CN110904020A - 一种产电希瓦氏重组菌株及构建方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产电希瓦氏重组菌株及构建方法及用途，一种产电希瓦氏重组菌株的构建方法，包括如下步骤：敲除野生型希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR‑1的目标基因SO_1860，得到产电希瓦氏重组菌株Δ1860，所述基因SO_1860的核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示。本发明构建的一种产电希瓦氏重组菌株Δ1860为基因缺陷型菌株，能够改变细胞表面结构，促进电极表面生物膜的形成，增强胞外电子传递速率，提高微生物燃料电池的功率密度。

Description

一种产电希瓦氏重组菌株及构建方法及用途

技术领域

本发明涉及生物能源技术领域，更具体的说是涉及一种产电希瓦氏重组菌株及构建方法及用途。

背景技术

能源短缺和环境污染是我国现今面临的日益严峻的问题，因而能源开发和环境废物治理及过程中能源可再生利用成为了我国现代社会进行可持续发展的一大挑战。科学家们不断寻找新的技术解决方案，其中微生物燃料电池(MicrobialFuelCell,MFC)就是其中之一用来产生可替代能源和环境废物治理新装置，并且其重要性现今日益显现。

MFC是利用产电微生物作为阳极催化剂将有机物中的化学能转化为电能的装置。微生物产电能力相差很大，产电微生物决定着MFC的功能及应用，希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)属是目前发现的广泛用于MFC中产电的微生物之一，其代谢路径和胞外电子传递路径研究的比较明确。Shewanella oneidensis MR-1(简称希瓦氏菌MR-1)是希瓦氏菌属中在基因组序列注释和遗传特性方面研究最广泛的菌株。该菌株能够在不添加外源媒介的情况下，将电子转移到微生物燃料电池中的阳极，成为研究微生物如何在MFCs中产生电流的模型生物之一。

研究表明微生物胞外电子传递(Extracellular Electron Transfer,EET)是一个受多种细胞成分影响的复杂过程。其中生物膜的厚度直接影响胞外电子传递的强度，影响生物燃料电池的功率密度。但野生型希瓦氏菌株MR-1细胞粘附性较弱，不能形成较厚且稳定的生物膜。因此，构建易于形成生物膜的希瓦氏菌株，不仅能够弥补希瓦氏菌的一些缺陷，而且也能够提高MFC的电化学效果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种产电希瓦氏重组菌株。

本发明的第二个目的是提供一种产电希瓦氏重组菌株的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种产电希瓦氏重组菌株的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种产电希瓦氏重组菌株的构建方法，包括如下步骤：敲除野生型希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1的目标基因SO_1860，得到产电希瓦氏重组菌株Δ1860，所述基因SO_1860的核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示。

上述方法构建的产电希瓦氏重组菌株Δ1860。

上述产电希瓦氏重组菌株Δ1860产电的用途。

本发明的优点：

本发明构建的一种产电希瓦氏重组菌株Δ1860为基因缺陷型菌株，能够改变细胞表面结构，促进电极表面生物膜的形成，增强胞外电子传递速率，提高微生物燃料电池的功率密度。

附图说明

图1为引物设计与同源区基因扩增方法。

图2为希瓦氏菌MR-1与产电希瓦氏重组菌株Δ1860MFC产电电压对比图。

图3为电化学表征图。

具体实施方式

原始菌株野生型希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1简称：野生型希瓦氏菌MR-1，于2010年9月购自ATCC(美国，https://www.atcc.org/)公司的ATCC 700550菌株。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种产电希瓦氏重组菌株的构建方法，包括如下步骤：敲除野生型希瓦氏菌MR-1的目标基因SO_1860，得到产电希瓦氏重组菌株Δ1860，所述基因SO_1860的核苷酸序列如SEQ ID NO 15表示。

