CN115322923B - 一种解磷菌及其在盐碱地的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株解磷菌在盐碱地中的应用。该菌分离自甘肃省庆阳市小崆峒沟盐碱土壤中，经鉴定为Mixta theicola，命名为米克斯塔菌N1，该菌保藏单位为：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏日：2021.11.1，保藏登记号为：CCTCC M 20211350。该菌株能够在低温和较高盐碱环境中生存，并且在低温盐碱环境中具有较强的解磷能力，该菌株在低温盐碱条件下的解磷特性，可以有效为盐碱土壤中植物生长提供有效的磷，并且适合应用于我国寒冷地区广泛分布的盐碱地，为提高我国寒冷地区盐碱土壤的磷供给及盐碱地的开发利用提供了解决办法。

Description

一种解磷菌及其在盐碱地的应用

【技术领域】

本发明涉及应用微生物技术领域，具体涉及一种解磷菌及其在盐碱地的应用。

【技术背景】

土地的盐碱化使土壤理化性质无法满足作物的生长。特别是在盐碱地中植物生长所必须的磷元素主要以正磷酸盐的形式储存在土壤中，这种形式存在的磷元素很难被植物直接吸收利用。而通过施磷肥来提高土壤磷供给的方式效率不高，施入到土壤中的磷肥当季利用率低于25％，其余全部被固定在土壤中；所以如何将盐碱地中的无机正磷酸盐中的磷元素成为植物所需的有效磷的技术研发对盐碱地的作物开垦利用具有十分积极的现实意义。

中国专利CN201711267727.6_公开了一种无机解磷菌，它是一种伯克霍尔德氏菌，可吸收土壤中的难溶态的无机磷并通过自身的新陈代谢将磷固定在体内，最后再排出体外形成可以被植物吸收利用的磷形态，由此实现有效降解无机磷，减少磷肥的施用量，提高磷肥的利用率。但是微生物的生长受限于周围环境条件，盐碱土壤的高盐碱胁迫下会导致微生物无法生存或使溶磷微生物的溶磷能力完全丧失，降低了对盐碱地改良的有效性。该专利所提供的解磷菌也一样，由于其不抗盐碱，所以它对盐碱环境的土壤就不能发挥其对无机磷转换成有效磷的作用。

解磷微生物在土壤中广泛存在，它们可以溶解不溶性无机(矿物)磷，增加土壤不溶性磷的生物有效性，供植物使用。因此，给盐碱土壤接种耐盐碱性的溶磷微生物进行盐碱地改良是一种彻底解决问题的方法，使之对盐碱地土壤的改良更安全和可持续，但是自然界的大部分盐碱地中解磷微生物很少，这就需要人为地将其分离培育适合于盐碱地环境生存的解磷微生物，从而再返回盐碱地去改良盐碱地成为适合植物生长的土壤。

中国专利202011132508.9公开了一种耐盐碱解磷菌及其应用，其所述的解磷菌是巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium，其公开资料介绍能够耐受pH值9.5，5.0％NaCl的盐碱条件，在其公开的实施例中表明其在pH值7.5，1.0％NaCl的盐碱条件下3天后的解磷能力为158.24mg，在pH值9.5，5.0％NaCl的盐碱条件下3天后的解磷能力为105.28mg，但这种解磷效果是远远不够满足盐碱地的改良的，并且该公开的耐盐碱的解磷菌并不耐寒，从公开资料介绍可知其最适合的生长环境温度是30℃，所以在寒冷地区，该菌的生存能力和其表现的解磷活性就会很差，甚至没有能力，而我国很大部分的盐碱地都是分布在寒冷地区。

【发明内容】

本发明的目的是为解决上述技术的不足而提供一种能够耐受低温盐碱环境，并且有效发挥解磷能力、提高土壤可溶磷含量的解磷菌及其在盐碱地的应用。

为了实现上述目的，本发明所提供的解磷米克斯塔菌为米克斯塔菌N1，拉丁文名称是： Mixta theicolaN1，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏日：2021年11月1日，保藏登记号：CCTCC M 20211350。

本发明提供的米克斯塔菌(Mixta theicola)N1解磷菌的培养方法，包括对菌种的驯化分离，其特征是选用采自甘肃省庆阳市小崆峒沟的盐碱土壤中，具体步骤如下:

