CN109980258B - 弧菌作为海洋产电菌的产电方法 - Google Patents

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Abstract

弧菌作为海洋产电菌的产电方法，包括:a.制备弧菌作为微生物燃料电池接种物；b.制备阴极液和含燃料的阳极液；c.往微生物燃料电池阳极室中加入微生物燃料电池接种物，连接外电路，进行产电检测；d.弧菌接种于产电基础培养基中，在30℃，100rpm培养24h，采用4000rpm离心5min收集菌体，得到微生物燃料电池接种物；本发明的优点是：弧菌易于培养，能利用多种有机物产电，产电电压大。

Description

弧菌作为海洋产电菌的产电方法
技术领域
本发明涉及弧菌作为海洋产电菌的产电方法，属于微生物发电技术领域。
背景技术
微生物燃料电池（MFCs）是一种利用微生物作为催化剂，将燃料中的化学能直接转化为电能的生物反应器。近年来MFCs的研究内容在广度和深度上均有显著提升，在微生物电子传递机制等方面取得了重大发现，在系统构型、低成本高性能电极及其催化材料等方面不断获得技术突破。尤其自Habermann等首次将MFCs用于废水处理以来，因其可以利用微生物的代谢活动直接使化学能转化为电能，并能有效去除COD等污染物，同时具有比常规燃料电池的燃料来源更加多样化、操作条件更温和、无污染、可实现零排放、无需能量输入等方面的优点，成为近年来国内外处理污水和废水的研究热点，并已经在生活废水、养猪废水、酿酒废水、食品废水、乳品加工废水、大米加工废水、淀粉废水、造纸废水、染料废水、重金属废水、制药废水、焦化废水、垃圾渗滤液等多种复杂环境中进行了污染物去除和产电的相关研究。
在MFC 微生物方面，到目前为止有系统命名的菌种约有14种，绝大多数是2000年以后筛选得到的新种，主要分布于变形菌门(Proteobacteria) 和厚壁菌门(Firmicutes)，包括希瓦氏菌属(Shewanella)、地杆菌属(Geobacter)、红育菌属(Rhodoferax)和芽孢杆菌属(Bacillus)等。国内研究者也报道了分离出的产电菌，包括费氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)、克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)、Nitratireductor sp等，而副溶血性弧菌的报道则不多见。
由于海水盐度效应，以及养殖废水中污染结构与常见陆源污水的差异，增加了养殖废水的处理难度，单纯针对海水养殖废水处理的专有技术很少。目前主要采用常规的物理、化学和生化工艺处理养殖废水，目的在于降低养殖废水中的化学耗氧量(COD)、悬浮物和氨氮( NH4-N)浓度，然后部分循环利用。生物燃料电池用于海水养殖环境沉积物和废水的污染治理还有一个非常有利的条件，就是海水的导电性强，这使得MFC在治理养殖废水的同时，能更好的发挥其产电功能，达到节能环保的双重作用。目前海洋产电菌一般都是芽孢杆菌，还没有对弧菌的产电方法进行系统的研究。
发明内容
本发明的目的是提供弧菌作为海洋产电菌的产电方法。
本发明要解决的问题是目前海洋产电菌一般都是芽孢杆菌的问题。
为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：
弧菌作为海洋产电菌的产电方法，包括:
a.制备弧菌作为微生物燃料电池接种物；
b.制备阴极液和含燃料的阳极液；
c.往微生物燃料电池阳极室中加入微生物燃料电池接种物，连接外电路，进行产电检测；d.弧菌接种于产电基础培养基中，在30 ℃，100rpm培养24h，采用4000rpm离心5min收集菌体，得到微生物燃料电池接种物；
d．步骤b中的燃料为乙酸钠，阳极液为产电基础培养基和10 mM 乙酸钠的混合液，所述步骤b中的阴极液为产电基础培养基和50 mM 铁氰化钾的混合液；
e.所述步骤c中微生物燃料电池接种物的量为0. 025g/mL阳极液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明为弧菌开拓了新的应用领域，为微生物燃料电池提供了一种新的适应性强的产电微生物，弧菌易于培养，能利用多种有机物产电，产电电压大。
本发明菌株弧菌已于2018年8月21日保藏于浙江海洋大学海洋微生物菌种库，保藏编号为HD-1001。
附图说明
图1为本发明菌株弧菌(Vibrio parahaemolyticus N1A_BW)的16S rDNA系统发育树;
图2为本发明菌株弧菌(Vibrio parahaemolyticus N1A_BW)利用乙酸钠为燃料产生的电压随时间的变化曲线图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步阐明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例1：本发明菌株弧菌的筛选
a.菌株分离：
无菌采集舟山海域潮间带表面沉积物，加无菌水振荡，过滤后滤液为接种物，富集培养1-2个月，涂布于琼脂平板，置于厌氧培养箱，30℃培养，待菌落直径0. 5 cm时取典型菌落接种于富集培养基中再培养，菌落长成后再次涂布分离，如此反复几次，得到1批纯种菌株；
其中，富集培养基：蛋白胨5 g, 酵母膏1 g,氢氧化铁FeO(OH) 10 g, pH 7.0,陈海水1L；
