CN113564225B

CN113564225B - 用于atp检测的细胞裂解液及其应用

Info

Publication number: CN113564225B
Application number: CN202111109674.1A
Authority: CN
Inventors: 楼建荣; 杨翔; 谢桂华; 黄婷
Original assignee: Leide Biosciences Co ltd
Current assignee: Leide Biosciences Co ltd
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2022-01-07
Anticipated expiration: 2041-09-23
Also published as: CN113564225A

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了用于ATP检测的细胞裂解液及其应用，细胞裂解液通过在缓冲液中添加TritonX‑100、EDTA和NaCl等制备得到。本发明一些实例的细胞裂解液，可以在裂解细胞的同时并很好地稳定其中的ATP，裂解后的样品可以稳定保存于2～8℃的环境下，有助于获得更为准确的ATP检测结果，存储条件易满足。与现有的细胞裂解液相比，其检测的稳定性得到了大幅度提升，且操作方便，易于配制，且成本较低等优点。本发明一些实例的细胞裂解液，裂解液本身可稳定保存于2‑8℃，存储条件易满足，使用时不需要反复冻融。

Description

用于ATP检测的细胞裂解液及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及一种用于ATP检测的细胞裂解液及其应用。

背景技术

免疫功能由免疫细胞来完成，通过监测个体的免疫细胞，可为个体的免疫功能评估提供依据。ATP测定法是一种快速又灵敏的测定免疫细胞功能的方法，活化后淋巴细胞内ATP的含量可以反应细胞的免疫状态。其中，活化后淋巴细胞需要进行细胞裂解后，才能测定淋巴细胞内的ATP含量。使用过程中，通过在全血中加入刺激物进行孵育后，用CD4抗体磁珠免疫分选出CD4细胞，使用磁力架洗涤出选定的CD4细胞后，加入裂解液和荧光素酶-荧光素底物，释放细胞内ATP并通过化学发光免疫分析仪进行荧光值的测定。

ATP是一种易于被生物酶利用的能量分子，因此ATP测定法中的细胞裂解需要考虑多种因素，不仅需要能完全有效地对细胞进行裂解，而且需要抑制胞内ATP降解酶的活性，从而令胞内ATP的检测值在一定检测时间内保持稳定，达到稳定检测，并且，其不能对后续ATP生物荧光法检测的整个反应体系产生影响。这对细胞裂解提出了更高的要求。

目前，细胞裂解的方法主要包括：反复冻溶法（热休克法）、超声破碎法和裂解液处理法等。反复冻溶法以及超声破碎法需要专业的仪器，对检测的推广应用有较多限制，而且其无法有效抑制胞内ATP降解酶的活性，使得细胞裂解后胞内ATP含量检测值下降快，无法在一定的检测时间内达到稳定检测。裂解液处理法属于较为温和的方法，也应用最为广泛。细胞裂解液通过去污剂破坏脂质双分子层、破裂细胞；溶解蛋白；蛋白变性使其稳定；抑制蛋白酶活性。不同的实验目的，裂解液的组分有所不同。

CN110702476A公开了一种ATP体外磷酸化样本制备方法，其使用的细胞裂解液组成为20mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA和1vol.％Triton X-100，并加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，需要于-20℃下保存裂解后的样本。

商品化的细胞裂解液有多种，可以较为高效地裂解细胞，然而专用于ATP检测的细胞裂解液较少。常见的商品化ATP检测试剂有碧云天S0026，裂解后样品中的ATP在室温不太稳定，需在4℃或冰上操作。其他商品化的ATP裂解液也存在类似的问题，这导致ATP的检测结果受时间影响巨大，无法达到稳定检测，检测结果不够准确。另外，大部分针对ATP检测优化的裂解液需要保存在-20℃（如Sigma-Aldrich旗下的ATP生物发光测定试剂盒，要求储存于-20℃）。储存要求较高，使用时需要反复冻融，使用不便。

