CN108802401B - 驱动马达蛋白活性的检测方法 - Google Patents

驱动马达蛋白活性的检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种驱动马达蛋白活性的检测方法，包括以下步骤：(1)先将不同浓度三磷酸腺苷ATP分别和荧光素/荧光素酶混合，得到混合物；(2)将混合物分成两等份后分别加入测试样品池和对照样品池；(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入驱动马达；(4)开启探测仪，检测测试样品池中的产物ADP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度和对照样品池中的荧光强度，得到荧光强度时间曲线；(5)针对不同标准浓度的ATP，测得对应的FATP，进而生成校准曲线；(6)制作米氏曲线：(7)根据米氏公式，拟合所得的Vmax即是衡量驱动马达水解ATP的活性参数；(8)判断驱动马达活性。采用本发明的检测方法能够方便快捷的检测驱动马达蛋白活性。

Description

驱动马达蛋白活性的检测方法
技术领域
本申请涉及一种检测方法，具体涉及驱动马达蛋白活性的检测方法。
背景技术
驱动蛋白是细胞内重要的输运机器，属于平动分子马达。其有两个主要特征：其一是持续性,马达的两个头部在交替步行时至少有一头保持与微管吸附,因此马达能沿微管长距离步进而不脱轨；另一个特征是马达的力学过程和化学过程是紧耦合的,即马达每前进一步消耗一个三磷酸腺苷(ATP)。
现有技术中还没有一种能够方便快捷的检测驱动马达蛋白活性的方法。
发明内容
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种能够方便快捷的检测驱动马达蛋白活性的方法。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种驱动马达蛋白活性的检测方法，包括以下步骤：
(1)先将不同浓度三磷酸腺苷ATP分别和荧光素luciferin/荧光素酶luciferase混合，得到各浓度的混合物；
(2)将各浓度的混合物分成体积相同的两等份，一份加入底部布满微管的测试样品池，另一份加入底部布满微管的对照样品池；
(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入驱动马达，则测试样品池发生酶促反应：
Figure BDA0001632769260000011
其中，Kinesin·Microtubulen表示马达结合在微管的n位点；而Kinesin·Microtubulen+1表示马达结合在微管的n+1位点；k+表示Kinesin同时与ATP和微管的n位点的结合速率；k--表示ATP从吸附在微管上的Kinesin解离的速率；kcat表示Kinesin对ATP的催化水解并向微管n+1位点步进的速率；
(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的底物三磷酸腺苷ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线；
(5)针对不同标准浓度的ATP，测得每个浓度对应的ATP荧光强度FATP，进而生成校准曲线；
(6)制作米氏曲线：
根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α7：
在线性区间:
[ATP]＝α7FATP，
[ATP]表示ATP的浓度；FATP为与[ATP]对应的稳态时测试样品池的荧光强度减去对照样品池的荧光强度；
VATP反应速率是所述荧光强度时间曲线在起始点的负导数：
Figure BDA0001632769260000021
t为检测时间，fATP为[ATP]对应的实时荧光强度；
不同浓度ATP存在对应的反应速率，以浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，在坐标系中标出ATP浓度所述对应的VATP，连接这些点，制作得到米氏曲线；
(7)求出Vmax：
根据米氏公式：
Figure BDA0001632769260000022
其中，Vmax表示最大水解速率；KM表示米氏常数；
拟合所得的Vmax即是衡量驱动马达水解ATP的活性参数；
(8)按照以下方法判断驱动马达活性：
测试样品池中的转动马达数量：Nm＝NAv×10-3×30×10-6＝3NAv×10-8；
每秒能水解ATP的数量：NATP＝100×Nm＝3.0NAv×10-6；
对应的每秒mM数：VATPmax＝(NATP/NAv)×103/(100×10-6)＝30mM/s；
如果拟合的Vmax<1mM/s,则表明马达已经失活。
所述混合物中：
所述ATP选用的标准浓度分别为1、5、10、50、100、500、1000和2000uM，体积均为30uL。
所述驱动马达加入量为30uL浓度为1mM。
所述缓冲液加入量为30uL；所述缓冲液为BBS缓冲液，所述缓冲液的组分含量为：130mM NaCl，5mM KCl，1.5mM CaCl2，1mM MgSO4，5mM葡萄糖和0.1％牛血清白蛋白；pH为7.4。
所述luciferin/luciferase的体积为10uL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
采用本发明的检测方法能够方便快捷的检测驱动马达蛋白活性。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例提供的反应动力学定量探测仪的结构示意图；
图2为本发明实施例提供的测试转盘的结构示意图；
图3是本发明实施例提供的样品池和对照池的荧光强度的时间曲线图；
图4是本发明实施例提供的校准曲线图；
图5是本发明实施例提供的米氏曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
本发明的检测原理：
