CN108587972B - 吸附重金属的苏云金芽孢杆菌mrp-3及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及土壤保护领域，具体涉及吸附重金属的苏云金芽孢杆菌MRP‑3及其应用。所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)MRP‑3的保藏编号为CGMCC NO.15338。本发明筛选得到的菌株对重金属抗性优异，同时具有活化磷素的作用，可以应用于土壤重金属污染的原位修复。

Description

吸附重金属的苏云金芽孢杆菌MRP-3及其应用
技术领域
本发明涉及土壤保护领域，具体涉及吸附重金属的苏云金芽孢杆菌MRP-3及其应用。
背景技术
随着工业废水废气的排放、农肥不合理施用等问题，大量重金属以土壤作为最终承载体而被积累。而这些重金属不能被生物体降解或分解，只能沿着食物链逐级向上传递并最终危害到人类健康，因此土壤重金属污染问题亟需解决。
目前生物修复土壤重金属污染因其低成本，环境友好，效果好而成为研究热点，其中，利用植物吸收土壤重金属是一个重要的研究方向。植物对重金属的吸收取决于植物根际生理功能及根际圈内微生物群落组成，实际应用中植物根系常面临多种重金属同时存在的生长环境，存在于土壤中的具有重金属吸附能力的微生物则可以通过自身对重金属的吸附与转化，降低植物根系吸收重金属时所承受的压力，从而对植物进行保护。实际应用中还往往伴随植株生长缓慢，扎根浅等问题，具有解磷能力的微生物通过活化土壤磷素，可以促进植株对营养物质的吸收从而促进植物生长，但这些解磷微生物对重金属耐受性往往较差，所以能够找到并分离出具有高重金属抗性并具有解磷能力的菌株对于土壤重金属污染的生物修复有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高重金属抗性的土壤微生物苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3；
本发明从土壤中筛选得到具有高重金属抗性及较高重金属吸附能力的土壤细菌，由16S rDNA测序确定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，于2018年2月2日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号为：CGMCC NO.15338。
本发明的再一目的是提供上述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3在高浓度重金属条件下的应用，重金属包括铅、铬。
本发明的再一目的是提供上述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3在活化土壤磷素方面的应用。
本发明还提供了包含上述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3的改善土壤的生物菌剂。
本发明筛选得到的菌株对重金属抗性优异，同时具有活化磷素的作用，可以应用于土壤重金属污染的原位修复。
附图说明
图1显示苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuriniensis)MRP-3在铅、铬压力下生长量变化。
图2显示苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3对铅、铬的去除率。
图3显示苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3在磷酸三钙培养基中活化磷素的能力。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3于2018年2月2日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号为：CGMCC NO.15338。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1具有解磷能力金属抗性菌的筛选
以重金属污染土壤为细菌来源，将采集来的土壤样品放在-20℃保存。待实验时，将土壤样品解冻至常温，称取10g土壤至90mL无菌水中，在120rpm震荡30min后，制成土壤悬液。梯度稀释，对10-5～10-3稀释梯度用移液枪各取0.1mL菌液至重金属铅、铬浓度为0.5、1、2、4、8、12mM的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，涂布均匀，倒置于28℃恒温培养箱7d，观察平板中菌落生长情况，将生长出菌落的菌种采用平板涂布和分区划线法，经多次分离纯化，最终获得具有高重金属抗性的菌株，并将其接种在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，于4℃冰箱内保存备用。
将筛得的菌株挑取一环在牛肉膏蛋白胨培养液中培养28℃ 120rpm培养24h，然后取0.1mL菌液至磷酸三钙固体培养基中，涂布均匀，倒置于28℃恒温培养箱中培养7d。观察平板中菌落生长情况与溶磷圈的产生，将产生溶磷圈的菌种，采用平板涂布和分区划线法，经过多次分离纯化，最终获得具有金属抗性且有解磷能力的菌株。将筛选得到的菌种接种在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，于4℃冰箱内保存使用。
其中，所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基组成为：牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g、蛋白胨10g，蒸馏水1000mL，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至7.2左右，在121℃、110kPa条件下灭菌30min。
所述的磷酸三钙培养基组成为：葡萄糖10.0g、氯化钠0.3g、硫酸镁0.3g、硫酸锰0.03g、硫酸铵0.5g、氯化钾0.3g、硫酸铁0.03g、磷酸钙5.0g、蒸馏水1000mL、pH为7.2～7.4。对于固体培养基，需要添加琼脂粉2.0％(m/v)，所用培养基均在121℃、110kPa条件下灭菌30min。
