JPH07274957A - D−アミノ酸オキシダーゼ、その製造法および産生菌 - Google Patents
D−アミノ酸オキシダーゼ、その製造法および産生菌Info
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】臨床診断薬として極めて有用なD−アミノ酸オ
キシダーゼの工業的生産に適した製造法を提供する。 【構成】不完全糸状菌クルブラリア(Curvularia)属、
ロビラーダ(Robillarda)属またはミロセシウム(Myro
thecium ) 属に属し、D−アミノ酸オキシダーゼ生産能
を有する微生物を培養し、培養物からD−アミノ酸オキ
シダーゼを採取する。
キシダーゼの工業的生産に適した製造法を提供する。 【構成】不完全糸状菌クルブラリア(Curvularia)属、
ロビラーダ(Robillarda)属またはミロセシウム(Myro
thecium ) 属に属し、D−アミノ酸オキシダーゼ生産能
を有する微生物を培養し、培養物からD−アミノ酸オキ
シダーゼを採取する。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なD−アミノ酸オ
キシダーゼ、その製造法および産生菌に関するものであ
る。本発明のD−アミノ酸オキシダーゼは、特に、臨床
診断薬として極めて有用である。
キシダーゼ、その製造法および産生菌に関するものであ
る。本発明のD−アミノ酸オキシダーゼは、特に、臨床
診断薬として極めて有用である。
【0002】
【従来の技術】D−アミノ酸オキシダーゼは、酸素の存
在下D−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、2−オキソ酸
およびアンモニアを生成する酵素であり、国際生化学連
合(IUB)の分類ではEC1.4.3.3に分類され
る。また、この酵素は、哺乳動物の器官や微生物に広く
存在していることが知られている(酵素ハンドブック:
丸尾文治、田宮信雄監修、朝倉書店)。
在下D−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、2−オキソ酸
およびアンモニアを生成する酵素であり、国際生化学連
合(IUB)の分類ではEC1.4.3.3に分類され
る。また、この酵素は、哺乳動物の器官や微生物に広く
存在していることが知られている(酵素ハンドブック:
丸尾文治、田宮信雄監修、朝倉書店)。
【0003】上記の酵素を産生する微生物としては、ア
スペルギルス・ウスタス(特公昭55−35119号公
報、特公昭59−15635号公報)、セファロスポリ
ウム・ポトロニイ(特公昭57−30479号公報)、
トリコノプシス・バリアビリス(特公昭59−1563
5号公報、特公昭62−501677号公報、特開昭5
4−32694号公報、特開昭56−30988号公
報、特開昭62−262994号公報、特開昭63−7
1180号公報)、グリオクラディウム属(特公昭60
−57837号公報)、カンジダ属(特開昭55−23
966号公報)、シュ−ドモナス属(特開昭63−63
377号公報)、フザリウム・ソラニ(特開平2−20
0181号公報)、ロドトルラ・グルチニス(特開平5
−211890、EP517200号公報)等が報告さ
れている。
スペルギルス・ウスタス(特公昭55−35119号公
報、特公昭59−15635号公報)、セファロスポリ
ウム・ポトロニイ(特公昭57−30479号公報)、
トリコノプシス・バリアビリス(特公昭59−1563
5号公報、特公昭62−501677号公報、特開昭5
4−32694号公報、特開昭56−30988号公
報、特開昭62−262994号公報、特開昭63−7
1180号公報)、グリオクラディウム属(特公昭60
−57837号公報)、カンジダ属(特開昭55−23
966号公報)、シュ−ドモナス属(特開昭63−63
377号公報)、フザリウム・ソラニ(特開平2−20
0181号公報)、ロドトルラ・グルチニス(特開平5
−211890、EP517200号公報)等が報告さ
れている。
【0004】上記の酵素は、抗生物質前駆体の製造に利
用されている(特公昭55−35119号公報、特公昭
57−18879号公報、特公昭57−30479号公
報、特公昭59−15635号公報、特公昭60−57
837号公報、特公昭62−501677号公報、特公
平01−23473号公報、特開昭51−112594
号公報、特開昭52−11890号公報、特開昭52−
38092号公報、特開昭54−32694号公報、特
開昭55−23966号公報、特開昭56−30988
号公報、特開昭62−262994号公報、特開昭63
−71180号公報、特開昭63−74488号公報、
特開平2−200181号公報、特開平4−22919
0号公報、特開平4−504362号公報、特開平5−
211890号公報、EP465600号公開公報、E
P474211号公開公報、EP517200号公開公
報)。
用されている(特公昭55−35119号公報、特公昭
57−18879号公報、特公昭57−30479号公
報、特公昭59−15635号公報、特公昭60−57
837号公報、特公昭62−501677号公報、特公
平01−23473号公報、特開昭51−112594
号公報、特開昭52−11890号公報、特開昭52−
38092号公報、特開昭54−32694号公報、特
開昭55−23966号公報、特開昭56−30988
号公報、特開昭62−262994号公報、特開昭63
−71180号公報、特開昭63−74488号公報、
特開平2−200181号公報、特開平4−22919
0号公報、特開平4−504362号公報、特開平5−
211890号公報、EP465600号公開公報、E
P474211号公開公報、EP517200号公開公
報)。
【0005】また、上記の酵素は、D・L−アミノ酸か
らL−アミノ酸の製造にも利用され(特開昭43−65
484号公報、特開昭48−72314号公報、特開昭
48−72391号公報、特開昭63−63377号公
報)、更には、ロイシンアミノペプチダーゼ活性の測定
法(特公昭59−2278号公報、特開昭53−657
87号公報)、抗生物質の分析法(EP181102号
公開公報)等にも利用されている。
らL−アミノ酸の製造にも利用され(特開昭43−65
484号公報、特開昭48−72314号公報、特開昭
48−72391号公報、特開昭63−63377号公
報)、更には、ロイシンアミノペプチダーゼ活性の測定
法(特公昭59−2278号公報、特開昭53−657
87号公報)、抗生物質の分析法(EP181102号
公開公報)等にも利用されている。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】最近、血中のD−アミ
ノ酸の測定が、腎不全の指標となる可能性が示された
(Clinical Science, 73, 105-108(1987) 、Journal of
Chromatography, 614, 7-17 (1993) 、北里医学, 23,
51-62(1993) )。既に、D−アミノ酸オキシダーゼを使
用して酵素的にD−アミノ酸を測定する方法が長田らに
より検討されている(Analytical Biochemistry, 150,
238-242(1985) 、Clinical Science, 73, 105-108(198
7) )。しかしながら、ブタの腎臓から抽出したD−ア
ミノ酸オキシダーゼを使用しているため、その量的な確
保に問題が有る。また、多種類のD−アミノ酸と幅広く
反応する基質特異性の広いD−アミノ酸オキシダーゼが
望まれている。
ノ酸の測定が、腎不全の指標となる可能性が示された