正常的驱动马达在饱和ATP浓度下每秒能行走800nm以上，即每秒消耗100个ATP以上，而溶液中ATP浓度可以由luciferin/luciferase的方法经荧光强度定量。因此通过luciferin/luciferase的荧光强度定量可用于鉴定驱动马达蛋白kinesin的活性。
参见图1和图2，一种反应动力学定量探测仪，包括：
测试转盘1，测试转盘1上设有测试样品池2和对照样品池3，测试转盘1通过转轴4连接电机5，电机5能够带动测试转盘1转动和定位；
控制器6，通过导线7连接电机5，用于控制电机5的转轴4转动和定位；
光电倍增管8，通过导线7连接控制器6，用于采集测试样品池2或对照样品池3中的样品自发光的化学荧光，将所述化学荧光转换成电信号并发送给控制器6的数据处理系统，控制器6的数据处理系统根据接收的电信号分析测试样品或对照样品的检测浓度。
优选地，电机5还连接有码盘9和码盘计数器10，用于测试样品池2或对照样品池3的定位，码盘计数器10通过导线7连接控制器6。
优选地，测试样品池2和对照样品池3对称设置在测试转盘1的中心轴线的两侧，测试样品池2和对照样品池3位于测试转盘1的同一条轴线上。
本发明还提供一种利用上述的反应动力学定量探测仪检测驱动马达蛋白活性的方法，包括以下步骤：
(1)先将不同浓度1、5、10、50、100、500、1000和2000uM三磷酸腺苷ATP30uL分别和荧光素luciferin/荧光素酶luciferase10uL混合，得到各浓度的混合物；
(2)将各浓度的混合物分成体积相同的两等份，其中一个浓度的混合物中的一份加入底部布满微管的测试样品池，另一份加入底部布满微管的对照样品池；
(3)在对照样品池中再注入缓冲液30uL，在测试样品池中注入1mM的驱动马达30uL，则测试样品池发生酶促反应：
Figure BDA0001632769260000051
根据上述反应可知：ATP通过上述反应以1:1化学计量生成ADP，ADP的浓度等同于ATP的浓度；
其中，Kinesin·Microtubulen表示马达结合Kinesin·Microtubulen+1而Kinesin·Microtubulen+1在微管的n+1位点；k+表示Kinesin同时与ATP和微管的n位点的结合速率；k-表示ATP从吸附在微管上的Kinesin解离的速率；kcat表示Kinesin对ATP的催化水解并向微管n+1位点步进的速率；
所述缓冲液为BBS缓冲液，所述缓冲液的组分含量为：130mM NaCl，5mM KCl，1.5mMCaCl2，1mM MgSO4，5mM葡萄糖和0.1％牛血清白蛋白；pH为7.4；
(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的底物三磷酸腺苷ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线；
如图3所示，控制面板显示两条荧光强度(f)的时间曲线，曲线fATP代表检测样品池荧光强度与时间曲线，曲线fControl(Control对照)代表对照样品池荧光强度与时间曲线。对样品池起始点的荧光强度时间曲线求导，可以间接获得反应的初始速率VATP；稳态时样品池与对照池的荧光强度差(FATP＝fControl-fATP)直接反应了底物ATP的浓度。
(5)针对不同标准浓度的ATP([ATP])，测得每个浓度对应的ATP荧光强度FATP，进而生成校准曲线；
按照以下定义：
FATP≡[fControl-fATP]t→∞。
此公式表示ATP水解的量化指标。针对不同标准浓度([ATP])的ATP，测得对应的FATP，进而生成如图4所示的校准曲线。
图4为荧光强度与产物ATP浓度之间的标准曲线。8个标准浓度[ATP]分别为1、5、10、50、100、500、1000和2000uM，针对每个标准浓度各做9个独立实验，得到的实验数据进行平均后每个浓度对应一个点，得到如图4所示的统计结果(点)。整个浓度区间均呈线性，拟合结果表明：[ATP]＝0.23FATP。
(6)制作米氏曲线：
根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α7：
在线性区间:
[ATP]＝α7FATP，
[ATP]表示ATP的浓度；FATP为与[ATP]对应的稳态时测试样品池的荧光强度减去对照样品池的荧光强度；
VATP反反应速率是如图3所述的荧光强度时间曲线在起始点的负导数：
Figure BDA0001632769260000061
t为检测时间，fATP为[ATP]对应的实时荧光强度；
基于ADP的浓度等同于ATP的浓度，不同浓度ATP存在对应的反应速率，以浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，在坐标系中标出ATP浓度所述对应的VATP，连接这些点，制作得到图5所示的米氏曲线；
从不同ATP浓度的荧光强度时间曲线中测得不同的初始反应速率。经校准曲线后得到合成速率与ATP浓度之间制作得到米氏曲线。
(7)求出Vmax：
根据米氏公式：
Figure BDA0001632769260000062
其中，Vmax表示最大水解速率；KM表示米氏常数；
8个标准浓度[ADP]分别为1、5、10、50、100、500、1000和2000uM，针对每个标准浓度各做9个独立实验，得到的实验数据进行平均后每个浓度对应一个点，得到如图5所示的统计结果(点)。整个浓度区间呈米氏关系，拟合结果表明：KM＝95uM，Vmax＝25mM/s。
拟合所得的Vmax即是衡量驱动马达水解ATP的活性参数；
(8)按照以下方法判断驱动马达活性：
测试样品池中的转动马达数量：Nm＝NAv×10-3×30×10-6＝3NAv×10-8；
每秒能水解ATP的数量：NATP＝100×Nm＝3.0NAv×10-6；
对应的每秒mM数：VATPmax＝(NATP/NAv)×103/(100×10-6)＝30mM/s；
如果拟合的Vmax<1mM/s,则表明马达已经失活。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

