CN116555390A - 一种微生物检测试剂及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种微生物检测试剂及检测方法。一种微生物检测试剂，包括：无菌去离子水、D‑荧光素钠盐、荧光素酶、Tris‑HCl缓冲液、硫酸铵、甘油、乙二醇、二硫苏糖醇、Tricine、硫酸镁、EDTA、叠氮化钠。本发明所述的一种微生物检测试剂及检测方法，通过利用萤火虫荧光素‑荧光素酶系统对微生物的ATP进行标记，用于微生物检测具有成本低、效率高、检测范围广等优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种微生物检测试剂及检测方法。
背景技术
有些微生物是有益的，也有些微生物的存在可引起多种应变性疾病和传染性疾病，会对人身体健康产生不良的影响；还会使食品及原料腐烂和变质。在空气或液体中，对于微生物的采集，选择合适的试验仪器发挥着不可磨灭的作用。微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义。
微生物的存在数量会直接影响样品的使用效果及储存时间，为保证样品的安全质量，现亟需一种准确、快速、便捷且安全的快速微生物检测方法，而实现这一目标需要稳定、高效、低成本的微生物检测试剂。通过使用这种微生物检测试剂，检测人员可以凭借现有的荧光技术手段进行快速检测，且具有良好的可重复性。
荧光技术是一种被普遍应用于微生物检测领域的检测技术，检测人员可以通过荧光酶标仪、荧光显微镜、荧光分光光度计或手持式荧光检测仪实现样品的检测。目前，依托荧光技术已可以实现快速的微生物检测，常见的检测手段包括酶快速反应系统、免疫荧光检测技术以及基因芯片检测技术。其中，免疫荧光检测技术需要使用特异性抗体对某类微生物的高表达蛋白进行标记，然后间接通过抗体的荧光信号进行微生物的定量。这一技术的优点是可以有针对性地识别特定的微生物，而且检测信号稳定，但这一技术的检测成本较高，部分抗体标记后的细菌可能要经过固定、孵育等步骤，耗时约在1-2天不等。另外，基因芯片检测技术也具有免疫荧光技术的特异性，但是芯片的前期研发成本较高，且需要一定时间对程序进行优化。
有鉴于此，本发明提出一种新的微生物检测试剂及检测方法，检测成本低，效率高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物检测试剂，通过利用萤火虫荧光素-荧光素酶系统对微生物的ATP进行标记，是一种基于酶促反应的检测手段，用于微生物检测具有成本低、效率高的优点。
为了实现上述目的，所采用的技术方案：
一种微生物检测试剂，包括：无菌去离子水、D-荧光素钠盐、荧光素酶、Tris-HCl缓冲液、硫酸铵、甘油、乙二醇、二硫苏糖醇、Tricine、硫酸镁、EDTA、叠氮化钠。
进一步的，所述的Tris-HCl缓冲液的浓度为1mol/L。
进一步的，所述的微生物检测试剂包括：无菌去离子水、试剂E、试剂G、试剂H、试剂B、叠氮化钠；
其中，所述的试剂B包括：无菌去离子水、Tris-HCl缓冲液、硫酸铵、乙二醇和甘油、荧光素酶；
所述的试剂E包括：无菌去离子水、tricine、硫酸镁和EDTA；
试剂F包括：所述的试剂E和无菌去离子水；
所述的试剂G包括：D-荧光素钠盐和所述的试剂F；
所述的试剂H包括：二硫苏糖醇和无菌去离子水。
再进一步的，所述的微生物检测试剂包括：8.9mL无菌去离子水、0.5mL试剂E、0.5mL试剂G、0.1mL试剂H、2.5μL试剂B、叠氮化钠；
所述的叠氮化钠的用量为微生物检测试剂中除了叠氮化钠外，其他成分总体积的0.05％。
再进一步的，所述的试剂B包括：105μL无菌去离子水、5μL的Tris-HCl、5.3mg硫酸铵、60μL乙二醇和30μL甘油、1.0mg荧光素酶；
所述的试剂E包括：10mL无菌去离子水，8.96g的tricine、1.2g硫酸镁和58.4mgEDTA；
所述的试剂F包括：450μL所述的试剂E和8550μL无菌去离子水；
所述的试剂G包括：25mgD-荧光素钠盐和8333.3μL所述的试剂F；
所述的试剂H包括：50mg二硫苏糖醇和3.24mL无菌去离子水。
本发明的目的在于提供一种微生物的检测方法，该检测方法效率快，成本低，检测信号范围大。
为了实现上述目的，所采用的技术方案：