(Clinical Science, 73, 105-108(1987) 、Journal of
Chromatography, 614, 7-17 (1993) 、北里医学, 23,
51-62(1993) )。既に、D−アミノ酸オキシダーゼを使
用して酵素的にD−アミノ酸を測定する方法が長田らに
より検討されている(Analytical Biochemistry, 150,
238-242(1985) 、Clinical Science, 73, 105-108(198
7) )。しかしながら、ブタの腎臓から抽出したD−ア
ミノ酸オキシダーゼを使用しているため、その量的な確
保に問題が有る。また、多種類のD−アミノ酸と幅広く
反応する基質特異性の広いD−アミノ酸オキシダーゼが
望まれている。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記実情
に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、基質特異性の広い新規
なD−アミノ酸オキシダーゼを効率良く産生する菌を見
い出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、腎不全
などの診断薬として有用性の高い新規なD−アミノ酸オ
キシダーゼ、その製造法およびその産生菌に関するもの
であり、各発明の要旨は、次の通りである。
に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、基質特異性の広い新規
なD−アミノ酸オキシダーゼを効率良く産生する菌を見
い出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、腎不全
などの診断薬として有用性の高い新規なD−アミノ酸オ
キシダーゼ、その製造法およびその産生菌に関するもの
であり、各発明の要旨は、次の通りである。
【0008】本発明の第1の要旨は、次の(1) 〜(8) に
記載の理化学的性質を有することを特徴とするD−アミ
ノ酸オキシダーゼに存する。 (1) 作用:酸素の存在下、D−アミノ酸を酸化し、過酸
化水素、2−オキソ酸およびアンモニアを生成する。 (2) 基質特異性:D−アラニン、D−バリン、D−フェ
ニルアラニン、D−メチオニン、D−イソロイシン、D
−ロイシン及びD−グルタミンに強く作用し、D−セリ
ン、D−アスパラギン、D−スレオニン及びD−グルタ
ミン酸にも作用するが、D−システイン、D−シスチ
ン、D−チロシン、D−トリプトファン、D−プロリ
ン、D−アスパラギン酸、D−リジン、D−アルギニ
ン、D−ヒスチジン、グリシン及びL−アミノ酸には作
用しない。 (3) 至適 pH と pH 安定性:至適 pH は9〜10であ
り、30℃で30分処理の安定 pH 範囲は7〜10であ
る。 (4) 至適温度と熱安定性:至適温度は約35℃であり、
pH 8.5における10分間の処理では35℃まで安定
である。 (5) 阻害剤:塩化鉛、塩化亜鉛、塩化カドミウム、塩化
水銀、硝酸銀、p−クロロマーキュリー安息香酸および
N−エチルマレインイミドで強く阻害される。 (6) 分子量:ゲル濾過法で測定した分子量が約150,
000、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
電気泳動法で測定した分子量が約39,000であり、
単一のサブユニットから構成されている。 (7) 等電点:4.9 (8) 基質親和性(Km値):D−アラニン:2.06m
M、D−バリン:1.58mM、D−フェニルアラニ
ン:0.855mM
記載の理化学的性質を有することを特徴とするD−アミ
ノ酸オキシダーゼに存する。 (1) 作用:酸素の存在下、D−アミノ酸を酸化し、過酸
化水素、2−オキソ酸およびアンモニアを生成する。 (2) 基質特異性:D−アラニン、D−バリン、D−フェ
ニルアラニン、D−メチオニン、D−イソロイシン、D
−ロイシン及びD−グルタミンに強く作用し、D−セリ
ン、D−アスパラギン、D−スレオニン及びD−グルタ
ミン酸にも作用するが、D−システイン、D−シスチ
ン、D−チロシン、D−トリプトファン、D−プロリ
ン、D−アスパラギン酸、D−リジン、D−アルギニ
ン、D−ヒスチジン、グリシン及びL−アミノ酸には作
用しない。 (3) 至適 pH と pH 安定性:至適 pH は9〜10であ
り、30℃で30分処理の安定 pH 範囲は7〜10であ
る。 (4) 至適温度と熱安定性:至適温度は約35℃であり、
pH 8.5における10分間の処理では35℃まで安定
である。 (5) 阻害剤:塩化鉛、塩化亜鉛、塩化カドミウム、塩化
水銀、硝酸銀、p−クロロマーキュリー安息香酸および
N−エチルマレインイミドで強く阻害される。 (6) 分子量:ゲル濾過法で測定した分子量が約150,
000、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
電気泳動法で測定した分子量が約39,000であり、
単一のサブユニットから構成されている。 (7) 等電点:4.9 (8) 基質親和性(Km値):D−アラニン:2.06m
M、D−バリン:1.58mM、D−フェニルアラニ
ン:0.855mM
【0009】また、本発明の第2の要旨は、不完全糸状
菌クルブラリア(Curvularia)属、ロビラーダ(Robill
arda)属またはミロセシウム(Myrothecium ) 属に属
し、D−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する微生物を
培養し、培養物からD−アミノ酸オキシダーゼを採取す
ることを特徴とするD−アミノ酸オキシダーゼの製造法
に存する。
菌クルブラリア(Curvularia)属、ロビラーダ(Robill
arda)属またはミロセシウム(Myrothecium ) 属に属
し、D−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する微生物を
培養し、培養物からD−アミノ酸オキシダーゼを採取す
ることを特徴とするD−アミノ酸オキシダーゼの製造法
に存する。
【0010】また、本発明の第3の要旨は、不完全糸状
菌クルブラリア(Curvularia)属に属し、D−アミノ酸
オキシダーゼ産性能を有する「NF 02201」株
(生命工学工業技術研究所寄託番号FERM P−14
017)又はその変異株に存する。
菌クルブラリア(Curvularia)属に属し、D−アミノ酸
オキシダーゼ産性能を有する「NF 02201」株
(生命工学工業技術研究所寄託番号FERM P−14
017)又はその変異株に存する。
【0011】以下、本発明を詳細に説明する。先ず、本
発明の第2の要旨に係るD−アミノ酸オキシダーゼの製
造法および第3の要旨に係るD−アミノ酸オキシダーゼ
産生菌について説明する。本発明の製造法に使用される
不完全糸状菌は、クルブラリア(Curvularia)属、ロビ
ラーダ(Robillarda)属またはミロセシウム(Myrothec
ium ) 属に属する菌株であり、例えば、クルブラリア
(Curvularia)属に属する「NF 02201」株(生
命工学工業技術研究所寄託番号FERM P−1401
7)又はその変異株が挙げられる。上記の「NF 02
201」株は、本発明者らが、土壌中より分離した新菌
株であり、その菌学的性質は下記の通りである。
発明の第2の要旨に係るD−アミノ酸オキシダーゼの製
造法および第3の要旨に係るD−アミノ酸オキシダーゼ
産生菌について説明する。本発明の製造法に使用される
不完全糸状菌は、クルブラリア(Curvularia)属、ロビ
ラーダ(Robillarda)属またはミロセシウム(Myrothec
