JPH0975078A - 耐熱性ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、その製造法および微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】診断薬として有用性の高い耐熱性Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼを工業的に製造すること。 【解決手段】アスペルギルス (Aspergillus) 属に属す
る微生物を培養し、その培養物から診断薬として有用性
の高い耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、耐熱性Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼ、その製造法およびアスペルギルス (As
pergillus)属に属する微生物に関するものである。本発
明の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、特に臨床診断
薬として有用である。

【０００２】

【従来の技術】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、酸素の存
在下Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、２−オキソ
酸、アンモニアを生成する酵素であり、国際生化学連合
（ＩＵＢ）の分類ではＥＣ１．４．３．３に分類され
る。また、この酵素は、哺乳動物の器官や微生物に広く
存在している（酵素ハンドブック：丸尾文治、田宮信雄
監修、朝倉書店）。

【０００３】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを産生する微生
物としては、アスペルギルス・ウスタス（特公昭５５−
３５１１９号公報、特公昭５９−１５６３５号公報）、
セファロスポリウム・ポトロニイ（特公昭５７−３０４
７９号公報）、トリゴノプシス・バリアビリス（特公昭
５９−１５６３５号公報、特公昭６２−５０１６７７号
公報、特開昭５４−３２６９４号公報、特開昭５６−３
０９８８号公報、特開昭６２−２６２９９４号公報、特
開昭６３−７１１８０号公報）、グリオクラディウム属
（特公昭６０−５７８３７号公報）、カンジダ属（特開
昭５５−２３９６６号公報）、シュ−ドモナス属（特開
昭６３−６３３７７号公報）、フザリウム・ソラニ（特
開平２−２００１８１号公報）、ロドトルラ・グルチニ
ス（特開平５−２１１８９０号公報、ＥＰ５１７２００
号公開公報）等の報告がある。

【０００４】これらの酵素は、抗生物質前駆体の製造
（特公昭５５−３５１１９号公報、特公昭５７−１８８
７９号公報、特公昭５７−３０４７９号公報、特公昭５
９−１５６３５号公報、特公昭６０−５７８３７号公
報、特公昭６２−５０１６７７号公報、特公平０１−２
３４７３号公報、特開昭５１−１１２５９４号公報、特
開昭５２−１１８９０号公報、特開昭５２−３８０９２
号公報、特開昭５４−３２６９４号公報、特開昭５５−
２３９６６号公報、特開昭５６−３０９８８号公報、特
開昭６２−２６２９９４号公報、特開昭６３−７１１８
０号公報、特開昭６３−７４４８８号公報、特開平２−
２００１８１号公報、特開平４−２２９１９０号公報、
特開平４−５０４３６２号公報、特開平５−２１１８９
０号公報、ＥＰ４６５６００号公開公報、ＥＰ４７４２
１１号公開公報、ＥＰ５１７２００号公開公報）、Ｄ，
Ｌ−アミノ酸からＬ−アミノ酸の製造（特開昭４３−６
５４８４号公報、特開昭４８−７２３１４号公報、特開
昭４８−７２３９１号公報、特開昭６３−６３３７７号
公報）、ロイシンアミノペプチダーゼ活性測定法（特公
昭５９−２２７８号公報、特開昭５３−６５７８７号公
報）、抗生物質の分析法（ＥＰ１８１１０２号公開公
報）等に利用されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】最近、血中のＤ−アミ
ノ酸の測定値が腎不全の指標となる可能性が示された
（Clinical Science, 73, 105-108(1987) 、Journal of
Chromatography, 614, 7-17 (1993) 、北里医学, 23,
51-62(1993) ）。既に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用
いて、酵素的にＤ−アミノ酸を測定する方法（Analytic
al Biochemistry, 150, 238-242(1985) 、Clinical Sci
ence, 73, 105-108(1987) ）が長田らにより検討されて
いる。しかしながら、ブタの腎臓から抽出した酵素を用
いているため、酵素の安定性や量的な確保に問題があ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記実情
に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、耐熱性Ｄ−アミノ酸オ
キシダーゼを産生する菌を見出し、本発明に至った。す
なわち、本発明の目的は、腎不全などの診断薬として有
用性の高い耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及びその製
造法を提供することにある。本発明の他の目的は、アス
ペルギルス属に属する耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
生産能を有する微生物を提供することにある。各発明の
要旨は、次の通りである。

