JPH11318440A - ギベレラ属由来のｄ−アミノ酸オキシダーゼ - Google Patents
ギベレラ属由来のｄ−アミノ酸オキシダーゼInfo
- Publication number
- JPH11318440A JPH11318440A JP10155212A JP15521298A JPH11318440A JP H11318440 A JPH11318440 A JP H11318440A JP 10155212 A JP10155212 A JP 10155212A JP 15521298 A JP15521298 A JP 15521298A JP H11318440 A JPH11318440 A JP H11318440A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- acid oxidase
- gibberella
- oxidase
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】ギベレラ属の培養液中から、Ｄ−アミノ酸オキ
シダーゼを分離精製して、前記酵素の諸性質を明らかに
すること。 【解決手段】本発明に記載されたギベレラ属の生産する
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを培養液から分離精製するこ
とによって、臨床診断薬として有用なＤ−アミノ酸オキ
シダーゼ及びその生産に適した製造法が提供することが
できた。
シダーゼを分離精製して、前記酵素の諸性質を明らかに
すること。 【解決手段】本発明に記載されたギベレラ属の生産する
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを培養液から分離精製するこ
とによって、臨床診断薬として有用なＤ−アミノ酸オキ
シダーゼ及びその生産に適した製造法が提供することが
できた。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ−アミノ酸オキ
シダーゼ、その製造法および微生物、およびそれを用い
たＤ−アミノ酸の測定法に関し、詳しくは、診断用酵素
として有用なＤ−アミノ酸オキシダーゼ、その製造法お
よびギベレラ フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆ
ｕｊｉｋｕｒｏｉ）に属する微生物、およびＤ−アミノ
酸オキシダーゼの働きによって消費する酸素量又は生成
する過酸化水素量、又は２−オキソ酸を定量することに
よりＤ−アミノ酸を測定する発明に関する。
シダーゼ、その製造法および微生物、およびそれを用い
たＤ−アミノ酸の測定法に関し、詳しくは、診断用酵素
として有用なＤ−アミノ酸オキシダーゼ、その製造法お
よびギベレラ フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆ
ｕｊｉｋｕｒｏｉ）に属する微生物、およびＤ−アミノ
酸オキシダーゼの働きによって消費する酸素量又は生成
する過酸化水素量、又は２−オキソ酸を定量することに
よりＤ−アミノ酸を測定する発明に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、酸素の存
在下Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、２−オキソ
酸、アンモニアを生成する酵素で、国際生化学連合（Ｉ
ＵＢ）の分類ではＥＣ１．４．３．３に分類される。ま
た、この酵素は、哺乳動物の器官および微生物に広く存
在していることが知られている（酵素ハンドブック：丸
尾文治、田宮信雄監修、朝倉書店）。
在下Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、２−オキソ
酸、アンモニアを生成する酵素で、国際生化学連合（Ｉ
ＵＢ）の分類ではＥＣ１．４．３．３に分類される。ま
た、この酵素は、哺乳動物の器官および微生物に広く存
在していることが知られている（酵素ハンドブック：丸
尾文治、田宮信雄監修、朝倉書店）。
【０００３】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを産生する微生
物としては、アスペルギルス ウスタス（特公昭５５−
３５１１９号公報、特公昭５９−１５６３５号公報）、
セファロスポリウム ポトロニイ（特公昭５７−３０４
７９号公報）、トリゴノプシス バリアビリス（特公昭
５９−１５６３５号公報、特公昭６２−５０１６７７号
公報、特開昭５４−３２６９４号公報、特開昭５６−３
０９８８号公報、特開昭６２−２６２９９４号公報、特
開昭６３−７１１８０号公報）、グリオクラディウム属
（特公昭６０−５７８３７号公報）等の報告がある。
物としては、アスペルギルス ウスタス（特公昭５５−
３５１１９号公報、特公昭５９−１５６３５号公報）、
セファロスポリウム ポトロニイ（特公昭５７−３０４
７９号公報）、トリゴノプシス バリアビリス（特公昭
５９−１５６３５号公報、特公昭６２−５０１６７７号
公報、特開昭５４−３２６９４号公報、特開昭５６−３
０９８８号公報、特開昭６２−２６２９９４号公報、特
開昭６３−７１１８０号公報）、グリオクラディウム属
（特公昭６０−５７８３７号公報）等の報告がある。
【０００４】更に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを産生す
る微生物としては、カンジダ属（特開昭５５−２３９６
６号公報）、シュードモナス属（特開昭６３−６３３７
７号公報）、フザリウム ソラニ（特開平２−２００１
８１号公報）、ロドトルラグルチニス（特開平５−２１
１８９０号公報、ＥＰ５１７２００号公開公報）、不完
全糸状菌クルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ロ
ビラーダ（Ｒｏｂｉｌｌａｒｄａ）属、ミロセシウム
トリアティスポリウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｓｔ
ｒｉａｔｉｓｐｏｒｕｍ）属（特開平７−２７４９５７
号公報）、アスペルギルス属（特開平９−７５０７８号
公報）、フザリウム イクイセチ（特開平１０−５２２
６５号公報）等の報告がある。
る微生物としては、カンジダ属（特開昭５５−２３９６
６号公報）、シュードモナス属（特開昭６３−６３３７
７号公報）、フザリウム ソラニ（特開平２−２００１
８１号公報）、ロドトルラグルチニス（特開平５−２１
１８９０号公報、ＥＰ５１７２００号公開公報）、不完
全糸状菌クルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ロ
ビラーダ（Ｒｏｂｉｌｌａｒｄａ）属、ミロセシウム
トリアティスポリウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｓｔ
ｒｉａｔｉｓｐｏｒｕｍ）属（特開平７−２７４９５７
号公報）、アスペルギルス属（特開平９−７５０７８号
公報）、フザリウム イクイセチ（特開平１０−５２２
６５号公報）等の報告がある。
【０００５】これらの酵素は、抗生物質前駆体の製造
（特公昭５５−３５１１９号公報、特公昭５７−１８８
７９号公報、特公昭５７−３０４７９号公報、特公昭５
９−１５６３５号公報、特公昭６０−５７８３７号公
報、特公昭６２−５０１６７７号公報、特公平１−２３
４７３号公報、特開昭５１−１１２５９４号公報、特開
昭５２−１１８９０号公報、特開昭５２−３８０９２号
公報、特開昭５４−３２６９４号公報、特開昭５５−２
３９６６号公報、特開昭５６−３０９８８号公報、特開
昭６２−２６２９９４号公報、特開昭６３−７１１８０
号公報、特開昭６３−７４４８８号公報、特開平２−２
００１８１号公報、特開平４−２２９１９０号公報、特
開平４−５０４３６２号公報、特開平５−２１１８９０
号公報、ＥＰ４７４２１１号公報、ＥＰ５１７２００号
公報）に利用されている。
（特公昭５５−３５１１９号公報、特公昭５７−１８８
７９号公報、特公昭５７−３０４７９号公報、特公昭５
９−１５６３５号公報、特公昭６０−５７８３７号公
報、特公昭６２−５０１６７７号公報、特公平１−２３
４７３号公報、特開昭５１−１１２５９４号公報、特開
昭５２−１１８９０号公報、特開昭５２−３８０９２号
公報、特開昭５４−３２６９４号公報、特開昭５５−２
３９６６号公報、特開昭５６−３０９８８号公報、特開
昭６２−２６２９９４号公報、特開昭６３−７１１８０
号公報、特開昭６３−７４４８８号公報、特開平２−２
００１８１号公報、特開平４−２２９１９０号公報、特
開平４−５０４３６２号公報、特開平５−２１１８９０
号公報、ＥＰ４７４２１１号公報、ＥＰ５１７２００号
公報）に利用されている。
【０００６】更に、これらの酵素は、ＤＬ−アミノ酸か
らのＬ−アミノ酸の製造（特開昭４３−６５４８４号公
報、特開昭４８−７２３１４号公報、特開昭４８−７２
３９１号公報、特開昭６３−６３３７７号公報）、ロイ
シンアミノペプチダーゼ活性測定法（特公昭５９−２２
７８号公報、特開昭５３−６５７８７号公報）抗生物質
の分析法（ＥＰ１８１１０２号公開公報）などに利用さ
れている。
らのＬ−アミノ酸の製造（特開昭４３−６５４８４号公
報、特開昭４８−７２３１４号公報、特開昭４８−７２
３９１号公報、特開昭６３−６３３７７号公報）、ロイ
シンアミノペプチダーゼ活性測定法（特公昭５９−２２
７８号公報、特開昭５３−６５７８７号公報）抗生物質
の分析法（ＥＰ１８１１０２号公開公報）などに利用さ
れている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】最近、血中のＤ−アミ
ノ酸の測定が、腎不全の指標となる可能性が示された
（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，７３，１０５−
１０８（１９８７）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，６１４，７−１７（１９９
３）、北里医学，２３，５１−６２（１９９３））。ま
た、アルツハイマー病患者の脳灰白質のタンパク質では
アミノ酸のラセミ化率が高いとの報告も見られる（Ｄ’
Ａｎｉｅｌｏ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅ
ｓ．，５９２，４４（１９９２）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｇ．
Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，１
４３，２１５（１９９２））。白内障の悪化と共に眼レ
ンズタンパク質中のＤ−アミノ酸量が増加しているとい