ium ) 属に属する菌株であり、例えば、クルブラリア
(Curvularia)属に属する「NF 02201」株(生
命工学工業技術研究所寄託番号FERM P−1401
7)又はその変異株が挙げられる。上記の「NF 02
201」株は、本発明者らが、土壌中より分離した新菌
株であり、その菌学的性質は下記の通りである。
【0012】1.各培地における生育状態 (1) 麦芽エキス寒天培地(25℃)における生育は良好
であり、7日間での集落の径は64〜67mmに達する。
集落の表面は気生菌糸が発達して羊毛状となる。培養日
数に従い、淡褐色から黒褐色を呈し、裏面も同色を呈す
る。分生子の形成は良好である。
であり、7日間での集落の径は64〜67mmに達する。
集落の表面は気生菌糸が発達して羊毛状となる。培養日
数に従い、淡褐色から黒褐色を呈し、裏面も同色を呈す
る。分生子の形成は良好である。
【0013】(2) ポテト・デキストロース寒天培地(2
5℃)における生育は極めて良好であり、7日間での集
落の径は56〜62mmに達する。集落の表面は麦芽エキ
ス寒天培地上の生育とほぼ同じとなる。
5℃)における生育は極めて良好であり、7日間での集
落の径は56〜62mmに達する。集落の表面は麦芽エキ
ス寒天培地上の生育とほぼ同じとなる。
【0014】(3) ツアペック寒天培地(25℃)におけ
る生育は悪く、7日間での集落の径は53〜58mmに達
する。集落の表面は気生菌糸が少なく、平坦な羊毛状と
なる。培養日数に従い、無色から暗緑褐色を呈し、裏面
も同色を呈する。集落の周辺は不整で分生子の形成は悪
い。
る生育は悪く、7日間での集落の径は53〜58mmに達
する。集落の表面は気生菌糸が少なく、平坦な羊毛状と
なる。培養日数に従い、無色から暗緑褐色を呈し、裏面
も同色を呈する。集落の周辺は不整で分生子の形成は悪
い。
【0015】(4) コーンミール寒天培地(25℃)にお
ける生育はやや悪く、7日間での集落の径は65〜68
mmに達する。集落の表面は気生菌糸が薄く平坦に広が
る。培養日数に従い、無色から暗緑色を呈する。裏面も
同色を呈する。分生子の形成は悪い。
ける生育はやや悪く、7日間での集落の径は65〜68
mmに達する。集落の表面は気生菌糸が薄く平坦に広が
る。培養日数に従い、無色から暗緑色を呈する。裏面も
同色を呈する。分生子の形成は悪い。
【0016】(5) V−8寒天培地(25℃)における生
育は良好であり、7日間での集落の径は71〜75mmに
達する。集落の表面は羊毛状で同心輪紋を生じる。培養
日数に従い、白色から黒緑色を呈し、裏面も同色を呈す
る。分生子の形成は良好である。
育は良好であり、7日間での集落の径は71〜75mmに
達する。集落の表面は羊毛状で同心輪紋を生じる。培養
日数に従い、白色から黒緑色を呈し、裏面も同色を呈す
る。分生子の形成は良好である。
【0017】(6) 本菌株は、V−8寒天培地で速やかに
生育し、集落全面に分生子を豊富に形成する。菌糸は、
直径1.6〜5.2μm 、淡色から褐色を呈し、また、
隔壁を有し、その表面は平滑である。分生子柄は、長さ
60〜320μm 、直径3.0〜4.0μm の円筒形で
あり、また、隔壁を有し、その表面は平滑である。菌糸
上に頂生または側生し、単一または数本で束生する。上
方ではジグザグ状を呈する。基部は褐色、頂部は淡色で
顕著な分離痕を有する。分生子は、ポロ型分生子であ
り、紡錘形ないし紡錘状楕円形であって3隔壁を有し、
下方から3番目の細胞が膨れて湾曲し他の細胞より大型
である。また、両端細胞は、殆ど無色ないし淡褐色であ
り、中間部細胞は、やや濃色であって表面は平滑であ
る。大きさは18〜33×7〜12μm (平均28.2
×10.6μm )であり、へそ(hilum)は突起しない。
本菌株の至適生育温度は、30℃前後であるが、37℃
でも生育する。生育 pH の範囲は3〜10と広く、至適
pH は5.5〜6.0である。
生育し、集落全面に分生子を豊富に形成する。菌糸は、
直径1.6〜5.2μm 、淡色から褐色を呈し、また、
隔壁を有し、その表面は平滑である。分生子柄は、長さ
60〜320μm 、直径3.0〜4.0μm の円筒形で
あり、また、隔壁を有し、その表面は平滑である。菌糸
上に頂生または側生し、単一または数本で束生する。上
方ではジグザグ状を呈する。基部は褐色、頂部は淡色で
顕著な分離痕を有する。分生子は、ポロ型分生子であ
り、紡錘形ないし紡錘状楕円形であって3隔壁を有し、
下方から3番目の細胞が膨れて湾曲し他の細胞より大型
である。また、両端細胞は、殆ど無色ないし淡褐色であ
り、中間部細胞は、やや濃色であって表面は平滑であ
る。大きさは18〜33×7〜12μm (平均28.2
×10.6μm )であり、へそ(hilum)は突起しない。
本菌株の至適生育温度は、30℃前後であるが、37℃
でも生育する。生育 pH の範囲は3〜10と広く、至適
pH は5.5〜6.0である。
【0018】以上の菌学的性状から、本菌株は、Ainswo
rth and Bisby's Dictionary of the Fungi ( D. L. Ha
wksworth, B. C. Sutton and G.C. Ainsworth 著、第7
版、C. M. I.、Kew 、1983年) に従い、真菌門、不完全
菌亜門、不完全糸状菌綱の Curvularia 属菌と同定し
た。本菌株は、「NF 02201」と命名されて工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている(生命
工学工業技術研究所寄託番号FERM P−1401
7)。なお、「NF 02201」株の変異株は、各種
の放射線、化学的突然変異誘発物質を利用した公知の突
然変異誘発手段により容易に発生させることが出来る。
rth and Bisby's Dictionary of the Fungi ( D. L. Ha
wksworth, B. C. Sutton and G.C. Ainsworth 著、第7
版、C. M. I.、Kew 、1983年) に従い、真菌門、不完全
菌亜門、不完全糸状菌綱の Curvularia 属菌と同定し
た。本菌株は、「NF 02201」と命名されて工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている(生命
工学工業技術研究所寄託番号FERM P−1401
7)。なお、「NF 02201」株の変異株は、各種
の放射線、化学的突然変異誘発物質を利用した公知の突
然変異誘発手段により容易に発生させることが出来る。
【0019】本発明に使用される菌の培養には、カビの
培養に利用される通常の培地が使用できる。具体的に
は、炭素源、窒素源、無機物の他、使用菌が必要とする
微量栄養素を適当に含有するものであれば、合成培地、
天然培地の何れも使用可能である。
培養に利用される通常の培地が使用できる。具体的に
は、炭素源、窒素源、無機物の他、使用菌が必要とする
微量栄養素を適当に含有するものであれば、合成培地、
天然培地の何れも使用可能である。
【0020】上記の炭素源としては、グルコース、シュ
ークロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜な
どが使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、
硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム等の無機塩類、D−アラニン、L−グルタミン酸な
どのアミノ酸類、ペントン、肉エキス、酵母エキス、麦
芽エキス、コーンスチープリッカー等の窒素含有天然物
