CN108548808B - 反应动力学定量探测仪及转动马达atp合酶活性检测方法 - Google Patents
反应动力学定量探测仪及转动马达atp合酶活性检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种反应动力学定量探测仪及转动马达ATP合酶活性检测方法,该检测方法包括:(1)将带电池的转动马达、磷酸根和荧光素/荧光素酶混合后分成两等份;(2)分别加入测试样品池和对照样品池;(3)在对照样品池中注入缓冲液,在测试样品池中注入不同浓度的ADP,测试样品池中发生酶促反应产生荧光;(4)开启探测仪,检测测试样品池中的产物ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光,检测对照样品池中的荧光强度;(5)针对不同标准浓度的ATP,测得对应的FATP,进而生成校准曲线;(6)制作米氏曲线;(7)根据米氏公式:拟合所得的Vmax即是衡量FoF1‑ATPase活性的参数;(8)判断FoF1‑ATPase活性。本发明能够方便快捷的检测ATP合酶活性。
Description
技术领域
本申请涉及一种检测方法,具体涉及反应动力学定量探测仪及转动马达ATP合酶活性检测方法。
背景技术
三磷酸腺苷ATP合成酶是嵌膜复合蛋白,广泛存在于细菌、线粒体和叶绿体中。位于分泌泡上的合酶也称V-ATPases,而古细菌中的合酶又称A-ATPases。ATP合酶在结构上可被分拆成嵌膜的Fo和亲水的F1两个转动马达。三对αβ亚基环成F1“定子”,γ则是其结构上非轴对称的“转子”(偏心轴);膜内的a蛋白和质子通道Cn则分别是Fo的“定子”和“转子”。两个马达的“定子”和“转子”分别通过δb2蛋白组合和ε亚基连接成一体,耦合成一个可逆马达FoF1-ATP合酶。
现有技术中还没有一种能够方便快捷的检测ATP合酶活性的方法。
发明内容
鉴于现实需要,期望提供一种能够方便快捷的ATP合酶活性的检测方法。
为了实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
本发明实施例提供一种反应动力学定量探测仪,包括:
测试转盘,所述测试转盘上设有测试样品池和对照样品池,所述测试转盘通过转轴连接电机,所述电机能够带动所述测试转盘转动和定位;
控制器,通过导线连接电机,用于控制电机的转轴转动和定位;
光电倍增管,通过导线连接所述控制器,用于采集测试样品池或对照样品池中的样品自发光的化学荧光,将所述化学荧光转换成电信号并发送给所述控制器的数据处理系统,所述控制器的数据处理系统根据接收的电信号分析测试样品或对照样品的检测浓度。
所述电机还连接有码盘和码盘计数器,用于测试样品池或对照样品池的定位,所述码盘计数器通过导线连接所述控制器。
所述测试样品池和对照样品池对称设置在所述测试转盘的中心轴线的两侧,所述测试样品池和对照样品池位于所述测试转盘的同一条轴线上。
本发明实施例还提供一种反应动力学定量探测仪,包括:
测试转盘,所述测试转盘上设有测试样品池和对照样品池,所述测试转盘通过转轴连接电机,所述电机能够带动所述测试转盘转动和定位;
控制器,通过导线连接电机,用于控制电机的转轴转动和定位;
光电倍增管,通过导线连接所述控制器,用于采集测试样品池或对照样品池中的样品自发光的化学荧光,将所述化学荧光转换成电信号并发送给所述控制器的数据处理系统,所述控制器的数据处理系统根据接收的电信号分析测试样品或对照样品的检测浓度。
所述电机还连接有码盘和码盘计数器,用于测试样品池或对照样品池的定位,所述码盘计数器通过导线连接所述控制器。
所述测试样品池和对照样品池对称设置在所述测试转盘的中心轴线的两侧,所述测试样品池和对照样品池位于所述测试转盘的同一条轴线上。
本发明还提供一种使用上述的反应动力学定量探测仪检测ATP合酶活性的方法,包括以下步骤:
(1)将带电池的转动马达、磷酸根Pi和荧光素luciferin/荧光素酶luciferase混合,得到混合物;
(2)将所述混合物分成体积相同的两等份,一份加入测试样品池,另一份加入对照样品池;
(3)在对照样品池中再注入缓冲液,在测试样品池中选择注入不同浓度的二磷酸腺苷ADP,当注入其中一种浓度ADP时,则测试样品池发生酶促反应:
根据上述反应可知:ADP通过上述反应以1:1化学计量生成ATP,终态ATP的浓度等同于初态ADP的浓度;
k+表示ATP合酶FoF1ATPase同时与ADP和Pi的结合速率;k--表示FoF1ATPase与ADP和Pi完全解离的速率;kcat表示FoF1ATPase对ADP的催化速率;