う報告も見られる（ファルマシア，Ｖｏｌ．３２，Ｎ
ｏ．１０，１２１４−１２１８（１９９６））。既に、
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを使用して、酵素的にＤ−ア
ミノ酸を測定する方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５０，２３８−２４２（１９８
５）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，７３，１０
５−１０８（１９８７））が長田らにより検討されてい
るが、ブタの腎臓から抽出した酵素を使用しているた
め、酵素の安定生産および量的な確保に問題があった。
ノ酸の測定が、腎不全の指標となる可能性が示された
（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，７３，１０５−
１０８（１９８７）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，６１４，７−１７（１９９
３）、北里医学，２３，５１−６２（１９９３））。ま
た、アルツハイマー病患者の脳灰白質のタンパク質では
アミノ酸のラセミ化率が高いとの報告も見られる（Ｄ’
Ａｎｉｅｌｏ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅ
ｓ．，５９２，４４（１９９２）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｇ．
Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，１
４３，２１５（１９９２））。白内障の悪化と共に眼レ
ンズタンパク質中のＤ−アミノ酸量が増加しているとい
う報告も見られる（ファルマシア，Ｖｏｌ．３２，Ｎ
ｏ．１０，１２１４−１２１８（１９９６））。既に、
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを使用して、酵素的にＤ−ア
ミノ酸を測定する方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５０，２３８−２４２（１９８
５）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，７３，１０
５−１０８（１９８７））が長田らにより検討されてい
るが、ブタの腎臓から抽出した酵素を使用しているた
め、酵素の安定生産および量的な確保に問題があった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記実情
に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、Ｄ−アミノ酸オキシダ
ーゼを産生する菌を見出し、本発明に至った。即ち本発
明の目的は、腎不全、アルツハイマー、白内障等の疾病
の診断薬として有用なＤ−アミノ酸オキシダーゼを提供
することにある。
に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、Ｄ−アミノ酸オキシダ
ーゼを産生する菌を見出し、本発明に至った。即ち本発
明の目的は、腎不全、アルツハイマー、白内障等の疾病
の診断薬として有用なＤ−アミノ酸オキシダーゼを提供
することにある。
【０００９】また、本発明によれば、前記Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼの製造法を提供することが可能である。更
に本発明によれば、ギベレラ属に属するＤ−アミノ酸オ
キシダーゼ生産能を有する微生物が提供される。また、
前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いたＤ−アミノ酸の
測定法も提供される。
オキシダーゼの製造法を提供することが可能である。更
に本発明によれば、ギベレラ属に属するＤ−アミノ酸オ
キシダーゼ生産能を有する微生物が提供される。また、
前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いたＤ−アミノ酸の
測定法も提供される。
【００１０】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼは、次
の理化学的性質を有している。 （１）作用 酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化
し、過酸化水素、２−オキソ酸およびアンモニアを生成
する。 （２）基質特異性 Ｄ−アラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ
−メチオニン、Ｄ−バリンに強く作用し、Ｄ−リジン、
Ｄ−セリンにも作用し、Ｌ−アミノ酸にはほとんど作用
しない。 （３）至適ｐＨ 至適ｐＨは７〜８であり、ｐＨ６〜
９で実用的に使用が可能である。 （４）至適温度 至適ｐＨが３０〜３５℃であり、２
０〜５０℃で実用的に使用が可能である。 （５）分子量 ゲル濾過法で測定した分子量は約１
６２，０００である。
の理化学的性質を有している。 （１）作用 酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化
し、過酸化水素、２−オキソ酸およびアンモニアを生成
する。 （２）基質特異性 Ｄ−アラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ
−メチオニン、Ｄ−バリンに強く作用し、Ｄ−リジン、
Ｄ−セリンにも作用し、Ｌ−アミノ酸にはほとんど作用
しない。 （３）至適ｐＨ 至適ｐＨは７〜８であり、ｐＨ６〜
９で実用的に使用が可能である。 （４）至適温度 至適ｐＨが３０〜３５℃であり、２
０〜５０℃で実用的に使用が可能である。 （５）分子量 ゲル濾過法で測定した分子量は約１
６２，０００である。
【００１１】前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、ギベレ
ラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）に属する、Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培養
し、培養微生物にＤ−アミノ酸オキシダーゼを生成蓄積
せしめ、これを採取することにより得ることが出来る。
ラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）に属する、Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培養
し、培養微生物にＤ−アミノ酸オキシダーゼを生成蓄積
せしめ、これを採取することにより得ることが出来る。
【００１２】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する
微生物としては、ギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００
２（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ ＫＤ
Ｋ３００２：ＦＥＲＭ Ｐ−１６８０５）又はその変異
株を挙げることが出来る。
微生物としては、ギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００
２（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ ＫＤ
Ｋ３００２：ＦＥＲＭ Ｐ−１６８０５）又はその変異
株を挙げることが出来る。
【００１３】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼを用い
ることにより、Ｄ−アラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−メ
チオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−リジン、Ｄ−セリン等のＤ
−アミノ酸の簡易な測定が可能となる。
ることにより、Ｄ−アラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−メ
チオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−リジン、Ｄ−セリン等のＤ
−アミノ酸の簡易な測定が可能となる。
【００１４】以下に本発明を詳細に説明する。先ず、本
発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造法について説明
する。本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有す
る微生物としては、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）
属に属するギベレラ フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌ
ａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、例えば、Ｇｉｂｂｅｒｅｌ
ｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ ＫＤＫ３００２（工業技術
院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１
６８０５）があげられる。本発明においては、上記菌株
の変異株も使用できる。変異株は、紫外線、エックス線
などの放射線または化学的変異剤（ＮＴＧ）などの処理
によって得られる。
発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造法について説明
する。本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有す
る微生物としては、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）
属に属するギベレラ フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌ
ａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、例えば、Ｇｉｂｂｅｒｅｌ
ｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ ＫＤＫ３００２（工業技術