が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、
リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用でき
る。
ークロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜な
どが使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、
硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム等の無機塩類、D−アラニン、L−グルタミン酸な
どのアミノ酸類、ペントン、肉エキス、酵母エキス、麦
芽エキス、コーンスチープリッカー等の窒素含有天然物
が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、
リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用でき
る。
【0021】培養は、通常、振盪培養や通気攪拌培養で
行う。培養温度は、10〜37℃、好適には20〜37
℃である。培地の pH は、3〜10、好適には5〜6の
範囲である。培養期間は、1〜7日間であり、通常は2
〜4日である。斯かる条件で培養することにより、培養
物中、特に、菌体内にD−アミノ酸オキシダーゼを生成
蓄積することが出来る。
行う。培養温度は、10〜37℃、好適には20〜37
℃である。培地の pH は、3〜10、好適には5〜6の
範囲である。培養期間は、1〜7日間であり、通常は2
〜4日である。斯かる条件で培養することにより、培養
物中、特に、菌体内にD−アミノ酸オキシダーゼを生成
蓄積することが出来る。
【0022】培養物からD−アミノ酸オキシダーゼを採
取する方法は、蛋白質の精製で採用される通常の方法が
使用される。例えば、培養液をろ過して菌体を得、この
菌体を適当な方法で破砕し、破砕液から遠心分離などに
よって上清液を得る。この上清液中に含まれるD−アミ
ノ酸オキシダーゼは、塩析、透析、イオン交換クロマト
グラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、
電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによ
って採取することが出来る。
取する方法は、蛋白質の精製で採用される通常の方法が
使用される。例えば、培養液をろ過して菌体を得、この
菌体を適当な方法で破砕し、破砕液から遠心分離などに
よって上清液を得る。この上清液中に含まれるD−アミ
ノ酸オキシダーゼは、塩析、透析、イオン交換クロマト
グラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、
電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによ
って採取することが出来る。
【0023】次に、本発明の第1の要旨に係るD−アミ
ノ酸オキシダーゼについて説明する。この酵素の活性
は、次の各方法で測定することが出来る。 (1) 過酸化水素の比色検出法 100mMのトリス・塩酸緩衝液( pH 8.5)1ml、2
5mMの4−アミノアンチピリン0.1ml、420mMのフ
ェノール溶液0.1ml、100units/mlの西洋わさびペ
ルオキシダーゼ0.1ml、100mMのD−アラニン1m
l、水0.65mlを3ml石英セルに入れ、恒温セルホル
ダー付き分光光度計にセットして37℃で5分間インキ
ュベートした後、酵素溶液0.05mlを加えて攪拌し、
500nmにおける5分間の吸光度変化(ΔABS/min)
を測定する。そして、次の式により酵素活性を算出す
る。なお、式中のnは希釈倍率を表す。
ノ酸オキシダーゼについて説明する。この酵素の活性
は、次の各方法で測定することが出来る。 (1) 過酸化水素の比色検出法 100mMのトリス・塩酸緩衝液( pH 8.5)1ml、2
5mMの4−アミノアンチピリン0.1ml、420mMのフ
ェノール溶液0.1ml、100units/mlの西洋わさびペ
ルオキシダーゼ0.1ml、100mMのD−アラニン1m
l、水0.65mlを3ml石英セルに入れ、恒温セルホル
ダー付き分光光度計にセットして37℃で5分間インキ
ュベートした後、酵素溶液0.05mlを加えて攪拌し、
500nmにおける5分間の吸光度変化(ΔABS/min)
を測定する。そして、次の式により酵素活性を算出す
る。なお、式中のnは希釈倍率を表す。
【0024】
【数1】
【0025】(2) 2オキソ酸のDNP検出法 100mMのトリス・塩酸緩衝液( pH 8.5)1ml、1
00mMのD−アラニン1ml、水0.95mlを試験管に入
れ、37℃の恒温槽で5分間インキュベートした後、酵
素溶液0.05mlを加えて攪拌し、10分間反応させ
る。反応後、30%トリクロロ酢酸1mlを加えて反応を
止める。反応液2mlを別の試験管に採取し、0.05%
2,4−ジニトロフェニルヒドラジン(DNP)の2M
塩酸溶液2mlを加えて充分攪拌し、室温下に5分間放置
後、トルエン6mlを加えて強く攪拌する。上層(トルエ
ン層)5mlを別の試験管に移し、これに10%炭酸ナト
リウム溶液5mlを加えて強く攪拌し、DNP反応物を水
層に抽出する。下層(水層)3mlを別の試験管に取り、
これに4M 水酸化ナトリウム溶液1mlを加えて充分攪拌
した後、470nmにおける吸光度を測定する。酵素活性
は、予め、ピルビン酸カリウム(mM単位)で作成した検
量線の値(PmM)から、次の式により算出する。なお、
式中のnは希釈倍率を表す。
00mMのD−アラニン1ml、水0.95mlを試験管に入
れ、37℃の恒温槽で5分間インキュベートした後、酵
素溶液0.05mlを加えて攪拌し、10分間反応させ
る。反応後、30%トリクロロ酢酸1mlを加えて反応を
止める。反応液2mlを別の試験管に採取し、0.05%
2,4−ジニトロフェニルヒドラジン(DNP)の2M
塩酸溶液2mlを加えて充分攪拌し、室温下に5分間放置
後、トルエン6mlを加えて強く攪拌する。上層(トルエ
ン層)5mlを別の試験管に移し、これに10%炭酸ナト
リウム溶液5mlを加えて強く攪拌し、DNP反応物を水
層に抽出する。下層(水層)3mlを別の試験管に取り、
これに4M 水酸化ナトリウム溶液1mlを加えて充分攪拌
した後、470nmにおける吸光度を測定する。酵素活性
は、予め、ピルビン酸カリウム(mM単位)で作成した検
量線の値(PmM)から、次の式により算出する。なお、
式中のnは希釈倍率を表す。
【0026】
【数2】
【0027】本発明のD−アミノ酸オキシダーゼの他の
特性は、次の通りである。 (1) 作用:本発明のD−アミノ酸オキシダーゼは、酸素
の存在下D−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、2−オキ
ソ酸およびアンモニアを生成する酵素であり、国際生化
学連合(IUB)の分類ではEC1.4.3.3に分類
される。酸化反応の一例として、D−アラニンが基質の
場合の反応式を次に示す。
特性は、次の通りである。 (1) 作用:本発明のD−アミノ酸オキシダーゼは、酸素
の存在下D−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、2−オキ
ソ酸およびアンモニアを生成する酵素であり、国際生化
学連合(IUB)の分類ではEC1.4.3.3に分類
される。酸化反応の一例として、D−アラニンが基質の
場合の反応式を次に示す。
【0028】
【化1】 D−アラニン+O2 +H2 O──→ ピルビン酸+H2 O2 +NH3
