏摩根菌ZJB09203新菌株稳定性好，能够耐受高浓度的底物和产物，且立体选择性严格，产物光学纯度大于95％。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种微生物新菌株及其应用，特别涉及一种摩氏摩根菌ZJB09203(Morganella morganii ZJB09203)及在制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。
(二)背景技术
(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的化学结构如式(I)所示。(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸脱羧生成(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，再经水解和加氢还原等2步反应即可合成普瑞巴林。普瑞巴林化学名为(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是γ-氨基丁酸(GABA)的三位异丁基取代物，通过调节钙通道减少钙离子进入神经末梢，减少谷氨酸和去甲肾上腺素等兴奋性神经递质的过度释放。由于神经病理性疼痛、癫痫均与神经元过度兴奋、神经递质释放增加相关，普瑞巴林能够有效抑制该过程，从而产生治疗作用。与扑痫酮、卡马西平、苯妥英钠等传统神经病理性疼痛和癫痫治疗药物相比，普瑞巴林具有剂量低、副作用小、持续时间长和耐受性强等显著优势。
美国辉瑞公司Martinez等(Organic Process Research&Development，2008，12，392-398)报道了一系列能够选择性拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的脂肪酶、酯酶和蛋白酶等，其中Novozymes商品化脂肪酶Lipolase选择性水解效果最好。与普瑞巴林第一代全化学合成工艺相比，引入酶催化工艺后，每年可节省超过1000万加仑醇类有机溶剂和2000吨手性扁桃酸、2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯和金属镍等原材料(Current Opinion in Chemical Biology，2009，13，43-50)。但是由于采用商品化酶，该工艺生产成本高。浙江大学杨立荣等(CN 101985609)公开了利用假单胞菌CGMCC No.4184(Pseudomonas sp.CGMCC No.4184)R-选择性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯合成(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的方法。该工艺需进一步限制性水解(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，且难以实现2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的消旋回用。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种新菌株——摩氏摩根菌ZJB09203，及其在微生物转化制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，该菌株稳定性好，立体选择性严格，产物光学纯度高。
本发明采用的技术方案是：
摩氏摩根菌ZJB09203(Morganella morganii ZJB09203)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2011年5月19日，保藏编号CCTCC M 2011175。
本发明所述摩氏摩根菌ZJB09203是通过以下程序筛选得到的：
1)将由浙江、江苏、山东等地采回的土壤和污水样品加入生理盐水中，制成土壤悬液并接种到富集培养基，在30℃，180rpm的摇床上培养4天。待培养基变浑浊后，取1ml培养液转接到新鲜的富集培养基中，再培养4天。如此重复3～4个循环。富集培养基成分为(g/L)：2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯1.0～3.5，硫酸铵2.0～5.0，硫酸镁0.1～0.3，硫酸亚铁0.02～0.05，氯化钠0.4～1.0，磷酸二氢钾1.0～2.0，磷酸氢二钾1.5～2.5，pH 6.0～8.0，溶剂为水；
2)最后一次富集培养液稀释后涂布到平板培养基上，30℃培养2～3天，挑取单菌落接种至斜面培养基保藏。平板培养基为富集培养基中加入1.5％～2.0％的琼脂，斜面培养基成分为(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，溶剂为水；
本发明所述摩氏摩根菌ZJB09203(Morganella morganii ZJB09203)菌株的鉴定：
a)菌株形态特征和生理生化特征：
1)形态特征：短杆菌，两端钝圆，无芽孢，无荚膜，直径0.6～0.7μm，长1.0～1.7μm，菌落呈乳白色半透明状、无光泽、圆形、边缘整齐、表面光滑、湿润。
2)生理生化特征：革兰氏阴性，氧化酶阴性，脲酶阳性，见表1所示。
表1摩氏摩根菌ZJB09203的生理生化特征
| 性状 | 结果 | 性状 | 结果 | 性状 | 结果 |
| 革兰氏染色(24h) | - | 明胶液化(22℃) | - | 七叶灵水解 | - |
| 氧化酶(24h) | - | V-P | - | D-木糖产酸 | - |
| 丙二酸利用 | - | 乙酸盐利用 | - | 海藻糖产酸 | - |
| D-阿东醇产酸 | - | 葡萄糖产酸 | + | 蔗糖产酸 | - |
| 甘油产酸 | - | 纤维二糖产酸 | - | D-山梨醇产酸 | - |
| 卫矛醇产酸 | - | D-甘露醇产酸 | - | L-鼠李糖产酸 | - |
| 乳糖产酸 | - | 麦芽糖产酸 | - | 棉籽糖产酸 | - |
| D-甘露糖产酸 | + | 蜜二糖产酸 | - | α-甲基-D-葡萄糖苷产酸 | - |
(“+”表示阳性，“-”表示阴性)