(1)驯化富集：取5g土壤在100ml无菌水中震荡混匀，吸取5ml土壤溶液加入到NaCl质量分数为5％，pH值为9.0的无机磷液体培养基中，在15℃条件下，180r/min培养6天；

(2)分离纯化：驯化富集好的菌液采用稀释涂布平板法涂到无机磷琼脂培养基上，30℃倒置培养5天，挑取产生透明圈的单菌落在无机磷琼脂培养基上划线纯化，观察纯化菌株的解磷圈产生情况，纯化得到能产生解磷圈的菌株N1。

所述用于驯化富集上述解磷菌的培养基，为无机磷液体培养基，其配方为：葡萄糖10.0g， (NH4)2S040.5g，KCl 0.3g，NaCl 50.0g，MgSO4·7H200.3g,FeS04·7H200.03g，MnS04·H2O 0.03g，Ca3(PO4)25.0g，去离子水1000m1，pH 9.0。无机磷琼脂培养基是在无机磷液体培养基中添加琼脂获得。由于琼脂添加入液体培养基中成为可划线纯化的固体培养基是本领域的常规技术，所以对琼脂的添加比例不作详细介绍和限定。

本发明提供了一种解磷菌在低温盐碱条件下解无机磷的应用，在对解磷作用的分析中，本发明提供的米克斯塔菌(Mixta theicola)N1接种至不同盐碱梯度的无机磷液体培养基中，在15℃、180r/min的条件下摇床培养3天后，当无机磷液体培养基初始pH值为8.0时，在 NaCl质量分数为7％时获得最大解磷量，为384.4mg/L；当无机磷液体培养基初始pH为9.0 时，在NaCl质量分数为3％时获得最大解磷量，为336.8mg/L。在15℃的摇床培养条件下，该菌可在pH 8、9％NaCl和pH 9、5％NaCl的低温盐碱环境中将不溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐，3天后培养基中的可溶磷磷含量达206.3mg/L、301.7mg/L。

本发明的解磷米克斯塔菌N1能够在低温和较高盐碱环境中生存，并且在低温盐碱环境中具有较强的解磷能力。该菌株在低温盐碱条件下的解磷特性，可以有效为盐碱土壤中植物生长提供有效的磷，并且适合应用于我国寒冷地区广泛分布的盐碱地，为提高我国寒冷地区盐碱土壤的磷供给及盐碱地的开发利用提供了解决办法。

本发明提供的米克斯塔菌N1解磷菌接种至无机磷液体培养基液体培养基中，在15℃低温下培养，最大可耐受到NaCl的质量分数为9％的高盐环境以及pH值为9.0的碱性环境。本发明提供的解磷菌，能适合在寒冷地区的盐碱地生存并有效解磷，能够在较低温度和盐碱胁迫下发挥解磷作用。

【附图说明】

图1为米克斯塔菌N1的扫描电镜照片。

图2为米克斯塔菌N1在低温不同含盐量条件下的生长情况。

图3为米克斯塔菌N1在低温不同碱性pH条件下的生长情况。

图4为米克斯塔菌N1在低温不同盐碱梯度条件下的解磷情况。

【具体实施方式】

以下实施例是对本发明的详细说明，本发明不局限于以下列举的实施方式。

实施例1

本实施例提供的一种解磷菌，命名为米克斯塔菌为米克斯塔菌N1，拉丁文名称是：Mixta theicolaN1，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏日：2021年11月1日，保藏登记号：CCTCC M 20211350。

本发明提供的米克斯塔菌(Mixta theicola)N1解磷菌的培养方法，包括对菌种的驯化分离，其特征是选用采自甘肃省庆阳市小崆峒沟的盐碱土壤中，具体步骤如下:

(1)驯化富集：取5g土壤在100ml无菌水中震荡混匀，吸取5ml土壤溶液加入到NaCl质量分数为5％，pH值为9.0的无机磷液体培养基中，在15℃条件下，180r/min培养6天；

(2)分离纯化：驯化富集好的菌液采用稀释涂布平板法涂到无机磷琼脂培养基上，30℃倒置培养5天，挑取产生透明圈的单菌落在无机磷琼脂培养基上划线纯化，观察纯化菌株的解磷圈产生情况，纯化得到能产生解磷圈的菌株N1。