产电基础培养基（BM）：NaCl 20.0 g, KCl 0.745 g,NaH2PO4 0.35 g, Na2HPO40.44 g, MgSO4 0.188 g, Wolfe 微量元素溶液10 mL陈海水1L；
Wolfe微量元素溶液（g/L）：FeSO4.7H2O 3，MnSO4 .2H2O 0.5，NaCl2 1.0，MgSO4.7H2O 0.1，CaCl2 0.1，ZnSO4.7H2O 0.1，CoCl2.6H2O 0.1，CuSO4.5H2O 0.01，AlK（SO4）2.12H2O 0.01；
b.产电菌的筛选：
对分离得到的纯菌株的菌液进行循环伏安CV扫描来确定所测菌株是否具有电化学活性，所接菌种先培养至对数末期，可以用分光光度计测D600，冷冻离心后用产电基础培养基重新悬浮，加入阳极室，阴极加入等量的产电基础培养基即可。利用多通道万用数字电表测量电压。
实施例2：本发明菌株弧菌(Vibrio parahaemolyticus N1A_BW)的鉴定，通过形态特征观察、生理生化测定及16S rDNA基因序列分析对实施例1得到的菌株进行鉴定；
c.形态特征观察：
弧菌为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无芽孢，该菌嗜盐畏酸，对酸较敏感，在固体培养基上菌落常隆起，圆形，表面光滑，湿润。
d.16S rDNA系统进化分析：
用细菌DNA提取试剂盒提取弧菌(Vibrio parahaemolyticus N1A_BW)的全基因，然后以提取的基因为模板，采用细菌16S rDNA通用引物27F(5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3')和1492R(5'- TACGGTTACCTTGTTACGACTT -3')进行片段扩增；
PCR反应体系（总体积50 μL）为：10×buffer 5 μL，dNTPs 0.5 μL，正反向Primer各1 μL，H2O 41 μL，Taq酶(TaKaRa) 0.5 μL，模板DNA 1 μL；
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min；55℃退火1.5min；72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；
将5μl PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为100V电泳30min，电泳完毕在253nm波长下观察并拍照，并用DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物，方法见相关试剂盒说明书。将PCR产物进行测序，测序结果利用NCBI的BLAST检索系统，检索网站为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/及EzTaxon公用数据库进行同源序列比对，从中选取相似序列，并使用MEGA4内嵌的CLUSTALW对从GenBank数据库中获得的序列相似性较高的菌株序列及原序列进行多序列匹配排列Multiple Alignments，采用邻接法Neighbour-joiningmethod对相似度较近的菌株进行聚类，构建系统发育树；
测序长度为1328bp， NCBI的GenBank登录号为MK053885，菌株与Vibrio parahaemolyticus R22进化位置最近，暂时将菌株N1A_BW命名为Vibrio parahaemolyticus N1A_BW，进化树图可参见图1。
实施例3本发明菌株弧菌以乙酸钠为燃料的产电考察：
本实施例按照现有技术和方法来构建利用弧菌发电的微生物燃料电池，实验产电测试均采用试剂瓶型双室微生物燃料电池H型，整个电池装置由两个玻璃瓶连接而成，电池装置主要为有机玻璃材质，包括阳极室、阴极室、硅胶垫圈、紧固夹、无孔瓶盖、硅胶垫、接管接头，试剂瓶容积250 mL，装入200 mL电极液，两个接口间各垫一个硅胶圈防止电极液泄露及外界空气进入，PEM位于两个硅胶圈之间，使用夹子固定，阴极和阳极均使用碳布作为电极，将准备好的碳布与铜线连接，并在连接处用环氧树脂密封好防止污染，左室阴极室和右室阳极室分别加入相应培养基，并将沉积物作为接种物加入阳极室；
本实施例的产电考察步骤为:
(1)将Vibrio parahaemolyticus N1A_BW接种于BM产电基础液体培养基中，30℃, 100rpm培养24h,4000rpm离心5min收集菌体，作为微生物燃料电池接种物；
(2)阳极室加入阳极反应液为BM产电基础液体培养基和10 mM 乙酸钠的混合液，作为电子供体，阴极室加入阴极反应液为产电基础液体培养基和50 mM 铁氰化钾，作为电子受体。
(3)往阳极室中接种Vibrio parahaemolyticus N1A_BW菌株，接种量为0.2g/mL阳极液，30℃静置培养。
(4)将阳极、阴极通过1000Ω外阻连接，数据采集卡每1s记录一次电压。
由图2可知Vibrio parahaemolyticus N1A_BW菌株可应用到微生物燃料电池中产电，以葡萄糖为燃料的微生物燃料电池最大电压达到68mV。
上述详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