【０００７】本発明の第１の要旨は、pH８．５の条件
下、１０分間の処理では５５℃まで安定な耐熱性Ｄ−ア
ミノ酸オキシダーゼに存する。

【０００８】本発明の第２の要旨は、次の(1) 〜(8) に
記載の理化学的性質を有する耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシ
ダーゼに存する。 (1) 作用：酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸
化水素、２−オキソ酸、アンモニアを生成する。 (2) 基質特異性：Ｄ−アラニン、Ｄ−フェニルアラニ
ン、Ｄ−バリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−
ヒスチジン、Ｄ−グルタミンには作用し、Ｄ−システイ
ン、Ｄ−シスチン、Ｄ−チロシン、Ｄ−トリプトファ
ン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタ
ミン酸、グリシン、Ｌ−アミノ酸には作用しない。 (3) 至適 pH と pH 安定性：至適 pH は８〜９、特に
８．５付近であり、 pH ４．５〜１１．５では安定であ
る。

【０００９】(4) 至適温度と熱安定性：至適温度は３０
〜５０℃、特に４０℃付近であり、 pH ８．５の条件
下、１０分間の処理では５５℃まで安定である。 (5) 阻害剤：硝酸銀、アミノグアニジンで強く阻害され
る。 (6) 分子量：ゲル濾過法で測定した分子量は約１２６，
０００であり、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミド電気泳動法による測定値は約６０，０００であ
り、単一のサブユニットから構成されている。 (7) 等電点：５．４である。 (8) 基質親和性（Ｋｍ値）：Ｄ−アラニン：５．９ｍ
Ｍ、Ｄ−フェニルアラニン：２．３ｍＭ、Ｄ−バリン：
１．５ｍＭ、Ｄ−メチオニン：１．２ｍＭである。

【００１０】本発明の第３の要旨は、アスペルギルス
(Aspergillus)属に属し、耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダ
ーゼ生産能を有する微生物を栄養培地にて培養し、培養
物中に耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする上記耐熱性Ｄ−ア
ミノ酸オキシダーゼの製造法に存する。

【００１１】本発明の第４の要旨は、アスペルギルス
(Aspergillus)属に属し、耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダ
ーゼ生産能を有する微生物に存する。

【００１２】本発明の第５の要旨は、耐熱性Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼ生産能を有するアスペルギルス・エスピ
ー (Aspergillus sp.)に存する。

【００１３】更に本発明の第６の要旨は、耐熱性Ｄ−ア
ミノ酸オキシダーゼ生産能を有するアスペルギルス・エ
スピー (Aspergillus sp.)ＩＫＤ−Ｆ３２株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４９１８）又はその変異株に存する。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、本発明の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能
を有する微生物について説明する。耐熱性Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼ生産能を有する微生物の一例としては、ア
スペルギルス (Aspergillus)属に属する、例えば、アス
ペルギルス・エスピー (Aspergillus sp.)ＩＫＤ−Ｆ３
２（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４９１８）が挙げられる。上記の菌株は、
本発明者らによって土壌中より分離され、その菌学的性
質は下記の通りである。

【００１５】１．形態的性質：ポテト・デキストロース
寒天培地上で生育した本菌株の光学顕微鏡下での形態的
特徴を以下に記述する。菌糸は、無色、滑面、隔壁を有
する。分生子頭は、長さ１９０〜２８０μｍ、直径３０
〜５５μｍで円筒形となり、緑色〜暗緑色を呈する。分
生子柄は、長さ２５０〜６００μｍ、直径３．２〜５．
６μｍ、表面は、滑面、基底菌糸または気生菌糸より分
岐して立ち上がり、淡緑色を呈する。頂のうは、直径１
２〜３０μｍ、フラスコ形、淡緑色を呈する。頂のう上
部半分ぐらいからフィアライドを形成する。メトレは形
成されない。フィアライドは、４．７〜７．７×２．２
〜３．８μｍ、淡緑色で互いに平行して形成される。分
生子は、直径２．６〜３．８μｍ、淡緑色、球形〜亜球
形、表面は粗面である。集塊は暗緑色を呈する。