b)菌株16S rDNA序列测定：
以8F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCGA-3’)和1510R(5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’)为上、下游引物扩增菌株的16S rRNA序列，由生工生物工程(上海)有限公司测定其16S rDNA序列为：
TAGAGTTTGA TCCTGGCTCA GATTGAACGC TGGCGGCAGG CCTAACACAT GCAAGTCGGG 60
CGGTAACAGG GAGAAGCTTG CTTCTCTGCT GACGAGCGGC GGACGGGTGA GTAATGTATG 120
GGGATCTGCC TGATGGAGGG GGATAACTAC TGGAAACGGT AGCTAATACC GCATAATGTC 180
TCCGGACCAA AGCGGGGGAC CTTCGGGCCT CGCACCATCA GATGAACCCA TATGGGATTA 240
GCTTGTAGGT GAGGTAACGG CTCACCTAGG CGACGATCCC TAGCTGGTCT GAGAGGATGA 300
TCAGCCACAC TGGGACTGAG ACACGGCCCA GACTCCTACG GGAGGCAGCA GTGGGGAATA 360
TTGCACAATG GGCGCAAGCC TGATGCAGCC ATGCCGCGTG TATGAAGAAG GCCTTCGGGT 420
TGTAAAGTAC TTTCAGTCGG GAGGAAGGTG TTAAGGTTAA TAACCTTGAC AATTGACGTT 480
ACCGACAGAA GAAGCACCGG CTAACTCCGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GGAGGGTGCA 540
AGCGTTAATC GGAATTACTG GGCGTAAAGC GCACGCAGGC GGTTGATTGA GTCAGATGTG 600
AAATCCCCGG GCTTAACCCG GGAATTGCAT CTGATACTGG TCAGCTAGAG TCTTGTAGAG 660
GGGGGTAGAA TTCCATGTGT AGCGGTGAAA TGCGTAGAGA TGTGGAGGAA TACCGGTGGC 720
GAAGGCGGCC CCCTGGACAA AGACTGACGC TCAGGTGCGA AAGCGTGGGG AGCAAACAGG 780
ATTAGATACC CTGGTAGTCC ACGCTGTAAA CGATGTCGAC TTGGAGGTTG TGCCCTTGAG 840
GCGTGGCTTC CGGAGCTAAC GCGTTAAGTC GACCGCCTGG GGAGTACGGC CGCAAGGTTA 900
AAACTCAAAT GAATTGACGG GGGCCCGCAC AAGCGGTGGA GCATGTGGTT TAATTCGATG 960
CAACGCGAAG AACCTTACCT ACTCTTGACA TCCAGAGAAC TTAGCAGAGA TGCTTTGGTG 1020
CCTTCGGGAA CTCTGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTT GTGAAATGTT 1080
GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT ATCCTTTGTT GCCAGCGCGT GATGGCGGGA 1140
ACTCAAAGGA GACTGCCGGT GATAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGTC AAGTCATCAT 1200
GGCCCTTACG AGTAGGGCTA CACACGTGCT ACAATGGCGT ATACAAAGGG AAGCGACCCT 1260
GCGAAGGCAA GCGGAACTCA TAAAGTACGT CGTAGTCCGG ATTGGAGTCT GCAACTCAAC 1320
TCCATGAAGT CGGAATCGCT AGTAATCGTA GATCAGAATG CTACGGTGAA TACGTTCCCG 1380
GGCCTTGTAC ACACCGCCCG TCACACCATG GGAGTGGGTT GCAAAAGAAG TAGGTAGCTT 1440
AACCTTCGGG AGGGCGCTTA CCACTTTGTG ATTCATGACT GGGGTGAAGT CGCAACAAGG 1500
TAACCGTAGG GGAACCTGCG GCTGGATCAC CTCCTTA 1537
所述菌株的16S rDNA序列与Morganella morganii 3D4A相比，同源性99％，因此根据菌株生理生化特征及序列，将菌株鉴定为摩氏摩根菌，命名为摩氏摩根菌ZJB09203。
另一方面，本发明还涉及所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物转化制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。
进一步，所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物转化制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用为：以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以摩氏摩根菌ZJB09203培养获得的酶为酶源，20～45℃下，调节pH值至6.5～9.0，于水中转化反应4～48h，得转化液分离纯化制得(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，所述摩氏摩根菌ZJB09203以湿菌体质量计为50～200g/L水，所述底物初始浓度为10～300g/L水。
优选，所述酶源为摩氏摩根菌ZJB09203含菌细胞菌悬液。