开发出一种可以有效维持裂解液中ATP稳定的细胞裂解液，对于准确测定细胞中ATP的量有着非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种特别适用于ATP检测的细胞裂解液及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种用于ATP检测的细胞裂解液，其基础液为缓冲液，所述基础液中添加了0.1～1v/v % TritonX-100、5～15 mM的EDTA、100～150 mM的NaCl。

在一些实例中，所述缓冲液选自HEPES、Tricine、Tris缓冲液中的一种。

在一些实例中，所述缓冲液为Tricine缓冲液，浓度为25～100 mM。

在一些实例中，所述TritonX-100的添加量为0.25 v/v %。

在一些实例中，所述细胞裂解液的pH为7.5～9.5。

在一些实例中，所述细胞裂解液添加有防腐剂适量和/或裂解反应指示剂适量。

在一些实例中，所述防腐剂选自青霉素、链霉素中的至少一种。

在一些实例中，所述裂解反应指示剂选自酚红或酚蓝。

在一些实例中，所述细胞裂解液的组成为：基础液为25-100mM Tricine缓冲液，所述基础液中添加了0.25 v/v % TritonX-100、10 mM的EDTA、100 mM的NaCl。

本发明的第二个方面，提供：

一种ATP检测试剂盒，包括ATP发光值检测试剂和细胞裂解液，所述细胞裂解液如本发明第一个方面所述。

本发明的第三个方面，提供：

一种细胞裂解方法，包括使用本发明第一个方面所述的细胞裂解液对细胞进行裂解处理。

本发明的有益效果是：

本发明一些实例的细胞裂解液，可以在裂解细胞的同时并很好地稳定其中的ATP，裂解后的样品可以稳定保存于2～8℃的环境下，有助于获得更为准确的ATP检测结果，存储条件易满足。与现有的细胞裂解液相比，其检测的稳定性得到了大幅度提升，且操作方便，易于配制，且成本较低等优点。

本发明一些实例的细胞裂解液，裂解液本身可稳定保存于2-8℃，存储条件易满足，使用时不需要反复冻融。

附图说明

图1是不同缓冲液对ATP发光值的影响；

图2是本发明一些实例细胞裂解液的裂解效果；

图3是本发明一些实例细胞裂解液裂解后细胞的AO/PI染色图；

图4是不同裂解液ATP检测值随读板时间的变化图；

图5是不同裂解液裂解细胞后保存时间对ATP含量的影响。

具体实施方式

本发明的第一个方面，提供：

在一些实例中，所述缓冲液为Tricine缓冲液，浓度为25～100 mM。实验数据显示，这一浓度下的缓冲液，更有利于ATP的检测。

在一些实例中，所述TritonX-100的添加量为0.25 v/v %。

在一些实例中，所述裂解反应指示剂选自酚红或酚蓝。

裂解液的pH无特殊要求，对裂解效果和检测结果基本无影响，主要是使裂解反应指示剂可以更好地反应显色。裂解液的pH可以根据裂解反应指示剂的种类进行相应的调整。在一些实例中，所述细胞裂解液的pH为7.5～9.5。

在一些实例中，所述细胞裂解液的组成为：基础液为25-100mM Tricine缓冲液，所述基础液中添加了0.25 v/v % TritonX-100、10 mM的EDTA、100 mM的NaCl。实验结果显示，这一组成在所有的实例中，具有最佳的性能。

本发明的第二个方面，提供：

本发明的第三个方面，提供：

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：缓冲体系的选择

选择常用的不同种类的缓冲体系（HEPES、Tricine、Tris）进行缓冲体系的筛选，反应工作液包括反应液（0.5%BSA，40mm MgSO₄，不同缓冲液），荧光素酶（sigma），荧光素底物（麦克林），反应液、荧光素酶、荧光素底物按1000:3:6体积比混合，在检测孔中依次加入不同浓度的ATP校准品，70ul/孔，在每孔ATP校准品中加入70ul ATP反应工作液，18～28℃条件下避光静置反应5min，采用化学发光免疫分析仪进行ATP发光值检测。