【００１６】２．各培地における生育：各種培地上、２
５℃で７日間培養したときの生育状態を表１に示す。本
菌株は、ポテト・デキストロース寒天培地、麦芽エキス
寒天培地上での生育は速く、ビロード状の集落となり、
ときに中心部が綿毛状となることもある。分生子形成は
極めて良好である。集落の表面は、暗緑色、灰緑色、青
緑色を呈し、裏面は、乳白色、黄白色を呈する。ツァペ
ック寒天培地上での生育はやや悪いが気生菌糸が薄く広
がりビロード状の集落となる。分生子形成は良好であ
る。集落表面は緑色を呈し、裏面は、白色、乳白色を呈
する。

【００１７】

【表１】

【００１８】３．生理的性質：本菌株は、好気性であ
り、麦芽エキス寒天培地において至適ｐＨは６付近であ
る。また、生育至適温度は２５℃付近であり、５℃では
生育しないが、４５℃でも生育は良好である。

【００１９】以上の菌学的性状より、本菌株は、ホーク
スワース(D.L.Hawksworth)、サットン(B.C.Sutton)、エ
ーンズワース(G.C.Ainsworth) 編、「エーンズワース・
アンド・ビスビーズ・ディクショナリー・オブ・ザ・フ
ァンジャイ第７版(Ainsworthand Bisby's Dictionary
of the Fungi,7th ed.(1983))」に従い、真菌門、不完
全菌亜門、不完全糸状菌綱のアスペルギルス (Aspergil
lus)に属する一菌株であることが明らかとなり、本菌株
をアスペルギルス・エスピー (Aspergillus sp.)ＩＫＤ
−Ｆ３２株と命名した。なお、この菌株は、平成７年５
月９日から工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９１８として寄託されている。本
発明では上記菌株の変異株も使用できる。変異株は、紫
外線、Ｘ線などの放射線または化学的変異剤（ＮＴＧ
等）等の処理によって得られる。

【００２０】菌の培養には、通常のカビの培養に使用さ
れる培地が使用でき、炭素源、窒素源、無機物、その他
に使用菌が必要とする微量栄養素を程よく含有する培地
であれば、合成培地、天然培地の何れも使用可能であ
る。炭素源としては、グルコース、シュークロース、デ
キストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜などが使用でき
る。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機
塩類、または、Ｄ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸などの
アミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エ
キス、コーンスチープリカー等の窒素含有天然物が利用
できる。

【００２１】無機物としては、リン酸一ナトリウム、リ
ン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。
培養は、通常、振盪培養や通気攪拌培養で行う。培養温
度は、通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜５０℃であ
り、培地の pH は、通常３〜１０、好ましくは５〜７の
範囲である。培養期間は、通常１〜７日間、好ましくは
２〜４日間である。斯かる方法で培養することにより、
培養物中、特に菌体内に耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダー
ゼを生成蓄積することが出来る。

【００２２】培養物中から耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダ
ーゼを得る方法は、通常の蛋白質の精製で用いられる方
法が利用できる。具体的には、菌を培養後、培養液をろ
過して菌体を得、次いで、適当な方法で菌体を破砕し、
破砕液から遠心分離などによって上清液を得る。この上
清液中に含まれる耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、
塩析、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着
クロマトグラフィー、ゲルろ過、電気泳動などの適当な
操作を組み合わせることによって精製できる。この様に
して、前記第１の要旨に係る耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシ
ダーゼ、その具体例としては、前記第２の要旨に係る耐
熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが得られる。

【００２３】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの酵素
活性は、次の２つの方法で測定できる。 (1) 過酸化水素の比色検出法（活性測定法１）：１００
mMトリス・塩酸緩衝液（ pH ８．５）１ml、２５mM ４
−アミノアンチピリン０．１ml、４２０mM フェノール
溶液０．１ml、１００units/ml 西洋わさびペルオキシ
ダーゼ０．１ml、１００mM Ｄ−アラニン１ml、水０．
６５mlを３ml石英セルに入れ、恒温セルホルダー付き分
光光度計にセットして３７℃で５分間インキュベート
後、酵素溶液０．０５mlを加えて攪拌し、５００nmにお
ける５分間の吸光度変化（ΔＡＢＳ／min)を測定し、次
の式により酵素活性を算出する。なお、式中のｎは希釈
倍率を表す。