一种微生物的检测方法，将取样后的鼻拭子，在上述的微生物检测试剂中浸润后用，放入石英比色皿中，加入PBS缓冲液，再采用荧光分光光度计进行荧光检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明所述的一种微生物检测试剂，基于提拭子-试剂分离的检测思路。拭子是常见的鼻拭子，容易获得，成本也明显低很多。试剂是通过利用萤火虫荧光素-荧光素酶系统对微生物的ATP进行标记，是一种基于酶促反应的检测手段。从而试剂材料的成本明显低于上述免疫荧光检测技术以及基因芯片检测技术，并且具有重复性高、效率高的优点。
附图说明
图1为市售微生物ATP检测仪的标准曲线；
图2为采用实施例1制备的微生物检测试剂获得的荧光分光光度计的标准曲线。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明一种微生物检测试剂及检测方法，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种微生物检测试剂及检测方法，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。
下面将结合具体的实施例，对本发明一种微生物检测试剂及检测方法做进一步的详细介绍：
本发明的微生物检测试剂是利用萤火虫荧光素-荧光素酶系统对微生物的ATP进行标记，是一种基于酶促反应的检测手段。微生物检测试剂的材料成本明显低于上述免疫荧光检测技术以及基因芯片检测技术。另外，特异性的微生物数量与微生物总量是有一定比例的，当微生物整体水平下降，特异性的微生物也会减少，而且大多数情况下很少会对特异性的微生物进行长期检测。依据这一思路，只要实现检测对象的总微生物数可控，一定程度上也可实现特异性微生物的有效控制。
目前市售的微生物ATP检测仪即是利用这一检测原理，但检测所需的耗材，如检测拭子是一次性的，且结构较为复杂，只能通过配套手持式检测仪实现检测，无法应用于其他检测设备。另外，这种拭子内存储有一定量的检测试剂，久置会有少量的挥发，且会氧化变黄，影响检测的准确性和可重复性。为实现多次的微生物总量检测，检测者需使用大量的检测拭子，而且这种拭子的单支成本在7.5元，使用成本过高。
所以，本发明提出了一种拭子-试剂分离的检测思路。拭子是常见的鼻拭子，容易获得，成本也明显低很多，而承载检测拭子的试管选用合适尺寸的石英试管。这样一来，检测者可以使用现有市售的微生物ATP检测仪，也可以使用荧光分光光度计来实现快速的微生物检测，且可凭借石英材料获得更为准确的检测信号。为实现多次的重复检测，石英试管还被设计成耐高压灭菌的，这样就可以达到耗材重复利用的目的，大大节省检测成本。
实施例1.
具体操作步骤如下：
(1)材料准备：
按照表1-2准备试剂和耗材。
表1
表2
注：上述为需要准备的基本耗材及最低使用量，在实际操作时，建议多准备一些，实际规格略有差异也可接受。
(2)配制试剂：
a：试剂B：按先后顺序依次将105μL无菌去离子水、5μL的Tris-HCl(1mol/L)、5.3mg硫酸铵、60μL乙二醇和30μL甘油混合，待所有物质全部溶解后，加入1mg荧光素酶。为使荧光素酶被充分使用，需采用少量配制好的溶液涮洗荧光素酶试剂瓶壁，并和原溶液混合。
注：①全过程不可使用涡旋混合仪，需振摇溶解。②此试剂需避光，可用铝箔纸包裹。
b：试剂E：准备10mL无菌去离子水，依次加入8.96g的tricine、1.2g硫酸镁和58.4mgEDTA，充分溶解。
c：试剂F：将450μL试剂E加入8550μL无菌去离子水中。
d：试剂G：将25mg的D-荧光素钠盐(整瓶)加入到8333.3μL试剂F中，并涮洗一遍原试剂瓶。
e：试剂H：将50mgDTT溶解于3.24mL无菌去离子水中，并分装为20份，每份150μL。
(3)配制标准反应溶液：
配制标准反应溶液：
①完全检测试剂：按照表3配制1份标准反应溶液，包含表中所有组分。另需添加除了叠氮化钠外，其他成分总体积的0.05％的叠氮化钠。
②不完全检测试剂：按照表3配制1份标准反应溶液，不包含试剂B。其原因是：试剂B现配现用，其他成分可以提前配制。
剩余组分不进行分装，所有试剂全部4℃低温保存备用，其中试剂B需避光。
表3
| 试剂名称或编号 | 状态 | 使用量 |
| 无菌去离子水 | 液体 | 8.9mL |
| 试剂E | 液体 | 0.5mL |
| 试剂H | 液体 | 0.1mL |
| 试剂G | 液体 | 0.5mL |
| 试剂B | 液体 | 2.5μL |
取1份完全检测试剂，剩余组分预估量清单如表4所示(参考用)。
表4
实施例2.
