JPH07274957A - Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、その製造法および産生菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】臨床診断薬として極めて有用なＤ−アミノ酸オ
キシダーゼの工業的生産に適した製造法を提供する。 【構成】不完全糸状菌クルブラリア（Curvularia）属、
ロビラーダ（Robillarda）属またはミロセシウム（Myro
thecium ) 属に属し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能
を有する微生物を培養し、培養物からＤ−アミノ酸オキ
シダーゼを採取する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なＤ−アミノ酸オ
キシダーゼ、その製造法および産生菌に関するものであ
る。本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼは、特に、臨床
診断薬として極めて有用である。

【０００２】

【従来の技術】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、酸素の存
在下Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、２−オキソ酸
およびアンモニアを生成する酵素であり、国際生化学連
合（ＩＵＢ）の分類ではＥＣ１．４．３．３に分類され
る。また、この酵素は、哺乳動物の器官や微生物に広く
存在していることが知られている（酵素ハンドブック：
丸尾文治、田宮信雄監修、朝倉書店）。

【０００３】上記の酵素を産生する微生物としては、ア
スペルギルス・ウスタス（特公昭５５−３５１１９号公
報、特公昭５９−１５６３５号公報）、セファロスポリ
ウム・ポトロニイ（特公昭５７−３０４７９号公報）、
トリコノプシス・バリアビリス（特公昭５９−１５６３
５号公報、特公昭６２−５０１６７７号公報、特開昭５
４−３２６９４号公報、特開昭５６−３０９８８号公
報、特開昭６２−２６２９９４号公報、特開昭６３−７
１１８０号公報）、グリオクラディウム属（特公昭６０
−５７８３７号公報）、カンジダ属（特開昭５５−２３
９６６号公報）、シュ−ドモナス属（特開昭６３−６３
３７７号公報）、フザリウム・ソラニ（特開平２−２０
０１８１号公報）、ロドトルラ・グルチニス（特開平５
−２１１８９０、ＥＰ５１７２００号公報）等が報告さ
れている。

【０００４】上記の酵素は、抗生物質前駆体の製造に利
用されている（特公昭５５−３５１１９号公報、特公昭
５７−１８８７９号公報、特公昭５７−３０４７９号公
報、特公昭５９−１５６３５号公報、特公昭６０−５７
８３７号公報、特公昭６２−５０１６７７号公報、特公
平０１−２３４７３号公報、特開昭５１−１１２５９４
号公報、特開昭５２−１１８９０号公報、特開昭５２−
３８０９２号公報、特開昭５４−３２６９４号公報、特
開昭５５−２３９６６号公報、特開昭５６−３０９８８
号公報、特開昭６２−２６２９９４号公報、特開昭６３
−７１１８０号公報、特開昭６３−７４４８８号公報、
特開平２−２００１８１号公報、特開平４−２２９１９
０号公報、特開平４−５０４３６２号公報、特開平５−
２１１８９０号公報、ＥＰ４６５６００号公開公報、Ｅ
Ｐ４７４２１１号公開公報、ＥＰ５１７２００号公開公
報）。

【０００５】また、上記の酵素は、Ｄ・Ｌ−アミノ酸か
らＬ−アミノ酸の製造にも利用され（特開昭４３−６５
４８４号公報、特開昭４８−７２３１４号公報、特開昭
４８−７２３９１号公報、特開昭６３−６３３７７号公
報）、更には、ロイシンアミノペプチダーゼ活性の測定
法（特公昭５９−２２７８号公報、特開昭５３−６５７
８７号公報）、抗生物質の分析法（ＥＰ１８１１０２号
公開公報）等にも利用されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】最近、血中のＤ−アミ
ノ酸の測定が、腎不全の指標となる可能性が示された
（Clinical Science, 73, 105-108(1987) 、Journal of
Chromatography, 614, 7-17 (1993) 、北里医学, 23,
51-62(1993) ）。既に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを使
用して酵素的にＤ−アミノ酸を測定する方法が長田らに
より検討されている（Analytical Biochemistry, 150,
238-242(1985) 、Clinical Science, 73, 105-108(198
7) ）。しかしながら、ブタの腎臓から抽出したＤ−ア
ミノ酸オキシダーゼを使用しているため、その量的な確
保に問題が有る。また、多種類のＤ−アミノ酸と幅広く
反応する基質特異性の広いＤ−アミノ酸オキシダーゼが
望まれている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記実情
に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、基質特異性の広い新規
なＤ−アミノ酸オキシダーゼを効率良く産生する菌を見
い出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、腎不全
などの診断薬として有用性の高い新規なＤ−アミノ酸オ
キシダーゼ、その製造法およびその産生菌に関するもの
であり、各発明の要旨は、次の通りである。