院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１
６８０５）があげられる。本発明においては、上記菌株
の変異株も使用できる。変異株は、紫外線、エックス線
などの放射線または化学的変異剤（ＮＴＧ）などの処理
によって得られる。
【００１５】上記の菌株（以下、本菌株と略称する）の
菌学的性質は、下記の通りである。
菌学的性質は、下記の通りである。
【００１６】形態的特徴を以下に示す。分生子はフィア
ロ型で連鎖状に形成し、長く連接または集団となる。大
型分生子はほぼまっすぐで３〜７の隔壁を有している。
子のう胞子は紡錘型〜だ円型である。子のう果は主とし
て表在性で青色〜スミレ色である。生育は酵母ＭＹ培地
においては、発育は良好で、菌糸の色は白色〜暗紫色と
なる。本菌株は好気性であり、本発明に斯かる培養時に
は、通常、振とう培養または通気攪拌培養が適してい
る。
ロ型で連鎖状に形成し、長く連接または集団となる。大
型分生子はほぼまっすぐで３〜７の隔壁を有している。
子のう胞子は紡錘型〜だ円型である。子のう果は主とし
て表在性で青色〜スミレ色である。生育は酵母ＭＹ培地
においては、発育は良好で、菌糸の色は白色〜暗紫色と
なる。本菌株は好気性であり、本発明に斯かる培養時に
は、通常、振とう培養または通気攪拌培養が適してい
る。
【００１７】本菌株の培養時には、通常のカビ用培地が
使用でき、炭素源、窒素源、無機物その他使用菌が必要
とする微量栄養素を程良く含有するものであれば、合成
培地、天然培地のいずれも使用可能である。炭素源とし
ては、グルコース、フルクトース、ラクトース、シュー
クロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜など
が使用できる。窒素源としては、ペプトン、肉エキス、
酵母エキス、麦芽エキス、コーンスチープリッカー等の
窒素含有天然物、又は、塩化アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無
機塩類、又はＬ−リジン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−バリ
ン、ＤＬ−アラニン等のアミノ酸類が利用可能である。
各種アミノ酸を使用する際には、各種アミノ酸のＤ体を
加えることにより、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産量
を向上させることも可能である。無機物としては、リン
酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウ
ム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウム、塩化第二鉄などが使用できる。
使用でき、炭素源、窒素源、無機物その他使用菌が必要
とする微量栄養素を程良く含有するものであれば、合成
培地、天然培地のいずれも使用可能である。炭素源とし
ては、グルコース、フルクトース、ラクトース、シュー
クロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜など
が使用できる。窒素源としては、ペプトン、肉エキス、
酵母エキス、麦芽エキス、コーンスチープリッカー等の
窒素含有天然物、又は、塩化アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無
機塩類、又はＬ−リジン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−バリ
ン、ＤＬ−アラニン等のアミノ酸類が利用可能である。
各種アミノ酸を使用する際には、各種アミノ酸のＤ体を
加えることにより、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産量
を向上させることも可能である。無機物としては、リン
酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウ
ム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウム、塩化第二鉄などが使用できる。
【００１８】培養は、通常、振とう培養または通気攪拌
培養で行う。培養温度は通常１５〜４０℃、好ましくは
２０〜３５℃の範囲であり、培地のｐＨは、通常３〜１
３、好ましくは５〜１０の範囲である。培養期間は、通
常１〜７日間、好ましくは２〜４日間である。斯かる方
法で培養することにより、培養物中、特に菌体内にＤ−
アミノ酸オキシダーゼを生成蓄積することが出来る。
培養で行う。培養温度は通常１５〜４０℃、好ましくは
２０〜３５℃の範囲であり、培地のｐＨは、通常３〜１
３、好ましくは５〜１０の範囲である。培養期間は、通
常１〜７日間、好ましくは２〜４日間である。斯かる方
法で培養することにより、培養物中、特に菌体内にＤ−
アミノ酸オキシダーゼを生成蓄積することが出来る。
【００１９】培養物中からＤ−アミノ酸オキシダーゼを
得る方法は、タンパク質における通常の精製方法が利用
できる。すなわち、菌を培養後培養液を濾過して菌体を
集菌し、次いで、適当な方法で菌体を破砕し、破砕液か
ら遠心分離などによって上清液を得る。この上清液中に
含まれるＤ−アミノ酸オキシダーゼは、塩析、透析、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、電気泳動などの適当な精製操作を組み合
わせることによって精製できる。
得る方法は、タンパク質における通常の精製方法が利用
できる。すなわち、菌を培養後培養液を濾過して菌体を
集菌し、次いで、適当な方法で菌体を破砕し、破砕液か
ら遠心分離などによって上清液を得る。この上清液中に
含まれるＤ−アミノ酸オキシダーゼは、塩析、透析、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、電気泳動などの適当な精製操作を組み合
わせることによって精製できる。
【００２０】次に、本発明によって得られたＤ−アミノ
酸オキシダーゼの用途について説明する。Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼは、酸素の存在下にＤ−アミノ酸の酸化反
応を触媒し、過酸化水素、２−オキソ酸およびアンモニ
アを生成する酵素であるから、この反応による変化が利
用できるものであれば、用途は特に制限されない。
酸オキシダーゼの用途について説明する。Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼは、酸素の存在下にＤ−アミノ酸の酸化反
応を触媒し、過酸化水素、２−オキソ酸およびアンモニ
アを生成する酵素であるから、この反応による変化が利
用できるものであれば、用途は特に制限されない。
【００２１】直接反応生成物を利用するものとしては、
２−オキソ酸の製造法および前駆原料のＤ−アミノ酸側
鎖を酸化し、抗生物質の原料などを製造する方法、例え
ば、セファロスポリンＣからの７−セファロスポラン酸
の製造が挙げられる。また、間接的に利用するものとし
ては、ＤＬ−アミノ酸からＤ体だけを酸化し、Ｌ−アミ
ノ酸を製造する方法および反応生成物の量的変化を直接
または間接的にシグナルとして検出する基質のＤ−アミ
ノ酸、抗生物質などの測定法が挙げられる。
２−オキソ酸の製造法および前駆原料のＤ−アミノ酸側
鎖を酸化し、抗生物質の原料などを製造する方法、例え
ば、セファロスポリンＣからの７−セファロスポラン酸
の製造が挙げられる。また、間接的に利用するものとし
ては、ＤＬ−アミノ酸からＤ体だけを酸化し、Ｌ−アミ
ノ酸を製造する方法および反応生成物の量的変化を直接
または間接的にシグナルとして検出する基質のＤ−アミ
ノ酸、抗生物質などの測定法が挙げられる。
【００２２】また、Ｄ−アミノ酸の生成を伴う別な酵素
反応系の後にＤ−アミノ酸測定系を結合した、末端にＤ
−アミノ酸を有する前駆基質、例えば、ペプチド等の測
定法、逆に、Ｄ−アミノ酸を有する合成ペプチドを基質
として添加するエキソプロテアーゼ、ペプチダーゼ等の
酵素活性の測定法、例えば、ロイシンアミノペプチダー
ゼ活性の測定などが挙げられる。
反応系の後にＤ−アミノ酸測定系を結合した、末端にＤ
−アミノ酸を有する前駆基質、例えば、ペプチド等の測
定法、逆に、Ｄ−アミノ酸を有する合成ペプチドを基質
として添加するエキソプロテアーゼ、ペプチダーゼ等の
酵素活性の測定法、例えば、ロイシンアミノペプチダー
ゼ活性の測定などが挙げられる。
【００２３】また、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよびＤ
−アミノ酸の検出に必要な後述する試薬を調整し、Ｄ−
アミノ酸の測定キットとして診断薬に組み立てることが
出来る。
−アミノ酸の検出に必要な後述する試薬を調整し、Ｄ−
アミノ酸の測定キットとして診断薬に組み立てることが
出来る。
【００２４】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの酵素
活性（力価）は、下記の方法により測定できる。 （１）生成する過酸化水素を比色法により測定する方
法。 Ａ.速度法 ４５ｍＭ４−アミノアンチピリン、６０ユニット／ｍｌ
パーオキシダーゼ溶液、及び６０ｍＭ フェノール溶液
それぞれ１００μｌと、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）１ｍｌ、及び酵素溶液５０μｌを混合
し、全量を蒸留水で３．０ｍｌとする。３０℃で２分間
インキュベートした後、１００ｍＭＤ−アラニン（Ｄ−
Ａｌａ）溶液５０μｌを添加し、５０５ｎｍにおける吸
光度を経時的に測定する。生成するキノン色素の分子吸
光係数（５．１６×１０3Ｍ-1cm-1）から、１分間に生
成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を
酵素活性単位（ユニット：Ｕ）とする。
活性（力価）は、下記の方法により測定できる。 （１）生成する過酸化水素を比色法により測定する方
法。 Ａ.速度法 ４５ｍＭ４−アミノアンチピリン、６０ユニット／ｍｌ
パーオキシダーゼ溶液、及び６０ｍＭ フェノール溶液
それぞれ１００μｌと、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）１ｍｌ、及び酵素溶液５０μｌを混合
し、全量を蒸留水で３．０ｍｌとする。３０℃で２分間
インキュベートした後、１００ｍＭＤ−アラニン（Ｄ−
Ａｌａ）溶液５０μｌを添加し、５０５ｎｍにおける吸
光度を経時的に測定する。生成するキノン色素の分子吸
光係数（５．１６×１０3Ｍ-1cm-1）から、１分間に生
成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を
