CN105255766A - 一株柴油降解菌及其菌剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一株柴油降解菌，该菌为剑菌(Ensifer？sp.)C2-10，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO：M2014653。本发明还公开了利用上述柴油降解菌制备的微生物菌剂及其在降解柴油中的应用。本发明的柴油降解菌具有较好的细胞亲油性，可直接与油滴接触并对其进行摄取，达到降解柴油的效果；本发明的柴油降解菌对柴油组分C17、C18和C21-C27等中、长链烷烃的降解率高达100％；同时采用本发明的柴油降解菌制备的微生物菌剂同样具有良好的柴油去除效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株柴油降解菌以及该菌株在环境治理领域的应用，尤其是在涉及石油烃类污染的生物治理领域的应用。
背景技术
柴油属于轻质石油产品，广泛用于大型车辆、船舰、发电机等。随着世界对石油烃类物质需求的增长，在海上开采、运输、装卸以及利用石油过程中的溢油事故也日渐增多，造成严重的环境污染。石油烃类污染物具有潜在毒性，会导致一些珍贵海洋动物的死亡，破坏生态系统的功能，对近海生态敏感去(养殖区、旅游区等)也带来巨大的经济损失。另外石油烃类污染物中的致癌、致畸等物质经过生物累积过程，通过食物链会对人类的健康产生严重的威胁。因此，研究近海柴油污染物的控制与修复问题对于保护海洋生态系统，保障人类健康安全，促进经济和社会的可持续发展具有重要意义。
微生物修复技术是指通过微生物的作用清除土壤和水体中的污染物，或是使污染物无害化的过程。相比于传统的物理、化学等油污治理方法，微生物降解修复法具有成本低、处理效率高、易于管理、无二次污染等优点，是去除环境中石油污染物的主要途径。其降解的主要过程包括石油烃吸附在微生物细胞膜表面、石油烃进入细胞膜内、石油烃与细胞内降解酶结合发生酶促反应。因此，石油烃污染修复的关键因素之一是寻求高效降解石油烃的微生物，尤其依赖于已经适应海洋环境的各种土著石油降解微生物。
发明内容
本发明公开了一株柴油降解菌，本发明还公开了利用该柴油降解菌制备的菌剂，以及利用该菌和菌剂在降解柴油中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株柴油降解菌，其特征在于：该菌为剑菌(Ensifersp.)C2-10，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2014653。
利用上述柴油降解菌在降解柴油中的应用。
所述柴油为烷烃类化合物。
一种含有上述柴油降解菌的微生物菌剂。
上述微生物菌剂的制备方法，将所述柴油降解菌与载体混合培养，离心后取出载体，用生理盐水清洗，再次离心得到固定化微生物菌剂。
所述培养方式为在30～35℃温度下，180～220r/min振荡培养36～42h，载体吸附的有效活菌数为2×108～4×108CFU/g。
所述载体为秸秆与无纺布的混合物，长度为1～4cm。
所述秸秆和无纺布的质量比为1-1.5:1.5。
利用上述微生物菌剂在降解柴油中的应用。
所述柴油为烷烃类化合物
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的柴油降解菌不产生表面活性剂，但具有较好的细胞亲油性，可通过直接与油滴接触并对其进行摄取，达到降解海洋中的柴油的效果。
(2)本发明的柴油降解菌环境适应能力较强，在海洋及土壤环境中均可以良好生长，可以解决海洋以及土壤的石油烃类污染，具有极大的应用价值。
(3)本发明的柴油降解菌可在以柴油为唯一碳源的MMC培养基中生长，具有较好的亲油性和表面张力。在最适条件(温度为30℃、pH为7.6、转速为220r/min、柴油浓度为20g/L)下柴油降解率可达到70.0％，并对柴油组分C17、C18和C21-C27等中、长链烷烃的降解率高达100％。
(4)采用本发明的柴油降解菌制备的菌剂对柴油具有良好的去除效果，在模拟海洋系统试验中，10d内对柴油的去除率为48.4％。
保藏信息
本发明提供的柴油降解菌，为剑菌(Ensifersp.)C2-10，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2014653，保藏日期为2014年12月19日。
说明书附图
