CN102690863B - 一种基于atp检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒及其制备和应用 - Google Patents
一种基于atp检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒及其制备和应用，试剂盒的组成为：细胞培养液、单克隆抗体包被的CD4阳性选择免疫磁珠、洗涤缓冲液、裂解液、酶反应液和ATP标准应用液。应用步骤如下：(1)分离纯化获得CD4细胞，将CD4细胞进行裂解，释放细胞内ATP；(2)将上述含ATP的样本与酶反应溶液混合，同时进行ATP标准品和样本的RLU测定，绘制标准品的ATP浓度-RLU值双对数曲线；(3)将样本的RLU值代入步骤(2)得到的标准曲线和公式，计算样本的ATP浓度值。本发明的试剂盒可实施高通量样本检测，灵敏度高，特异性好，检测结果稳定可靠。
Description
技术领域
本发明属于ATP浓度检测领域，特别涉及一种T淋巴细胞增殖活性后细胞内ATP浓度检测试剂盒及其制备和应用。
背景技术
T细胞是淋巴细胞的主要组分，按其在免疫应答中的功能又可分为CD4细胞(Th辅助淋巴细胞)和CD8细胞(Tc细胞毒T细胞)等。
CD4细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞。通过检测CD4细胞内代谢标记物ATP的浓度水平，可直接反映CD4细胞数量或增殖转化的活性，从而反应机体免疫功能水平。
ATP作为最重要的能量分子，在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用。ATP水平的改变，会影响许多细胞的功能。通常细胞在凋亡、坏死或处于一些毒性状态下，ATP水平会下降，而高葡萄糖刺激等对于一些细胞可以上调细胞内ATP水平。通常ATP水平的下降表明线粒体的功能受损或下降，在细胞凋亡时ATP水平的下降通常和线粒体的膜电位下降同时发生。
目前检测淋巴细胞增殖转化的实验室方法主要有细胞涂片染色法(形态法)，放射性核素示踪法(胸腺嘧啶(3H-T)掺入法)和MTT比色法。形态学方法简单易行，但判读结果易受主观因素影响，重复性和可靠性较差；胸腺嘧啶(3H-T)掺入法通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力，但存在环境污染的风险，使其广泛应用受限；MTT法简单、快速，但可以敏感性较差，量程较窄；本发明通过测量CD4细胞内ATP的浓度，快速测定受抗原刺激后CD4细胞的增殖反应，克服了上述方法诸多缺陷，具有灵敏度高，特异性好，检测结果稳定可靠，无放射性污染，测定浓度范围宽等优点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒及其制备和应用。
一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒，所述试剂盒的组成为：细胞培养液、CD4免疫磁珠、洗涤缓冲液、裂解液、酶反应液、ATP标准应用液、96孔检测板和荧光测量板。
所述细胞培养液为RPMI1640，含有100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素。
所述裂解液为含0.05wt％的非离子去污剂Triton X-100溶液。
所述洗涤缓冲液为含1wt％BSA的PBS磷酸盐缓冲溶液，0.4wt％的防腐剂叠氮钠。
所述酶反应液为含1mg/ml荧光素、0.5mg/ml荧光素酶、1mmol/L MgSO4、0.5mmol/LEDTA、10mmol/L二硫苏糖醇和5mg/ml牛血清白蛋白的甘氨酸甘氨酰缓冲液，pH＝7.6-7.8。
本发明的一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒的制备方法，包括：