【０００８】本発明の第１の要旨は、次の(1) 〜(8) に
記載の理化学的性質を有することを特徴とするＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼに存する。 (1) 作用：酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸
化水素、２−オキソ酸およびアンモニアを生成する。 (2) 基質特異性：Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−フェ
ニルアラニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ
−ロイシン及びＤ−グルタミンに強く作用し、Ｄ−セリ
ン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−スレオニン及びＤ−グルタ
ミン酸にも作用するが、Ｄ−システイン、Ｄ−シスチ
ン、Ｄ−チロシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−プロリ
ン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニ
ン、Ｄ−ヒスチジン、グリシン及びＬ−アミノ酸には作
用しない。 (3) 至適 pH と pH 安定性：至適 pH は９〜１０であ
り、３０℃で３０分処理の安定 pH 範囲は７〜１０であ
る。 (4) 至適温度と熱安定性：至適温度は約３５℃であり、
pH ８．５における１０分間の処理では３５℃まで安定
である。 (5) 阻害剤：塩化鉛、塩化亜鉛、塩化カドミウム、塩化
水銀、硝酸銀、ｐ−クロロマーキュリー安息香酸および
Ｎ−エチルマレインイミドで強く阻害される。 (6) 分子量：ゲル濾過法で測定した分子量が約１５０，
０００、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
電気泳動法で測定した分子量が約３９，０００であり、
単一のサブユニットから構成されている。 (7) 等電点：４．９ (8) 基質親和性（Ｋｍ値）：Ｄ−アラニン：２．０６ｍ
Ｍ、Ｄ−バリン：１．５８ｍＭ、Ｄ−フェニルアラニ
ン：０．８５５ｍＭ

【０００９】また、本発明の第２の要旨は、不完全糸状
菌クルブラリア（Curvularia）属、ロビラーダ（Robill
arda）属またはミロセシウム（Myrothecium ) 属に属
し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する微生物を
培養し、培養物からＤ−アミノ酸オキシダーゼを採取す
ることを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造法
に存する。

【００１０】また、本発明の第３の要旨は、不完全糸状
菌クルブラリア（Curvularia）属に属し、Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼ産性能を有する「ＮＦ ０２２０１」株
（生命工学工業技術研究所寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４
０１７）又はその変異株に存する。

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。先ず、本
発明の第２の要旨に係るＤ−アミノ酸オキシダーゼの製
造法および第３の要旨に係るＤ−アミノ酸オキシダーゼ
産生菌について説明する。本発明の製造法に使用される
不完全糸状菌は、クルブラリア（Curvularia）属、ロビ
ラーダ（Robillarda）属またはミロセシウム（Myrothec
ium ) 属に属する菌株であり、例えば、クルブラリア
（Curvularia）属に属する「ＮＦ ０２２０１」株（生
命工学工業技術研究所寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４０１
７）又はその変異株が挙げられる。上記の「ＮＦ ０２
２０１」株は、本発明者らが、土壌中より分離した新菌
株であり、その菌学的性質は下記の通りである。

【００１２】１．各培地における生育状態 (1) 麦芽エキス寒天培地（２５℃）における生育は良好
であり、７日間での集落の径は６４〜６７mmに達する。
集落の表面は気生菌糸が発達して羊毛状となる。培養日
数に従い、淡褐色から黒褐色を呈し、裏面も同色を呈す
る。分生子の形成は良好である。

【００１３】(2) ポテト・デキストロース寒天培地（２
５℃）における生育は極めて良好であり、７日間での集
落の径は５６〜６２mmに達する。集落の表面は麦芽エキ
ス寒天培地上の生育とほぼ同じとなる。

【００１４】(3) ツアペック寒天培地（２５℃）におけ
る生育は悪く、７日間での集落の径は５３〜５８mmに達
する。集落の表面は気生菌糸が少なく、平坦な羊毛状と
なる。培養日数に従い、無色から暗緑褐色を呈し、裏面
も同色を呈する。集落の周辺は不整で分生子の形成は悪
い。

【００１５】(4) コーンミール寒天培地（２５℃）にお
ける生育はやや悪く、７日間での集落の径は６５〜６８
mmに達する。集落の表面は気生菌糸が薄く平坦に広が
る。培養日数に従い、無色から暗緑色を呈する。裏面も
同色を呈する。分生子の形成は悪い。

【００１６】(5) Ｖ−８寒天培地（２５℃）における生
育は良好であり、７日間での集落の径は７１〜７５mmに
達する。集落の表面は羊毛状で同心輪紋を生じる。培養
日数に従い、白色から黒緑色を呈し、裏面も同色を呈す
る。分生子の形成は良好である。