具体构建方法包括如下步骤：

利用att位点特异性重组和双交换删除的方法敲除野生型希瓦氏菌MR-1目标基因SO_1860。

(1)引物设计和基因扩增：

从NCBI数据库获得希瓦氏菌MR-1的基因组序列，根据目标基因SO_1860及其上下游基因序列设计三对引物，1860-LF(SEQ ID NO.4)和1860-LR(SEQ ID NO.5)、1860-5-O(SEQ ID NO.6)和1860-5-I(SEQ ID NO.7)、1860-3-O(SEQ ID NO.8)和1860-3-I(SEQ IDNO.9)，在体外扩增目的基因上游同源区和下游同源区，其中包含部分目的基因序列，扩增长度大约500-1000bp,再通过融合PCR把上下游同源区基因连接在一起，形成融合同源区片段。如图1所示。其中在引物1860-5-O和1860-3-O的5’端分别添加特异性位点attB1和attB2，在引物1860-5-I和1860-3-I的5’端添加一个20bp左右的同源互补序列(Linker)。

上游同源区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

下游同源区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

融合同源区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

特异性位点attB1和attB2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；

同源互补序列(Linker)的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

(2)将步骤(1)获得的融合片段通过att位点特异性重组整合到自杀质粒pHG1.0载体(核苷酸序列如SEQ ID NO.13示)上，构建好的质粒先转入大肠杆菌WM3064(商业菌株)中，然后WM3064与希瓦氏菌MR-1结合转移，将构建好的质粒转入希瓦氏菌MR-1中。希瓦氏菌MR-1需要在LB培养基中，30℃培养，而大肠杆菌WM3064其生长需要在LB培养基中添加0.3M/mL DAP(2,6-二氨基庚二酸)，37℃培养。

a、att位点特异性重组反应体系(5uL)：

融合片段:1uL(_～75ng)

pHG1.0:1uL(_～75ng)

BP clonase II enzyme mix:1uL

H₂O:2uL

b、Gateway BP clonase II enzyme反应程序：

将上述各种成分混匀，在25℃条件下反应5小时,然后降温到4℃保存；

c、WM3064化学转化步骤：

1.从-80℃冰箱中取50ul WM3064感受态细胞置于冰上10min；

2.把b中反应复合物与WM3064感受态细胞在1.5mL的离心管中混匀，冰浴30min；

3.然后在水浴锅中42℃热激90s，再次冰浴5min；

4.向上述体系中添加1mL含0.3M/mL DAP的LB培养基，37℃，150rpm，培养1小时；

5.取200uL培养液涂布于LB平板(含15ug/mL庆大霉素)上,30℃培养12小时；

6.挑取单菌落进行PCR验证，验证正确的WM3064与希瓦氏菌MR-1进行接合转移。

(3)将步骤(2)获得重组菌株在LB(含15ug/mL的庆大霉素)平板上培养，挑单菌落进行PCR验证，通过抗性筛选以及菌落PCR验证，获得自杀质粒整合到MR-1基因组中的重组菌株。其中菌落PCR所用引物为1860-LF(在MR-1基因组上)和F primer(在自杀质粒pHG1.0上)。引物F primer的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

(4)将步骤(3)验证正确的菌株在LB(含15ug/mL的庆大霉素)液体培养基中过夜培养，然后以1％的比例转接到无抗LB培养基中培养至OD值为0.4左右，取200uL涂布于不含NaCl，含有质量浓度10％蔗糖的LB平板上，30℃培养12小时。然后挑取单菌落进行PCR验证，并且进行测序验证；通过蔗糖负筛选和菌落PCR验证，获得SO_1860基因敲除型希瓦氏菌Δ1860。验证正确的重组菌株保存于-80℃冰箱，用于后续实验。

实施例2：产电希瓦氏重组菌株Δ1860和野生型希瓦氏菌MR-1 MFC产电

1、菌株活化

将产电希瓦氏重组菌株Δ1860和野生型希瓦氏菌MR-1从-80℃冰箱取出，在LB培养基里30℃，200rpm，分别过夜培养。过夜培养液按1％的比例分别转接入新的LB培养基里30℃，200rpm，培养10小时，测OD 600，计算体积(MFC中OD 600＝0.5)，5000rpm离心10分钟，用阳极液重悬后，加入MFC阳极室中。

2、MFC产电

实验装置采用双室MFC,110mL阳极室(包含菌体和阳极液共110mL)和110mL阴极室，阳极碳布电极大小为1cm×1cm，阴极碳布电极大小为2.5cm×3cm，双室之间用质子交换膜隔开，质子交换膜用之前用1M盐酸水溶液过夜浸泡，并用无菌的蒸馏水冲洗三次。