Claims (5)

1.一种驱动马达蛋白活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)先将不同浓度三磷酸腺苷ATP分别和荧光素/荧光素酶混合，得到各浓度的混合物；
(2)将各浓度的混合物分成体积相同的两等份，一份加入底部布满微管的测试样品池，另一份加入底部布满微管的对照样品池；
(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入驱动马达，则测试样品池发生酶促反应：
Figure FDA0002834628010000011
其中，Kinesin·Microtubulen表示马达结合在微管的n位点；而kinesin·Microtubulen+1表示马达结合在微管的n+1位点；k+表示Kinesin同时与ATP和微管的n位点的结合速率；k--表示ATP从吸附在微管上的Kinesin解离的速率；kcat表示Kinesin对ATP的催化水解并向微管n+1位点步进的速率；
(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的底物三磷酸腺苷ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池荧光强度-时间曲线fATP和对照样品池的荧光强度-时间曲线fControl；
(5)针对不同标准浓度的ATP，测得每个浓度对应的ATP荧光强度FATP，其中FATP≡[fATP-fControl]t→∞，其中t为检测时间，即FATP为与ATP浓度对应的稳态时测试样品池的荧光强度减去对照样品池的荧光强度，进而生成FATP-ATP浓度校准曲线；
(6)制作米氏曲线：
根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α7：
在线性区间:
[ATP]＝α7FATP，
[ATP]表示ATP的浓度；
VATP反应速率是所述荧光强度时间曲线在起始点的负导数：
Figure FDA0002834628010000021
t为检测时间，fATP为[ATP]对应的实时荧光强度；
不同浓度ATP存在对应的反应速率，以浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，在坐标系中标出ATP浓度所述对应的VATP，连接这些点，制作得到米氏曲线；
(7)求出Vmax：
根据米氏公式：
Figure FDA0002834628010000022
其中，Vmax表示最大水解速率；KM表示米氏常数；
拟合所得的Vmax即是衡量驱动马达水解ATP的活性参数；
(8)按照以下方法判断驱动马达活性：
测试样品池中的转动马达数量：Nm＝NAv×10-3×30×10-6＝3NAv×10-8；
每秒能水解ATP的数量：NATP＝100×Nm＝3.0NAv×10-6；
对应的每秒mM数：VATPmax＝(NATP/NAv)×103/(100×10-6)＝30mM/s；
如果拟合的Vmax<1mM/s,则表明马达已经失活。
2.根据权利要求1所述的驱动马达蛋白活性的检测方法，其特征在于，所述混合物中：
所述ATP选用的标准浓度分别为1、5、10、50、100、500、1000和2000uM，体积均为30μL。
3.根据权利要求2所述的驱动马达蛋白活性的检测方法，其特征在于，所述驱动马达加入量为30μL浓度为1mM。
4.根据权利要求2所述的驱动马达蛋白活性的检测方法，其特征在于，所述缓冲液加入量为30μL；所述缓冲液为BBS缓冲液，所述缓冲液的组分含量为：130mM NaCl，5mM KCl，1.5mM CaCl2，1mM MgSO4，5mM葡萄糖和0.1％牛血清白蛋白；pH为7.4。
5.根据权利要求1-4任一项所述的驱动马达蛋白活性的检测方法，其特征在于，所述荧光素/荧光素酶的体积为10μL。
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