(4)开启反应动力学定量探测仪,检测测试样品池中的产物三磷酸腺苷ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度,旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度,在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线;
(5)针对不同标准浓度的ATP,测得每个浓度对应的ATP荧光强度FATP,进而生成校准曲线;
(6)制作米氏曲线:
根据所得到的校准曲线,按照以下公式拟合得到比例常数α6:
在线性区间:
[ATP]=α6FATP,
[ATP]表示ATP的浓度;FATP为与[ATP]对应的稳态时样品池荧光强度减去对照样品池的荧光强度;
VATP反应速率是所述的荧光强度时间曲线在起始点的导数:
t为检测时间,fATP为[ATP]对应的实时荧光强度;
基于终态ATP的浓度等同于初态ADP的浓度,不同浓度ADP存在对应的反应速率,以浓度为横坐标,反应速率为纵坐标,在坐标系中标出ADP浓度所述对应的VATP,连接这些点,制作得到米氏曲线;
(7)求出Vmax:
根据米氏公式:
其中,[ADP]表示ADP的浓度;
拟合所得的Vmax即是衡量FoF1-ATPase活性的参数;
(8)按照以下方法判断FoF1-ATPase活性:
测试样品池中的转动马达数量:Nm=NAv×10-3×30×10-6=3NAv×10-8;
每秒能合成ATP的数量:NATP=40×Nm=1.2NAv×10-6;
对应的每秒mM数:VATPmax=(NATP/NAv)×103/(100×10-6)=12mM/s;
如果拟合的Vmax<1mM/s,则表明马达已经失活。
所述混合物中:
所述带电池的转动马达的体积为30uL,浓度为1mM,所述Pi的体积为30uL,浓度为5mM,所述luciferin/luciferase的体积为10uL。
所述缓冲液加入量为30uL,所述缓冲液为BBS缓冲液,所述缓冲液的组分含量为:130mM NaCl,5mM KCl,1.5mM CaCl2,1mM MgSO4,5mM葡萄糖和0.1%牛血清白蛋白;pH为7.4。
所述ADP选用的标准浓度分别为1、5、10、50、100、500、1000和2000uM,体积均为30uL。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
采用本发明的检测方法能够方便快捷的检测ATP合酶活性。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述,本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为本发明实施例提供的反应动力学定量探测仪的结构示意图;
图2为本发明实施例提供的测试转盘的结构示意图;
图3是本发明实施例提供的样品池和对照池的荧光强度的时间曲线图;
图4是本发明实施例提供的校准曲线图;
图5是本发明实施例提供的米氏曲线图。
图中:
1测试转盘,2测试样品池,3对照样品池,4转轴,5电机,6控制器,7导线,8光电倍增管,9码盘,10码盘计数器。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明,而非对该发明的限定。另外还需要说明的是,为了便于描述,附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
本发明的检测原理:
转动马达ATP合酶在生命体内的主要功能是合成能量分子ATP,其力学化学之间存在紧耦合的关系,即每转一圈合作3个ATP。正常的(活性较好)ATP合酶每秒转13.3转,即合成速率为40ATP/秒。而溶液中ATP浓度可以由luciferin/luciferase的方法经荧光强度定量。因此通过luciferin/luciferase的荧光强度定量可用于鉴定ATP合酶的活性。
参见图1和图2,一种反应动力学定量探测仪,包括:
测试转盘1,测试转盘1上设有测试样品池2和对照样品池3,测试转盘1通过转轴4连接电机5,电机5能够带动测试转盘1转动和定位;
控制器6,通过导线7连接电机5,用于控制电机5的转轴4转动和定位;
光电倍增管8,通过导线7连接控制器6,用于采集测试样品池2或对照样品池3中的样品自发光的化学荧光,将所述化学荧光转换成电信号并发送给控制器6的数据处理系统,控制器6的数据处理系统根据接收的电信号分析测试样品或对照样品的检测浓度。
优选地,电机5还连接有码盘9和码盘计数器10,用于测试样品池2或对照样品池3的定位,码盘计数器10通过导线7连接控制器6。