【００２４】

【数１】

【００２５】(2) ２−オキソ酸のＤＮＰ検出法（活性測
定法２）：１００mMトリス・塩酸緩衝液（ pH ８．５）
１ml、１００mM Ｄ−アラニン１ml、水０．９５mlを試
験管に入れ、３７℃の恒温槽で５分間インキュベート
後、酵素溶液０．０５mlを加えて攪拌し、１０分間反応
させる。反応後、３０％トリクロロ酢酸１mlを加えて反
応を止める。反応液２mlを別の試験管に取り、０．０５
％２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰ）の２
M 塩酸溶液２mlを加えてよく攪拌し、室温下に５分間放
置後、トルエン６mlを加えて強く攪拌する。さらに、上
層（トルエン層）５mlを別の試験管に移し、これに１０
％炭酸ナトリウム溶液５mlを加えて強く攪拌し、ＤＮＰ
反応物を水層に抽出する。下層（水層）３mlを別の試験
管に取り、これに４M 水酸化ナトリウム溶液１mlを加え
てよく攪拌後、４７０nmにおける吸光度を測定する。酵
素活性は、予めピルビン酸カリウム（mM単位）で作成し
た検量線の値（ＰmM）から、次の式により算出する。な
お、式中のｎは希釈倍率を表す。

【００２６】

【数２】

【００２７】次に、本発明の第２の要旨に係る耐熱性Ｄ
−アミノ酸オキシダーゼ（実施例１で得られた酵素）に
ついて説明する。 (1) 作用：酸素の存在下Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化
水素、２−オキソ酸、アンモニアを生成する酵素であ
り、国際生化学連合（ＩＵＢ）の分類ではＥＣ１．４．
３．３に分類される。一例として、Ｄ−アラニンが基質
の場合の反応式を次に示す。

【００２８】

【化１】Ｄ−アラニン＋Ｏ₂ ＋Ｈ₂ Ｏ──→ ピルビン
酸＋Ｈ₂ Ｏ₂ ＋ＮＨ₃

【００２９】(2) 基質特異性と基質親和性：活性測定法
１において、Ｄ−アラニンの代わりに、他の各種アミノ
酸（何れも終濃度３３mM）を用いた場合の相対反応性
（基質特異性）は表２の様であった。また、Ｄ−スレオ
ニン、Ｄ−シスチン、Ｄ−システイン、Ｄ−チロシン、
Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタ
ミン酸、グリシン、Ｌ−アミノ酸は、全く反応しなかっ
た。Ｄ−アラニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−バリ
ン、Ｄ−メチオニンについての基質親和性（Ｋｍ）と最
大反応速度（Ｖmax ）は、表２の様であった。

【００３０】

【表２】

【００３１】（３) 至適 pH および pH 安定性：活性測
定法２の緩衝液を、図１に示した各種 pH を有する酢酸
緩衝液、グッド（ＭＯＰＳ）緩衝液、トリス・塩酸緩衝
液、グリシン緩衝液（各緩衝液とも３３mM）に代え、精
製酵素の酵素活性を測定し、図１に示した。同図から、
本酵素の至適 pH は、８〜９、特に８．５付近であるこ
とが分かる。精製酵素を、図２に示した各種の pH を有
する酢酸緩衝液、グッド（ＭＥＳ）緩衝液、リン酸緩衝
液、トリス・塩酸緩衝液、グリシン緩衝液（各緩衝液と
も５０mM）等に溶解し、３０℃で３０分間処理後、活性
測定法１を用いて残存酵素活性を測定し、図２に示し
た。同図から、本酵素は、 pH ４．５〜１１．５では安
定であることが分かる。

【００３２】(4) 至適温度および熱安定性：活性測定法
２で反応温度を変えて精製酵素の酵素活性を測定し、図
３に示した。同図から、本酵素の至適温度は、３０〜５
０℃、特に４０℃付近であることが分かる。精製酵素を
５０mMトリス・塩酸緩衝液（pH８．５）に溶解し、各温
度で１０分間処理後、活性測定法１を用いて残存酵素活
性を測定し、図４に示した。同図から、本酵素は、５５
℃まで安定であることが分かる。

【００３３】(5) 阻害剤：活性測定法２の系に、１mM濃
度になる様に各種添加物を加え、精製酵素の酵素活性を
測定した。添加物無しのコントロールに対し、表３及び
表４の様な阻害効果や増強効果が添加物により認められ
た。本酵素は、硝酸銀、アミノグアニジンで強く阻害さ
れることが分かる。