阳极液包含6g/L磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L氯化钠、1g/L氯化铵、1mM硫酸镁、0.1mM氯化钙、20mM乳酸钠、5％LB培养基，余量是水。阴极液包含50mM铁氰化钾、50mM磷酸氢二钾和50mM磷酸二氢钾，余量是水。MFC放在30℃培养箱中，阴阳两极连接2KΩ的外电阻。

3、电化学效果分析

循环伏安法(CV)以氯化银为参比电极，用多通道电化学工作站CHI1000C扫描，扫速为1mV/s。线性扫描伏安法(LSV)从-0.87V扫到-0.1V，扫速为0.1mV/s，仪器为多通道电化学工作站CHI1000C。

4、结果

由图2可以看出，产电重组希瓦氏菌Δ1860MFC产电具备较佳的产电性能，最高输出电压为138.6mV，相对于原始菌株野生型希瓦氏菌MR-1提高了59.3％；

利用生物电化学分析可以进一步研究MFC中胞外电子传递效率，图3所示是以扫速为0.1mV/s的线性扫描伏安图(LSV)即极化曲线，从图上可以看出，利用产电重组希瓦氏菌Δ1860进行MFC发电的最大电流密度约为351mA/m²，最大功率密度为109.9mW/m²,相对于原始菌株野生型希瓦氏菌MR-1均得到大幅提升。

表1：本发明所涉及引物及其序列

序列表

<110> 天津大学前沿技术研究院

<120> 一种产电希瓦氏重组菌株及构建方法及用途

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 625

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta cactcaatgt tggcgttatg tcagtatctc 60

atttcaaacg gcagtaatta gcgagttgtt cctttaaatt tcatctagtt aacaatattc 120

attttatgct ttgcgaaatg ccattgttgg gctaaattac cctgataacc tatatttcgg 180

ttgcagtact ctgatttggc taaactctct tagtcagcat tggttaaagg tggataaagt 240

tgatatcgat atatttagtt gacgatcatg agctggtaag aactgggatc cgccgtatct 300

tagaagatga gcgggggatc aaagttgtcg gtgaagcgcc cgatggcgag accgcagtac 360

aatgggctag gcaaaatgaa gccgacgtca tcttaatgga catgaatatg ccagttatgg 420

gcggactcga agccacccgt aaaattttgc gttatcaacc ccatgccaag attattgtat 480

taaccgtgca taccgaagat cctttcccca gcaaagtgat gcaggcgggc gcgtctggtt 540

atttaaccaa aggtgcgacg ccacccgagg tgttgcaagc gatacgtcag gtttcccgtg 600

gtcagataga tagcgaaccc ggacc 625

<210> 2

<211> 794

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atagatagcg aacccggacc tgtggagctg acccgtttag cgatccgcta taaaatgtta 60

gatgctggac atttttaatc tatagcatta attaatcctg cttatatagt gtgttaggcg 120

tgagtttgaa aacgatttat caagctgttt tgaagatagt aagtaaaaaa gtgggtgtat 180

aacgatgtct acaggtttta acgcccagag ttttttacgt acagtcacct cttcggcggg 240

ggtttatcgc atgtatgacg tcaaaggtga cgtcatttat gtgggtaaag ccaaagatct 300

taaaaagcgc ttatcttctt atttccgtaa aaaccttggc aatgtcaaaa cccaggcgct 360

ggtgtcgcat attcatcata tcgatgtgac actgactcat agtgagaccg atgcgctgct 420

gcttgaaaat gactatatca agcagtacat gcctaaatac aatgtgttac tgcgggatga 480

taagtcatac ccctatattt tattgagtca gcatgagcat ccacgccttg cttaccatcg 540

cgggccacag cgggagaagg gccattactt tggaccttat cctaatggcg gcgcggtgcg 600

tgaaagtttg catttgatgc aaaagttgtt tcctatccgc cagtgtgatg atctctatta 660

caaatcccgc actcgcccct gtttgcaata ccagttatcc cgctgcagtg cgccttgcgt 720

tggtaaagtc agtaatgcgg agtatgacga gcaggtaaaa cttgcaccca gctttcttgt 780

acaaagtggt cccc 794

<210> 3

<211> 1399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta cactcaatgt tggcgttatg tcagtatctc 60