(3)菌株鉴定：用27F和1492R通用引物扩增N1菌株16s序列，凝胶电泳检测到在1500bp左右有条带，将PCR产物送公司测序。测序结果如下序列表所示，将测序获得的16s序列在NCBI数据库进行序列比对 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD＝Get&RID＝XG4W6WK8016)，比对结果与Mixta theicola的序列同源性为98.53％，分离菌株为Mixtatheicola，命名为米克斯塔菌N1；

(4)菌体形态观察：用扫描电镜观察菌体形态，菌体形态如图1所示。

所述用于驯化富集上述解磷菌的培养基，为无机磷液体培养基，其配方为：葡萄糖10.0g，(NH4)2S040.5g，KCl 0.3g，NaCl 50.0g，MgSO4·7H200.3g,FeS04·7H200.03g，MnS04·H2O 0.03g，Ca3(PO4)25.0g，去离子水1000m1，pH 9.0。无机磷琼脂培养基是在无机磷液体培养基中添加琼脂获得。由于琼脂添加入液体培养基中成为可划线纯化的固体培养基是本领域的常规技术，所以对琼脂的添加比例不作详细介绍和限定。

实施例2：米克斯塔菌N1在低温条件耐盐能力测定。

采用LB液体培养基(胰蛋白胨10.0g、NaCl 10.0g、酵母提取物5.0g，去离子水1000ml)，设定NaCl的初始浓度梯度，其质量分数分别为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、 10％。

菌株活化：在LB液体培养基中接菌，26℃，180r/min摇床培养至OD600为0.8-1.0。

以3％的接种量接种到不同NaCl浓度梯度的培养基中，每个盐梯度设置三个重复摇瓶。在15℃，180r/min条件下培养，于第12h、24h、36h、60h测量菌液OD600，菌液OD600 的变化代表菌株在低温不同含盐量条件下的生长情况。

测定结果：

菌株在低温不同含盐量条件下的生长情况如图2所示。

在15℃的低温条件下，菌株在不同NaCl含量的LB液体培养基中的生长情况随着NaCl 含量的增加而受到抑制。在第6h，N1菌株在所有NaCl浓度梯度均生长不明显或未出现生长。在第24h、36h、60h菌液OD600值均随着NaCl浓度的增加而降低，当NaCl的质量分数为7％时菌株可以缓慢生长，第24h、36h和60h的OD600值分别为0.0895、0.1195、0.1945，直至NaCl的含量达到9％时菌株生长停滞或未出现生长，第24h、36h和60h的OD600值分别为0.071、0.0735、0.0825。

结果表明在LB液体培养基中，在15℃低温条件下，菌株N1可最大耐受到9％的NaCl含量。

实施例3：米克斯塔菌N1在低温条件下耐碱能力测定。

采用LB液体培养基，设定初始pH分别为8.0、9.0、10.0、11.0。

取活化菌液，以3％的接种量接种到不同pH梯度的培养基中，每个梯度设置三个重复摇瓶。在15℃，180r/min条件下摇床培养，于第24h、36h、48h测量菌液OD600，菌液OD600的变化代表菌株在低温不同碱性pH条件下的生长情况。

测定结果：

菌株在低温不同碱性pH条件下的生长情况如图3所示。

在15℃的低温条件下，菌液OD600值随着培养基pH的增加而降低，当pH为8时，第24h、36h、48h的OD600值分别为0.753、0.9635、1.04，菌株能够正常生长，当pH为10时，菌液的OD600值分别降至0.069、0.0645、0.065，菌株几乎不生长。

结果表明菌株在不同pH的LB液体培养基中，在15℃的低温条件下，最大可耐受到pH10 的碱性环境。

实施例4：米克斯塔菌(Mixtatheicola)N1在低温盐碱条件下解磷能力测定。

采用无机磷液体培养基(葡萄糖10.0g，(NH4)2S040.5g，KCl 0.3g，NaCl 0.3g，MgSO4·7H200.3g，FeS04·7H200.03g，MnS04·H2O 0.03g，Ca3(PO4)25.0g，去离子水1000m1，pH 7.0)，在无机磷培养基的基础上，设置NaCl初始质量分数分别为1％、3％、5％、7％、9％，并且在每个NaCl浓度上分别设置pH为8.0、9.0，形成不同盐碱梯度的无机磷液体培养基。