将筛选得到的菌株使用引物27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)和1492R(5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)，使用PCR技术，扩增16S rDNA片段，并对扩增产物进行测序，得到该菌株的16S rDNA序列，进行对比，经鉴定该菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
实施例2苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)MRP-3在铅、铬压力下的生长量
制备种子液：150mL三角锥形瓶盛有牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL，灭菌。挑取一环储存于斜面培养基中的MRP-3菌体接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃，120rpm，培养12h即获得种子液。
将活化后的菌液取1mL接种至50mL含有重金属铅、铬的Luria-Bertani(LB)培养基中。上述LB培养基其配制方法为：使用浓度为500mM的硝酸铅、重铬酸钾储备液，吸取0.1mL至50mL LB培养基中，制成重金属浓度为1mM的压力条件。于28℃，120rpm，培养120h，测量OD600。
如图1所示，苏云金芽孢杆菌在铅、铬压力下生长量略微受到抑制，但与对照组相差不大，说明MRP-3具有良好的多金属抗性，优于大部分重金属污染修复菌株。
实施例3苏云金芽孢杆菌MRP-3对铅、铬的去除率
制备种子液：150mL三角锥形瓶盛有牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL，灭菌。挑取一环储存于斜面培养基中的MRP-3菌体接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃，120rpm，培养12h即获得种子液。
将活化后的菌液取1mL接种至50mL含有重金属铅、铬的LB培养基中。每隔24h取出对应菌液，4000rpm，离心10分钟，吸出上清液通过原子吸收法测定上清液浓度。上述LB培养基其配制方法为：使用浓度为500mM的硝酸铅、重铬酸钾储备液，吸取0.1mL至50mL LB培养基中，制成重金属浓度为1mM的压力条件。于28℃，120rpm，培养120h。然后使用原子吸收法测定上清液中重金属含量。
如图2所示，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)MRP-3对铅、铬的去除率分别达到了97％和20％，去除能力优于大部分报道菌株，其高效的吸附能力是本发明的特点。
实施例4苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3解磷能力的测定
制备种子液：150mL三角锥形瓶盛有牛肉膏蛋白胨液体培养基50mL，灭菌。挑取一环储存于斜面培养基中的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3菌体接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，120rpm，28℃培养12h获得种子液。
取活化好的菌液1mL至50mL磷酸三钙液体培养基中，在120rpm，28℃条件下培养7d，设置对照。
绘制可溶性磷标准曲线：分别吸取10mg/L的K2HPO4标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于50mL具塞比色管中，先加少许水，加入二硝基酚2～3滴，并用100g/L碳酸钠和50mL/L硫酸溶液调节至黄色，加入5mL钼锑抗显色剂，上下颠倒摇匀，加水定容至50mL，制成浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L的溶液。静置30min，在波长700nm处，测定吸光度，以吸光度为纵坐标，磷浓度(mg/L)为横坐标，绘制标准曲线。
测定培养液中可溶性磷含量：取5mL菌液至10mL离心管中，5000rpm离心10min取上清液过膜，然后取0.1mL至50mL具塞比色管中，加入二硝基酚2～3滴，并用100g/L碳酸钠和50mL/L硫酸溶液调节至黄色，加入5mL钼锑抗显色剂，上下颠倒摇匀，加水定容至50mL，静置30min，使用紫外可见分光光度计在700nm波长处测定吸光度，对照可溶性磷标准曲线计算出上清液中的可溶性磷含量。
如图3所示，经过24小时培养，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3解磷能力即达到99mg/L。
序列表
<110> 北京林业大学
<120> 吸附重金属的苏云金芽孢杆菌MRP-3及其应用
<130> FDI18005
<140> 2018104474679
<141> 2018-05-11
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (4)

1.苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3，其特征在于，所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3的保藏编号为CGMCC NO.15338。
2.权利要求1所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuriniensis)MRP-3在吸附重金属方面的应用，所述重金属为铅和铬。
3.权利要求1所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3在转化不溶或难溶性磷方面的应用。
4.一种改善土壤的生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)MRP-3。
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