atttcaaacg gcagtaatta gcgagttgtt cctttaaatt tcatctagtt aacaatattc 120

attttatgct ttgcgaaatg ccattgttgg gctaaattac cctgataacc tatatttcgg 180

ttgcagtact ctgatttggc taaactctct tagtcagcat tggttaaagg tggataaagt 240

tgatatcgat atatttagtt gacgatcatg agctggtaag aactgggatc cgccgtatct 300

tagaagatga gcgggggatc aaagttgtcg gtgaagcgcc cgatggcgag accgcagtac 360

aatgggctag gcaaaatgaa gccgacgtca tcttaatgga catgaatatg ccagttatgg 420

gcggactcga agccacccgt aaaattttgc gttatcaacc ccatgccaag attattgtat 480

taaccgtgca taccgaagat cctttcccca gcaaagtgat gcaggcgggc gcgtctggtt 540

atttaaccaa aggtgcgacg ccacccgagg tgttgcaagc gatacgtcag gtttcccgtg 600

gtcagataga tagcgaaccc ggacctgtgg agctgacccg tttagcgatc cgctataaaa 660

tgttagatgc tggacatttt taatctatag cattaattaa tcctgcttat atagtgtgtt 720

aggcgtgagt ttgaaaacga tttatcaagc tgttttgaag atagtaagta aaaaagtggg 780

tgtataacga tgtctacagg ttttaacgcc cagagttttt tacgtacagt cacctcttcg 840

gcgggggttt atcgcatgta tgacgtcaaa ggtgacgtca tttatgtggg taaagccaaa 900

gatcttaaaa agcgcttatc ttcttatttc cgtaaaaacc ttggcaatgt caaaacccag 960

gcgctggtgt cgcatattca tcatatcgat gtgacactga ctcatagtga gaccgatgcg 1020

ctgctgcttg aaaatgacta tatcaagcag tacatgccta aatacaatgt gttactgcgg 1080

gatgataagt cataccccta tattttattg agtcagcatg agcatccacg ccttgcttac 1140

catcgcgggc cacagcggga gaagggccat tactttggac cttatcctaa tggcggcgcg 1200

gtgcgtgaaa gtttgcattt gatgcaaaag ttgtttccta tccgccagtg tgatgatctc 1260

tattacaaat cccgcactcg cccctgtttg caataccagt tatcccgctg cagtgcgcct 1320

tgcgttggta aagtcagtaa tgcggagtat gacgagcagg taaaacttgc acccagcttt 1380

cttgtacaaa gtggtcccc 1399

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cattctaagc gcagctcgtg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catcttcgcc accagttcac 20

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta cactcaatgt tggcgttatg tc 52

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtccgggtt cgctatctat ctgaccacgg gaaacctgac 40

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg caagttttac ctgctcgtc 49

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atagatagcg aacccggacc tgtggagctg acccgtttag 40

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atagatagcg aacccggacc 20

<210> 13

<211> 10381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atataaatat caatatatta aattagattt tgcataaaaa acagactaca taatactgta 60

aaacacaaca tatccagtca ctatgaatca actacttaga tggtattagt gacctgtagt 120

cgactaagtt ggcagcatca cccgacgcac tttgcgccga ataaatacct gtgacggaag 180

atcacttcgc agaataaata aatcctggtg tccctgttga taccgggaag ccctgggcca 240

acttttggcg aaaatgagac gttgatcggc acgtaagagg ttccaacttt caccataatg 300

aaataagatc actaccgggc gtattttttg agttatcgag attttcagga gctaaggaag 360

ctaaaatgga gaaaaaaatc actggatata ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta 420

aagaacattt tgaggcattt cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag accgttcagc 480

tggatattac ggccttttta aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt tatccggcct 540

ttattcacat tcttgcccgc ctgatgaatg ctcatccgga attccgtatg gcaatgaaag 600

acggtgagct ggtgatatgg gatagtgttc acccttgtta caccgttttc catgagcaaa 660

ctgaaacgtt ttcatcgctc tggagtgaat accacgacga tttccggcag tttctacaca 720

tatattcgca agatgtggcg tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct aaagggttta 780

ttgagaatat gtttttcgtc tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt tttgatttaa 840

acgtggccaa tatggacaac ttcttcgccc ccgttttcac catgggcaaa tattatacgc 900

aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtc tgtgatggct 960

tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagtactg cgatgagtgg cagggcgggg 1020