【0029】(2) 基質特異性と基質親和性:前記の「過
酸化水素の比色検出法」において、D−アラニンの代わ
りに他の各種アミノ酸(いずれも終濃度33mM)を使用
した場合の相対反応性(基質特異性)は、表1に示す通
りである。すなわち、D−アラニン、D−バリン、D−
フェニルアラニン、D−メチオニン、D−イソロイシ
ン、D−ロイシン及びD−グルタミンに強く作用し、D
−セリン、D−アスパラギン、D−スレオニン及びD−
グルタミン酸にも作用する。しかし、データの記載を省
略したが、D−システイン、D−シスチン、D−チロシ
ン、D−トリプトファン、D−プロリン、D−アスパラ
ギン酸、D−リジン、D−アルギニン、D−ヒスチジ
ン、グリシン及びL−アミノ酸(19種)には作用しな
い。また、D−アラニン、D−バリン、D−フェニルア
ラニン、D−イソロイシンについての基質親和性(K
m)と最大反応速度(Vmax)は、表1に示す通りで
ある。
酸化水素の比色検出法」において、D−アラニンの代わ
りに他の各種アミノ酸(いずれも終濃度33mM)を使用
した場合の相対反応性(基質特異性)は、表1に示す通
りである。すなわち、D−アラニン、D−バリン、D−
フェニルアラニン、D−メチオニン、D−イソロイシ
ン、D−ロイシン及びD−グルタミンに強く作用し、D
−セリン、D−アスパラギン、D−スレオニン及びD−
グルタミン酸にも作用する。しかし、データの記載を省
略したが、D−システイン、D−シスチン、D−チロシ
ン、D−トリプトファン、D−プロリン、D−アスパラ
ギン酸、D−リジン、D−アルギニン、D−ヒスチジ
ン、グリシン及びL−アミノ酸(19種)には作用しな
い。また、D−アラニン、D−バリン、D−フェニルア
ラニン、D−イソロイシンについての基質親和性(K
m)と最大反応速度(Vmax)は、表1に示す通りで
ある。
【0030】
【表1】 (*D−アラニンの反応性を100とした)
【0031】(3) 至適 pH と pH 安定性 前記の「2オキソ酸のDNP検出法」において、緩衝液
として、図1に示した各種の pH を有するクエン酸緩衝
液、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グリシン緩衝
液を使用し、精製酵素の酵素活性を測定した。結果を図
1に示す。図1から、本酵素の至適 pH は、9〜10で
あることが分かる。
として、図1に示した各種の pH を有するクエン酸緩衝
液、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グリシン緩衝
液を使用し、精製酵素の酵素活性を測定した。結果を図
1に示す。図1から、本酵素の至適 pH は、9〜10で
あることが分かる。
【0032】図2に示した各種の pH を有するクエン酸
緩衝液、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グリシン
緩衝液(各緩衝液とも50mM)に精製酵素を溶解し、3
0℃で30分処理後、前記の「過酸化水素の比色検出
法」により残存酵素活性を測定し、その結果を図2に示
す。図2から、本酵素の安定 pH 範囲は、7〜10であ
ることが分かる。
緩衝液、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グリシン
緩衝液(各緩衝液とも50mM)に精製酵素を溶解し、3
0℃で30分処理後、前記の「過酸化水素の比色検出
法」により残存酵素活性を測定し、その結果を図2に示
す。図2から、本酵素の安定 pH 範囲は、7〜10であ
ることが分かる。
【0033】(4) 至適温度と熱安定性 「2オキソ酸のDNP検出法」において反応温度を変え
て精製酵素の酵素活性を測定し、その結果を図3に示
す。図3から、本酵素の至適温度は約35℃であること
が分かる。また、20mMトリス・塩酸緩衝液(pH8.
5)に精製酵素を溶解し、20〜70℃の各温度で10
分処理後、「過酸化水素の比色検出法」により残存酵素
活性を測定し、その結果を図4に示す。図4から、本酵
素は、35℃まで安定であることが分かる。
て精製酵素の酵素活性を測定し、その結果を図3に示
す。図3から、本酵素の至適温度は約35℃であること
が分かる。また、20mMトリス・塩酸緩衝液(pH8.
5)に精製酵素を溶解し、20〜70℃の各温度で10
分処理後、「過酸化水素の比色検出法」により残存酵素
活性を測定し、その結果を図4に示す。図4から、本酵
素は、35℃まで安定であることが分かる。
【0034】(5) 阻害剤 上記の「2オキソ酸のDNP検出法」の系に、1mM濃度
になる様に表2及び3に示す各種の添加物を加え、精製
酵素の酵素活性を測定した。添加物無しのコントロ−ル
に対し、添加物により表2及び3に示す様な阻害効果や
増強効果が認められた。これらの結果から、本酵素は、
塩化鉛、塩化亜鉛、塩化カドミウム、塩化水銀、硝酸
銀、p−クロロマーキュリ安息香酸およびN−エチルマ
レインイミドによって強く阻害されることが分かる。
になる様に表2及び3に示す各種の添加物を加え、精製
酵素の酵素活性を測定した。添加物無しのコントロ−ル
に対し、添加物により表2及び3に示す様な阻害効果や
増強効果が認められた。これらの結果から、本酵素は、
塩化鉛、塩化亜鉛、塩化カドミウム、塩化水銀、硝酸
銀、p−クロロマーキュリ安息香酸およびN−エチルマ
レインイミドによって強く阻害されることが分かる。
【0035】
【表2】
【0036】
【表3】
【0037】(6) 分子量 本酵素のゲル濾過法で測定した分子量は、約150,0
00である。また、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミド電気泳動法で測定した分子量は約39,00
0であり、単一のバンドを示した。従って、単一のサブ
ユニットから構成されていることが分かる。
00である。また、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミド電気泳動法で測定した分子量は約39,00
0であり、単一のバンドを示した。従って、単一のサブ
ユニットから構成されていることが分かる。
【0038】(7) 等電点 等電点電気泳動法で測定した本酵素の等電点(pI)は
4.9である。
4.9である。
【0039】次に、本発明によって得られるD−アミノ
酸オキシダーゼの用途について説明する。D−アミノ酸
オキシダーゼは、酸素の存在下にD−アミノ酸の酸化反
応を触媒し、過酸化水素、2−オキソ酸とアンモニアを
生成する酵素である。従って、斯かる反応による変化を
利用できる用途であれば、如何なる用途にも利用し得
る。
酸オキシダーゼの用途について説明する。D−アミノ酸
オキシダーゼは、酸素の存在下にD−アミノ酸の酸化反
応を触媒し、過酸化水素、2−オキソ酸とアンモニアを
生成する酵素である。従って、斯かる反応による変化を
利用できる用途であれば、如何なる用途にも利用し得
る。
【0040】直接的に反応生成物を利用する例として
は、2−オキソ酸の製造法が挙げられる。また、前駆原
料のD−アミノ酸の側鎖を酸化する抗生物質原料などの
製造法、例えば、セファロスポリンCからの7−アミノ
セファロスポラン酸の製造法が挙げられる。
は、2−オキソ酸の製造法が挙げられる。また、前駆原
料のD−アミノ酸の側鎖を酸化する抗生物質原料などの
製造法、例えば、セファロスポリンCからの7−アミノ
セファロスポラン酸の製造法が挙げられる。
【0041】また、間接的に反応生成物を利用する例と
しては、D・L−アミノ酸からD−体だけを酸化するL
−アミノ酸の製造法が挙げられる。また、反応生成物の
量的変化を直接または間接的にシグナルとして検出する
基質のD−アミノ酸や抗生物質などの測定法、D−アミ