优选地,测试样品池2和对照样品池3对称设置在测试转盘1的中心轴线的两侧,测试样品池2和对照样品池3位于测试转盘1的同一条轴线上。
本发明提供一种ATP合酶活性的检测方法,包括以下步骤:
(1)将30uL,浓度为1mM的带电池的转动马达、体积为30uL,浓度为5mM的磷酸根Pi和体积为10uL的荧光素luciferin/荧光素酶luciferase混合,得到混合物;
(2)将所述混合物分成体积相同的两等份,一份加入测试样品池,另一份加入对照样品池;
(3)在对照样品池中再注入30uL缓冲液BBS,在测试样品池中选择注入不同浓度的二磷酸腺苷ADP,[ADP]选自1、5、10、50、100、500、1000和2000uM,当注入其中一种浓度ADP时,则测试样品池发生酶促反应:
根据上述反应可知:ADP通过上述反应以1:1化学计量生成ATP,终态ATP的浓度等同于初态ADP的浓度;
k+表示ATP合酶FoF1ATPase同时与ADP和Pi的结合速率;k--表示FoF1ATPase与ADP和Pi完全解离的速率;kcat表示FoF1ATPase对ADP的催化速率,FoF1ATPase表示带电池的转动马达。
缓冲液BBS的组分含量为:130mM NaCl,5mM KCl,1.5mM CaCl2,1mM MgSO4,5mM葡萄糖和0.1%牛血清白蛋白;pH=7.4。
(4)开启反应动力学定量探测仪,检测测试样品池中的产物三磷酸腺苷ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度,旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度,在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线;
如图3所示,控制面板显示两条荧光强度(f)的时间曲线,曲线fATP代表检测样品池实时荧光强度与时间曲线,曲线fControl(对照)代表对照样品池实时荧光强度与时间曲线。对样品池起始点的荧光强度时间曲线求导,可以间接获得反应的初始速率VATP;稳态时样品池与对照池的荧光强度差(FATP=fATP-fControl)直接反应了产物ATP的浓度。
(5)针对不同标准浓度的ATP的混合物,测得每个浓度对应的ATP荧光强度FATP,进而生成校准曲线;
按照以下定义:
FATP≡[fATP-fControl]t→∞,
此公式表示ATP合成的量化指标,针对不同标准浓度的ATP([ATP]),测得对应的FATP,进而生成如图4所示的校准曲线。
图4为荧光强度与产物ATP浓度之间的标准曲线。8个标准浓度[ATP]分别为1、5、10、50、100、500、1000和2000uM,针对每个标准浓度各做9个独立实验,得到的实验数据进行平均后每个浓度对应一个点,得到如图4所示的统计结果(每个浓度9个独立实验数据统计)。整个浓度区间均呈线性,拟合结果表明:[ATP]=0.23FATP。
(6)制作米氏曲线:
根据所得到的校准曲线,按照以下公式拟合得到比例常数α6:
在线性区间:
[ATP]=α6FATP,
[ATP]表示ATP的浓度;FATP为与[ATP]对应的稳态时样品池荧光强度减去对照样品池的荧光强度;
VATP反应速率是如图3所示的荧光强度时间曲线在起始点的导数:
t为检测时间,fATP为[ATP]对应的实时荧光强度;
基于终态ATP的浓度等同于初态ADP的浓度,不同浓度ADP存在对应的反应速率,以浓度为横坐标,反应速率为纵坐标,在坐标系中标出不同ADP浓度所述对应的VATP,连接这些点,制作得到米氏曲线;
(7)求出Vmax:
根据米氏公式:
其中,[ADP]表示ADP的浓度,Vmax表示最大速率,KM表示米氏常数;
8个标准浓度[ADP]分别为1、5、10、50、100、500、1000和2000uM,针对每个标准浓度各做9个独立实验,得到的实验数据进行平均后每个浓度对应一个点,得到如图5所示的统计结果(每个浓度9个独立实验数据统计)。整个浓度区间呈米氏关系,拟合结果表明:KM=86uM,Vmax=8.65mM/s。
拟合所得的Vmax即是衡量FoF1-ATPase活性的参数;
(8)按照以下方法判断FoF1-ATPase活性:
测试样品池中的转动马达数量:Nm=NAv×10-3×30×10-6=3NAv×10-8;
每秒能合成ATP的数量:NATP=40×Nm=1.2NAv×10-6;
对应的每秒mM数:VATPmax=(NATP/NAv)×103/(100×10-6)=12mM/s;
如果拟合的Vmax<1mM/s,则表明马达已经失活;