(1)细胞培养液：选用RPMI-1640作为细胞培养或稀释用的主要缓冲液成分，分别加入双抗(青-链霉素)至工作浓度(青霉素100U/ml，链霉素0.1mg/ml)；
(2)CD4免疫磁珠：取500万个羧基化磁珠于1.5ml离心管中，加入1ml清洗缓冲液，混合均匀并超声洗涤15分钟，磁分离洗涤2遍后，重悬在250μl的2-(N-吗啉基)乙磺酸中，再分别加入500μg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和750μg N-羟基-琥珀酰亚胺，37℃条件下活化磁珠表面的羧基15min，然后用2-(N-吗啉基)乙磺酸洗涤两次，重悬后，加入25μg的CD4单克隆抗体，室温反应2h，将抗体偶联于磁珠表面，得到CD4免疫磁珠；用PBS洗涤偶联后免疫磁珠2遍，加入到50μl的PBS磷酸盐缓冲液中，4℃保存；
(3)洗涤缓冲液：取1克牛血清白蛋白(BSA)溶于0.01mol/LPBS磷酸盐缓冲溶液中，定容至100ml。然后加入4ml的10％的叠氮钠，作为防腐剂；充分混匀后，4℃保存；
(4)裂解液：采用含非离子去污剂Triton X-100的氢氧化钠碱性缓冲溶液作为裂解液，TritonX-100浓度为0.05wt％，pH 12.0-12.6；配制采用去离子纯化水，配制后电导率小于5000μS/cm，4℃保存；
(5)酶反应液：缓冲体系采用甘氨酰甘氨酸缓冲溶液。
A、50mM甘氨酰甘氨酸缓冲溶液配制方法是：先配制50毫升200mM甘氨酸溶液，用200mMNaOH调定pH到7.6，然后加水定容到200毫升即可。
B、然后，称量500mg的牛血清白蛋白至一容量瓶中，加入50mmol/L的甘氨酰甘氨酸缓冲液进行溶解，然后加入100mmol/L MgSO41ml，50mmol/L EDTA溶液1ml，1mol/L二硫苏糖醇(DTT)1ml，甘氨酰甘氨酸缓冲液补充体积定容至100ml，磁力搅拌混匀；
C、在上述步骤B配制的缓冲体系中，加入100mg荧光素、50mg荧光素酶，轻轻摇晃混匀；避光储存于-20℃的冰箱中；
(6)ATP标准品试剂：取三磷酸腺苷二钠标准品，无菌去离子水配制成浓度为1000ng/ml的ATP标准应用液；使用时采用上述步骤(4)配制的裂解液10倍倍比稀释1000ng/ml的ATP标准应用液，得到浓度分别为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0ng/ml的ATP标准品试剂；
(7)将步骤(1)～(6)得到的产品制作成基于ATP的淋巴细胞增殖活性检测试剂盒。
本发明的一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒的应用，具体步骤如下：
(1)样本准备：外周静脉血中淋巴细胞分离纯化后，加入适当的非特异抗原(如PHA、ConA等)刺激增殖转化培养；或直接采用全血细胞进行非特异抗原(如PHA、ConA等)刺激增殖转化培养。
(2)通过磁珠免疫法或流式分选进行分离纯化获得CD4细胞；将CD4细胞进行裂解，释放细胞内ATP；
(3)将上述含ATP的样本或ATP标准品与酶反应溶液按照体积比1∶3的进行混合，平板振荡混匀后，在1-10分钟内对ATP标准品和样本的进行RLU测定，绘制标准品的ATP浓度-RLU值双对数曲线；
(4)将样本的RLU值代入步骤(2)得到的标准曲线和公式，即可计算得到样本的ATP浓度值。
操作流程为：
淋巴细胞纯化或增殖转化培养——CD4阳性选择——CD4细胞裂解，ATP释放——ATP化学发光法浓度测量。
有益效果
(1)本发明定量准确，操作简单，无污染；
(2)试剂工作体系稳定可靠，发光强度强；
(3)可同时进行高通量的样本检测，灵敏度高，特异性好，检测结果稳定可靠。
附图说明
图1为本发明ATP标准品曲线。
图2为本发明检测流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
试剂盒的制备