ノ酸の生成を伴う別な酵素反応系の後にD−アミノ酸測
定法を結合した末端にD−アミノ酸を有する前駆基質
(例えばペプチド等)の測定法が挙げられる。また、上
記とは逆に、D−アミノ酸を有する合成ペプチドを基質
として添加するエクソプロテアーゼやペプチダーゼ等の
酵素活性の測定法、例えば、ロイシンアミノペプチダー
ゼ活性の測定法などが挙げられる。
しては、D・L−アミノ酸からD−体だけを酸化するL
−アミノ酸の製造法が挙げられる。また、反応生成物の
量的変化を直接または間接的にシグナルとして検出する
基質のD−アミノ酸や抗生物質などの測定法、D−アミ
ノ酸の生成を伴う別な酵素反応系の後にD−アミノ酸測
定法を結合した末端にD−アミノ酸を有する前駆基質
(例えばペプチド等)の測定法が挙げられる。また、上
記とは逆に、D−アミノ酸を有する合成ペプチドを基質
として添加するエクソプロテアーゼやペプチダーゼ等の
酵素活性の測定法、例えば、ロイシンアミノペプチダー
ゼ活性の測定法などが挙げられる。
【0042】次に、基質を測定する方法の一例として、
D−アラニンの定量法について詳述する。D−アラニン
が基質の場合、D−アミノ酸オキシダーゼが触媒する反
応式を以下に示す。
D−アラニンの定量法について詳述する。D−アラニン
が基質の場合、D−アミノ酸オキシダーゼが触媒する反
応式を以下に示す。
【0043】
【化2】 D−アラニン+O2 +H2O──→ ピルビン酸+H2O2 +NH3
【0044】上記の反応式から明らかなように、反応生
成物のピルビン酸、過酸化水素、アンモニアの何れを検
出してもD−アラニンを定量することが出来る。ピルビ
ン酸の検出法としては、通常の生化学検査で使用されて
いる乳酸脱水素酵素を利用したピルビン酸の測定方法、
D−アミノ酸オキシダーゼの酵素活性測定で前記した
「2オキソ酸のDNP検出法」などが利用できる。
成物のピルビン酸、過酸化水素、アンモニアの何れを検
出してもD−アラニンを定量することが出来る。ピルビ
ン酸の検出法としては、通常の生化学検査で使用されて
いる乳酸脱水素酵素を利用したピルビン酸の測定方法、
D−アミノ酸オキシダーゼの酵素活性測定で前記した
「2オキソ酸のDNP検出法」などが利用できる。
【0045】過酸化水素の検出法としては、公知の方
法、例えば、前記の「過酸化水素の比色検出法」を利用
することが出来る。アンモニアの検出法としては、通常
の測定法、例えば、グルタミン酸脱水素酵素を利用した
アンモニアの測定系を使用することが出来る。また、こ
れらの測定法は、反応速度上、レート法とエンドポイン
ト法の2つに分類されているが、その何れであってもよ
く、測定系、反応時間、基質のD−アラニンの濃度、検
体の種類などの条件により、適宜選択される。
法、例えば、前記の「過酸化水素の比色検出法」を利用
することが出来る。アンモニアの検出法としては、通常
の測定法、例えば、グルタミン酸脱水素酵素を利用した
アンモニアの測定系を使用することが出来る。また、こ
れらの測定法は、反応速度上、レート法とエンドポイン
ト法の2つに分類されているが、その何れであってもよ
く、測定系、反応時間、基質のD−アラニンの濃度、検
体の種類などの条件により、適宜選択される。
【0046】基質のD−アミノ酸を測定する場合は、基
質を含有する試料およびD−アミノ酸オキシダーゼを、
約 pH 7〜12の緩衝液に加えて反応させればよい。D
−アミノ酸オキシダーゼは、溶液状態の他、必要に応じ
て、凍乾品、マイクロカプセル化したもの、または、担
体に固定し不溶化したものも使用することが出来る。緩
衝液としては、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グ
リシン緩衝液などが使用される。酵素は、通常1〜50
0μM 濃度の基質に対し、0.5〜50 units/ml 濃度
の割合で使用される。
質を含有する試料およびD−アミノ酸オキシダーゼを、
約 pH 7〜12の緩衝液に加えて反応させればよい。D
−アミノ酸オキシダーゼは、溶液状態の他、必要に応じ
て、凍乾品、マイクロカプセル化したもの、または、担
体に固定し不溶化したものも使用することが出来る。緩
衝液としては、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グ
リシン緩衝液などが使用される。酵素は、通常1〜50
0μM 濃度の基質に対し、0.5〜50 units/ml 濃度
の割合で使用される。
【0047】過酸化水素の検出法としては、上記の他、
公知の比色法、蛍光法、化学発光法、電極法なども使用
できる。比色法では、ペルオキシダーゼ等の触媒によ
り、過酸化水素でペルオキシダーゼの基質を酸化発色さ
せ、発色濃度を分光光度計で測定する。ペルオキシダー
ゼの基質としては、0−フェニレンジアミン、5−アミ
ノサリチル酸、4−アミノアンチピリンとフェノール、
2,2’−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−
6−スルフォン酸)、ビス〔3−ビス(4−クロロフェ
ニル)メチル−4−ジメチル−アミノフェニル〕アミン
等が利用できる。
公知の比色法、蛍光法、化学発光法、電極法なども使用
できる。比色法では、ペルオキシダーゼ等の触媒によ
り、過酸化水素でペルオキシダーゼの基質を酸化発色さ
せ、発色濃度を分光光度計で測定する。ペルオキシダー
ゼの基質としては、0−フェニレンジアミン、5−アミ
ノサリチル酸、4−アミノアンチピリンとフェノール、
2,2’−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−
6−スルフォン酸)、ビス〔3−ビス(4−クロロフェ
ニル)メチル−4−ジメチル−アミノフェニル〕アミン
等が利用できる。
【0048】蛍光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒に
より、過酸化水素で基質を酸化して蛍光物質を生成さ
せ、その蛍光強度を蛍光光度計で測定する。ペルオキシ
ダーゼの基質としては、p−ヒドロキシフェニル酢酸、
p−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などが利用でき
る。
より、過酸化水素で基質を酸化して蛍光物質を生成さ
せ、その蛍光強度を蛍光光度計で測定する。ペルオキシ
ダーゼの基質としては、p−ヒドロキシフェニル酢酸、
p−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などが利用でき
る。
【0049】化学発光法では、ペルオキシダーゼ等の触
媒により、過酸化水素で基質を酸化して発光させ、その
発光強度をルミノメーターで測定する。化学発光する基
質としては、ルミノール化合物、ルシゲニン、アリルシ
ュウ酸エステル類の化合物などが利用できる。また、D
−アミノ酸オキシダーゼとD−アミノ酸の検出に必要な
前記の試薬成分を含む試薬を調製し、D−アミノ酸の測
定キットとして診断薬に組み立てることが出来る。
媒により、過酸化水素で基質を酸化して発光させ、その
発光強度をルミノメーターで測定する。化学発光する基
質としては、ルミノール化合物、ルシゲニン、アリルシ
ュウ酸エステル類の化合物などが利用できる。また、D
−アミノ酸オキシダーゼとD−アミノ酸の検出に必要な
前記の試薬成分を含む試薬を調製し、D−アミノ酸の測
定キットとして診断薬に組み立てることが出来る。
【0050】
【実施例】以下、本発明を実施例によって更に詳細に説
明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の
実施例に限定されるものではない。