【００３４】

【表３】

【００３５】

【表４】

【００３６】（６) 分子量：本酵素の分子量は、ゲル濾
過法で測定した結果、約１２６，０００であった。ま
た、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法で測定した結果、約６０，０００であり、単
一のバンドを示した。

【００３７】(7) 等電点：等電点電気泳動法で測定した
本酵素の等電点（ｐＩ）は５．４であった。

【００３８】本発明の第２の要旨に係る耐熱性Ｄ−アミ
ノ酸オキシダーゼの安定性について、Ｄ−アミノ酸また
はＤ−アミノ酸を介する測定法に広く用いられてきたブ
タ腎由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ（シグマ社製、Ty
peＩ）と比較しながら次の２つの例で説明する。

【００３９】(1) 熱安定性：それぞれの酵素を、約０．
２Ｕ／mlとなる様に５０mMトリス・塩酸緩衝液（pH８．
５）に溶解し、５０℃で０、１０、３０分間処理後、活
性測定法１を用いて残存酵素活性を測定した。結果を表
５に示す。この結果から、耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダ
ーゼは全く失活せず、極めて安定であることが分かる。

【００４０】

【表５】

【００４１】(2) 溶液保存安定性：それぞれの酵素を、
０．３〜０．５Ｕ／mlとなる様に５０mMトリス・塩酸緩
衝液（pH８．５）に溶解して冷蔵庫（４℃）に保存し、
０、１、３、８、１７、３０日目に、活性測定法１を用
いて残存酵素活性を測定した。耐熱性Ｄ−アミノ酸オキ
シダーゼは全く失活せず、極めて安定であることが分か
る。

【００４２】次に、本発明によって得られる耐熱性Ｄ−
アミノ酸オキシダーゼの用途について説明する。Ｄ−ア
ミノ酸オキシダーゼは、酸素の存在下にＤ−アミノ酸の
酸化反応を触媒し、過酸化水素、２−オキソ酸およびア
ンモニアを生成する酵素であるから、この反応による変
化が利用できる限り、その用途は特に制限されない。直
接的に反応生成物を利用する用途としては、２−オキソ
酸の製造法の他、前駆原料のＤ−アミノ酸側鎖を酸化
し、抗生物質の原料などを製造する方法、例えば、セフ
ァロスポリンＣから７−アミノセファロスポラン酸の製
造が挙げられる。

【００４３】また、間接的に反応生成物を利用する用途
としては、Ｄ, Ｌ−アミノ酸のうちからＤ−体だけを酸
化するＬ−アミノ酸の製造法の他、反応生成物の量的変
化を直接または間接的にシグナルとして検出する基質の
Ｄ−アミノ酸や抗生物質などの測定法、Ｄ−アミノ酸の
生成を伴う別な酵素反応系の後にＤ−アミノ酸測定法を
結合した、末端にＤ−アミノ酸を有する前駆基質、例え
ば、ペプチド等の測定法や、逆にＤ−アミノ酸を有する
合成ペプチドを基質として添加するエクソプロテアーゼ
やペプチダーゼ等の酵素活性の測定法、例えば、ロイシ
ンアミノペプチダーゼ活性の測定などが挙げられる。本
発明の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、従来の酵素
より安定性に優れ、従来使用が制限されていた領域にも
応用可能である。

【００４４】基質を測定する方法の一例として、Ｄ−ア
ラニンの定量法を用いて詳しく説明する。Ｄ−アラニン
が基質の場合、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが触媒する反
応の式を以下に示す。

【００４５】

【化２】Ｄ−アラニン＋Ｏ₂ ＋Ｈ₂ Ｏ──→ ピルビン
酸＋Ｈ₂ Ｏ₂ ＋ＮＨ₃

【００４６】反応式から明らかな様に、反応生成物のピ
ルビン酸、過酸化水素またはアンモニアの何れを検出し
てもＤ−アラニンを定量することが出来る。具体的に
は、反応生成物のピルビン酸を検出する場合、通常の生
化学検査で用いられている乳酸脱水素酵素を用いるピル
ビン酸の測定方法やＤ−アミノ酸オキシダーゼの酵素活
性測定で前記した「２−オキソ酸のＤＮＰ検出法」等が
利用できる。反応生成物の過酸化水素を検出する場合、
過酸化水素の検出法として公知の方法を利用することが
でき、例えば、前記の「過酸化水素の比色検出法」を例
示することが出来る。反応生成物がアンモニアの場合、
通常のアンモニア測定法が利用でき、例えば、グルタミ
ン酸脱水素酵素を用いるアンモニアの測定系がある。