酵素活性単位（ユニット：Ｕ）とする。
【００２５】Ｂ.終末法 上記Ａ法と同様に処理し、基質添加後、３０分間３０℃
でインキュベートした後の５０５ｎｍにおける吸光度を
測定し、予め作成された検量線に基づいて酵素活性を求
める。
でインキュベートした後の５０５ｎｍにおける吸光度を
測定し、予め作成された検量線に基づいて酵素活性を求
める。
【００２６】上記ＡおよびＢの方法は反応生成物の量に
基づいてＤ−アミノ酸の測定を行う方法である。Ｄ−ア
ミノ酸とＤ−アミノ酸オキシダーゼとの反応によって、
過酸化水素及び２−オキソ酸が生成される。過酸化水素
の測定には上記に示した試薬を用いる方法の他に、当該
技術分野で既知の方法、例えば、発色法や、過酸化水素
電極を用いる方法で過酸化水素を測定し、予め作成され
た検量線に基づいてＤ−アミノ酸を定量する方法も使用
することが出きる。ただし、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
の活性量は、常に一定であることが必要であり、必要で
あれば緩衝液による希釈を行う。過酸化水素の比色法に
おける発色系としては、ペルオキシダーゼの存在下で４
−アミノアンチピリン（４ＡＡ）、３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等のカップラ
ーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生
成する系を用いることができる。
基づいてＤ−アミノ酸の測定を行う方法である。Ｄ−ア
ミノ酸とＤ−アミノ酸オキシダーゼとの反応によって、
過酸化水素及び２−オキソ酸が生成される。過酸化水素
の測定には上記に示した試薬を用いる方法の他に、当該
技術分野で既知の方法、例えば、発色法や、過酸化水素
電極を用いる方法で過酸化水素を測定し、予め作成され
た検量線に基づいてＤ−アミノ酸を定量する方法も使用
することが出きる。ただし、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
の活性量は、常に一定であることが必要であり、必要で
あれば緩衝液による希釈を行う。過酸化水素の比色法に
おける発色系としては、ペルオキシダーゼの存在下で４
−アミノアンチピリン（４ＡＡ）、３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等のカップラ
ーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生
成する系を用いることができる。
【００２７】色原体として、フェノール誘導体、アニリ
ン誘導体、トルイジン誘導体等があり、例えば、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−
ジエチルアニリン、２，４−ジクロロフェノール、Ｎ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３
−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡ
ＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−３,５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）
等が挙げられる。又ペルオキシダーゼの存在下で酸化さ
れて呈色するロイコ型発色試薬も用いることができ、そ
のようなロイコ型発色試薬は、当業者に既知であり、ｏ
−ジアニシジン、ｏ−トリジン、３，３−ジアミノベン
ジジン、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン、Ｎ
−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビ
ス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ６４）、
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル)−３，７
−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ６
７）、等が挙げられる。
ン誘導体、トルイジン誘導体等があり、例えば、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−
ジエチルアニリン、２，４−ジクロロフェノール、Ｎ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３
−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡ
ＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−３,５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）
等が挙げられる。又ペルオキシダーゼの存在下で酸化さ
れて呈色するロイコ型発色試薬も用いることができ、そ
のようなロイコ型発色試薬は、当業者に既知であり、ｏ
−ジアニシジン、ｏ−トリジン、３，３−ジアミノベン
ジジン、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン、Ｎ
−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビ
ス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ６４）、
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル)−３，７
−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ６
７）、等が挙げられる。
【００２８】（２）酵素反応による酸素吸収を測定する
方法 ０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌとＤ
−アミノ酸オキシダーゼ５０μｌを混合し、蒸留水で全
量を３．０ｍｌとし、ランクブラザーズ社の酸素電極の
セルに入れる。３０℃で攪拌し、溶存酸素と温度を平衡
化した後、５０ｍＭ Ｄ−アラニンを１００μｌ添加
し、酸素吸収を記録計で連続的に計測し初速度を得る。
標準曲線から１分間に吸収された酸素量を求め、これを
酵素単位とする。
方法 ０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌとＤ
−アミノ酸オキシダーゼ５０μｌを混合し、蒸留水で全
量を３．０ｍｌとし、ランクブラザーズ社の酸素電極の
セルに入れる。３０℃で攪拌し、溶存酸素と温度を平衡
化した後、５０ｍＭ Ｄ−アラニンを１００μｌ添加
し、酸素吸収を記録計で連続的に計測し初速度を得る。
標準曲線から１分間に吸収された酸素量を求め、これを
酵素単位とする。
【００２９】（３）生成する２−オキソ酸をＤＮＰ法に
より測定する方法 ０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌ、
０．１ＭのＤ−アラニン１ｍｌおよび蒸留水０．９５ｍ
ｌを試験管に添加し、３７℃で５分間インキュベート
後、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ５０μｌを加えて攪拌
し、１０分間反応させる。反応後、３０％トリクロロ酢
酸１ｍｌを加えて反応を停止させる。反応液２ｍｌを別
の試験管に取り、０．０５％ＤＮＰ（２，４−ジニトロ
フェニルヒドラジン）の２Ｍ塩酸溶液２ｍｌを加えてよ
く攪拌し、室温下に５分間放置後、トルエン６ｍｌを加
えて強く攪拌する。次いで、上層（トルエン層）５ｍｌ
を別の試験管に移し、これに１０％炭酸ナトリウム溶液
５ｍｌを加えて強く攪拌し、ＤＮＰ反応物を水層に抽出
する。下層（水層）３ｍｌを別の試験管に取り、これに
４Ｍ水酸化ナトリウム溶液１ｍｌを加えてよく攪拌後、
４７０ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性は、あ
らかじめピルビン酸カリウム（ｍＭ単位）で作成した検
量線の値（ＰｍＭ）から算出する。
より測定する方法 ０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌ、
０．１ＭのＤ−アラニン１ｍｌおよび蒸留水０．９５ｍ
ｌを試験管に添加し、３７℃で５分間インキュベート
後、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ５０μｌを加えて攪拌
し、１０分間反応させる。反応後、３０％トリクロロ酢
酸１ｍｌを加えて反応を停止させる。反応液２ｍｌを別
の試験管に取り、０．０５％ＤＮＰ（２，４−ジニトロ
フェニルヒドラジン）の２Ｍ塩酸溶液２ｍｌを加えてよ
く攪拌し、室温下に５分間放置後、トルエン６ｍｌを加
えて強く攪拌する。次いで、上層（トルエン層）５ｍｌ
を別の試験管に移し、これに１０％炭酸ナトリウム溶液
５ｍｌを加えて強く攪拌し、ＤＮＰ反応物を水層に抽出
する。下層（水層）３ｍｌを別の試験管に取り、これに
４Ｍ水酸化ナトリウム溶液１ｍｌを加えてよく攪拌後、
４７０ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性は、あ
らかじめピルビン酸カリウム（ｍＭ単位）で作成した検
量線の値（ＰｍＭ）から算出する。
【００３０】基質を測定する方法の一例として、Ｄ−ア
ラニンの定量法を使用して詳しく説明する。Ｄ−アラニ
ンが基質の場合のＤ−アミノ酸オキシダーゼが触媒する
反応の式は次の通りである。
ラニンの定量法を使用して詳しく説明する。Ｄ−アラニ
ンが基質の場合のＤ−アミノ酸オキシダーゼが触媒する
反応の式は次の通りである。
【００３１】Ｄ−アラニン＋Ｏ2＋Ｈ2Ｏ → ピルビン
酸＋Ｈ2Ｏ2＋ＮＨ3
酸＋Ｈ2Ｏ2＋ＮＨ3
【００３２】上記の反応式から明らかなように、反応生
成物のピルビン酸、過酸化水素、アンモニアのいずれか
を検出してもＤ−アラニンを定量することが出来る。具
体的には、反応生成物のピルビン酸を検出する場合、通
常の生化学検査で使用されている乳酸脱水素酵素を利用
するピルビン酸の測定方法、前述の２−オキソ酸のＤＮ
Ｐ検出法などが利用出来る。
成物のピルビン酸、過酸化水素、アンモニアのいずれか
を検出してもＤ−アラニンを定量することが出来る。具
体的には、反応生成物のピルビン酸を検出する場合、通
常の生化学検査で使用されている乳酸脱水素酵素を利用
するピルビン酸の測定方法、前述の２−オキソ酸のＤＮ
Ｐ検出法などが利用出来る。
【００３３】反応生成物の過酸化水素を検出する場合、