(1)细胞培养液：选用RPMI-1640作为细胞培养或稀释用的主要缓冲液成份，分别加入双抗(青-链霉素)至工作浓度(青霉素100U/ml，链霉素0.1mg/ml)。
(2)CD4免疫磁珠：取500万个羧基化磁珠于1.5ml离心管中，加入1ml清洗缓冲液，混合均匀并超声洗涤15分钟，磁分离洗涤2遍后，重悬在250μl的2-(N-吗啉基)乙磺酸中，再分别加入500μg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和750μg N-羟基-琥珀酰亚胺，37℃条件下活化磁珠表面的羧基15min，然后用2-(N-吗啉基)乙磺酸洗涤两次，重悬后，加入25μg的CD4单克隆抗体，室温反应2h，将抗体偶联于磁珠表面，得到CD4免疫磁珠。用PBS洗涤偶联后免疫磁珠2遍，加入到50μl的PBS磷酸盐缓冲液中，4℃保存。
(3)洗涤缓冲液：取1克牛血清白蛋白(BSA)溶于0.01mol/LPBS磷酸盐缓冲溶液中，定容至100ml。然后加入4ml的10％的叠氮钠，作为防腐剂。充分混匀后，4℃保存。
(4)裂解液：采用含非离子去污剂Triton X-100的氢氧化钠碱性缓冲溶液作为裂解液，TritonX-100浓度为0.05wt％，pH 12.0-12.6。配制采用去离子纯化水，配制后电导率小于5000μS/cm，4℃保存。
(5)酶反应液：缓冲体系采用甘氨酰甘氨酸缓冲溶液。
A、50mM甘氨酰甘氨酸缓冲溶液配制方法是：先配制50毫升200mM甘氨酸溶液，用200mMNaoH调定pH到7.6，然后加水定容到200毫升即可。
B、然后，称量500mg的牛血清白蛋白至一容量瓶中，加入50mmol/L的甘氨酰甘氨酸缓冲液进行溶解，然后加入100mmol/L MgSO41ml，50mmol/L EDTA溶液1ml，1mol/L二硫苏糖醇(DTT)1ml，甘氨酰甘氨酸缓冲液补充体积定容至100ml，磁力搅拌混匀。
C、在上述步骤B配制的缓冲体系中，加入100mg荧光素、50mg荧光素酶。轻轻摇晃混匀。避光储存于-20℃的冰箱中。
(6)ATP标准品试剂：取三磷酸腺苷二钠标准品，无菌去离子水配制成浓度为1000ng/ml的ATP标准应用液；使用时采用上述步骤(4)配制的裂解液10倍倍比稀释1000ng/ml的ATP标准应用液，得到浓度分别为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0ng/ml的ATP标准品试剂。
实施例2
1.样本处理
淋巴细胞增殖转化可采用非特异性抗原刺激剂，如植物血凝素PHA(有丝分裂原刺激剂)、ConA等。
将外周静脉血中淋巴细胞分离纯化后，加入适当的非特异抗原(如PHA、ConA等)刺激增殖转化培养；或直接采用全血细胞进行非特异抗原(如PHA、ConA等)刺激增殖转化培养。
CD4细胞可以通过磁珠免疫法进行分离纯化获得，或者其他分离方法也可，如流式分选。通过本发明所提供的裂解液，进行CD4细胞的裂解和细胞内ATP的释放。
获得的ATP样本可立即进行定量检测，也可-80度冻存，1个月内测定。
2.样本检测
将含ATP的样本与酶反应溶液按照1∶3的体积比进行混合，适当混匀后，3-10分钟内，按照Luminemeter化学发光仪的检测流程，进行样本的RLU测定。
每次样本检测同时，需采用ATP标准品同时进行发光测定标准品的RLU值。并绘制标准品的ATP浓度-RLU值双对数曲线。
3.结果判断
样品的RLU与其中的AFP浓度呈正相相关，样品中的ATP浓度依据由标准品ATP浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量。将样本的RLU值代入标准曲线和公式，即可计算得到样本的ATP浓度值。
4.结果报告：
ATP浓度单位ng/ml。
根据CD4细胞内的ATP浓度水平即可以进行ATP定量描述。
Claims (1)