cgtaaacgcc gcgtggatcc ggcttactaa aagccagata acagtatgcg tatttgcgcg 1080

ctgatttttg cggtataaga atatatactg atatgtatac ccgaagtatg tcaaaaagag 1140

gtatgctatg aagcagcgta ttacagtgac agttgacagc gacagctatc agttgctcaa 1200

ggcatatatg atgtcaatat ctccggtctg gtaagcacaa ccatgcagaa tgaagcccgt 1260

cgtctgcgtg ccgaacgctg gaaagcggaa aatcaggaag ggatggctga ggtcgcccgg 1320

tttattgaaa tgaacggctc ttttgctgac gagaacaggg gctggtgaaa tgcagtttaa 1380

ggtttacacc tataaaagag agagccgtta tcgtctgttt gtggatgtac agagtgatat 1440

tattgacacg cccgggcgac ggatggtgat ccccctggcc agtgcacgtc tgctgtcaga 1500

taaagtctcc cgtgaacttt acccggtggt gcatatcggg gatgaaagct ggcgcatgat 1560

gaccaccgat atggccagtg tgccggtctc cgttatcggg gaagaagtgg ctgatctcag 1620

ccaccgcgaa aatgacatca aaaacgccat taacctgatg ttctggggaa tataaatgtc 1680

aggctccctt atacacagcc agtctgcagg tcgatacagt agaaattaca gaaactttat 1740

cacgtttagt aagtatagag gctgaaaatc cagatgaagc cgaacgactt gtaagagaaa 1800

agtataagag ttgtgaaatt gttcttgatg cagatgattt tcaggactat gacactagcg 1860

tatatgaata ggtagatgtt tttattttgt cacacaaaaa agaggctcgc acctcttttt 1920

cttatttctt tttatgattt aatacggcat tgaggacaat agcgagtagg ctggatacga 1980

cgattccgtt tgagaagaac atttggaagg ctgtcggtcg actaagttgg cagcatcacc 2040

cgaagaacat ttggaaggct gtcggtcgac tacaggtcac taataccatc taagtagttg 2100

attcatagtg actggatatg ttgtgtttta cagtattatg tagtctgttt tttatgcaaa 2160

atctaattta atatattgat atttatatca ttttacgttt ctcgttcagc ttttttgtac 2220

aaagttggca ttataaaaaa gcattgctca tcaatttgtt gcaacgaaca ggtcactatc 2280

agtcaaaata aaatcattat ttggggcccg agatccatgc tagcgtgagc tcgatatcgc 2340

atgcggtacc tctagaagaa gcttgggatc cgtcgacgcg tcgatccggt gattgattga 2400

gcaagctagc tttatgcttg taaaccgttt tgtgaaaaaa tttttaaaat aaaaaagggg 2460

acctctaggg tccccaatta attagtaata taatctatta aaggtcattc aaaaggtcat 2520

ccaccggatc agcttagtaa agccctcgct agattttaat gcggatgttg cgattacttc 2580

gccaactatt gcgataacaa gaaaaagcca gcctttcatg atatatctcc caatttgtgt 2640

agggcttatt atgcacgctt aaaaataata aaagcagact tgacctgata gtttggctgt 2700

gagcaattat gtgcttagtg catctaacgc ttgagttaag ccgcgccgcg aagcggcgtc 2760

ggcttgaacg aattgttaga cattatttgc cgactacctt ggtgatctcg cctttcacgt 2820

agtggacaaa ttcttccaac tgatctgcgc gtcgaattaa ttctcgaatt gacataagcc 2880

tgttcggttc gtaaactgta atgcaagtag cgtatgcgct cacgcaactg gtccagaacc 2940

ttgaccgaac gcagcggtgg taacggcgca gtggcggttt tcatggcttg ttatgactgt 3000

ttttttgtac agtctatgcc tcgggcatcc aagcagcaag cgcgttacgc cgtgggtcga 3060

tgtttgatgt tatggagcag caacgatgtt acgcagcagc aacgatgtta cgcagcaggg 3120

cagtcgccct aaaacaaagt taggtggctc aagtatgggc atcattcgca catgtaggct 3180

cggccctgac caagtcaaat ccatgcgggc tgctcttgat cttttcggtc gtgagttcgg 3240

agacgtagcc acctactccc aacatcagcc ggactccgat tacctcggga acttgctccg 3300

tagtaagaca ttcatcgcgc ttgctgcctt cgaccaagaa gcggttgttg gcgctctcgc 3360

ggcttacgtt ctgcccaagt ttgagcagcc gcgtagtgag atctatatct atgatctcgc 3420

agtctccggc gagcaccgga ggcagggcat tgccaccgcg ctcatcaatc tcctcaagca 3480

tgaggccaac gcgcttggtg cttatgtgat ctacgtgcaa gcagattaca gtgacgatcc 3540

cgcagtggct ctctatacaa agttgggcat acgggaagaa gtgatgcact ttgatatcga 3600

cccaagtacc gccacctaac aattcgttca agccgagatc ggcttcccgg ccaattcgac 3660