過酸化水素の検出法として公知の方法が利用でき、例え
ば、前述の速度法および終末法を例示することが出来
る。反応生成物のアンモニアを検出する場合、通常のア
ンモニア測定法が利用でき、例えば、グルタミン酸脱水
素酵素を使用するアンモニアの測定系がある。
過酸化水素の検出法として公知の方法が利用でき、例え
ば、前述の速度法および終末法を例示することが出来
る。反応生成物のアンモニアを検出する場合、通常のア
ンモニア測定法が利用でき、例えば、グルタミン酸脱水
素酵素を使用するアンモニアの測定系がある。
【００３４】基質Ｄ−アミノ酸を測定する場合、基質を
含有する試料およびＤ−アミノ酸オキシダーゼを約ｐＨ
７〜８の緩衝液に加えて反応させればよい。Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼは、溶液状態の他、必要に応じて凍乾
品、マイクロカプセル化または担体に固定し、不溶化し
て使用することも出来る。緩衝液としては、リン酸緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、
グッドバッファーなどが使用される。
含有する試料およびＤ−アミノ酸オキシダーゼを約ｐＨ
７〜８の緩衝液に加えて反応させればよい。Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼは、溶液状態の他、必要に応じて凍乾
品、マイクロカプセル化または担体に固定し、不溶化し
て使用することも出来る。緩衝液としては、リン酸緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、
グッドバッファーなどが使用される。
【００３５】生成した過酸化水素の検出には、比色法、
蛍光法、化学発光法、電極法などのいずれも使用出来
る。前述の通り、比色法では、ペルオキシダーゼ等の触
媒により、過酸化水素でペルオキシダーゼの基質を酸化
発色させ、発色濃度を分光光度計で測定する。
蛍光法、化学発光法、電極法などのいずれも使用出来
る。前述の通り、比色法では、ペルオキシダーゼ等の触
媒により、過酸化水素でペルオキシダーゼの基質を酸化
発色させ、発色濃度を分光光度計で測定する。
【００３６】蛍光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒に
より、過酸化水素で基質を酸化して蛍光物質を生成さ
せ、その蛍光強度を蛍光光度計で測定する。ペルオキシ
ダーゼの基質としては、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、
ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などが利用でき
る。
より、過酸化水素で基質を酸化して蛍光物質を生成さ
せ、その蛍光強度を蛍光光度計で測定する。ペルオキシ
ダーゼの基質としては、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、
ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などが利用でき
る。
【００３７】化学発光法では、ペルオキシダーゼ等の触
媒により、過酸化水素で基質を酸化して発光させ、その
発光光度をルミノメーターで測定する。化学発光する基
質としては、ルミノール化合物、ルシゲニン、アリルシ
ュウ酸エステル類の化合物などが利用出来る。
媒により、過酸化水素で基質を酸化して発光させ、その
発光光度をルミノメーターで測定する。化学発光する基
質としては、ルミノール化合物、ルシゲニン、アリルシ
ュウ酸エステル類の化合物などが利用出来る。
【００３８】電極法では、白金電極、炭素電極等の電極
により、過酸化水素の定量が可能となる。Ｄ−アミノ酸
の量が微量である場合、又は試料中に電極への影響を与
える妨害物質が共存する場合には、作用極（陽極）、対
照極（陰極）に加えて参照極を加えた３極法の電極を使
用することにより、正確な定量が可能となる。
により、過酸化水素の定量が可能となる。Ｄ−アミノ酸
の量が微量である場合、又は試料中に電極への影響を与
える妨害物質が共存する場合には、作用極（陽極）、対
照極（陰極）に加えて参照極を加えた３極法の電極を使
用することにより、正確な定量が可能となる。
【００３９】
【発明の実施の形態】（実施例１） ギベレラ フジク
ロイ ＫＤＫ３００２によるＤ−アミノ酸オキシダーゼ
の製造 検討には、ギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００２（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１６８０５）を使用した。同菌株を１０ｍ
ｌのＧＰＹＭ培地に接種し、３０℃で２日間振とう培養
し、これを種培養液とした。振とう速度は１１１ｒｐｍ
とした。ＧＰＹＭ培地は下記に示す組成とした。 Ｇｌｕｃｏｓｅ １．０％ Ｐｅｐｔｏｎ ０．５％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．３％ Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．３％ （ｐＨ５．５〜６．０、１２０℃・２０ｍｉｎオートクレイブにて滅菌）
ロイ ＫＤＫ３００２によるＤ−アミノ酸オキシダーゼ
の製造 検討には、ギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００２（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１６８０５）を使用した。同菌株を１０ｍ
ｌのＧＰＹＭ培地に接種し、３０℃で２日間振とう培養
し、これを種培養液とした。振とう速度は１１１ｒｐｍ
とした。ＧＰＹＭ培地は下記に示す組成とした。 Ｇｌｕｃｏｓｅ １．０％ Ｐｅｐｔｏｎ ０．５％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．３％ Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．３％ （ｐＨ５．５〜６．０、１２０℃・２０ｍｉｎオートクレイブにて滅菌）
【００４０】次にこの種培養液を本培養の培地に植え継
ぎ、さらに２日間の培養を行った。本培養はジャーファ
ーメンター（丸菱バイオエンジ社製）を用いて通気攪拌
培養により行った。攪拌の速度は３００ｒｐｍとし、３
０℃にて培養した。本培養の培地は下記に示す組成とし
た。 Ｇｌｕｃｏｓｅ ２．０％ Ｌｙｓｉｎｅ １．０％ Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％ ＮａＨ2ＰＯ4 ０．１％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．０１％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．２％ （ｐＨ５．５〜６．０、１２０℃・２０ｍｉｎオートクレイブにて滅菌） 培養終了後、濾過により菌体を集菌して重量（湿重量）
の測定を行った。７Ｌの培地を用いた培養により、１４
９．９ｇの菌体が得られた。
ぎ、さらに２日間の培養を行った。本培養はジャーファ
ーメンター（丸菱バイオエンジ社製）を用いて通気攪拌
培養により行った。攪拌の速度は３００ｒｐｍとし、３
０℃にて培養した。本培養の培地は下記に示す組成とし
た。 Ｇｌｕｃｏｓｅ ２．０％ Ｌｙｓｉｎｅ １．０％ Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％ ＮａＨ2ＰＯ4 ０．１％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．０１％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．２％ （ｐＨ５．５〜６．０、１２０℃・２０ｍｉｎオートクレイブにて滅菌） 培養終了後、濾過により菌体を集菌して重量（湿重量）
の測定を行った。７Ｌの培地を用いた培養により、１４
９．９ｇの菌体が得られた。
【００４１】得られた菌体５０ｇを２ｍＭジチオスレイ
トールを含む０．１Ｍトリス-塩酸緩衝液（pＨ８.０）
に懸濁し、冷却下にビードビーダーを用いて破砕した。
破砕には直径０．５ｍｍのガラスビーズを使用し、１分
間の破砕と２分間の冷却を６度繰り返した。破砕終了後
ガラスビーズを濾過により分離した後、濾液を４℃、８
０００ｒｐｍ、４０分で遠心分離して菌体残渣を取り除
いた。
トールを含む０．１Ｍトリス-塩酸緩衝液（pＨ８.０）
に懸濁し、冷却下にビードビーダーを用いて破砕した。
破砕には直径０．５ｍｍのガラスビーズを使用し、１分
間の破砕と２分間の冷却を６度繰り返した。破砕終了後
ガラスビーズを濾過により分離した後、濾液を４℃、８
０００ｒｐｍ、４０分で遠心分離して菌体残渣を取り除
いた。
【００４２】次いで、上記遠心上清のＤ−アミノ酸オキ
シダーゼ活性を測定した。反応液の組成については下に
示した。測定時のブランクは、Ｄ−アラニンの変わりに
蒸留水を加え、前述の過酸化水素の測定法（速度法）か
ら活性値を求めた。 蒸留水 ３９５μｌ ０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ３００μｌ ３ｍＭ ４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ ３０μｌ ３ｍＭ ＴＯＯＳ ３０μｌ ６０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ ３０μｌ ０．１Ｍ Ｄ−アラニン １５μｌ 遠心上清 １００μｌ その結果、０．０３９１Ｕ／ｍｌの活性が得られ、総活
性は１５．６４Ｕであった。
シダーゼ活性を測定した。反応液の組成については下に
示した。測定時のブランクは、Ｄ−アラニンの変わりに
蒸留水を加え、前述の過酸化水素の測定法（速度法）か
ら活性値を求めた。 蒸留水 ３９５μｌ ０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ３００μｌ ３ｍＭ ４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ ３０μｌ ３ｍＭ ＴＯＯＳ ３０μｌ ６０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ ３０μｌ ０．１Ｍ Ｄ−アラニン １５μｌ 遠心上清 １００μｌ その結果、０．０３９１Ｕ／ｍｌの活性が得られ、総活
性は１５．６４Ｕであった。
【００４３】（実施例２） ギベレラ フジクロイ Ｋ