【００４７】また、これらの測定法は、反応速度上か
ら、レート法とエンドポイント法の２つに分類されてい
るが、何れであってもよく、測定系、反応時間、基質の
Ｄ−アラニンの濃度、検体の種類などの条件により、適
宜選択される。基質Ｄ−アミノ酸を測定する場合、基質
を含有する試料および耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
を、約 pH ６〜１２の緩衝液に加えて反応させればよ
い。耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、溶液状態の
他、必要に応じ、凍乾品、マイクロカプセル化、また
は、担体に固定し不溶化して用いることも出来る。緩衝
液としては、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グッ
ド緩衝液、グリシン緩衝液などが用いられる。酵素は、
通常１〜５００μM 濃度の基質に対し、０．５〜５０Ｕ
／ml濃度で用いられる。

【００４８】生成した過酸化水素の検出には、比色法、
蛍光法、化学発光法、電極法などが知られており、その
何れもが使用できる。比色法では、ペルオキシダーゼ等
の触媒により、過酸化水素でペルオキシダーゼの基質を
酸化発色させ、発色濃度を分光光度計で測定する。ペル
オキシダーゼの基質としては、ｏ−フェニレンジアミ
ン、５−アミノサリチル酸、４−アミノアンチピリンと
フェノール、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾ
チアゾリン−６−スルフォン酸）、ビス〔３−ビス（４
−クロロフェニル）メチル−４−ジメチル−アミノフェ
ニル〕アミン等が利用できる。

【００４９】蛍光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒に
より、過酸化水素で基質を酸化して蛍光物質を生成さ
せ、その蛍光強度を蛍光光度計で測定する。ペルオキシ
ダーゼの基質としては、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、
ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などが利用でき
る。化学発光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒によ
り、過酸化水素で基質を酸化して発光させ、その発光強
度をルミノメーターで測定する。化学発光する基質とし
ては、ルミノール化合物、ルシゲニン、アリルシュウ酸
エステル類の化合物などが利用できる。耐熱性Ｄ−アミ
ノ酸オキシダーゼとＤ−アミノ酸の検出に必要な前記の
試薬成分を含む試薬を調製し、Ｄ−アミノ酸の測定キッ
トとして診断薬に組み立てることが出来る。

【００５０】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実
施例に限定されるものではない。

【００５１】実施例１（アスペルギルス属に属する菌に
よる耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの製造） 酵母エキスＤ−３（和光純薬）０．８％、モルトエキス
（Ｄｉｆｃｏ）２％、アルギン酸ナトリウム（和光純
薬）１％、フジプロＳＡ（不二製油）１％、アデカノー
ル（旭電化）０．１％、クロラムフェニコール（和光純
薬）０．０１％を含む水から成る培地（ｐＨ６）を、５
００ml容の培養フラスコ４本に各１００mlずつ分注し、
１２１℃で２０分間殺菌冷却後、各培養フラスコにアス
ペルギルス・エスピー (Aspergillus sp.)ＩＫＤ−Ｆ３
２（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４９１８）を一白金耳接種し、４５℃、１
日間振とう培養して、種培養液とした。

【００５２】前記と同じ組成の培地４リットルを入れた
５リットル容のジャーファーメンターを、１２１℃で２
０分間殺菌冷却後、前記の種培養液４００mlを接種し、
４５℃で３日間培養して前培養液とした。次に、前記と
同じ組成の培地１６０リットルを、２００リットル容の
ジャーファーメンターに入れ、１２１℃で３０分間殺菌
冷却後、前記の前培養液４リットルを接種し、４５℃で
４０時間、１．２ｖ／ｖ／ｍの通気量と、３００rpm の
攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液をろ過
して湿菌体１２Kgを得た。

【００５３】得られた菌体のうち２Kgを３倍容の１mMジ
チオスレイトール含有２０mMトリス・塩酸緩衝液（ pH
８．５）に懸濁し、冷却下に磨砕装置ダイノミルを用い
て菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して菌体残渣を除
き、粗酵素液４４００mlを得た。この粗酵素液を５０℃
の湯浴上で１時間処理し、続いて氷浴上で２０℃まで冷
却した。これに終濃度１mg/ml になる様にストレプトマ
イシン硫酸塩を添加し、氷浴上に１５時間置き、遠心分
離して、上清液４２３０mlを得た。この上清液に硫安を
５０％飽和になる様に加え、一昼夜放置後、析出した沈
殿物を遠心分離により除き、得られた上清液に６０％飽
和となる様に硫安を追加し、再度一昼夜放置し、遠心分
離により析出した沈殿物を得た。