实验结果如图1所示。结果显示HEPES、Tricine和Tris缓冲液均可工作，发光检测值比较Tris＜ HEPES＜ Tricine，优选检测值更高的Tricine缓冲液作为裂解液中的缓冲液。

实施例2：不同细胞裂解液组成对ATP检测的影响

从PBMC细胞中磁分选出CD4细胞（细胞密度约为5×10⁶个/ml），在微孔中加入20ulCD4细胞悬液，采用 20mM Tricine缓冲液按表1配置裂解液，将80ul裂解液加入细胞悬液中裂解10min，磁力架吸附磁珠，取70ul裂解物至检测孔，加入70ul ATP反应工作液，18-28℃条件下避光静置反应5min，室温条件下稳定10min，采用化学发光免疫分析ATP发光值检测，检测结果如表2所示。

表1

表2

从表2的结果可知，采用含NP-40的裂解液，不同显色时间的发光值太低，几乎不能检测到裂解后的ATP值；含浓度为0.1-0.05%(v/v) SDS的裂解液，发光检测值太低，稳定性结果可信度不高，当SDS在浓度0.01-0.005%，裂解细胞在20min内稳定性大于0.9，且检测值高，结果可靠，但由于0.1-0.005%(v/v)SDS裂解液条件下，磁珠聚集成有粘性的团，且失去磁性，影响后续检测结果；相较而言，含0.125%(v/v)-1%(v/v) TritonX-100的裂解液，发光检测值高，结果可靠稳定，且没有磁珠聚集的情况出现，因此裂解液优先选择TritonX-100，且从不同浓度的TritonX-100发光检测值分析，使用0.25% TritonX-100裂解液的检测值最大，说明该浓度下的裂解液的ATP产出率最高。

实施例3：不同组成细胞裂解液对ATP检测的影响

从PBMC细胞中磁分选出CD4细胞（细胞密度约为5×10⁶个/ml），在微孔中加入20ulCD4细胞悬液（约1×10⁵个CD4细胞），将80ul裂解液加入细胞悬液中裂解10min，磁力架吸附磁珠，取70ul裂解物至检测孔，加入70ul ATP反应工作液，18-28℃条件下避光静置反应5min，室温条件下稳定10min，采用化学发光免疫分析仪进行ATP发光值检测，测试不同组成细胞裂解液对ATP检测的影响。裂解液1-6的组成如表3所示，检测结果如表4所示。

表3

表4

从表4的数据可知，裂解液1-5的ATP检测值在20min内可以基本稳定在90%以上，而裂解液6的ATP检测值在20min内的稳定性在80%以下。这说明裂解液的组成对于ATP的稳定性有着明显的影响。

实施例4

在CD4细胞密度（细胞密度约为5×10⁶个/ml）保存一致的条件下，在微孔内加入不同倍数（4倍、2倍、1倍）体积的细胞悬液进行进一步验证，分别在检测孔中分别加入80ul、40ul和20ul的CD4细胞悬液，并进行裂解液1-6稀释液的ATP发光值检测。结果见表5。

表5

表5的结果显示，裂解液1、5、6稀释后的ATP检测不稳定，而裂解液2、3、4的检测结果则相对稳定，表明EDTA对检测结果的稳定性有着难以预见的影响。

实施例5：不同防腐剂对ATP检测的影响

从PBMC细胞中磁分选出CD4细胞（细胞密度约为5×10⁶个/ml），在微孔中加入20ulCD4细胞悬液（约1×10⁵个CD4细胞），固定的裂解液组分为Tricine缓冲液、0.25% TritonX-100、10mM EDTA和100mM NaCl，分别在该固定的裂解液组分中分别加入常用的防腐剂NaN₃、PC300、双抗(青霉素 0.1 KU/ml，链霉素 0.1 mg/ml)和硫柳汞钠进行ATP检测，将80ul裂解液加入细胞悬液中裂解10min，磁力架吸附磁珠，取70ul裂解物至检测孔，加入70ul ATP反应工作液，18-28℃条件下避光静置反应5min，采用化学发光免疫分析仪进行ATP发光值检测。结果如表6所示。