所述反应液经离心去除菌体和未反应的底物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，含产物(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的上清液经加热脱羧制得普瑞巴林的另一关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。
优选的，所述生物催化反应体系调节pH值至6.5～9.0所用的酸性物质包括但不限于：①1mol/L盐酸水溶液、②1mol/L硫酸水溶液、③1mol/L醋酸水溶液、④1mol/L磷酸水溶液、⑤1mol/L硝酸水溶液或⑥1mol/L硼酸水溶液；调节pH所用的碱性物质包括但不限于：①1mol/L氢氧化钠水溶液、②1mol/L氢氧化钙水溶液、③1mol/L氢氧化钾水溶液、④1mol/L氢氧化镁水溶液或⑤1mol/L碳酸钙水溶液。
进一步，所述摩氏摩根菌ZJB09203含菌细胞菌悬液按以下步骤获得：(1)斜面培养：将摩氏摩根菌ZJB09203接种于斜面培养基，20～42℃培养16～48h，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，溶剂为水；(2)种子培养：用接种环从斜面挑取一环菌体接种于种子培养基，25～37℃培养14～35h，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成(g/L)为：葡萄糖8～25，牛肉膏10～18，蛋白胨6～16，氯化钠1～4，磷酸氢二钾1.0～3.0，磷酸二氢钾1.0～3.0，自然pH值，溶剂为水；(3)发酵培养：将种子液以接种量3～15％接种至发酵培养基，摇瓶装液量10～30％，培养温度20～40℃，摇床转速100～300rpm，培养时间为48～72h，获得含细胞发酵液，发酵液离心分离，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤，收集湿菌体并悬浮于纯水中，获得所述摩氏摩根菌ZJB09203含菌细胞菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成(g/L)为：葡萄糖5～20，酵母粉5～15，蛋白胨5～10，氯化钠1～5，磷酸氢二钾0.5～2.0，磷酸二氢钾0～2.0，硫酸镁0.1～0.5，橄榄油1～3，pH 6.0～8.5，溶剂为水。
具体的，优选所述摩氏摩根菌ZJB09203在微生物转化制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用按以下步骤进行：以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以摩氏摩根菌ZJB09203含菌细胞菌悬液为酶源，25～36℃下，pH值7.0～8.5，于纯水中转化反应14～36h，转化液离心分离除去菌体和残留的底物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，取上清液在80℃下回流加热进行脱羧反应5h，冷却至室温，离心，取上层物质(上层浅黄色油状液体)，干燥，制得普瑞巴林的另一关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，所述底物初始浓度为100～250g/L水，所述摩氏摩根菌ZJB09203以湿菌体质量计为80～200g/L水。
本发明摩尔转化率和产物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸光学纯度(对映体过量值(ee％))的测定：
反应结束后，取转化液离心分离，上清液经乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥、过滤后用于色相色谱分析，分析条件为BGB-174手性毛细管气相色谱柱，载气为高纯氦气，流量1.0mL/min，进样量1.0μL，分流比50∶1；进样口温度220℃，检测器温度250℃，柱温160℃；手性柱可检测(R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯、(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯、(R)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸和(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸4种单体的含量，进一步计算出反应的摩尔转化率和2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的对映体过量值(ee％)。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种摩氏摩根菌ZJB09203新菌株，该新菌株的稳定性好，能够耐受高浓度的底物和产物，且立体选择性严格，当转化率接近50％时，产物ee值达95％以上；摩氏摩根菌ZJB09203新菌株制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的过程反应条件温和，可大幅减少有机溶剂使用，环境友好，产物具有立体选择性、光学度高；因此，本发明提供了一种高效、廉价的工业化生产普瑞巴林关键手性中间体(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的新方法。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1菌种筛选及菌株鉴定
1)菌株筛选
在9.0mL 0.85％的生理盐水中加入0.5g采自江苏(江苏科技大学)、浙江(浙江工业大学)、山东(山东农业大学)周围的土样，混匀使成均匀土壤悬液；吸取1.0mL的土壤悬液接种到装有20mL富集培养基的250mL三角摇瓶中，在30℃，180rpm的摇床上培养4天。等富集液出现浑浊后，取1ml培养液转接到新鲜的富集培养基中，再培养4天。如此重复3～4个循环后，将富集液稀释多个梯度，涂布到分离平板上，获得单菌落。
富集培养基以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为唯一碳源，成分为(g/L)：2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯2.0，硫酸铵5.0，硫酸镁0.3，硫酸亚铁0.02，氯化钠1.0，磷酸二氢钾1.5，磷酸氢二钾1.5，自来水配置，pH 7.0；平板培养基为富集培养基中加入1.5％～2.0％的琼脂；
2)菌株鉴定
a)菌株形态特征和生理生化特征：
形态特征：短杆菌，两端钝圆，无芽孢，无荚膜，直径0.6～0.7μm，长1.0～1.7μm，菌落呈乳白色半透明状、无光泽、圆形、边缘整齐、表面光滑、湿润。
生理生化特征：革兰氏阴性，氧化酶阴性，脲酶阳性，见表1所示。
表1摩氏摩根菌ZJB09203的生理生化特征
| 性状 | 结果 | 性状 | 结果 | 性状 | 结果 |
| 革兰氏染色(24h) | - | 明胶液化(22℃) | - | 七叶灵水解 | - |
| 氧化酶(24h) | - | V-P | - | D-木糖产酸 | - |
| 丙二酸利用 | - | 乙酸盐利用 | - | 海藻糖产酸 | - |
| D-阿东醇产酸 | - | 葡萄糖产酸 | + | 蔗糖产酸 | - |
| 甘油产酸 | - | 纤维二糖产酸 | - | D-山梨醇产酸 | - |
| 卫矛醇产酸 | - | D-甘露醇产酸 | - | L-鼠李糖产酸 | - |
| 乳糖产酸 | - | 麦芽糖产酸 | - | 棉籽糖产酸 | - |
| D-甘露糖产酸 | + | 蜜二糖产酸 | - | α-甲基-D-葡萄糖苷产酸 | - |
(“+”表示阳性，“-”表示阴性)
b)16S rDNA测序：
以8F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCGA-3’)和1510R(5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’)为上、下游引物扩增菌株的16S rRNA序列，由生工生物工程(上海)有限公司测定菌株的16S rDNA序列，根据菌株的生理生化特性及16S rDNA序列，将菌株命名为摩氏摩根菌ZJB09203。
实施例2摩氏摩根菌ZJB09203的含菌细胞菌悬液的制备
(1)斜面培养：将摩氏摩根菌ZJB09203接种于斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌体，斜面培养基终浓度组成为：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，溶剂为水；
(2)种子培养：用接种环从斜面菌体挑取一环菌体接种于种子培养基，30℃培养28h，获得种子液。种子培养基终浓度组成为：葡萄糖18g/L，牛肉膏12g/L，蛋白胨6g/L，氯化钠1g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH值，溶剂为水。
(3)发酵培养：将种子液以接种量3％接种至发酵培养基，摇瓶装液量为10％，20℃，100rpm，摇床培养72h，获得含菌细胞发酵液，发酵液离心分离，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤2次，收集湿菌体细胞并悬浮于纯水中，获得摩氏摩根菌ZJB09203含菌细胞菌悬液，含菌细胞菌悬液的湿菌体浓度为800g/L；发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖5.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.1g/L，橄榄油1g/L，pH 6.0，溶剂为水，121℃灭菌20min。
实施例3摩氏摩根菌ZJB09203的含菌细胞菌悬液的制备
发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖20.0g/l，酵母粉15.0g/l，蛋白胨10.0g/l，氯化钠3.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，磷酸二氢钾2.0g/l，硫酸镁0.5g/l，橄榄油3g/l，pH 8.5，溶剂为水。
摇瓶装液量30％，接种量15％(v/v)40℃，300rpm下振荡培养48h，其他操作同实施例2，获得湿菌体浓度800g/L的含菌细胞菌悬液，备用。
实施例4
在93.7ml纯水中加入6.3ml实施例2方法所制备的含菌细胞菌悬液(摩氏摩根菌ZJB09203以湿菌体质量计50.4g/L水)；加入1g外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯作为底物。于30℃恒温水浴搅拌反应4h，期间用1M盐酸水溶液和1M氢氧化钠水溶液调节反应体系pH值维持在6.5。反应结束后取转化液1ml，离心取上清液，经等体积乙酸乙酯萃取、有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，有机层进行气相色谱分析，产物(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的光学纯度98.5％(e.e.)，摩尔转化率31％。
实施例5
在87.5ml纯水中加入12.5ml实施例2方法所制备的含菌细胞菌悬液(摩氏摩根菌ZJB09203以湿菌体质量计100g/L水)；加入10g外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯作为底物。于20℃恒温水浴搅拌反应20h，期间用1M硫酸水溶液和1M氢氧化钠水溶液调节反应体系pH值维持在7.0。其它操作同实施例4，产物(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的光学纯度97.5％(e.e.)，摩尔转化率37％。
实施例6
在75ml纯水中加入25ml实施例2方法所制备的含菌细胞菌悬液(摩氏摩根菌ZJB09203以湿菌体质量计200g/L水)；加入20g外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯作为底物。于45℃恒温水浴搅拌反应48h，期间用1M醋酸水溶液和1M氢氧化钙水溶液调节反应体系pH维持在7.5，其它操作同实施例4，产物(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的光学纯度95.4％(e.e.)，摩尔转化率44％。
实施例7
在80ml纯水中加入20ml实施例3方法所制备的含菌细胞菌悬液(摩氏摩根菌ZJB09203以湿菌体质量计为160g/L水)；加入15g外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯作为底物。于40℃恒温水浴搅拌反应36h，期间用1M醋酸水溶液和1M碳酸钙水溶液调节反应体系pH维持在6.8，其它操作同实施例4，产物(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的光学纯度96％(e.e.)，摩尔转化率39％。
实施例8
在90ml纯水中加入10ml实施例3方法所制备的含菌细胞菌悬液(摩氏摩根菌ZJB09203以湿菌体质量计80g/L水)；加入9g外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯作为底物。于37℃恒温水浴搅拌反应24h，期间用1M盐酸水溶液和1M氢氧化钾水溶液调节反应体系pH维持在8.0，其它操作同实施例4，产物(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的光学纯度97.2％(e.e.)，摩尔转化率34％。
实施例9
在85ml纯水中加入15ml实施例3方法所制备的含菌细胞菌悬液(摩氏摩根菌ZJB09203以湿菌体质量计为120g/L水)；加入5g外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯作为底物。于28℃恒温水浴搅拌反应10h，期间用1M磷酸水溶液和1M氢氧化钠水溶液调节反应体系pH值维持在8.0，其它操作同实施例4，产物(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的光学纯度95.3％(e.e.)，摩尔转化率42％。
实施例10
在92ml纯水中加入8ml实施例3方法所制备的含菌细胞菌悬液(摩氏摩根菌ZJB09203以湿菌体质量计64g/L水)；加入6g外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯作为底物。于35℃恒温水浴搅拌反应21h，期间用1M硝酸水溶液和1M氢氧化钠水溶液调节反应体系pH维持在8.0，其它操作同实施例4，产物(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的光学纯度96.5％(e.e.)，摩尔转化率39％。
实施例11
取实施例5所得的转化液100ml，离心去除菌体及未反应底物2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，取上清液在80℃回流加热脱羧5小时，冷却至25℃以下，离心，获得上层物质，即上层浅黄色油状液体，干燥，制得(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯58g。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 摩氏摩根菌ZJB09203
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 1537
<212> DNA
<213> Morganella morganii
<400> 1
tagagtttga tcctggctca gattgaacgc tggcggcagg cctaacacat gcaagtcggg 60
cggtaacagg gagaagcttg cttctctgct gacgagcggc ggacgggtga gtaatgtatg 120
gggatctgcc tgatggaggg ggataactac tggaaacggt agctaatacc gcataatgtc 180
tccggaccaa agcgggggac cttcgggcct cgcaccatca gatgaaccca tatgggatta 240
gcttgtaggt gaggtaacgg ctcacctagg cgacgatccc tagctggtct gagaggatga 300
tcagccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 360
ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcc atgccgcgtg tatgaagaag gccttcgggt 420
tgtaaagtac tttcagtcgg gaggaaggtg ttaaggttaa taaccttgac aattgacgtt 480
accgacagaa gaagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggtgca 540
agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgcaggc ggttgattga gtcagatgtg 600
aaatccccgg gcttaacccg ggaattgcat ctgatactgg tcagctagag tcttgtagag 660
gggggtagaa ttccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa taccggtggc 720
gaaggcggcc ccctggacaa agactgacgc tcaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 780
attagatacc ctggtagtcc acgctgtaaa cgatgtcgac ttggaggttg tgcccttgag 840
gcgtggcttc cggagctaac gcgttaagtc gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta 900
aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg 960
caacgcgaag aaccttacct actcttgaca tccagagaac ttagcagaga tgctttggtg 1020
ccttcgggaa ctctgagaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtt gtgaaatgtt 1080
gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt atcctttgtt gccagcgcgt gatggcggga 1140
actcaaagga gactgccggt gataaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat 1200
ggcccttacg agtagggcta cacacgtgct acaatggcgt atacaaaggg aagcgaccct 1260
gcgaaggcaa gcggaactca taaagtacgt cgtagtccgg attggagtct gcaactcaac 1320
tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgta gatcagaatg ctacggtgaa tacgttcccg 1380
ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt gcaaaagaag taggtagctt 1440
aaccttcggg agggcgctta ccactttgtg attcatgact ggggtgaagt cgcaacaagg 1500
taaccgtagg ggaacctgcg gctggatcac ctcctta 1537
Claims (10)
1.摩氏摩根菌ZJB09203(Morganella morganii ZJB09203)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2011年5月19日，保藏编号CCTCC M 2011175。
2.如权利要求1所述的摩氏摩根菌ZJB09203，其特征在于所述摩氏摩根菌ZJB09203的16S rDNA序列为：
TAGAGTTTGA TCCTGGCTCA GATTGAACGC TGGCGGCAGG CCTAACACAT GCAAGTCGGG 60
CGGTAACAGG GAGAAGCTTG CTTCTCTGCT GACGAGCGGC GGACGGGTGA GTAATGTATG 120
GGGATCTGCC TGATGGAGGG GGATAACTAC TGGAAACGGT AGCTAATACC GCATAATGTC 180
TCCGGACCAA AGCGGGGGAC CTTCGGGCCT CGCACCATCA GATGAACCCA TATGGGATTA 240
GCTTGTAGGT GAGGTAACGG CTCACCTAGG CGACGATCCC TAGCTGGTCT GAGAGGATGA 300
TCAGCCACAC TGGGACTGAG ACACGGCCCA GACTCCTACG GGAGGCAGCA GTGGGGAATA 360
TTGCACAATG GGCGCAAGCC TGATGCAGCC ATGCCGCGTG TATGAAGAAG GCCTTCGGGT 420
TGTAAAGTAC TTTCAGTCGG GAGGAAGGTG TTAAGGTTAA TAACCTTGAC AATTGACGTT 480
ACCGACAGAA GAAGCACCGG CTAACTCCGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GGAGGGTGCA 540
AGCGTTAATC GGAATTACTG GGCGTAAAGC GCACGCAGGC GGTTGATTGA GTCAGATGTG 600
AAATCCCCGG GCTTAACCCG GGAATTGCAT CTGATACTGG TCAGCTAGAG TCTTGTAGAG 660
GGGGGTAGAA TTCCATGTGT AGCGGTGAAA TGCGTAGAGA TGTGGAGGAA TACCGGTGGC 720
GAAGGCGGCC CCCTGGACAA AGACTGACGC TCAGGTGCGA AAGCGTGGGG AGCAAACAGG 780
ATTAGATACC CTGGTAGTCC ACGCTGTAAA CGATGTCGAC TTGGAGGTTG TGCCCTTGAG 840
GCGTGGCTTC CGGAGCTAAC GCGTTAAGTC GACCGCCTGG GGAGTACGGC CGCAAGGTTA 900
AAACTCAAAT GAATTGACGG GGGCCCGCAC AAGCGGTGGA GCATGTGGTT TAATTCGATG 960
CAACGCGAAG AACCTTACCT ACTCTTGACA TCCAGAGAAC TTAGCAGAGA TGCTTTGGTG 1020
CCTTCGGGAA CTCTGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTT GTGAAATGTT 1080
GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT ATCCTTTGTT GCCAGCGCGT GATGGCGGGA 1140
ACTCAAAGGA GACTGCCGGT GATAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGTC AAGTCATCAT 1200
GGCCCTTACG AGTAGGGCTA CACACGTGCT ACAATGGCGT ATACAAAGGG AAGCGACCCT 1260
GCGAAGGCAA GCGGAACTCA TAAAGTACGT CGTAGTCCGG ATTGGAGTCT GCAACTCAAC 1320
TCCATGAAGT CGGAATCGCT AGTAATCGTA GATCAGAATG CTACGGTGAA TACGTTCCCG 1380
GGCCTTGTAC ACACCGCCCG TCACACCATG GGAGTGGGTT GCAAAAGAAG TAGGTAGCTT 1440
AACCTTCGGG AGGGCGCTTA CCACTTTGTG ATTCATGACT GGGGTGAAGT CGCAACAAGG 1500
TAACCGTAGG GGAACCTGCG GCTGGATCAC CTCCTTA 1537
3.如权利要求1所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物转化制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。
4.如权利要求3所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物转化制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述应用为：以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以摩氏摩根菌ZJB09203培养获得的酶为酶源，20～45℃下，调节pH值至6.5～9.0，于水中转化反应4～48h，得转化液分离纯化制得(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，所述摩氏摩根菌ZJB09203以湿菌体质量计为50～200g/L水，所述底物初始浓度为10～300g/L水。
5.如权利要求4所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物转化制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述酶源为摩氏摩根菌ZJB09203含菌细胞菌悬液。
6.如权利要求4所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物转化制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述pH值以如下酸性物质来调节：1mol/L盐酸水溶液、1mol/L硫酸水溶液、1mol/L醋酸水溶液、1mol/L磷酸水溶液、1mol/L硝酸水溶液或1mol/L硼酸水溶液。
7.如权利要求4所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物转化制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述pH值以如下碱性物质来调节：1mol/L氢氧化钠水溶液、1mol/L氢氧化钙水溶液、1mol/L氢氧化钾水溶液、1mol/L氢氧化镁水溶液或1mol/L碳酸钙水溶液。
8.如权利要求5所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物转化制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述摩氏摩根菌ZJB09203含菌细胞菌悬液按以下步骤获得：(1)斜面培养：将摩氏摩根菌ZJB09203接种于斜面培养基，20～42℃培养16～48h，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成(g/L)为：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，溶剂为水；(2)种子培养：用接种环从斜面菌体挑取一接种环菌体接种于种子培养基，25～37℃培养14～35h，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成(g/L)为：葡萄糖8～25，牛肉膏10～18，蛋白胨6～16，氯化钠1～4，磷酸氢二钾1.0～3.0，磷酸二氢钾1.0～3.0，溶剂为水；(3)发酵培养：将种子液以接种量3～15％接种至发酵培养基，摇瓶装液量10～30％，20～40℃，100～300rpm，摇床培养48～72h，获得含菌细胞发酵液，发酵液离心分离，弃去上清液，沉淀用生理盐水洗涤，收集湿菌体并悬浮于纯水中，获得所述摩氏摩根菌ZJB09203含菌细胞菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成(g/L)为：葡萄糖5～20，酵母粉5～15，蛋白胨5～10，氯化钠1～5，磷酸氢二钾0.5～2.0，磷酸二氢钾0～2.0，硫酸镁0.1～0.5，橄榄油1～3，pH 6.0～8.5，溶剂为水。
9.如权利要求4所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物转化制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述的转化液分离纯化方法为将转化液离心分离，取上清液，在80℃回流加热进行脱羧反应5h，反应结束后反应液冷却至室温，离心，取上层物质干燥，制得(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
10.如权利要求3所述的摩氏摩根菌ZJB09203在微生物转化制备(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于应用按以下步骤进行：以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以摩氏摩根菌ZJB09203含菌细胞菌悬液为酶源，20～36℃下，pH值7.0～8.5，于纯水中转化反应14～36h，转化液离心分离，取上清液，在80℃回流加热进行脱羧反应5h，反应结束后反应液冷却至室温，离心，取上层物质干燥，制得(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，所述底物初始浓度为10～250g/L水，所述摩氏摩根菌ZJB09203以湿菌体质量计为80～200g/L水。
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-
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