ＤＫ３００２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの精製 次いで、上記遠心上清からのＤ−アミノ酸オキシダーゼ
の精製を行った。遠心上清に氷冷下、攪拌を行いながら
４０％飽和になるように硫安を添加した。硫安添加時に
はｐＨをモニターし、ｐＨ８．０を維持するように適時
塩酸又は水酸化カリウム溶液を添加した。硫安添加終了
後、氷冷下に１時間の攪拌を行った後、４℃、８５００
ｒｐｍ、４０分間の遠心を行い、沈殿を除去した。上清
にはさらに上記と同様の方法で硫安を７５％飽和になる
ように添加し、氷冷下１時間の攪拌の後、４℃、８５０
０ｒｐｍ、４０分間の遠心分離を行い、沈殿を回収し
た。
ＤＫ３００２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの精製 次いで、上記遠心上清からのＤ−アミノ酸オキシダーゼ
の精製を行った。遠心上清に氷冷下、攪拌を行いながら
４０％飽和になるように硫安を添加した。硫安添加時に
はｐＨをモニターし、ｐＨ８．０を維持するように適時
塩酸又は水酸化カリウム溶液を添加した。硫安添加終了
後、氷冷下に１時間の攪拌を行った後、４℃、８５００
ｒｐｍ、４０分間の遠心を行い、沈殿を除去した。上清
にはさらに上記と同様の方法で硫安を７５％飽和になる
ように添加し、氷冷下１時間の攪拌の後、４℃、８５０
０ｒｐｍ、４０分間の遠心分離を行い、沈殿を回収し
た。
【００４４】回収した沈殿を２ｍＭジチオスレイトール
を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶
解し、同緩衝液で１夜透析した。透析の外液は６時間毎
に２回交換した。次いで、透析を終了した酵素液をスト
リームライン（ファルマシア社）で精製した。ストリー
ムラインには、ストリームラインＤＥＡＥゲル（ファル
マシア社）を使用し、流速１５ｍｌ／ｍｉｎでアプライ
を行った。次に２ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でゲルの洗浄を行
った。流速は１５ｍｌ／ｍｉｎとした。Ｄ−アミノ酸オ
キシダーゼの溶出には、あらかじめ、０．０５ＭＫＣｌ
及び２ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で不要なタンパク質を溶出さ
せた後、０．１ＭＫＣｌ及び２ｍＭジチオスレイトール
を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用
いて行った。この際の流速も上記と同様１５ｍｌ／ｍｉ
ｎとした。
を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶
解し、同緩衝液で１夜透析した。透析の外液は６時間毎
に２回交換した。次いで、透析を終了した酵素液をスト
リームライン（ファルマシア社）で精製した。ストリー
ムラインには、ストリームラインＤＥＡＥゲル（ファル
マシア社）を使用し、流速１５ｍｌ／ｍｉｎでアプライ
を行った。次に２ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でゲルの洗浄を行
った。流速は１５ｍｌ／ｍｉｎとした。Ｄ−アミノ酸オ
キシダーゼの溶出には、あらかじめ、０．０５ＭＫＣｌ
及び２ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で不要なタンパク質を溶出さ
せた後、０．１ＭＫＣｌ及び２ｍＭジチオスレイトール
を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用
いて行った。この際の流速も上記と同様１５ｍｌ／ｍｉ
ｎとした。
【００４５】次いで、上記ストリームライン溶出液から
ゲル濾過によりＤ−アミノ酸オキシダーゼを精製した。
ゲル濾過を行うにあたり、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（アミ
コン社）を用いて、ストリームライン溶出液の濃縮を行
った。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｐ使用の条件は、４℃、３００
０ｒｐｍ、４０分間とした。ゲル濾過は以下の条件で行
った。 使用カラム Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ ２６／６０ （ファルマシア社製） 溶出液 ２ｍＭジチオスレイトールを含む ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） 溶出条件 ２ｍｌ／ｍｉｎ 温度 ４℃ 検出 ＵＶ検出 （２２０ｎｍ） 試料添加量 ５ｍｌ 上記の条件でゲル濾過を行い、フラクションは１７ｍｌ
ずつ回収した。
ゲル濾過によりＤ−アミノ酸オキシダーゼを精製した。
ゲル濾過を行うにあたり、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（アミ
コン社）を用いて、ストリームライン溶出液の濃縮を行
った。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｐ使用の条件は、４℃、３００
０ｒｐｍ、４０分間とした。ゲル濾過は以下の条件で行
った。 使用カラム Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ ２６／６０ （ファルマシア社製） 溶出液 ２ｍＭジチオスレイトールを含む ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） 溶出条件 ２ｍｌ／ｍｉｎ 温度 ４℃ 検出 ＵＶ検出 （２２０ｎｍ） 試料添加量 ５ｍｌ 上記の条件でゲル濾過を行い、フラクションは１７ｍｌ
ずつ回収した。
【００４６】次いで各フラクションのＤ−アラニンに対
する活性を確認した。活性の確認には下記の反応液を用
いた。 蒸留水 ４６５μｌ ０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ３００μｌ ３ｍＭ ４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ ３０μｌ ３ｍＭ ＴＯＯＳ ３０μｌ ６０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ ３０μｌ ０．１Ｍ Ｄ−アラニン １５μｌ 各フラクション ３０μｌ その結果、フラクションＮｏ．１１および１２において
活性が見られた。総活性は９．８６Ｕで、細胞破砕液の
遠心上清からの精製の収率は約６３．１％であった。
する活性を確認した。活性の確認には下記の反応液を用
いた。 蒸留水 ４６５μｌ ０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ３００μｌ ３ｍＭ ４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ ３０μｌ ３ｍＭ ＴＯＯＳ ３０μｌ ６０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ ３０μｌ ０．１Ｍ Ｄ−アラニン １５μｌ 各フラクション ３０μｌ その結果、フラクションＮｏ．１１および１２において
活性が見られた。総活性は９．８６Ｕで、細胞破砕液の
遠心上清からの精製の収率は約６３．１％であった。
【００４７】（実施例３） ギベレラ フジクロイ Ｋ
ＤＫ３００２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの諸性質の
確認 ギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００２由来Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼの基質特異性について検討を行った。測
定に際しては０．１Ｍに調整した各種アミノ酸、Ｄ−ア
ラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−リジン、Ｄ−メチオニ
ン、Ｄ−バリン、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパラギン酸を用
意し、下記に示す反応液を用いてそれぞれのＤ−アミノ
酸に対する活性を測定した。 蒸留水 ４８５μｌ ０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ３００μｌ ３ｍＭ ４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ ３０μｌ ３ｍＭ ＴＯＯＳ ３０μｌ ６０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ ３０μｌ ０．１Ｍ Ｄ−アミノ酸 １５μｌ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ １０μｌ
ＤＫ３００２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの諸性質の
確認 ギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００２由来Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼの基質特異性について検討を行った。測
定に際しては０．１Ｍに調整した各種アミノ酸、Ｄ−ア
ラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−リジン、Ｄ−メチオニ
ン、Ｄ−バリン、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパラギン酸を用
意し、下記に示す反応液を用いてそれぞれのＤ−アミノ
酸に対する活性を測定した。 蒸留水 ４８５μｌ ０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ３００μｌ ３ｍＭ ４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ ３０μｌ ３ｍＭ ＴＯＯＳ ３０μｌ ６０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ ３０μｌ ０．１Ｍ Ｄ−アミノ酸 １５μｌ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ １０μｌ
【００４８】その結果、下記１に示す通り、ギベレラ
フジクロイ ＫＤＫ３００２由来Ｄ−アミノ酸オキシダ
ーゼは、Ｄ−アラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−メチオニ