表6

从表6的数据可知，NaN₃、PC300和硫柳汞钠会影响荧光素酶的活性，当其应用于ATP检测时，其检测到的发光值均在100左右，检测到的发光检测值太低，根本无法应用于ATP的检测。双抗应用于裂解液组合物，对整个裂解反应并无不良影响，ATP检测值在20min内也可以保持稳定在90%以上。

实施例6：裂解液的裂解效果检测

采用添加或不添加本发明裂解液对PBMC细胞进行ATP检测，在加入同样数量的细胞后进行发光值检测，验证裂解液对细胞的裂解效果。

裂解液采用25mM Tricine、100mM NaCl、10mM EDTA、0.25% TritonX-100、0.0005%酚红溶液、青霉素-链霉素溶液（青霉素 0.1 KU/ml；链霉素 0.1 mg/ml）进行配制，下同。

使用方法如下：

（1）细胞裂解：每孔细胞离心去上清，细胞沉淀中加入80ul裂解液，对照组加入80ul缓冲液，吹打混匀，室温放置5min后，吸取70ul至反应微板条；

（2）反应：将反应液、荧光素酶、荧光素底物按照1000:3:24配制成反应工作液，每孔加入70ul的反应工作液，18℃-28℃条件下避光静置反应5min；

（3）读数：利用化学发光免疫分析仪进行荧光测读。

检测结果如图2和图3所示。图3为采用本发明裂解液裂解后细胞的AO/PI染色图，从图2和图3可以看出，其中活细胞率为0%，本发明裂解液能裂解几乎所有的活细胞，释放ATP用于检测，非常有利于ATP的检测。

实施例7：裂解液的裂解检测值稳定性

采用不同裂解液以及对应的ATP检测试剂盒对PBMC细胞进行裂解，并检测裂解后细胞ATP含量，对检测结果进行间隔读板，对不同读板时间检测值进行比对。碧云天为其品牌下的ATP检测试剂盒，下同。

使用方法如下：

（1）CD4分选：将10M PBMC细胞采用3ml RPMI 1640重悬，均匀分配至96孔U型板，每孔100ul，加入30ul稀释10倍后的磁珠，室温600rpm摇动孵育20min；

（2）洗涤3次：第一次洗涤，保持96孔U型细胞培养板在磁力架上，每孔加入200ul洗涤液磁力架吸附2 ～ 3分钟，吸去上清；第二次洗涤，移去磁力架，每孔加入200ul洗涤液，轻轻吹打3 ～ 5次分散磁珠，磁力架吸附2 ～ 3分钟，吸去上清；第三次洗涤，移去磁力架，每孔加入200ul洗涤液，轻轻吹打3 ～ 5次分散磁珠，室温600 rpm摇动孵育3min，磁力架吸附2 ～ 3分钟，吸去上清；

（3）细胞裂解与检测：将洗涤完成得到的细胞分别按照对应试剂盒的ATP检测部分说明书进行细胞裂解和反应；

（4）读数：使用多功能酶标仪读取全波长下发光值。

检测结果如图4所示。从图4可以看出，采用本发明裂解液能快速检测细胞裂解后的ATP，并且反应完在一段之间内（1h）进行检测均能保持较高的稳定性，稳定性优于碧云天ATP检测试剂盒。