本发明实施例Vmax=8.65mM/s,表明马达未失活。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解,本申请中所涉及的发明范围,并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案,同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下,由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
Claims (1)
1.一种使用反应动力学定量探测仪检测ATP合酶活性的方法,其特征在于,
反应动力学定量探测仪包括:
测试转盘,所述测试转盘上设有测试样品池和对照样品池,所述测试转盘通过转轴连接电机,所述电机能够带动所述测试转盘转动和定位;
控制器,通过导线连接电机,用于控制电机的转轴转动和定位;
光电倍增管,通过导线连接所述控制器,用于采集测试样品池或对照样品池中的样品自发光的化学荧光,将所述化学荧光转换成电信号并发送给所述控制器的数据处理系统,所述控制器的数据处理系统根据接收的电信号分析测试样品或对照样品的检测浓度;
所述电机还连接有码盘和码盘计数器,用于测试样品池或对照样品池的定位,所述码盘计数器通过导线连接所述控制器;
所述测试样品池和对照样品池对称设置在所述测试转盘的中心轴线的两侧,所述测试样品池和对照样品池位于所述测试转盘的同一条轴线上;
包括以下步骤:
(1)将转动分子马达ATP合酶FoF1ATPase、磷酸根Pi和荧光素/荧光素酶混合,得到混合物;
(2)将所述混合物分成体积相同的两等份,一份加入测试样品池,另一份加入对照样品池;
(3)在对照样品池中再注入缓冲液,在测试样品池中选择注入不同浓度的二磷酸腺苷ADP,则当注入其中一种浓度ADP时,测试样品池发生酶促反应:
根据上述反应可知:ADP通过上述反应以1:1化学计量生成ATP,终态ATP的浓度等同于初态ADP的浓度;
k+表示ATP合酶FoF1ATPase同时与ADP和Pi的结合速率;k--表示 FoF1ATPase与ADP和Pi完全解离的速率;kcat表示FoF1ATPase对ADP的催化速率;
(4)开启反应动力学定量探测仪,检测测试样品池中的产物三磷酸腺苷ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度,旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度,在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线;
(5)针对不同标准浓度的ATP,测得每个浓度对应的ATP荧光强度FATP,进而生成校准曲线;
(6)制作米氏曲线:
根据所得到的校准曲线,按照以下公式拟合得到比例常数α6:
在线性区间:
[ATP]=α6FATP,
[ATP]表示ATP的浓度;FATP为与[ATP]对应的稳态时测试样品池荧光强度减去对照样品池的荧光强度;
VATP反应速率是所述的荧光强度时间曲线在起始点的导数:
t为检测时间,fATP为[ATP]对应的实时荧光强度;
基于终态ATP的浓度等同于初态ADP的浓度,不同浓度ADP存在对应的反应速率,以浓度为横坐标,反应速率为纵坐标,在坐标系中标出ADP浓度所对应的VATP,连接这些点,制作得到米氏曲线;
(7)求出Vmax:
根据米氏公式:
其中,[ADP]表示ADP的浓度;
拟合所得的Vmax即是衡量FoF1-ATPase活性的参数;
(8)按照以下方法判断FoF1-ATPase活性:
测试样品池中的转动马达数量:Nm=NAv×10-3×30×10-6=3NAv×10-8;
每秒能合成ATP的数量:NATP=40×Nm=1.2NAv×10-6;
对应的每秒能合成的ATP mM数:VATPmax=(NATP/NAv)×103/(100×10-6)=12mM/s;
如果拟合的Vmax<1mM/s,则表明马达已经失活;
所述混合物中:所述转动分子马达ATP合酶FoF1ATPase的体积为30uL,浓度为1mM,所述Pi的体积为30uL,浓度为5mM,所述荧光素/荧光素酶的体积为10uL;
所述缓冲液加入量为30uL,所述缓冲液为BBS缓冲液,所述缓冲液的组分含量为:130mMNaCl,5mM KCl,1.5mM CaCl2,1mM MgSO4,5mM葡萄糖和0.1%牛血清白蛋白;pH为7.4;
所述ADP选用的标准浓度分别为1、5、10、50、100、500、1000和2000uM,体积均为30uL。
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