CN111733112B - 一株剑菌及其在生物产电中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株剑菌及其在生物产电中的应用。所述的剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5，由广东省微生物菌种保藏中心保藏，简称GDMCC，其保藏编号：GDMCC No：60957，保藏日期为2020年1月14日。本发明的剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5筛选分离于黑臭水体沉积物，该菌株具有较强的产电能力，能在较宽的pH（5.5‑9.5）、温度（4‑45℃）范围内生长，并且能利用多种碳源进行产电，在环境治理与能源生产领域有良好的应用前景。

Description

一株剑菌及其在生物产电中的应用

技术领域

本发明涉及环境微生物和生物能源技术领域，具体涉及一株来源于黑臭水体沉积物的具有产电能力的剑菌及其在生物产电中的应用。

背景技术

产电微生物（也可称作胞外产电菌，阳极呼吸菌）是指能够将代谢产生的电子传递到细胞外电子受体的一类具有胞外电子传递功能的微生物，多为厌氧微生物或兼性厌氧微生物。产电微生物广泛分布于土壤、废水、湖泊、海洋和河流沉积物等厌氧或缺氧环境中。

微生物燃料电池是近些年来发展迅速的生物电化学反应装置，其将传统的生物降解与电化学技术融为一体，通过微生物的电子传递将微生物可利用的有机物中的化学能转化为电能。微生物燃料电池在污染治理、生物产电和绿色化工等方面展现出广阔的应用前景。其工作原理为在阳极，产电微生物氧化可利用的有机物的同时产生电子，电子通过相应的电子传递机制传递到阴极的电子受体，阴极的电子受体一般为氧气和铁氰化钾等。

产电微生物是微生物燃料电池发展与应用的关键，而目前研究报道已获得的产电微生物的种类和数量仍十分有限，且相关研究主要集中在Geobacter和Shewanella等菌属。除此之外，很多产电微生物的产电效率较低，可应用于微生物燃料电池的产电微生物还十分有限，对于产电微生物资源的开发利用还处在起步阶段，因此亟需筛选分离获得更多高效的产电菌种。

Ensifer（剑菌属）为革兰氏阴性菌，在土壤和河流沉积物等自然环境中广泛存在。然而目前针对Ensifer降解环境污染物的研究也较多，却尚未见到关于其在生物产电领域的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于针对目前产电微生物菌种资源相对紧缺的现状，提供一株剑菌及其在生物产电中的应用。

本发明的第一个目的是提供一株具有生物产电功能的剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5，该菌株已于2020年1月14号保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：中国.广州.广东省微生物研究所，邮编：510070，保藏中心登记入册编号为GDMCC No：60957。

所述剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5来源于广东佛山容桂文塔公园的黑臭河涌的沉积物。经过微生物燃料电池富集和梯度稀释-偶氮还原筛选方法分离得到。该菌株为兼性厌氧菌、杆状、长约3 μm、宽0.8-0.9 μm，有鞭毛，革兰氏阴性。有较宽的pH（5.5-9.5）、温度（4-45℃）生长范围。该菌的显著特性是具有产电活性。

剑菌是一种革兰氏阴性、兼性厌氧细菌。目前，Ensifer菌属经系统命名的菌种，一共有14个种，分别为Ensifer adhaerens（典型株：LMG 20216），Ensifer alkalisoli（典型株：YIC4027），Ensifer aridi（典型株：RMT3），Ensifer collicola（典型株：Mol 12），Ensifer garamanticus（典型株：ORS 1400），Ensifer glycinis（典型株：CCBAU 23380），Ensifer maghrebium（典型株：ORS 1410），Ensifer mexicanus（典型株：ITTG-R7），Ensifer numidicus（典型株：ORS 1407），Ensifer psoraleae（典型株：CCBAU 65732），Ensifer sesbaniae（典型株：CCBAU 65729），Ensifer shofinae（典型株：CCBAU 251167），Ensifer sojae（典型株：CCBAU 05684），Ensifer xericitae（典型株：STM 354）。而到目前为止，还没有关于剑菌属产电的报道。

本发明的第二个目的是提供剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5在生物产电或制备微生物燃料电池中的应用。

具体包括如下步骤：

（1）将剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5接种于微生物燃料电池的阳极室中的培养基中，剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5悬浮生长在培养基中，或附着在阳极表面；