将活化菌液以3％的接种量分别接种到不同盐碱梯度的无机磷液体培养基中。在15℃， 180r/min条件下摇床培养3天，于第3天用钼锑抗比色法测量上清中可溶磷含量，作为菌株解磷量。

菌株在低温不同盐碱梯度条件下的解磷情况如图4所示。

米克斯塔菌N1在15℃、180r/min的摇床培养条件下培养3天后，当无机磷培养基初始 pH为8时，在NaCl质量分数为7％时获得最大解磷量，为384.4mg/L；当无机磷培养基初始pH为9时，在NaCl质量分数为3％时获得最大解磷量，为336.8mg/L。该菌可在pH 8、9％NaCl和pH 9、5％NaCl的低温盐碱环境中将不溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐，3天后培养基中的可溶磷磷含量达206.3mg/L、301.7mg/L。

结果表明米克斯塔菌N1能够耐受较高盐碱环境，并且在低温盐碱环境下具有较强的解磷能力。

从以上实施例可以看出，本发明通过从盐碱土中分离获得的米克斯塔菌N1是一株解磷菌，该菌株能够在低温和较高盐碱环境中生存，并且在低温盐碱环境中具有较强的解磷能力。该菌株在低温盐碱条件下的解磷特性，可以有效为盐碱土壤中植物生长提供有效的磷，并且适合应用于我国寒冷地区广泛分布的盐碱地，为提高我国寒冷地区盐碱土壤的磷供给及盐碱地的开发利用提供了解决办法。

序列表

<110> 浙江永峰环保科技股份有限公司

庆阳陇沣海绵城市建设管理运营有限责任公司

西北农林科技大学

<120> 一中解磷菌及其在盐碱地的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1421

<212> DNA

<213> Mixta theicola

<400> 1

gcaggctacc atgcagtcga acggtaacag ggagcagctt gctgctctgc tgacgagtgg 60

cggacgggtg agtaatgtct ggggatctgc ccgatggagg gggataacca ctggaaacgg 120

tggctaatac cgcataacgt cgcaagacca aagtggggga ccttcgggcc tcacaccatc 180

ggatgaaccc agatgggatt agctagtagg tggggtaacg gctcacctag gcgacgatcc 240

ctagctggtc tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac 300

gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt 360

gtatgaagaa ggccttcggg ttgtaaagta ctttcagcgg ggaggaaggg agcgaggtta 420

ataacctggt tcattgacgt tacccgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc 480

cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg 540

cggtctgtca agtcggatgt gaaatccccg ggctcaaccc gggaactgca ttcgaaactg 600

gcaggctaga gtcttgtaga ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa atgcgtagag 660

atctggagga ataccggtgg cgaaggcggc cccctggaca aagactgacg ctcaggtgcg 720

aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcga 780

cttggaggct gtgagcttga ctcgtggctt ccggagctaa cgcgttaagt cgaccgcctg 840

gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 900

agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tggccttgac atccacggaa 960

ttctgcagag atgcggaagt gccttcggga accgtgagac aggtgctgca tggctgtcgt 1020

cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tatcctttgt 1080

tgccagcgat tcggtcggga actcaaggga gactgccggt gataaaccgg aggaaggtgg 1140

ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg gccagggcta cacacgtgct acaatggcgc 1200

atacaaagag aagcgacctc gcgagagcaa gcggacctca taaagtgcgt cgtagtccgg 1260

atcggagtct gcaactcgac tccgtgaagt cggaatcgct agtaatcgtg gatcagaatg 1320

ccacggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt 1380

gcaaaagaag taggtagctt aaccttcggg agggcgctac c 1421

Claims (3)

1.一株解磷菌，其特征在于，该菌为米克斯塔菌(Mixtatheicola)N1，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏日：2021.11.1，保藏登记号为：CCTCCM20211350。

2.一种根据权利要求1所述的解磷菌在低温盐碱条件下解无机磷的应用。

3.根据权利要求2所述的解磷菌在低温盐碱条件下解无机磷的应用，其特征是所述无机磷为Ca₃(PO₄)₂。

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