gcgcggatca gtgagggttt gcaactgcgg gtcaaggatc tggatttcga tcacggcacg 3720

atcatcgtgc gggagggcaa gggctccaag gatcgggcct tgatgttacc cgagagcttg 3780

gcacccagcc tgcgcgagca ggggaattga tccggtggat gaccttttga atgaccttta 3840

atagattata ttactaatta attggggacc ctagaggtcc ccttttttat tttaaaaatt 3900

ttttcacaaa acggtttaca agcataaagc tagcttgctc aatcaatcac cggatcctct 3960

agagtcgacg cgtcgactct agaggatcga tcctttttaa cccatcacat atacctgccg 4020

ttcactatta tttagtgaaa tgagatatta tgatattttc tgaattgtga ttaaaaaggc 4080

aactttatgc ccatgcaaca gaaactataa aaaatacaga gaatgaaaag aaacagatag 4140

attttttagt tctttaggcc cgtagtctgc aaatcctttt atgattttct atcaaacaaa 4200

agaggaaaat agaccagttg caatccaaac gagagtctaa tagaatgagg tcgaaaagta 4260

aatcgcgcgg gtttgttact gataaagcag gcaagaccta aaatgtgtaa agggcaaagt 4320

gtatactttg gcgtcacccc ttacatattt taggtctttt tttattgtgc gtaactaact 4380

tgccatcttc aaacaggagg gctggaagaa gcagaccgct aacacagtac ataaaaaagg 4440

agacatgaac gatgaacatc aaaaagtttg caaaacaagc aacagtatta acctttacta 4500

ccgcactgct ggcaggaggc gcaactcaag cgtttgcgaa agaaacgaac caaaagccat 4560

ataaggaaac atacggcatt tcccatatta cacgccatga tatgctgcaa atccctgaac 4620

agcaaaaaaa tgaaaaatat caagttcctg aattcgattc gtccacaatt aaaaatatct 4680

cttctgcaaa aggcctggac gtttgggaca gctggccatt acaaaacgct gacggcactg 4740

tcgcaaacta tcacggctac cacatcgtct ttgcattagc cggagatcct aaaaatgcgg 4800

atgacacatc gatttacatg ttctatcaaa aagtcggcga aacttctatt gacagctgga 4860

aaaacgctgg ccgcgtcttt aaagacagcg acaaattcga tgcaaatgat tctatcctaa 4920

aagaccaaac acaagaatgg tcaggttcag ccacatttac atctgacgga aaaatccgtt 4980

tattctacac tgatttctcc ggtaaacatt acggcaaaca aacactgaca actgcacaag 5040

ttaacgtatc agcatcagac agctctttga acatcaacgg tgtagaggat tataaatcaa 5100

tctttgacgg tgacggaaaa acgtatcaaa atgtacagca gttcatcgat gaaggcaact 5160

acagctcagg cgacaaccat acgctgagag atcctcacta cgtagaagat aaaggccaca 5220

aatacttagt atttgaagca aacactggaa ctgaagatgg ctaccaaggc gaagaatctt 5280

tatttaacaa agcatactat ggcaaaagca catcattctt ccgtcaagaa agtcaaaaac 5340

ttctgcaaag cgataaaaaa cgcacggctg agttagcaaa cggcgctctc ggtatgattg 5400

agctaaacga tgattacaca ctgaaaaaag tgatgaaacc gctgattgca tctaacacag 5460

taacagatga aattgaacgc gcgaacgtct ttaaaatgaa cggcaaatgg tacctgttca 5520

ctgactcccg cggatcaaaa atgacgattg acggcattac gtctaacgat atttacatgc 5580

ttggttatgt ttctaattct ttaactggcc catacaagcc gctgaacaaa actggccttg 5640

tgttaaaaat ggatcttgat cctaacgatg taacctttac ttactcacac ttcgctgtac 5700

ctcaagcgaa aggaaacaat gtcgtgatta caagctatat gacaaacaga ggattctacg 5760

cagacaaaca atcaacgttt gcgccaagct tcctgctgaa catcaaaggc aagaaaacat 5820

ctgttgtcaa agacagcatc cttgaacaag gacaattaac agttaacaaa taaaaacgca 5880

aaagaaaatg ccgatatcct attggcattt tcttttattt cttatcaaca taaaggtgaa 5940

tcccatatga actatataaa agcaggcaaa tggctaaccg tattcctaac cttttggtaa 6000

tgactccaac ttattgatag tgttttatgt tcagataatg cccgatgact ttgtcatgca 6060

gctccaccga ttttgagaac gacagcgact tccgtcccag ccgtgccagg tgctgcctca 6120

gattcacgtt atgccgctca attcgctgcg tatatcgctt gctgattacg tgcagctttc 6180

ccttcaggcg ggattcatac agcggccagc catccgtcat ccatatcacc acgtcaaagg 6240

gtgacagcag gctcataaga cgccccagcg tcgccatagt gcgttcaccg aatacgtgcg 6300