ン、Ｄ−バリンに強く作用し、Ｄ−リジン、Ｄ−セリン
にも作用し、Ｄ−アスパラギン酸にはほとんど作用しな
いことが判明した。また、Ｌ−アミノ酸には対しても活
性を持たなかった。 ギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの基質 特異性 Ｄ−アミノ酸 基質特異性（％） Ｄ−アラニン １００ Ｄ−ヒスチジン ６０．９ Ｄ−リジン ９．３ Ｄ−メチオニン １２６．４ Ｄ−バリン ５３．０ Ｄ−セリン ３３．８ Ｄ−アスパラギン酸 ０．０３
フジクロイ ＫＤＫ３００２由来Ｄ−アミノ酸オキシダ
ーゼは、Ｄ−アラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−メチオニ
ン、Ｄ−バリンに強く作用し、Ｄ−リジン、Ｄ−セリン
にも作用し、Ｄ−アスパラギン酸にはほとんど作用しな
いことが判明した。また、Ｌ−アミノ酸には対しても活
性を持たなかった。 ギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの基質 特異性 Ｄ−アミノ酸 基質特異性（％） Ｄ−アラニン １００ Ｄ−ヒスチジン ６０．９ Ｄ−リジン ９．３ Ｄ−メチオニン １２６．４ Ｄ−バリン ５３．０ Ｄ−セリン ３３．８ Ｄ−アスパラギン酸 ０．０３
【００４９】次いで、ギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３
００２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの至適ｐＨについ
て測定を行った。至適ｐＨの測定は、５０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ４〜７．５）、５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．５）、５０ｍＭグリシン−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９〜１３）を用意し、これらの緩
衝液を酵素活性測定時に用いることにより、測定した。
測定には下記の反応液を用いた。 蒸留水 ４８５μｌ 各緩衝液 ３００μｌ ３ｍＭ ４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ ３０μｌ ３ｍＭ ＴＯＯＳ ３０μｌ ６０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ ３０μｌ ０．１Ｍ Ｄ−アラニン １５μｌ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ １０μｌ 検討の結果、ギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００２由
来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、図１に示す通り、ｐＨ
５〜１０の間で活性を有し、その至適ｐＨは７〜８であ
ることが確認できた。
００２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの至適ｐＨについ
て測定を行った。至適ｐＨの測定は、５０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ４〜７．５）、５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．５）、５０ｍＭグリシン−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９〜１３）を用意し、これらの緩
衝液を酵素活性測定時に用いることにより、測定した。
測定には下記の反応液を用いた。 蒸留水 ４８５μｌ 各緩衝液 ３００μｌ ３ｍＭ ４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ ３０μｌ ３ｍＭ ＴＯＯＳ ３０μｌ ６０Ｕ／ｍｌ ＰＯＤ ３０μｌ ０．１Ｍ Ｄ−アラニン １５μｌ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ １０μｌ 検討の結果、ギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００２由
来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、図１に示す通り、ｐＨ
５〜１０の間で活性を有し、その至適ｐＨは７〜８であ
ることが確認できた。
【００５０】次にギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００
２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの至適温度の確認を行
った。測定に際しては、上記反応液の緩衝液を５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に固定し、０℃（氷
冷）〜６５℃の範囲において５℃間隔で測定を行った。
その結果、図２に示す通り、ギベレラ フジクロイＫＤ
Ｋ３００２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの至適温度は
３０〜３５℃であり、２０〜４５℃の広い範囲で高い活
性を持つ酵素であることが確認できた。
２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの至適温度の確認を行
った。測定に際しては、上記反応液の緩衝液を５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に固定し、０℃（氷
冷）〜６５℃の範囲において５℃間隔で測定を行った。
その結果、図２に示す通り、ギベレラ フジクロイＫＤ
Ｋ３００２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの至適温度は
３０〜３５℃であり、２０〜４５℃の広い範囲で高い活
性を持つ酵素であることが確認できた。
【００５１】ギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００２由
来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの分子量を測定するため、
ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。カラムはＹＭＣ
−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−２００を使用し、３０秒毎にフ
ラクションを回収した。ゲル濾過の条件は回収したフラ
クションの活性を測定することにより、そのフラクショ
ンの溶出時間からギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００
２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの分子量を推定した。
ゲル濾過により得られたフラクションのＤ−アミノ酸オ
キシダーゼ活性を前述と同様の測定法により測定したと
ころ、ギベレラフジクロイ ＫＤＫ３００２由来Ｄ−ア
ミノ酸オキシダーゼの分子量はおよそ１６２，０００で
あることが推察された。ゲル濾過の条件は以下の通りに
行った。 使用カラム ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−２００ （６００×８．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．）（ワイエムシィ社製） 溶出液 ２０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4＋０．２Ｍ ＮａＣｌ 溶出条件 ０．５ｍｌ／ｍｉｎ 温度 室温 （２３℃） 検出 ＵＶ検出 （２２０ｎｍ） 試料添加量 ５０μｌ
来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの分子量を測定するため、
ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。カラムはＹＭＣ
−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−２００を使用し、３０秒毎にフ
ラクションを回収した。ゲル濾過の条件は回収したフラ
クションの活性を測定することにより、そのフラクショ
ンの溶出時間からギベレラ フジクロイ ＫＤＫ３００
２由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの分子量を推定した。
ゲル濾過により得られたフラクションのＤ−アミノ酸オ
キシダーゼ活性を前述と同様の測定法により測定したと
ころ、ギベレラフジクロイ ＫＤＫ３００２由来Ｄ−ア
ミノ酸オキシダーゼの分子量はおよそ１６２，０００で
あることが推察された。ゲル濾過の条件は以下の通りに
行った。 使用カラム ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−２００ （６００×８．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．）（ワイエムシィ社製） 溶出液 ２０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4＋０．２Ｍ ＮａＣｌ 溶出条件 ０．５ｍｌ／ｍｉｎ 温度 室温 （２３℃） 検出 ＵＶ検出 （２２０ｎｍ） 試料添加量 ５０μｌ
【００５２】
【発明の効果】本発明により臨床診断薬として有用なＤ
−アミノ酸オキシダーゼ及びその工業的生産に適した製
造法が提供された。
−アミノ酸オキシダーゼ及びその工業的生産に適した製
造法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐＨ７（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液）に
おける測定値を１００として、各ｐＨにおける測定値を
換算値で示したグラフである。
おける測定値を１００として、各ｐＨにおける測定値を
換算値で示したグラフである。
【図２】 ３５℃における測定値を１００として、各温
度における測定値を換算値で示したグラフである。
度における測定値を換算値で示したグラフである。
Claims (4)
- 【請求項１】 ギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）が