明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の
実施例に限定されるものではない。
【0051】実施例1(クルブラリア属の菌によるD−
アミノ酸オキシダーゼの製造) ポリペプトン:1重量%(以下、単に%と略記する)、
酵母エキス:0.5%、MgSO4 ・7H2 O :0.05%、
KH2 PO4 :0.1%、D−アラニン:0.2%、グルコ
−ス:1%を含有し、 pH 6の培地100mlを500ml
の培養フラスコに分注し、120℃で20分間殺菌した
後、クルブラリア属の菌「NF 02201」株(生命
工学工業技術研究所寄託番号FERM P−1401
7)を一白金耳接種し、27℃で48時間、振とう培養
して種培養液とした。
アミノ酸オキシダーゼの製造) ポリペプトン:1重量%(以下、単に%と略記する)、
酵母エキス:0.5%、MgSO4 ・7H2 O :0.05%、
KH2 PO4 :0.1%、D−アラニン:0.2%、グルコ
−ス:1%を含有し、 pH 6の培地100mlを500ml
の培養フラスコに分注し、120℃で20分間殺菌した
後、クルブラリア属の菌「NF 02201」株(生命
工学工業技術研究所寄託番号FERM P−1401
7)を一白金耳接種し、27℃で48時間、振とう培養
して種培養液とした。
【0052】上記と同じ組成の培地400mlを入れた2
リットルの培養フラスコ4本を120℃で20分間殺菌
して冷却した後、上記の種培養液をそれぞれ4mlずつ分
注接種し、27℃で48時間、振とう培養して前培養液
とした。次に、上記と同じ培地組成に消泡剤0.01%
を添加した培地160リットルを、200リットルのジ
ャーファーメンターに入れ、120℃で30分間殺菌し
て冷却した後、上記の前培養液1.6リットルを接種
し、27℃で48時間、150リットル/分の通気量と
200rpm の攪拌速度の条件下で培養した。培養終了
後、培養液をろ過して湿菌体12Kgを得た。
リットルの培養フラスコ4本を120℃で20分間殺菌
して冷却した後、上記の種培養液をそれぞれ4mlずつ分
注接種し、27℃で48時間、振とう培養して前培養液
とした。次に、上記と同じ培地組成に消泡剤0.01%
を添加した培地160リットルを、200リットルのジ
ャーファーメンターに入れ、120℃で30分間殺菌し
て冷却した後、上記の前培養液1.6リットルを接種
し、27℃で48時間、150リットル/分の通気量と
200rpm の攪拌速度の条件下で培養した。培養終了
後、培養液をろ過して湿菌体12Kgを得た。
【0053】得られた菌体のうち2Kgを3倍容の1mMジ
チオスレイトール含有20mMトリス・塩酸緩衝液( pH
8.5)に懸濁し、冷却下に摩砕装置「ダイノミル」で
菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して菌体残渣を除
き、粗酵素液6200mlを得た。この粗酵素液に硫安を
40%飽和になる様に加え、一昼夜放置した後、析出し
た沈殿物を遠心分離により除去し、得られた上清液に5
5%飽和となる様に硫安を追加し、再度、一昼夜放置
し、遠心分離により析出した沈殿物を回収した。
チオスレイトール含有20mMトリス・塩酸緩衝液( pH
8.5)に懸濁し、冷却下に摩砕装置「ダイノミル」で
菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して菌体残渣を除
き、粗酵素液6200mlを得た。この粗酵素液に硫安を
40%飽和になる様に加え、一昼夜放置した後、析出し
た沈殿物を遠心分離により除去し、得られた上清液に5
5%飽和となる様に硫安を追加し、再度、一昼夜放置
し、遠心分離により析出した沈殿物を回収した。
【0054】上記の沈殿物を、1mMジチオスレイトール
含有20mMトリス・塩酸緩衝液( pH 8.5)150ml
に溶解した後、透析膜を使用し、同組成の緩衝液にて脱
塩した。脱塩液を、予め、1mMジチオスレイトール含有
20mMトリス・塩酸緩衝液(pH 8.5)で平衡化した
「DEAE−セルロファインA−500カラム」(直径
4.0cm×長さ12cm)に通して酵素を吸着させ、同組
成の緩衝液で洗浄後、1mMジチオスレイトール含有20
mMトリス・塩酸緩衝液( pH 8.5)から500mMのN
aClと1mMジチオスレイトールを含有する100mMト
リス・塩酸緩衝液( pH 8.5)への直線グラジエント
で溶出し、酵素の活性画分を集めた。
含有20mMトリス・塩酸緩衝液( pH 8.5)150ml
に溶解した後、透析膜を使用し、同組成の緩衝液にて脱
塩した。脱塩液を、予め、1mMジチオスレイトール含有
20mMトリス・塩酸緩衝液(pH 8.5)で平衡化した
「DEAE−セルロファインA−500カラム」(直径
4.0cm×長さ12cm)に通して酵素を吸着させ、同組
成の緩衝液で洗浄後、1mMジチオスレイトール含有20
mMトリス・塩酸緩衝液( pH 8.5)から500mMのN
aClと1mMジチオスレイトールを含有する100mMト
リス・塩酸緩衝液( pH 8.5)への直線グラジエント
で溶出し、酵素の活性画分を集めた。
【0055】上記の活性画分の溶出液に硫安を55%飽
和となる様に加え、一昼夜放置した後、遠心分離により
沈殿物を回収した。この沈殿物を、1mMジチオスレイト
ール含有20mMトリス・塩酸緩衝液( pH 8.5)5ml
に溶解した後、透析膜を使用し、同組成の緩衝液にて脱
塩した。この脱塩液に硫安を加え30%飽和となる様に
調整した後、予め、30%飽和硫安と1mMジチオスレイ
トールを含有する20mMトリス・塩酸緩衝液( pH 8.
5)で平衡化した「ブチルトヨパール650Mカラム」
(直径0.8cm×長さ2.5cm)に通して酵素を吸着さ
せ、同組成の緩衝液で洗浄した後、30%飽和硫安と1
mMジチオスレイトールを含有する20mMトリス・塩酸緩
衝液( pH 8.5)から1mMジチオスレイトール含有2
0mMトリス・塩酸緩衝液( pH 8.5)への直線グラジ
エントで溶出し、酵素の活性画分を集めた。
和となる様に加え、一昼夜放置した後、遠心分離により
沈殿物を回収した。この沈殿物を、1mMジチオスレイト
ール含有20mMトリス・塩酸緩衝液( pH 8.5)5ml
に溶解した後、透析膜を使用し、同組成の緩衝液にて脱
塩した。この脱塩液に硫安を加え30%飽和となる様に
調整した後、予め、30%飽和硫安と1mMジチオスレイ
トールを含有する20mMトリス・塩酸緩衝液( pH 8.
5)で平衡化した「ブチルトヨパール650Mカラム」
(直径0.8cm×長さ2.5cm)に通して酵素を吸着さ
せ、同組成の緩衝液で洗浄した後、30%飽和硫安と1
mMジチオスレイトールを含有する20mMトリス・塩酸緩
衝液( pH 8.5)から1mMジチオスレイトール含有2
0mMトリス・塩酸緩衝液( pH 8.5)への直線グラジ
エントで溶出し、酵素の活性画分を集めた。
【0056】上記の活性画分を限外ろ過膜(ザルトリウ
ス社製、セントリザルトI:分画分子量2万)で濃縮し
た後、この濃縮液を高速液体クロマトグラフィーの分析
用カラム「ショーデックスプロテインKW−803」
(直径0.8cm×長さ30cm)に通し、移動相:200
mM NaCl 含有100mMリン酸カリウム緩衝液( pH 7.
0)、流速:0.8ml/分の条件で活性画分を分取し
た。分取した酵素は、SDS電気泳動で単一なバンドを
示した。
ス社製、セントリザルトI:分画分子量2万)で濃縮し
た後、この濃縮液を高速液体クロマトグラフィーの分析
用カラム「ショーデックスプロテインKW−803」
(直径0.8cm×長さ30cm)に通し、移動相:200
mM NaCl 含有100mMリン酸カリウム緩衝液( pH 7.