caacaaccgt cttccggaga ctgtcatacg cgtaaaacag ccagcgctgg cgcgatttag 6360

ccccgacata gccccactgt tcgtccattt ccgcgcagac gatgacgtca ctgcccggct 6420

gtatgcgcga ggttaccgac tgcggcctga gttttttaag tgacgtaaaa tcgtgttgag 6480

gccaacgccc ataatgcggg ctgttgcccg gcatccaacg ccattcatgg ccatatcaat 6540

gattttctgg tgcgtaccgg gttgagaagc ggtgtaagtg aactgcaggt ggcacttttc 6600

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 6660

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 6720

gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 6780

ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 6840

tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 6900

aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg 6960

ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 7020

agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 7080

gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 7140

gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 7200

gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 7260

cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 7320

ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 7380

cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 7440

gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 7500

cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 7560

tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttat 7620

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat acactccgct 7680

atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc 7740

ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag 7800

ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc aaggagatgg 7860

cgcccaacag tcccccggcc acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca 7920

tgagcccgaa gtggcgagcc cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag 7980

caaccgcacc tgtggcgccg gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag aggatccttt 8040

ttgtccggtg ttgggttgaa ggtgaagccg gtcggggccg cagcgggggc cggcttttca 8100

gccttgcccc cctgcttcgg ccgccgtggc tccggcgtct tgggtgccgg cgcgggttcc 8160

gcagccttgg cctgcggtgc gggcacatcg gcgggcttgg ccttgatgtg ccgcctggcg 8220

tgcgagcgga acgtctcgta ggagaacttg accttccccg tttcccgcat gtgctcccaa 8280

atggtgacga gcgcatagcc ggacgctaac gccgcctcga catccgccct caccgccagg 8340

aacgcaaccg cagcctcatc acgccggcgc ttcttggccg cgcgggattc aacccactcg 8400

gccagctcgt cggtgtagct ctttggcatc gtctctcgcc tgtcccctca gttcagtaat 8460

ttcctgcatt tgcctgtttc cagtcggtag atattccaca aaacagcagg gaagcagcgc 8520

ttttccgctg cataaccctg cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc 8580

tttttcgcac gatatacagg attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc 8640

caacggcgtc agccgggcag gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc 8700

ttcactgtcc cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg 8760

ccggctaccg ccggcgtaac agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc 8820

aggaagggca gcccacctat caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag 8880

gaaaaggcgg cggcggccgg catgagcctg tcggcctacc tgctggccgt cggccagggc 8940

tacaaaatca cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg agctggcccg catcaatggc 9000