Claims (1)

1.弧菌作为海洋产电菌的产电方法，其特征是：包括：
本发明菌株弧菌的筛选：（1）菌株分离：无菌采集舟山海域潮间带表面沉积物，加无菌水振荡，过滤后滤液为接种物，富集培养1-2个月，涂布于琼脂平板，置于厌氧培养箱，30℃培养，待菌落直径0. 5 cm时取典型菌落接种于富集培养基中再培养，菌落长成后再次涂布分离，如此反复几次，得到1批纯种菌株；（2）产电菌的筛选：对分离得到的纯菌株的菌液进行循环伏安CV扫描来确定所测菌株是否具有电化学活性，所接菌种先培养至对数末期，用分光光度计测D600，冷冻离心后用产电基础培养基重新悬浮，加入阳极室，阴极加入等量的产电基础培养基即可，利用多通道万用数字电表测量电压；（3）形态特征观察：弧菌为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状，无芽孢，该菌嗜盐畏酸，对酸较敏感，在固体培养基上菌落常隆起，圆形，表面光滑，湿润；（4）16S rDNA系统进化分析：用细菌DNA提取试剂盒提取弧菌(Vibrio parahaemolyticus N1A_BW)的全基因，然后以提取的基因为模板，采用细菌16SrDNA通用引物27F(5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3')和1492R(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT -3')进行片段扩增；（5）产电考察步骤为：
a.制备弧菌作为微生物燃料电池接种物；
b.制备阴极液和含燃料的阳极液；
c.往微生物燃料电池阳极室中加入微生物燃料电池接种物，连接外电路，进行产电检测；d.弧菌接种于产电基础培养基中，在30 ℃，100rpm培养24h，采用4000rpm离心5min收集菌体，得到微生物燃料电池接种物；
d．步骤b中的燃料为乙酸钠，阳极液为产电基础培养基和10 mM 乙酸钠的混合液，所述步骤b中的阴极液为产电基础培养基和50 mM 铁氰化钾的混合液；
e.所述步骤c中微生物燃料电池接种物的量为0. 025g/mL阳极液。
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