0)、流速:0.8ml/分の条件で活性画分を分取し
た。分取した酵素は、SDS電気泳動で単一なバンドを
示した。
【0057】
【表4】 各精製工程の収率と比活性 ─────────────────────────────────── 精製工程 総活性 総蛋白 比活性 収率 (units) (mg) (units/mg) (%) ─────────────────────────────────── (1) 粗酵素液 6240 9860 0.63 100 (2) 硫安分画 5010 1480 3.39 80.3 (3) DEAE−セルロファイン 4990 380 13.1 80.0 A−500クロマト (4) ブチルトヨパール 1700 15.0 113 27.2 650Mクロマト (5) ショーデックスプロテイン 303 1.18 257 4.9 KW−803クロマト ───────────────────────────────────
【0058】実施例2(ロビラーダ属の菌によるD−ア
ミノ酸オキシダーゼの製造) 実施例1の菌株をロビラーダ(Robillarda)属の菌「M
ET006」に変え、実施例1と同様に操作し、実施例
1と同じ組成の培地400mlを入れた2リットルの培養
フラスコ4本を、27℃で48時間培養した。粗酵素液
中のD−アミノ酸オキシダーゼは、580units/リット
ルであった。
ミノ酸オキシダーゼの製造) 実施例1の菌株をロビラーダ(Robillarda)属の菌「M
ET006」に変え、実施例1と同様に操作し、実施例
1と同じ組成の培地400mlを入れた2リットルの培養
フラスコ4本を、27℃で48時間培養した。粗酵素液
中のD−アミノ酸オキシダーゼは、580units/リット
ルであった。
【0059】実施例3(ミロセシウム・トリアティスポ
リウム属の菌によるD−アミノ酸オキシダーゼの製造) 実施例1の菌株をミロセシウム・トリアティスポリウム
(Myrothecium striatisporum)属の菌「MET093」
に変え、実施例1と同様に操作し、実施例1と同じ組成
の培地400mlを入れた2リットルの培養フラスコ4本
を、27℃で48時間培養した。粗酵素液中のD−アミ
ノ酸オキシダーゼは、320units/リットルであった。
リウム属の菌によるD−アミノ酸オキシダーゼの製造) 実施例1の菌株をミロセシウム・トリアティスポリウム
(Myrothecium striatisporum)属の菌「MET093」
に変え、実施例1と同様に操作し、実施例1と同じ組成
の培地400mlを入れた2リットルの培養フラスコ4本
を、27℃で48時間培養した。粗酵素液中のD−アミ
ノ酸オキシダーゼは、320units/リットルであった。
【0060】
【発明の効果】以上説明した本発明によれば、臨床診断
薬として極めて有用なD−アミノ酸オキシダーゼ及びそ
の工業的生産に適した製造法が提供される。
薬として極めて有用なD−アミノ酸オキシダーゼ及びそ
の工業的生産に適した製造法が提供される。
【図1】本発明のD−アミノ酸オキシダーゼの至適 pH
を示すグラフである。
を示すグラフである。
【図2】本発明のD−アミノ酸オキシダーゼの pH 安定
性を示すグラフである。
性を示すグラフである。
【図3】本発明のD−アミノ酸オキシダーゼの至適温度
を示すグラフである。
を示すグラフである。
【図4】本発明のD−アミノ酸オキシダーゼの温度安定
性を示すグラフである。
性を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:645) (72)発明者 薮内 正彦 東京都練馬区小竹町1−40−5
Claims (7)
- 【請求項1】 次の(1) 〜(8) に記載の理化学的性質を
有することを特徴とするD−アミノ酸オキシダーゼ。 (1) 作用:酸素の存在下、D−アミノ酸を酸化し、過酸
化水素、2−オキソ酸およびアンモニアを生成する。 (2) 基質特異性:D−アラニン、D−バリン、D−フェ
ニルアラニン、D−メチオニン、D−イソロイシン、D
−ロイシン及びD−グルタミンに強く作用し、D−セリ
ン、D−アスパラギン、D−スレオニン及びD−グルタ
ミン酸にも作用するが、D−システイン、D−シスチ
ン、D−チロシン、D−トリプトファン、D−プロリ
ン、D−アスパラギン酸、D−リジン、D−アルギニ
ン、D−ヒスチジン、グリシン及びL−アミノ酸には作
用しない。 (3) 至適 pH と pH 安定性:至適 pH は9〜10であ
り、30℃で30分処理の安定 pH 範囲は7〜10であ
る。 (4) 至適温度と熱安定性:至適温度は約35℃であり、
pH 8.5における10分間の処理では35℃まで安定
である。 (5) 阻害剤:塩化鉛、塩化亜鉛、塩化カドミウム、塩化
水銀、硝酸銀、p−クロロマーキュリー安息香酸および
N−エチルマレインイミドで強く阻害される。 (6) 分子量:ゲル濾過法で測定した分子量が約150,
000、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
電気泳動法で測定した分子量が約39,000であり、
単一のサブユニットから構成されている。 (7) 等電点:4.9 (8) 基質親和性(Km値):D−アラニン:2.06m
M、D−バリン:1.58mM、D−フェニルアラニ
ン:0.855mM、 - 【請求項2】 不完全糸状菌クルブラリア(Curvulari
a)属、ロビラーダ(Robillarda)属またはミロセシウ
ム(Myrothecium ) 属に属し、D−アミノ酸オキシダー
ゼ生産能を有する微生物を培養し、培養物からD−アミ
ノ酸オキシダーゼを採取することを特徴とするD−アミ
ノ酸オキシダーゼの製造法。 - 【請求項3】 不完全糸状菌クルブラリア(Curvulari
a)属に属し、D−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有す
る微生物を培養し、培養物からD−アミノ酸オキシダー
ゼを採取することを特徴とするD−アミノ酸オキシダー
ゼの製造法。 - 【請求項4】 不完全糸状菌ロビラーダ(Robillarda)
属に属し、D−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する微
生物を培養し、培養物からD−アミノ酸オキシダーゼを
採取することを特徴とするD−アミノ酸オキシダーゼの
製造法。 - 【請求項5】 不完全糸状菌ミロセシウム(Myrotheciu
m ) 属に属し、D−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有す
る微生物を培養し、培養物からD−アミノ酸オキシダー
ゼを採取することを特徴とするD−アミノ酸オキシダー
ゼの製造法。 - 【請求項6】 不完全糸状菌クルブラリア(Curvulari
a)に属する「NF02201」株(生命工学工業技術
研究所寄託番号FERM P−14017)又はその変
異株を培養し、培養物からD−アミノ酸オキシダーゼを
採取することを特徴とするD−アミノ酸オキシダーゼの
製造法。 - 【請求項7】 不完全糸状菌クルブラリア(Curvulari
a)に属しD−アミノ酸オキシダーゼ産性能を有する
「NF 02201」株(生命工学工業技術研究所寄託
番号FERM P−14017)又はその変異株。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6095614A JPH07274957A (ja) | 1994-04-08 | 1994-04-08 | D−アミノ酸オキシダーゼ、その製造法および産生菌 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6095614A JPH07274957A (ja) | 1994-04-08 | 1994-04-08 | D−アミノ酸オキシダーゼ、その製造法および産生菌 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07274957A true JPH07274957A (ja) | 1995-10-24 |
Family
ID=14142434
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6095614A Pending JPH07274957A (ja) | 1994-04-08 | 1994-04-08 | D−アミノ酸オキシダーゼ、その製造法および産生菌 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH07274957A (ja) |
-
1994
- 1994-04-08 JP JP6095614A patent/JPH07274957A/ja active Pending
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Legal Events
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A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040527 |
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A02 | Decision of refusal |
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