【００５４】この沈殿物を、１mMジチオスレイトール含
有２０mMトリス・塩酸緩衝液（ pH８．５）５０mlに溶
解後、透析膜を用いて同組成の緩衝液にて脱塩した。脱
塩液を、予め１mMジチオスレイトール含有１００mMトリ
ス・塩酸緩衝液（ pH ８．５）で平衡化したＤＥＡＥ−
セルロファインＡ−５００ｍカラム（直径５．７cm×長
さ１８．４cm）に通して酵素を吸着させ、同組成の緩衝
液で洗浄後、１mMジチオスレイトール含有２０mMトリス
・塩酸緩衝液（ pH ８．５）から０．５M ＮａＣｌと１
mMジチオスレイトールを含有する１００mMトリス・塩酸
緩衝液（ pH ８．５）への直線グラジエントで溶出し、
酵素の活性画分を集めた。この活性画分に硫安を７０％
飽和となる様に加え、一昼夜放置後、遠心分離により沈
殿物を得た。

【００５５】この沈殿物を、１mMジチオスレイトール含
有２０mMトリス・塩酸緩衝液（ pH８．５）３０mlに溶
解後、透析膜を用いて同組成の緩衝液にて脱塩した。こ
の脱塩液を、予め１mMジチオスレイトール含有２０mMト
リス・塩酸緩衝液（ pH ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ
−セルロファインＡ−５００ｍカラム（直径４．７cm×
長さ８．６cm）に通して酵素を吸着させ、同組成の緩衝
液で洗浄後、０．１MＮａＣｌと１mMジチオスレイトー
ルを含有する３０mMトリス・塩酸緩衝液（ pH７．５）
で溶出し、酵素の活性画分を集めた。この活性画分に硫
安を６０％飽和となる様に加え、一昼夜放置後、遠心分
離かけて沈殿物を得た。

【００５６】この沈殿物を、１mMジチオスレイトール含
有２０mMトリス・塩酸緩衝液（ pH７．５）６０mlに溶
解後、透析膜を用いて同組成の緩衝液にて脱塩した。こ
の脱塩液に硫安を加え４０％飽和となる様に調整後、予
め４０％飽和硫安と１mMジチオスレイトールを含有する
２０mMトリス・塩酸緩衝液（ pH ７．５）で平衡化した
ブチルトヨパール６５０Ｍカラム（直径４．５cm×長さ
１１．５cm）に通して酵素を吸着させ、同組成の緩衝液
で洗浄後、４０％飽和硫安と１mMジチオスレイトールを
含有する２０mMトリス・塩酸緩衝液（ pH ７．５）から
１mMジチオスレイトール含有２０mMトリス・塩酸緩衝液
（ pH ７．５）への直線グラジエントで溶出し、酵素の
活性画分を集めた。

【００５７】次に、この活性画分を限外ろ過膜（アミコ
ン社製、セントリコン−１０：分画分子量１万）で濃縮
後、この濃縮液を高速液体クロマトグラフィーのカラム
ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー；直径７．５
mm×長さ６０cm）に、移動相０．２M ＮａＣｌを含有す
る０．１M リン酸カリウム緩衝液（ pH ７．５）、流速
０．７ml／分の条件で注入し、活性画分を分取した。こ
の活性画分を限外ろ過膜（アミコン社製、セントリコン
−１０：分画分子量１万）で濃縮した。この濃縮液を再
び高速液体クロマトグラフィーのカラムＴＳＫ−ｇｅｌ
Ｇ３０００ＳＷ（東ソー；直径７．５mm×長さ６０c
m）に、移動相０．２M ＮａＣｌを含有する０．１M リ
ン酸カリウム緩衝液（ pH ７．５）、流速０．７ml／分
の条件で注入し、活性画分を分取した。分取した酵素
は、ＳＤＳ電気泳動で単一なバンドを示した。各精製工
程における画分の収率および比活性を測定し、その結果
を表６に示す。