图1为实施例3中生物降解后柴油中烷烃含量。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的描述。下述实施例中的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂市场购买得到，以下的“％”如无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1：本发明柴油降解菌富集分离及鉴定
采集深圳港口表层海水样品，取5mL海水样品加入100mL以柴油为唯一碳源的MMC培养基中，置于30℃、180r/min的摇床中培养7d。MMC的配方为(每升含量)：NaCl24g，MgSO4·7H2O7g，NH4NO31g，KCl0.7g，KH2PO42g，Na2HPO43g。pH7.4，1.0×105Pa灭菌30min后，补加微量元素混合液(每升含量)：CaCl20.02g，FeCl3·6H2O0.5g，CuSO40.005g，MnCl2·4H2O0.005g，ZnSO4·7H2O0.1g。
随后取5mL培养液转接至新鲜的柴油培养基，重复以上步骤，连续转接富集培养4次，培养基中柴油量依次提升至1.0g、1.5g、2.0g。将柴油乳化现象明显的富集液梯度稀释，取0.1mL涂布于2216E平板，30℃培养3-5d，待长出菌落后，挑取不同形态和颜色的单菌落，多次划线纯化分离单菌。
经反复富集分离纯化得到一株柴油降解菌。平板观察该菌落呈乳白色，圆形，边缘整齐，表面光滑、突起，有粘液，菌落直径2-4mm菌落。镜检菌体呈杆状，(0.5-0.9)×(1.2-3.0)μm，革兰氏染色阴性。
参考《常见细菌系统鉴定手册》对柴油降解菌生理生化特征进行分析，结果为：接触酶阳性，氧化酶阳性，不产H2S，M.R实验阴性，V-P实验阴性，硝酸盐还原阴性，柠檬酸盐阴性，苯丙氨酸脱氨酶阳性，淀粉水解实验阴性，葡萄糖产酸不产气，明胶液化实验阴性，15-40℃范围生长，7％NaCl生长实验阴性。
将各菌株用无菌牙签依次挑至兔血平板培养基上，30℃培养2-3d，根据菌落周围透明圈的大小判断所产表面活性剂的浓度，并测定细胞亲油性。将活化后的柴油降解菌接种于2216E培养基中制备种子液，离心、用无菌MMC洗涤2次，以5％的比例接种到柴油培养基中，以不接菌的培养基作为空白对照，30℃、180r/min培养5d。采用铂金环式表面张力测定仪测定培养液的表面张力。结果为：该柴油降解菌不产生表面活性剂，表面张力为39.39±5.11mN/m，比对照有明显下降，亲油性较好。
16SrDNA序列，见核苷酸序列表所示。将所测16SrDNA序列提交GenBank进行分析，选择相似度较高种属的模式株进行比对，结合菌落形态，生理生化特征和16SrDNA序列分析，将该柴油降解菌鉴定定为剑菌(Ensifersp.)，命名为剑菌(Ensifersp.)C2-10，以下均称之为剑菌C2-10。
实施例2：剑菌C2-10降解柴油效率的检测
采用紫外分光光度法测定柴油浓度。分别在50mL容量瓶中加入一定量的柴油母液(浓度为1.2g/L)，用二氯甲烷定容，260nm处测定吸光度。以柴油浓度为横坐标、吸光度为纵坐标制作柴油标准曲线。
将待测剑菌C2-10接至2216E液体培养基中培养至对数期，5000r/min离心5min收集菌体，用无菌MMC洗涤2次并调节活菌数≈108CFU/mL，以5％的比例(体积比)接种至柴油培养基中30℃、180r/min摇床培养，以未接菌的培养基作为对照。培养7d后，向各样品中加入50mL二氯甲烷，200r/min振荡20min，再于40℃下超声15min萃取其中的残余油污，吸取二氯甲烷相，离心去除菌体碎片，待测。
吸取1mL待测液定容于50mL容量瓶，260nm处测定吸光度，根据标准曲线计算样品中残余的柴油浓度，每样品3个重复，下同。降解率＝(C1-C2)/C1×100％，C1为对照中柴油浓度，C2为样品中柴油浓度。为保证结果的准确，本研究对建立方法的加标回收率控制在95％-105％之间。
按此方法测定剑菌C2-10对柴油的降解率为38.2％。
实施例3：环境因素对剑菌C2-10降解柴油效率的影响
向柴油培养基中接种剑菌C2-10菌液，摇床培养7d，分析以下环境因素对柴油降解的影响：(1)培养温度分别为22、26、30、34、38℃；(2)培养基初始pH值分别为6.4、7.0、7.6、8.2、8.8；(3)通气量，设置摇床转速分别为160、180、200、220、240r/min；(4)初始柴油浓度分别为1.0、5.0、10.0、20.0、40.0g/L。按照实施例2方法测定培养基中残留柴油浓度，结果表明剑菌C2-10在温度为30℃、pH为7.6、转速为220r/min、柴油浓度为20g/L时对柴油降解率最高，可达到45.7％。