实施例1制备的微生物检测试剂可以用于以下对象：
①干燥物体表面；②潮湿物体表面；③液体样本
A所需检测条件
(1)器材：鼻拭子、石英试管(或石英比色皿)。
(2)试剂：采用实施例1配制的完全检测试剂、磷酸盐缓冲液(PBS)。
(注：下方所述内容中“检测试剂”均指“完全检测试剂”)
(3)设备：市售微生物ATP检测仪、荧光分光光度计。
B检测过程
(1)样品预处理
样品预处理只针对具有明显颗粒物(粒径10-100μm)的液体样本，需预先对该样品进行离心(500-2000rpm，1-2min)后，取上清液作为检测样本，不可采取过滤膜(过滤孔径0.2μm、0.45μm)过滤的方法。
(2)采样方法
采用鼻拭子进行采样。针对干燥物体表面以及潮湿物体表面，以鼻拭子采样头在接触面水平旋转一周为采样终点。针对液体样本，在经过预处理后，以拭子头部完全浸润为采样终点。
(3)检测方法
预先向检测用石英试管中加入(100μL检测液体)，将取样后的拭子(按照“(2)采样方法”进行采样后的拭子)插入试管中，静置15-30s后放入微生物ATP检测仪中，选择开始检测即可。一般情况下，微生物ATP检测仪检测的是反射荧光，并非透射荧光。本专利使用的是萤火虫荧光素-荧光素酶系统，属自发荧光，其发射波长为560nm，可以实现直接检测。在此方法下，微生物总量与荧光强度成正比。
针对使用荧光分光光度计的情况，需将浸润在含有实施例1制备的微生物检测试剂的石英试管中的取样后的拭子取出，放入石英比色皿中，并缓慢加入1.5mLPBS缓冲液，然后进行荧光检测。此时需注意拭子的柄长度不应超过荧光分光光度计检测池的高度，避免影响检测。
C前期检测数据
预先配制不同浓度的三磷酸腺苷(ATP)溶液，浓度分别为0.13、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和8.00pmol/L，然后分别采用市售微生物ATP检测仪和荧光分光光度计对采样后的拭子进行检测(即按照B检测过程的步骤进行检测)，每个浓度重复测定3次，全部检测完毕后绘制标准曲线。此外，将上述7个浓度的ATP试剂继续每隔15天检测一次，一共再测定4次。在此期间，检测试剂和ATP标准试剂均在4℃保存。
(1)使用市售微生物ATP检测仪
图1为市售微生物ATP检测仪的标准曲线。
表5为各浓度ATP日间日内精密度结果(n＝3)。
表5
(2)使用荧光分光光度计
图2为荧光分光光度计的标准曲线。
表6为各浓度ATP日间日内精密度结果(n＝3)。
表6
由表5-6和图1-2可知，本发明的微生物检测试剂用于微生物检测，其准确率高、稳定性强。与现有技术(ATP检测)的区别具体有：
(1)检测成本：本试剂检测成本为0.5-1.0元/单次检测，市售检测拭子中含有检测试剂，试剂不单卖，单只拭子7.5元。
(2)检测效率：按照上述检测步骤，若使用市售微生物ATP检测仪，单次检测从取样到获得数据约需1-2分钟，若使用荧光分光光度计，依据光度计单次检测样本数不同，每检测4个样本全程约需4-5分钟。
(3)检测结果可重复性：在使用市售微生物检测仪和荧光分光光度计检测时，检测结果均有良好重复性，且试剂久置也具有良好的可重复性，具体数据见第4部分。
(4)检测试剂保质期长(4℃保存2个月)，检测范围宽，且设备兼容性良好。针对检测范围，现市售微生物ATP检测仪配套检测试剂可支持0-50000的检测信号(RLU)，本发明的检测范围为0-70000RLU。
以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。
Claims (6)
1.一种微生物检测试剂，其特征在于，包括：无菌去离子水、D-荧光素钠盐、荧光素酶、Tris-HCl缓冲液、硫酸铵、甘油、乙二醇、二硫苏糖醇、Tricine、硫酸镁、EDTA、叠氮化钠。
2.根据权利要求1所述的微生物检测试剂，其特征在于，
所述的Tris-HCl缓冲液的浓度为1mol/L。