gacctgggcc gcctgggcgg cctgctgaaa ctctggctca ccgacgaccc gcgcacggcg 9060

cggttcggtg atgccacgat cctcgccctg ctggcgaaga tcgaagagaa gcaggacgag 9120

cttggcaagg tcatgatggg cgtggtccgc ccgagggcag agccatgact tttttagccg 9180

ctaaaacggc cggggggtgc gcgtgattgc caagcacgtc cccatgcgct ccatcaagaa 9240

gagcgacttc gcggagctgg tgaagtacat caccgacgag caaggcaaga ccgagcgcct 9300

gggtcacgtg cgcgtcacga actgcgaggc aaacaccctg cccgctgtca tggccgaggt 9360

gatggcgacc cagcacggca acacccgttc cgaggccgac aagacctatc acctgctggt 9420

tagcttccgc gcgggagaga agcccgacgc ggagacgttg cgcgcgattg aggaccgcat 9480

ctgcgctggg cttggcttcg ccgagcatca gcgcgtcagt gccgtgcatc acgacaccga 9540

caacctgcac atccatatcg ccatcaacaa gattcacccg acccgaaaca ccatccatga 9600

gccgtatcgg gcctaccgcg ccctcgctga cctctgcgcg acgctcgaac gggactacgg 9660

gcttgagcgt gacaatcacg aaacgcggca gcgcgtttcc gagaaccgcg cgaacgacat 9720

ggagcggcac gcgggcgtgg aaagcctggt cggctggatc cggccacgat gcgtccggcg 9780

tagaggatct gaagatcagc agttcaacct gttgatagta cgtactaagc tctcatgttt 9840

cacgtactaa gctctcatgt ttaacgtact aagctctcat gtttaacgaa ctaaaccctc 9900

atggctaacg tactaagctc tcatggctaa cgtactaagc tctcatgttt cacgtactaa 9960

gctctcatgt ttgaacaata aaattaatat aaatcagcaa cttaaatagc ctctaaggtt 10020

ttaagtttta taagaaaaaa aagaatatat aaggctttta aagcttttaa ggtttaacgg 10080

ttgtggacaa caagccaggg atgtaacgca ctgagaagcc cttagagcct ctcaaagcaa 10140

ttttgagtga cacaggaaca cttaacggct gacatgggaa ttccacatgt ggaattccac 10200

atgtggaatt gtgagcggat aacaatttgt ggaattcccg ggagagctcg agctgcagct 10260

ggatggcaaa taatgatttt attttgactg atagtgacct gttcgttgca acaaattgat 10320

aagcaatgct ttcttataat gccaactttg tacaagaaag ctgaacgaga aacgtaaaat 10380

g 10381

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agggatgtaa cgcactgaga agc 23

<210> 15

<211> 645

<212> DNA

<213> 希瓦氏菌(shewanella oneidensis)

<400> 15

ttgatatcga tatatttagt tgacgatcat gagctggtaa gaactgggat ccgccgtatc 60

ttagaagatg agcgggggat caaagttgtc ggtgaagcgc ccgatggcga gaccgcagta 120

caatgggcta ggcaaaatga agccgacgtc atcttaatgg acatgaatat gccagttatg 180

ggcggactcg aagccacccg taaaattttg cgttatcaac cccatgccaa gattattgta 240

ttaaccgtgc ataccgaaga tcctttcccc agcaaagtga tgcaggcggg cgcgtctggt 300

tatttaacca aaggtgcgac gccacccgag gtgttgcaag cgatacgtca ggtttcccgt 360

ggtcagcgct atttatcccc tgaaatagcc caacaaatgg cattgagcca atttaatcct 420

gccgatgaga atccgtttaa agccttatct gagcgcgaac tgcaaattat gttgatgatc 480

accaacggtg aaaaggtcaa tgatatttcg gagcagctca acttaagccc aaaaaccgtt 540

aacagttacc gttaccgctt atttgcgaag ctggggatca gtggtgatgt ggagctgacc 600

cgtttagcga tccgctataa aatgttagat gctggacatt tttaa 645

Claims (3)

1.一种产电希瓦氏重组菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：敲除野生型希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1的目标基因SO_1860，得到产电希瓦氏重组菌株Δ1860，所述基因SO_1860的核苷酸序列如SEQ ID NO 15所示。

2.权利要求1的方法构建的产电希瓦氏重组菌株Δ1860。

3.权利要求2的产电希瓦氏重组菌株Δ1860产电的用途。

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