实施例8：裂解液中ATP保存的稳定性

采用不同裂解液以及对应的ATP检测试剂盒对PBMC细胞进行裂解和检测，首先将裂解后的细胞裂解物均匀分配至每管，在2-8℃进行不同时间的保存，对保存时长不同的样本分别进行检测，并对检测值进行比对。

检测结果如图5所示。从图5可以看出，本发明裂解液细胞裂解后，在2-8℃存放7天仍有相对较好的稳定性，仅下降10%左右，在更低温度存放则保存时间更久，具有较好的保存稳定性，便于样本的集中检测。

实施例9：裂解液保存的稳定性

检验方法同实施例4，使用的检测试剂分别为2-8℃保存的试剂和37℃保存14天的试剂。对2例样本进行检测，实验结果如表7所示。

表7

如表7的实验数据所显示的，加速14天的试剂检测值与2-8℃保存的基本一致，稳定性较好。

实施例10：检测CD4细胞中三磷酸腺苷（ATP）的化学发光检测试剂盒的应用

该检测试剂盒用于检测经外源凝集素刺激CD4细胞产生的ATP。

使用方法如下：

（1）样本采集：采用肝素真空采血管收集不少于2ml的人静脉血；

（2）样本准备：将收集的血样与RPMI 1640按照1:3进行稀释，混匀备用；

（3）刺激剂准备：取出外源凝集素母液，稀释成终浓度的5倍，混匀备用；

（4）刺激：在刺激孔中加入25ul稀释过的外源凝集素，未刺激孔中加入等体积的RPMI 1640，然后在刺激孔和非刺激孔分别加入100ul稀释过的血样，室温600rpm摇动孵育2min，置于37℃培养箱培养15-18小时；

（5）CD4分选：在培养完成的样本中每孔加入30ul稀释10倍后的磁珠，室温600rpm摇动孵育20min；

（6）洗涤3次：第一次洗涤，保持96孔U型细胞培养板在磁力架上，每孔加入200ul洗涤液磁力架吸附2 ～ 3分钟，吸去上清；第二次洗涤，移去磁力架，每孔加入200ul洗涤液，轻轻吹打3 ～ 5次分散磁珠，磁力架吸附2 ～ 3分钟，吸去上清；第三次洗涤，移去磁力架，每孔加入200ul洗涤液，轻轻吹打3 ～ 5次分散磁珠，室温600 rpm摇动孵育3min，磁力架吸附2 ～ 3分钟，吸去上清；

（7）细胞裂解：每孔加入80ul裂解液，室温放置5min后放置磁力架上吸附3min，吸取70ul至反应微板条；

（8）反应：将反应液、荧光素酶、荧光素底物按照1000:3:24配制成反应工作液，每孔加入70ul的反应工作液，室温静置1min；

（9）读数：使用多功能酶标仪读取全波长下发光值。

样本来源：其中2例为医院健康人体检样本，临床免疫功能正常；另外2例为器官移植患者，使用免疫抑制剂。其CD4细胞ATP检测结果如表8所示。

表8

结果显示，实验免疫抑制剂的样本，检测值明显较低，经外源凝集素刺激也没有显著增加，免疫水平低。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于ATP检测的细胞裂解液，其组成为：25～100 mM的Tricine缓冲液、0.25 v/v% TritonX-100、8～12 mM的EDTA、100 mM的NaCl。

2.根据权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于：所述细胞裂解液添加有防腐剂适量和/或裂解反应指示剂适量。

3.根据权利要求2所述的细胞裂解液，其特征在于：所述防腐剂选自青霉素、链霉素中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的细胞裂解液，其特征在于：所述裂解反应指示剂选自酚红或酚蓝。

5.根据权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于：所述细胞裂解液的组成为：25～100mM Tricine缓冲液、0.25 v/v % TritonX-100、10 mM的EDTA、100 mM的NaCl。

6.一种ATP检测试剂盒，包括ATP发光值检测试剂和细胞裂解液，其特征在于：所述细胞裂解液如权利要求1～5任一项所述。