3.根据权利要求1所述的微生物检测试剂，其特征在于，
所述的微生物检测试剂包括：无菌去离子水、试剂E、试剂G、试剂H、试剂B、叠氮化钠；
其中，所述的试剂B包括：无菌去离子水、Tris-HCl缓冲液、硫酸铵、乙二醇和甘油、荧光素酶；
所述的试剂E包括：无菌去离子水、tricine、硫酸镁和EDTA；
试剂F包括：所述的试剂E和无菌去离子水；
所述的试剂G包括：D-荧光素钠盐和所述的试剂F；
所述的试剂H包括：二硫苏糖醇和无菌去离子水。
4.根据权利要求3所述的微生物检测试剂，其特征在于，
所述的微生物检测试剂包括：8.9mL无菌去离子水、0.5mL试剂E、0.5mL试剂G、0.1mL试剂H、2.5μL试剂B、叠氮化钠；
所述的叠氮化钠的用量为微生物检测试剂中除了叠氮化钠外，其他成分总体积的0.05％。
5.根据权利要求3所述的微生物检测试剂，其特征在于，
所述的试剂B包括：105μL无菌去离子水、5μL的Tris-HCl、5.3mg硫酸铵、60μL乙二醇和30μL甘油、1.0mg荧光素酶；
所述的试剂E包括：10mL无菌去离子水，8.96g的tricine、1.2g硫酸镁和58.4mgEDTA；
所述的试剂F包括：450μL所述的试剂E和8550μL无菌去离子水；
所述的试剂G包括：25mgD-荧光素钠盐和8333.3μL所述的试剂F；
所述的试剂H包括：50mg二硫苏糖醇和3.24mL无菌去离子水。
6.一种微生物的检测方法，其特征在于，
将取样后的鼻拭子，在权利要求1-5任一项所述的微生物检测试剂中浸润后用，放入石英比色皿中，加入PBS缓冲液，再采用荧光分光光度计进行荧光检测。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1680804A (zh) * | 2004-04-08 | 2005-10-12 | 广东省微生物研究所 | 微生物抗干扰快速检测方法及试剂 |
| CN1804602A (zh) * | 2005-12-15 | 2006-07-19 | 卢麟麟 | 表面清洁程度及微生物污染快速检测方法和装置 |
| CN1876829A (zh) * | 2006-03-17 | 2006-12-13 | 广东省微生物研究所 | 生物发光微生物数量抗干扰快速检测试剂盒 |
| CN1908186A (zh) * | 2005-08-09 | 2007-02-07 | 沈阳中科靓马生物工程有限公司 | 一种测定细菌总数的方法及其专用试剂与装置 |
| CN101126718A (zh) * | 2006-08-16 | 2008-02-20 | 中国科学院电子学研究所 | 用于卫生监控的表面洁净检测试剂 |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1680804A (zh) * | 2004-04-08 | 2005-10-12 | 广东省微生物研究所 | 微生物抗干扰快速检测方法及试剂 |
| CN1908186A (zh) * | 2005-08-09 | 2007-02-07 | 沈阳中科靓马生物工程有限公司 | 一种测定细菌总数的方法及其专用试剂与装置 |
| CN1804602A (zh) * | 2005-12-15 | 2006-07-19 | 卢麟麟 | 表面清洁程度及微生物污染快速检测方法和装置 |
| CN1876829A (zh) * | 2006-03-17 | 2006-12-13 | 广东省微生物研究所 | 生物发光微生物数量抗干扰快速检测试剂盒 |
| CN101126718A (zh) * | 2006-08-16 | 2008-02-20 | 中国科学院电子学研究所 | 用于卫生监控的表面洁净检测试剂 |
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