【００５８】

【表６】 （１）：グラジエント （２）：ステップワイズ

【００５９】実施例２（Ｄ−アラニン定量法への応用） ０．３８５mg/ml の４−アミノアンチピリン、４．１６
mg/ml のｐ−クロロフェノール、７．６９Ｕ/ml の西洋
わさびペルオキシダーゼを含む７６．９mMリン酸緩衝液
（ pH ７．５）（第１試薬）１３０μl に、Ｄ−アラニ
ン溶液１００μl を添加し、３７℃で５分間インキュベ
ートして恒温化した。次に、５．２Ｕ/ml の実施例１で
得られた耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを含む１００
mMリン酸緩衝液（ pH ７．５）（第２試薬）２０μl を
加えて３７℃で１時間インキュベートして発色後、マイ
クロプレートリーダーで４９０nmの吸光度を測定した。
測定結果を図６に示す。検量線は、１から４０ mg/l ま
で直線となり、Ｄ−アラニンの測定が可能であった。

【００６０】

【発明の効果】以上、説明した本発明によれば、臨床診
断薬として極めて有用な耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダー
ゼ及びその工業的生産に適した製造法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの至
適 pH を示す図である。

【図２】本発明の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの p
H 安定性を示す図である。

【図３】本発明の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの至
適温度を示す図である。

【図４】本発明の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの温
度安定性を示す図である。

【図５】本発明のＩＫＤ−Ｆ３２株由来Ｄ−アミノ酸オ
キシダーゼとブタ腎由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの溶
液保存安定性比較を示す図である。

【図６】本発明のＤ−アラニン測定の検量線を示す図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:66） (72)発明者 藤田 真司 埼玉県与野市上落合1090 (72)発明者 増田 稔 埼玉県上尾市小敷谷845−１ 西上尾第１ 団地２−３−504 (72)発明者 薮内 正彦 東京都練馬区小竹町１−40−５

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 pH８．５の条件下、１０分間の処理では
   ５５℃まで安定な耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ。
2. 【請求項２】 次の理化学的性質を有する耐熱性Ｄ−ア
   ミノ酸オキシダーゼ。 (1) 作用：酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸
   化水素、２−オキソ酸、アンモニアを生成する。 (2) 基質特異性：Ｄ−アラニン、Ｄ−フェニルアラニ
   ン、Ｄ−バリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−
   ヒスチジン、Ｄ−グルタミンには作用し、Ｄ−システイ
   ン、Ｄ−シスチン、Ｄ−チロシン、Ｄ−トリプトファ
   ン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタ
   ミン酸、グリシン、Ｌ−アミノ酸には作用しない。 (3) 至適 pH と pH 安定性：至適 pH は８〜９であり、
   pH ４．５〜１１．５で安定である。 (4) 至適温度と熱安定性：至適温度は３０〜５０℃付近
   であり、 pH ８．５の条件下、１０分間の処理では５５
   ℃まで安定である。 (5) 阻害剤：硝酸銀、アミノグアニジンで強く阻害され
   る。 (6) 分子量：ゲル濾過法で測定した分子量は約１２６，
   ０００であり、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
   アミド電気泳動法による測定値は約６０，０００であ
   り、単一のサブユニットから構成されている。 (7) 等電点：５．４である。 (8) 基質親和性（Ｋｍ値）：Ｄ−アラニン：５．９ｍ
   Ｍ、Ｄ−フェニルアラニン：２．３ｍＭ、Ｄ−バリン：
   １．５ｍＭ、Ｄ−メチオニン：１．２ｍＭである。
3. 【請求項３】 アスペルギルス (Aspergillus)属に属
   し、耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する微
   生物を栄養培地にて培養し、培養物中に耐熱性Ｄ−アミ
   ノ酸オキシダーゼを生成蓄積せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とする請求項１又は請求項２記載の耐熱性Ｄ−
   アミノ酸オキシダーゼの製造法。
4. 【請求項４】 アスペルギルス (Aspergillus)属に属
   し、耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する微
   生物。
5. 【請求項５】 アスペルギルス・エスピー (Aspergillu
   s sp.)である請求項４記載の微生物。
6. 【請求項６】 アスペルギルス・エスピー (Aspergillu
   s sp.)ＩＫＤ−Ｆ３２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４９１８）
   又はその変異株である請求項５記載の微生物。