采用GC-FID法对柴油降解后的残留组分定量分析。结果如图1所示，剑菌C2-10对柴油总烷烃的去除率为70.0％，其中对C17、C18和C21-C27等中链烷烃降解率可以达到100％，对C11-C13、C16、C20等烷烃的降解率也都在75％以上。
实施例4：微生物菌剂制备及应用
将剑菌C2-10活化后接种至2216E培养基中，30℃、200r/min摇床培养18h制备种子液。
微生物菌剂：将载体(秸秆：无纺布质量比＝1：1)，剪成约1-4cm的小段，灭菌后分装在已灭菌的塑料袋中备用。以1.5％的比例将载体投入2216E培养基中，按2％的比例接种C2-10种子液，32℃、200r/min条件下摇床培养42h。培养结束后离心并取出载体，用生理盐水冲洗2次后再次离心，得固定化微生物菌剂，检测载体中吸附的C2-10活菌数约为3.1×108CFU/g(以干重计)。
取上述微生物菌剂，按1.5％的比例加入柴油培养基中，30℃、200r/min振荡培养7d，测其对柴油的去除情况。结果表明，相比于游离细菌，固定化菌剂对对柴油的降解率有所提升，7d内对柴油的降解率约为54％。
实施例5：微生物菌剂在降解海洋柴油中的应用
制备一个长×宽×高约为1.5×0.8×0.7的有机玻璃容器，加入约500L的海水(取自深圳海域)，水位高约0.4m，底部采用空气泵曝气模拟海浪，体系温度为室温(26～32℃)。根据0.5kg/m2的原则均匀加入柴油0.6kg，模拟柴油污染海洋系统。按照0.1kg/m2的原则，投加菌剂0.12kg，20d后测定反应系统中的平均柴油含量，测定方法如实施例2。10d后，测得反应系统中柴油的含量有较大程度的下降，降解率约为48.4％，对照降解率约为5％。
综上所述，但本发明并不局限于上述实施方式，本领域一般技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化，均在本发明的保护范围之内。
SEQUENCELISTING
<110>深圳清华大学研究院
深圳市清研环境科技有限公司
<120>一株柴油降解菌及其菌剂和应用
<130>
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>1335
<212>DNA
<213>Ensifersp.
<400>1
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Claims (10)
1.一株柴油降解菌，其特征在于：该菌为剑菌(Ensifersp.)C2-10，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2014653。
2.利用权利要求1所述柴油降解菌在降解柴油中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述柴油为烷烃类化合物。
4.一种含有权利要求1所述柴油降解菌的微生物菌剂。
5.如权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：将所述柴油降解菌与载体混合培养，离心后取出载体，用生理盐水清洗，再次离心得到固定化微生物菌剂。
6.如权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述培养方式为在30～35℃温度下，180～220r/min振荡培养36～42h，载体吸附的有效活菌数为2×108～4×108CFU/g。
7.如权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述载体为秸秆与无纺布的混合物，长度为1～4cm。
8.如权利要求7所述的柴油降解菌剂的制备方法，其特征在于：所述秸秆和无纺布的质量比为1-1.5:1.5。
9.利用权利要求4所述微生物菌剂在降解柴油中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述柴油为烷烃类化合物。
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