1.一种基于ATP检测的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒的应用，其特征在于，具体步骤如下：
(1)通过磁珠免疫法或流式分选进行分离纯化获得CD4细胞，将CD4细胞进行裂解，释放细胞内ATP；
(2)将上述含ATP的样本与酶反应溶液按照体积比1∶3的进行混合，适当混匀后，3-10分钟内同时进行ATP标准品和样本的RLU测定，绘制标准品的ATP浓度-RLU值双对数曲线；
(3)将样本的RLU值代入步骤(2)得到的标准曲线和公式，即可计算得到样本的ATP浓度值；
其中：
所述试剂盒的组成为：细胞培养液、包被单克隆抗体的CD4磁珠、洗涤缓冲液、裂解液、酶反应液、ATP标准应用液、96孔检测板,所述细胞培养液为RPMI1640，含有100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素，所述裂解液为含0.05wt％的非离子去污剂Triton X-100溶液，所述洗涤缓冲液为含1wt％BSA的PBS磷酸盐缓冲溶液，0.4wt％的防腐剂叠氮钠，所述酶反应液为含1mg/ml荧光素、0.5mg/ml荧光素酶、1mmol/L MgSO4、0.5mmol/L EDTA、10mmol/L二硫苏糖醇和5mg/ml牛血清白蛋白的甘氨酸甘氨酰缓冲液，pH＝7.6，所述ATP标准应用液为1000ng/ml的ATP标准品；
所述试剂盒的制备方法包括步骤：
(1)选用RPMI-1640作为细胞培养或稀释用的主要缓冲液成分，分别加入100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素；
(2)取500万个羧基化磁珠于1.5ml离心管中，加入1ml清洗缓冲液，混合均匀并洗涤，重悬在250μl的2-(N-吗啉基)乙磺酸中，再分别加入500μg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和750μgN-羟基-琥珀酰亚胺，37℃条件下活化磁珠表面的羧基15min，然后用2-(N-吗啉基)乙磺酸洗涤，重悬后加入25μg的CD4单克隆抗体，室温反应2h，将抗体偶联于磁珠表面，得到CD4免疫磁珠；用PBS洗涤偶联后免疫磁珠，加入到50μl的PBS磷酸盐缓冲液中，4℃保存；
(3)取1克牛血清白蛋白溶于0.01mol/L PBS磷酸盐缓冲溶液中，定容至100ml；然后加入4ml的10％的叠氮钠，作为防腐剂；充分混匀后，4℃保存；
(4)采用含非离子去污剂Triton X-100的氢氧化钠碱性缓冲溶液作为裂解液，Triton X-100浓度为0.05wt％，pH 12.0-12.6；采用去离子纯化水配制，配制后电导率小于5000μS/cm，4℃保存；
(5)缓冲体系采用甘氨酰甘氨酸缓冲溶液：
A、先配制50毫升200mM甘氨酸溶液，用200mM NaOH调定pH到7.6，然后加水定容到200毫升；
B、然后，称量500mg的牛血清白蛋白，加入50mmol/L的甘氨酰甘氨酸缓冲液进行溶解，然后加入100mmol/L MgSO41ml，50mmol/L EDTA溶液1ml，1mol/L二硫苏糖醇DTT 1ml，甘氨酰甘氨酸缓冲液补充体积定容至100ml，磁力搅拌混匀；
C、在上述步骤B配制的缓冲体系中，加入100mg荧光素、50mg荧光素酶；避光储存于-20℃的冰箱中；
(6)取三磷酸腺苷二钠标准品，无菌去离子水配制成浓度为1000ng/ml的ATP标准应用液；使用时采用上述步骤(4)配制的裂解液稀释1000ng/ml的ATP标准应用液，得到浓度分别为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0ng/ml的ATP标准品试剂；
(7)将步骤(1)～(6)得到的产品制作成基于ATP的淋巴细胞增殖活性分析试剂盒；
所述应用用于非诊断和治疗目的。
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