（2）接种后，通入无菌氮气排除阳极室内的氧气后密闭阳极室，进行厌氧培养，微生物燃料电池产电。

优选，所述的阳极室中的培养基组成为：磷酸氢二钠17.1-18 g/L、磷酸二氢钾3-3.6 g/L、氯化钠0.5-0.6 g/L、氯化铵1-1.2 g/L、酵母提取物0.5-0.6 g/L、乙酸钠0.82-1g/L或甲酸钠1.04-1.2 g/L或乳酸钠1.12-1.5 g/L或葡萄糖1.8-2.0 g/L，溶剂为水。

优选，所述的步骤（1）为将剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5接种于固体培养基中，置于厌氧工作站中进行静止培养，挑取菌落于无菌的PBS缓冲溶液中混匀，将混匀后的菌液接种于微生物燃料电池的阳极室中的培养基中，剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5悬浮生长在培养基中，或附着在阳极表面。

优选，厌氧工作站的温度为30-37℃。

优选，所述的固体培养基为在所述的阳极室中的培养基的基础上加入0.15-0.2mM苋菜红或甲基橙染料，以及加有15-18 g的琼脂。

所述的PBS缓冲溶液组成为：磷酸氢二钠3.6 g/L、磷酸二氢钾0.27 g/L、氯化钠8g/L、氯化钾0.2 g/L，溶剂为水，pH值为7.3-7.5。

优选，接种后的阳极室培养液的OD₆₀₀为0.05-0.06。

优选，所述的微生物燃料电池是由质子交换膜间隔的双室微生物燃料电池，阴阳两极均为石墨板；或者是单室微生物燃料电池，阳极为石墨板，阴极为载铂空气阴极。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明的剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5是来自黑臭水体沉积物的产电微生物，该菌具有较强的产电活性，能在较宽的pH（5.5-9.5）、温度（4-45℃）范围内生长；此外，该菌能利用多种碳源进行产电。这些特性说明剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5有着很强的环境适应能力，能在低温，酸性或碱性条件下氧化降解有机废物并且产生电能。该应用既可以实现环境污染的治理，又可以获得清洁的电能，有着广阔的应用前景。

本发明的剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5于2020年1月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为： GDMCC No：60957。

附图说明

图1为剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5的菌落形态电镜图。

图2为剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5的产电验证图，图中的Y5代表剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5。

图3为剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5的产电特性（循环伏安分析图），图中的Y5代表剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5。

图4为剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5利用不同碳源产电分析。其中，a：甲酸钠，b：乙酸钠，c：乳酸钠，d：葡萄糖。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。对于特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5的筛选分离：

（1）准备接种物：在广东佛山容桂文塔公园的黑臭水体中采集了河流沉积物，储存在冷藏室（5-8℃）。取适量沉积物样品进行过筛（80目）处理，搅拌均匀后备用（混合均匀的沉积物）。

（2）沉积物微生物燃料电池装置的构造及电流采集系统：沉积物微生物燃料电池的体积为1 L，是无质子交换膜的单室微生物燃料电池。阴阳两极均为碳毡（5×5 cm），并通过钛丝连接电极。阳极连接钛丝后放于电池底部，加入600 mL混合均匀的沉积物，然后缓慢加入300 mL自来水作为上覆水。阴极连接钛丝后浮于上覆水中，阴阳两极通过钛丝和1000Ω的电阻连接。电池的电阻两端连接到Kethley 2700多通道数据采集器，用于收集电池的产电数据（电压）。

（3）沉积物微生物燃料电池富集产电微生物：电池经过一段迟滞期后，电压随时间不断上升并最终趋于稳定。待电池电压稳定，电池则完成对产电微生物的富集。

（4）产电微生物的筛选分离：将富集后的电池移至超净工作台，取出阳极碳毡。将碳毡浸没于无菌的PBS缓冲液（PBS溶液组成为：磷酸氢二钠3.6 g/L、磷酸二氢钾0.27 g/L、氯化钠8 g/L、氯化钾0.2 g/L，溶剂为水，pH值为7.3-7.5，其配制方法将各成分按其含量混合均匀，调pH值为7.3-7.5，灭菌。）中，通过涡旋振荡将电极表面上的微生物移除到溶液中。该溶液作为接种物，经梯度稀释后，将不同稀释度的接种液涂布于无菌的固体培养基（培养基组成：磷酸氢二钠17.1 g/L、磷酸二氢钾3 g/L、氯化钠0.5 g/L、氯化铵1 g/L、酵母提取物0.5 g/L、乙酸钠0.82 g/L、苋菜红0.15 mM、琼脂15 g/L，溶剂为水，配制：将培养基各成分混合，溶于水，搅拌溶解，灭菌，冷却，即得）。将涂布后的固体培养基（平板）置于厌氧工作站中培养，培养温度为30-37℃。培养一定时间后，取出培养基，挑取平板培养基上的单菌落于新的培养基上划线纯化，再将新培养基置于厌氧工作站中培养，培养温度为30-37℃。重复划线纯化过程，多次进行分离纯化，一直到所有菌落的形态、颜色一致。最终获得纯培养物，该纯培养物为一株具有较高产电活性的剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5，其形态如图1所示。

（5）菌种鉴定和产电活性验证：形态分析结果表明，该剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5为杆状、长约3 μm、宽0.8-0.9 μm，有鞭毛。该菌为兼性厌氧菌，革兰氏阴性。能利用甲酸钠、乙酸钠、乳酸钠和葡萄糖等多种碳源生长。能在较宽的pH（5.5-9.5）、温度（4-45℃）范围内生长，体现了该菌较强的环境适应能力。

通过16SrRNA基因（序列如SEQ ID NO.1所示）的同源性分析表明，该菌与剑菌（Ensifer sesbaniae CCBAU 65729）的相似度达到99.97%。但是目前已发现的归属于该菌属的所有菌种中还未见具有产电能力的菌株的相关报道。因此，暂时将该菌命名为剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5。

本发明的剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5于2020年1月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼， 保藏编号为： GDMCCNo：60957。

将剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5纯培养物用无菌的药匙刮取于无菌的PBS缓冲液中，充分混匀，得到菌液，将菌液接种到双室微生物燃料电池的阳极室的LM培养基（阳极液）中，进行产电测试，接种后的阳极室培养液的OD₆₀₀为0.05-0.06，剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5悬浮生长在培养基中，或附着在阳极表面，通入无菌氮气排除阳极室内的氧气后密闭阳极室，进行厌氧培养。测试方法：双室微生物燃料电池，电池阴阳两极均为尺寸（2 cm×3.3cm×0.2 cm）相同的高纯度石墨电极。阴极室电解液为50 mM铁氰化钾溶液，溶剂为PBS缓冲液。阳极液为LM培养基（培养基组成：磷酸氢二钠18 g/L、磷酸二氢钾3.6 g/L、氯化钠0.6g/L、氯化铵1.2 g/L、酵母提取物0.6 g/L、乙酸钠1 g/L，溶剂为水，配制：将培养基各成分混合，溶于水，搅拌溶解，灭菌，冷却，即得）。测试结果表明：该菌株可以在微生物燃料电池中长期稳定地产电，如图2所示。

实施例2

本实施例公开剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5的胞外电子传递特性。如实施例1所述，将剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5接种到双室微生物燃料电池的阳极室，运行电池一直到电压达到峰值并保持稳定。然后对电池阳极室进行循环伏安扫描分析，恒电位仪采用CHI700E，Ag/AgCl电极作为参比电极，阴极作为对电极。扫描电压-0.6-0.2V，扫描速度为10mV/s，结果如图3所示。

根据已有文献报道，产电微生物的电子传递方式主要有三种：外膜细胞色素的胞外传递途径，细胞外膜上纳米导线的胞外电子传递途径以及通过分泌可溶性氧化还原电子介体的电子传递途径。由图3可知，循环伏安曲线有一较小的氧化还原峰，说明剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5在产电过程中可能产生并分泌了可溶性的氧化还原介体。因此，剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5可能存在通过自身分泌可溶性氧化还原电子介体来传递电子的电子传递。

实施例3

本实施例公开剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5利用不同碳源的产电特性。测试方法按照实施例1中所述的步骤5。实验结果表明，剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5能利用甲酸钠，乙酸钠，乳酸钠和葡萄糖等碳源进行产电，但是产电的效果不尽相同。其中，利用乙酸钠进行产电时，产电效果最好（图4）。本实施例公开的是剑菌（Ensifer sesbaniae）Y5在双室微生物燃料电池中的产电特性，旨在公开该菌可以利用多种碳源进行产电。所使用的双室微生物燃料电池及工艺不是最优化的，目前已有很多文献报道，可以通过改造电极，反应器和优化反应条件等方法来显著提高产电微生物的产电能力。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润色，这些改进和润色也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)

<120> 一株剑菌及其在生物产电中的应用

<141> 2020-07-09

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1346

<212> DNA

<213> 剑菌Y5(Ensifer sesbaniae Y5)

<400> 1

tgcaaagtcg agcgccccgc aaggggagcg gcagacgggt gagtaacgcg tgggaatcta 60

cccttttcta cggaataacg cagggaaact tgtgctaata ccgtataagc cctttggggg 120

aaagatttat cgggaaagga tgagcccgcg ttggattagc tagttggtgg ggtaaaggcc 180

taccaaggcg acgatccata gctggtctga gaggatgatc agccacattg ggactgagac 240

acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg cgcaagcctg 300

atccagccat gccgcgtgag tgatgaaggc cctagggttg taaagctctt tcaccggtga 360

agataatgac ggtaaccgga gaagaagccc cggctaactt cgtgccagca gccgcggtaa 420

tacgaagggg gctagcgttg ttcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgta ggcggacatt 480

taagtcaggg gtgaaatccc ggggctcaac cccggaactg cctttgatac tgggtgtcta 540

gagtatggaa gaggtgagtg gaattccgag tgtagaggtg aaattcgtag atattcggag 600

gaacaccagt ggcgaaggcg gctcactggt ccattactga cgctgaggtg cgaaagcgtg 660

gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tgttagccgt 720

cgggcagttt actgttcggt ggcgcagcta acgcattaaa cattccgcct ggggagtacg 780

gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 840

tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac cagcccttga catcccgatc gcggattacg 900

gagacgtttt ccttcagttc ggctggatcg gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct 960

cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca accctcgccc ttagttgcca 1020

gcatttggtt gggcactcta aggggactgc cggtgataag ccgagaggaa ggtggggatg 1080

acgtcaagtc ctcatggccc ttacgggctg ggctacacac gtgctacaat ggtggtgaca 1140

gtgggcagcg agaccgcgag gtcgagctaa tctccaaaag ccatctcagt tcggattgca 1200

ctctgcaact cgagtgcatg aagttggaat cgctagtaat cgcagatcag catgctgcgg 1260

tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cagtgggagt tggttctacc 1320

cgaaggtagt gcgctaaccg caagga 1346

Claims (10)

1.剑菌Ensifer sesbaniae Y5，其保藏编号为：GDMCC No：60957。

2.权利要求1所述的剑菌Ensifer sesbaniae Y5在生物产电或制备微生物燃料电池中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）将剑菌Ensifer sesbaniae Y5接种于微生物燃料电池的阳极室中的培养基中，剑菌Ensifer sesbaniae Y5悬浮生长在培养基中，或附着在阳极表面；

（2）接种后，通入无菌氮气排除阳极室内的氧气后密闭阳极室，进行厌氧培养，微生物燃料电池产电。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的阳极室中的培养基组成为：磷酸氢二钠17.1-18 g/L、磷酸二氢钾3-3.6 g/L、氯化钠0.5-0.6 g/L、氯化铵1-1.2 g/L、酵母提取物0.5-0.6 g/L、乙酸钠0.82-1 g/L或甲酸钠1.04-1.2 g/L或乳酸钠1.12-1.5 g/L或葡萄糖1.8-2.0 g/L，溶剂为水。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的步骤（1）为将剑菌Ensifer sesbaniae Y5接种于固体培养基中，置于厌氧工作站中进行静止培养，挑取菌落于无菌的PBS缓冲溶液中混匀，将混匀后的菌液接种于微生物燃料电池的阳极室中的培养基中，剑菌Ensifer sesbaniae Y5悬浮生长在培养基中，或附着在阳极表面。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，厌氧工作站的温度为30-37℃。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的固体培养基为在权利要求4所述的阳极室中的培养基的基础上加入0.15-0.2 mM苋菜红或0.15-0.2 mM甲基橙染料，以及加有15-18 g/L的琼脂。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的PBS缓冲溶液组成为：磷酸氢二钠3.6 g/L、磷酸二氢钾0.27 g/L、氯化钠8 g/L、氯化钾0.2 g/L，溶剂为水，pH值为7.3-7.5。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，接种后的阳极室培养液的OD₆₀₀为0.05-0.06。

10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的微生物燃料电池是由质子交换膜间隔的双室微生物燃料电池，阴阳两极均为石墨板；或者是单室微生物燃料电池，阳极为石墨板，阴极为载铂空气阴极。

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