生産するＤ−アミノ酸オキシダーゼ。 - 【請求項２】 前記ギベレラ属がギベレラ フジクロイ
ＫＤＫ３００２（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋ
ｕｒｏｉ ＫＤＫ３００２：ＦＥＲＭ Ｐ−１６８０
５）である請求項１に記載するＤ−アミノ酸オキシダー
ゼ。 - 【請求項３】 前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの至適ｐ
Ｈが７〜８であり、至適温度が３０〜３５℃であること
を特徴とする請求項１〜２に記載するＤ−アミノ酸オキ
シダーゼ。 - 【請求項４】 前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの分子量
が１６２，０００程度である請求項１〜３に記載するＤ
−アミノ酸オキシダーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15521298A JP4068722B2 (ja) | 1998-05-20 | 1998-05-20 | ギベレラ属由来のｄ−アミノ酸オキシダーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15521298A JP4068722B2 (ja) | 1998-05-20 | 1998-05-20 | ギベレラ属由来のｄ−アミノ酸オキシダーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11318440A true JPH11318440A (ja) | 1999-11-24 |
| JP4068722B2 JP4068722B2 (ja) | 2008-03-26 |
Family
ID=15600968
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15521298A Expired - Fee Related JP4068722B2 (ja) | 1998-05-20 | 1998-05-20 | ギベレラ属由来のｄ−アミノ酸オキシダーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4068722B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012081539A1 (ja) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | 協和メデックス株式会社 | 測定対象成分の測定方法 |
-
1998
- 1998-05-20 JP JP15521298A patent/JP4068722B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012081539A1 (ja) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | 協和メデックス株式会社 | 測定対象成分の測定方法 |
| CN103261434A (zh) * | 2010-12-13 | 2013-08-21 | 协和梅迪克斯株式会社 | 测定对象成分的测定方法 |
| EP2653551A1 (en) * | 2010-12-13 | 2013-10-23 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for analysis for component to be assayed |
| EP2653551A4 (en) * | 2010-12-13 | 2014-05-14 | Kyowa Medex Co Ltd | ANALYSIS PROCEDURE FOR COMPONENTS TO BE TESTED |
| JPWO2012081539A1 (ja) * | 2010-12-13 | 2014-05-22 | 協和メデックス株式会社 | 測定対象成分の測定方法 |
| JP6004942B2 (ja) * | 2010-12-13 | 2016-10-12 | 協和メデックス株式会社 | 測定対象成分の測定方法 |
| US9671348B2 (en) | 2010-12-13 | 2017-06-06 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for measuring component by treating aqueous sample with alpha-keto acid and then converting component to hydrogen peroxide |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4068722B2 (ja) | 2008-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4061348B2 (ja) | 糖化タンパク質の酵素的測定方法 | |
| US4614714A (en) | Use of novel L-glutamic acid oxidase | |
| CA1143640A (en) | Process for manufacture of pyruvate oxidase and its use for the analysis and kit | |
| EP0012446B1 (en) | Acidic uricase, its production and its use for the determination of uric acid | |
| EP0135092B1 (en) | Method for determination of ammonia | |
| US5356790A (en) | Highly sensitive assay method for myo-inositol, composition for practicing same, novel myo-inositol dehydrogenase, and process for producing same | |
| FI56845C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av nadh-peroxidas | |
| US4605615A (en) | L-glutamic acid oxidase (H2 O2 -generating), its production and analytical method therefor | |
| Malavolti et al. | Determination of cholesterol with a microporous membrane chemiluminescence cell with cholesterol oxidase in solution | |
| US4657856A (en) | Glutathione peroxidase, process for production thereof, method and composition for the quantitative determination of lipid peroxide | |
| EP0437373B1 (en) | High sensitive assay method of L-carnitine and composition for an assay | |
| JP4068722B2 (ja) | ギベレラ属由来のｄ−アミノ酸オキシダーゼ | |
| US4954445A (en) | Novel NAD(P)H oxidase | |
| JP4068721B2 (ja) | フサリウム属由来のｄ−アミノ酸オキシダーゼ | |
| EP0029765B1 (en) | Creatinine iminohydrolase free from urease activity, methods of preparation and use, and assay compositions and analytical elements containing same | |
| KR890002412B1 (ko) | L-글루타민산 옥시다아제의 제조법 | |
| KR950012760B1 (ko) | 신규 nad 합성효소 및 그 제조법 및 이를 이용한 측정방법 | |
| US5279945A (en) | Method for the enzymatic determination of aspartame | |
| JPH01265899A (ja) | トリグリセリドの分析用試薬および分析方法 | |
| JPH0284177A (ja) | Ｌ―フコースデヒドロゲナーゼ | |
| JP3795972B2 (ja) | 耐熱性ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、その製造法および微生物 | |
| JP3114838B2 (ja) | 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼおよびその用途 | |
| JP2001252095A (ja) | 微量成分の測定法及びそれに用いる組成物 | |
| JPH0975078A (ja) | 耐熱性ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、その製造法および微生物 | |
| JPS6342519B2 (ja) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050401 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070814 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071010 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20071225 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110118 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110118 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110118 Year of fee payment: 3 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |