CN112301017A - 一种来源于假单胞菌脂肪酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种来源于假单胞菌脂肪酶在制备普瑞巴林关键手性中间体(S)‑3‑(2‑甲氧基‑2‑氧代乙基)‑5‑甲基己酸中的应用。所述来源于假单胞菌脂肪酶突变体对底物3‑(2‑甲基丙基)戊二酸二乙酯进行水解反应获得(S)‑3‑(2‑甲氧基‑2‑氧代乙基)‑5‑甲基己酸，ee值＞99%。充分实现了高光学纯度的(S)‑3‑(2‑甲氧基‑2‑氧代乙基)‑5‑甲基己酸酶法生产制备。

Description

一种来源于假单胞菌脂肪酶及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种来源于假单胞菌脂肪酶及其应用。
背景技术
普瑞巴林(Pregabalin，商品名：
Figure BDA0002809188240000011
)由辉瑞(Pfizer)公司生产，化学名称为S-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸，结构式如(1)所示。
Figure BDA0002809188240000012
2004年7月，欧盟批准其用于治疗部分癫痫发作，2005年由美国FDA批准上市，用于缓解与治疗神经性疼痛包括糖尿病周围神经病变神经痛(DPN)、带状疱疹后神经痛(PHN)、脊髓损伤相关神经痛、纤维肌痛相关神经痛以及4岁及以上患者癫痫部分发作的治疗。普瑞巴林是首个被美国FDA批准用于糖尿病周围神经病变和带状疱疹后神经痛的药物，也是目前最畅销的镇痛药。全球范围内，多家药物公司开展了对其生产工艺的研究。在这些方法中，人们重点关注了几种关键性中间体。例如(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，其结构式如(2)所示。
在专利US2005/0283023中，美国辉瑞公司使用诺维信公司(Novazymes)脂肪酶435，利用2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯作为底物进行选择性水解，得到(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，后者经过两步化学法在水解和氢化后得到目标产物普瑞巴林，其反应式如下所示：
Figure BDA0002809188240000021
在制备普瑞巴林的方法中，如结构式(3)所示的(S)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5-甲基己酸是另一个值得重视的关键中间体，该中间体在路易斯酸存在的条件下进行氨化，再经过霍夫曼反应，即可得到目标产物普瑞巴林。其反应式如下所示：
Figure BDA0002809188240000022
以上反应式中，R基团可以是具有C1至C6长度的烷基或芳香族基团。因此，开发一种制备(S)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5-甲基己酸的新方法显得非常关键。生物催化或酶法催化由于其固有的催化活力高、光学纯度好，以及对环境非常友好等优点，在现代医药生产中发挥了越来越重要的作用。(S)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5-甲基己酸可以通过脂肪酶水解3-(2-甲基丙基)戊二酸二乙酯得到，所述反应式如下所示：
Figure BDA0002809188240000031
该方法工艺条件在常温常压下进行，易于操作。但研究发现，该反应产物的光学纯度在现有的条件下是比较低的，不符合药物的高光学纯度要求。且现有的脂肪酶在催化解外消旋3-(2-甲基丙基)戊二酸二乙酯制备普瑞巴林关键中间体(S)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5-甲基己酸时，产物的光学纯度(ee值)比较低，比如使用novazyme435酶时，ee值为76％。其中，化合物样品的对映体组成可用术语“对映体过量(enantiomeric excess)”或“e.e.％”来描述。它表示一个对映体对另一个对映体的过量，通常用百分数表示。
发明内容
鉴于现有技术存在上述缺陷，本发明的目的在于提供一种一种来源于假单胞菌脂肪酶及其应用。
本发明的目的，将通过以下技术方案得以实现：
一种来源于假单胞菌脂肪酶在制备普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5-甲基己酸中的应用。
优选地，以上所述的应用，所述来源于假单胞菌脂肪酶突变体对底物3-(2-甲基丙基)戊二酸二乙酯进行水解反应获得(S)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5-甲基己酸，ee值＞99％。
优选地，所述的来源于假单胞菌脂肪酶突变体的制备方法，包括如下步骤，首先，以假单胞菌菌种为菌株进行PCR扩增，构建含有脂肪酶基因的质粒；构建核糖激酶大肠杆菌表达菌株，进行表达菌株的发酵培养，并进行离心制备假单胞菌脂肪酶粗液。
优选地，以上所述的方法制备的制备普瑞巴林关键手性中间体的脂肪酶,其序列如下所示，
MetValGlnIleGlnGlyHisTyrGluLeuLysPheGluAlaValArgGluAlaPheAlaAlaLeuPheAspAspProGlnGluArgGlyAlaGlyLeuCysIleGlnValGlyGlyGluThrValValAspLeuTrpAlaGlySerAlaAspLysAspGlyArgGluAlaTrpHisSerAspThrIleAlaAsnLeuPheSerCysThrLysThrPheThrAlaValThrAlaLeuGlnLeuValGlyGluGlyLysLeuSerLeuAspAlaProValValArgTyrTrpProGluPheGlyGlnAlaGlyLysAlaSerValThrLeuArgGlnLeuLeuSerHisArgAlaGlyLeuProAlaIleArgGluLeuLeuProAlaGluAlaLeuTyrAspTrpGlnAlaMetValAspAlaLeuAlaAlaGluAlaProTrpTrpThrProGlyThrGluHisGlyTyrAlaAlaIleThrTyrGlyTrpLeuIleGlyGluLeuIleArgArgValAspGlyArgGlyProGlyGluSerIleValAlaArgThrAlaArgProLeuGlyLeuAspPheHisValGlyLeuAlaAspGluGluPheHisArgValAlaHisIleAlaArgGlyLysGlyAsnProGlyAspAlaAlaAlaGlnArgLeuLeuGlnValThrLeuArgGluProGluAlaLeuSerThrArgAlaPheThrAsnProProAlaIleLeuThrSerThrAsnLysProGluTrpArgArgMetGlnGlnProAlaAlaAsnGlyHisGlyAsnAlaArgSerLeuAlaGlyPheTyrAlaGlyLeuLeuAspGlySerLeuLeuGluSerGluLeuLeuAspGluLeuThrArgGluHisSerLeuGlyGlnAspArgThrLeuLeuThrGlnThrArgPheGlyLeuGlyCysMetLeuAspGlnProAspValAlaAsnAlaThrPheGlyLeuGlyAlaArgAlaPheGlyHisProGlyAlaGlyGlySerValGlyPheAlaAspProGluTyrAspValAlaPheGlyPheValThrAsnThrLeuGlyProTyrValLeuMetAspProArgAlaGlnLysLeuValArgValLeuGlyThrCysLeu
即为SEQ ID NO:1
MVQIQGHYELKFEAVREAFAALFDDPQERGAGLCIQVGGETVVDLWAGSADKDGREAWHSDTIANLFSCTKTFTAVTALQLVGEGKLSLDAPVVRYWPEFGQAGKASVTLRQLLSHRAGLPAIRELLPAEALYDWQAMVDALAAEAPWWTPGTEHGYAAITYGWLIGELIRRVDGRGPGESIVARTARPLGLDFHVGLADEEFHRVAHIARGKGNPGDAAAQRLLQVTLREPEALSTRAFTNPPAILTSTNKPEWRRMQQPAANGHGNARSLAGFYAGLLDGSLLESELLDELTREHSLGQDRTLLTQTRFGLGCMLDQPDVANATFGLGARAFGHPGAGGSVGFADPEYDVAFGFVTNTLGPYVLMDPRAQKLVRVLGTCL
本发明的有益效果：本发明提供的来源于假单胞菌的脂肪酶突变体在催化3-(2-甲基丙基)戊二酸二乙酯制备普瑞巴林关键中间体(S)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5-甲基己酸时，产物ee值得到大幅提高，实现了高光学纯度的(S)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5-甲基己酸酶法生产制备，在不使用任何助溶剂的清情况下，产物ee值>99％，在添加DMSO作为助溶剂时，产物ee值>95％。
以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
附图说明
图1：本发明的来源于假单胞菌脂肪酶对3-(2-甲基丙基)戊二酸二乙酯水解后的不同助溶剂下的HPLC检测对照图。
具体实施方式
实施例1:来源于假单胞菌的野生型脂肪酶的克隆
设计一对引物psu-F:5’-CATATGGTTCAGATTCAGGG-3’；
psu-R:5’-CTCGAGTTACAGACATGTACC-3’；
以假单胞菌菌种为出发菌株模板，进行聚合酶链式反应(PCR反应)。假单胞菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为Pseudomonas CGMCC No.4184。PCR反应体系：重蒸水18μL，2.5μL PCR缓冲液(PCR buffer)，1μL氯化镁(25mM浓度)，1.5μL dNTP(2.5mM浓度)，0.5μL上述两条引物，上述模板20ng，2个单位的Taq酶(上海sangon公司)。
PCR条件：94℃变性10分钟后，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分15秒，共进行30个循环，最后72℃充分延伸10分钟。
实施例2：含脂肪酶基因的质粒构建
PCR扩增反应结束后，使用1％的琼脂糖凝胶进行电压为100伏的核苷酸电泳，待条带清晰出现后，对大小为1200bp左右的目标条带进行胶条割胶，使用胶回收试剂盒(宝生物公司)回收目标DNA片段，接着按照宝生物公司(网址：www.takara.com.cn)2009版产品目录说明书描述的方法，将所获得的DNA片段和载体pET24a+(Novagen公司)用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切。
酶切产物再次进行电压为100伏的DNA电泳，回收相应大小为1000bp和5300bp左右的片段和载体，最后将片段和载体按照3:1的比例混合后，加入1.5单位的T4连接酶，16℃连接12小时。
连接反应结束后，将连接产物取10μL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，经过NdeI和XhoI双酶切和DNA测序验证，获得包含有大小为1149kb的目标DNA序列的阳性克隆及其重组质粒。
实施例3：表达脂肪酶的基因工程菌构建
用氯化钙转化法(郝福英等编著，《分子生物学实验技术》，北京大学出版社，1998年，第12-15页)将实施例2中最终得到的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中(Novagen公司)，即获得脂肪酶大肠杆菌表达菌株。
实施例4：来源于假单胞菌的脂肪酶表达菌株发酵
将实施例3中获得的大肠杆菌表达菌株的单个微生物菌落接种于含有100μL/mL卡那霉素的50mL的LB培养基(蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％)中。细胞在37℃培养箱中于250rpm振荡生长过夜(至少12小时)。在1升培养瓶中装入250mL TB培养基(12g/L胰蛋白胨、24g/L酵母提取物、4ml/L甘油、65mM、pH7.0磷酸钾、1mM硫酸镁、100微克/毫升卡那霉素)，按照10％的接种量将上述过夜培养物接种于其中，然后在37℃下振荡培养。当培养物的OD600为0.7至0.8时，降温至28度，用1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导核糖激酶基因的表达，继续培养至少16小时。
实施例5:来源于假单胞菌的脂肪酶粗酶液制备
培养结束后，使用离心机在4℃，5000rpm条件下离心15分钟，收集细胞并弃去上清液。细胞沉淀物在相等体积的4℃、100mM、pH7.0三乙醇胺(氯化物)缓冲液中重悬，5000rpm条件下离心15分钟后，收集细胞。洗涤的细胞在2倍体积的4℃、100mM、pH7.0三乙醇胺(氯化物)缓冲液中重悬，以12000psi在高压匀浆机(ATS公司)中机械破胞两次，全程保持温度为4℃。细胞碎片通过冷冻高速离心机在4℃，10000rpm条件下离心40分钟去除，上清液为所获得的可溶性野生型脂肪酶粗酶液。冷冻干燥后即得脂肪酶酶粉。
实施例6：分析条件及分析方法
对本发明中底物3-(2-甲基丙基)戊二酸二乙酯及产物(S)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5-甲基己酸使用高效液相色谱(HPLC)进行分析定量。对反应物的测定需进行样品预处理：反应结束后，使用等体积的乙酸乙酯萃取，震荡混匀3-5min，离心取上清液，加入无水硫酸钠去除多余水分，萃取液中通风橱中挥发(3-5h)，加入等体积70％的正己烷和30％的异丙醇，反复吸打混合，用于检测。HPLC检测条件为：工作站岛津LC-2030C；流动相：正己烷：乙醇：乙二胺＝90:10:0.1
色谱柱：
Figure BDA0002809188240000081
IG 4.6x250mm 5um，流量：1.0ml/min，检测波长：220nm，色谱柱温度：35℃。在该条件下，底物3-(2-甲基丙基)戊二酸二乙酯的出峰时间为4.27分钟，产物(S)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5-甲基己酸出峰时间为7.29分钟。
实施例7：来源于假单胞菌的脂肪酶对底物3-(2-甲基丙基)戊二酸二乙酯的水解反应
反应瓶中加入20mg/ml的冻干酶粉，底物3-(2-甲基丙基)戊二酸二乙酯浓度为20mM，分别添加2％的乙腈、DMSO、异丙醇和乙醇作为助溶剂，使用pH 7.4的PBS缓冲液填充至500μl，放置于2ml EP管中，30℃，1000rpm水浴中反应24h。反应结束后使用等体积的乙酸乙酯萃取。离心取上清液，加入无水硫酸钠去除多余水分，萃取液中通风橱中挥发(3-5h)，加入等体积70％的正己烷和30％的异丙醇，反复吸打混合，用于HPLC检测。
结果：如HPLC检测图图1可以看出，不添加任何助溶剂的样品作为对照时，本发明所获的的酶不对称水解底物3-(2-甲基丙基)戊二酸二乙酯后，所获得的产物(S)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5-甲基己酸ee值>99％。添加DMSO作为助溶剂时，产物ee值>95％。
本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种来源于假单胞菌脂肪酶在制备普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5-甲基己酸中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述假单胞菌脂肪酶对底物3-(2-甲基丙基)戊二酸二乙酯进行水解反应获得制备普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5-甲基己酸，ee值＞99%。
3.如权利要求1所述的来源于假单胞菌脂肪酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，首先，以假单胞菌菌种为菌株进行PCR扩增，构建含有脂肪酶基因的质粒；构建核糖激酶大肠杆菌表达菌株，进行表达菌株的发酵培养，并进行离心制备假单胞菌脂肪酶粗液。
4.如权利要求3所述的方法制备的制备普瑞巴林关键手性中间体的脂肪酶，其序列为SEQ ID NO:1。
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