【００１７】(6) 本菌株は、Ｖ−８寒天培地で速やかに
生育し、集落全面に分生子を豊富に形成する。菌糸は、
直径１．６〜５．２μm 、淡色から褐色を呈し、また、
隔壁を有し、その表面は平滑である。分生子柄は、長さ
６０〜３２０μm 、直径３．０〜４．０μm の円筒形で
あり、また、隔壁を有し、その表面は平滑である。菌糸
上に頂生または側生し、単一または数本で束生する。上
方ではジグザグ状を呈する。基部は褐色、頂部は淡色で
顕著な分離痕を有する。分生子は、ポロ型分生子であ
り、紡錘形ないし紡錘状楕円形であって３隔壁を有し、
下方から３番目の細胞が膨れて湾曲し他の細胞より大型
である。また、両端細胞は、殆ど無色ないし淡褐色であ
り、中間部細胞は、やや濃色であって表面は平滑であ
る。大きさは１８〜３３×７〜１２μm （平均２８．２
×１０．６μm ）であり、へそ（hilum)は突起しない。
本菌株の至適生育温度は、３０℃前後であるが、３７℃
でも生育する。生育 pH の範囲は３〜１０と広く、至適
pH は５．５〜６．０である。

【００１８】以上の菌学的性状から、本菌株は、Ainswo
rth and Bisby's Dictionary of the Fungi ( D. L. Ha
wksworth, B. C. Sutton and G.C. Ainsworth 著、第７
版、C. M. I.、Kew 、1983年) に従い、真菌門、不完全
菌亜門、不完全糸状菌綱の Curvularia 属菌と同定し
た。本菌株は、「ＮＦ ０２２０１」と命名されて工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（生命
工学工業技術研究所寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４０１
７）。なお、「ＮＦ ０２２０１」株の変異株は、各種
の放射線、化学的突然変異誘発物質を利用した公知の突
然変異誘発手段により容易に発生させることが出来る。

【００１９】本発明に使用される菌の培養には、カビの
培養に利用される通常の培地が使用できる。具体的に
は、炭素源、窒素源、無機物の他、使用菌が必要とする
微量栄養素を適当に含有するものであれば、合成培地、
天然培地の何れも使用可能である。

【００２０】上記の炭素源としては、グルコース、シュ
ークロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜な
どが使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、
硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム等の無機塩類、Ｄ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸な
どのアミノ酸類、ペントン、肉エキス、酵母エキス、麦
芽エキス、コーンスチープリッカー等の窒素含有天然物
が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、
リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用でき
る。

【００２１】培養は、通常、振盪培養や通気攪拌培養で
行う。培養温度は、１０〜３７℃、好適には２０〜３７
℃である。培地の pH は、３〜１０、好適には５〜６の
範囲である。培養期間は、１〜７日間であり、通常は２
〜４日である。斯かる条件で培養することにより、培養
物中、特に、菌体内にＤ−アミノ酸オキシダーゼを生成
蓄積することが出来る。

【００２２】培養物からＤ−アミノ酸オキシダーゼを採
取する方法は、蛋白質の精製で採用される通常の方法が
使用される。例えば、培養液をろ過して菌体を得、この
菌体を適当な方法で破砕し、破砕液から遠心分離などに
よって上清液を得る。この上清液中に含まれるＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼは、塩析、透析、イオン交換クロマト
グラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、
電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによ
って採取することが出来る。

【００２３】次に、本発明の第１の要旨に係るＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼについて説明する。この酵素の活性
は、次の各方法で測定することが出来る。 (1) 過酸化水素の比色検出法 １００mMのトリス・塩酸緩衝液（ pH ８．５）１ml、２
５mMの４−アミノアンチピリン０．１ml、４２０mMのフ
ェノール溶液０．１ml、１００units/mlの西洋わさびペ
ルオキシダーゼ０．１ml、１００mMのＤ−アラニン１m
l、水０．６５mlを３ml石英セルに入れ、恒温セルホル
ダー付き分光光度計にセットして３７℃で５分間インキ
ュベートした後、酵素溶液０．０５mlを加えて攪拌し、
５００nmにおける５分間の吸光度変化（ΔＡＢＳ／min)
を測定する。そして、次の式により酵素活性を算出す
る。なお、式中のｎは希釈倍率を表す。

【００２４】

【数１】

【００２５】(2) ２オキソ酸のＤＮＰ検出法 １００mMのトリス・塩酸緩衝液（ pH ８．５）１ml、１
００mMのＤ−アラニン１ml、水０．９５mlを試験管に入
れ、３７℃の恒温槽で５分間インキュベートした後、酵
素溶液０．０５mlを加えて攪拌し、１０分間反応させ
る。反応後、３０％トリクロロ酢酸１mlを加えて反応を
止める。反応液２mlを別の試験管に採取し、０．０５％
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰ）の２M
塩酸溶液２mlを加えて充分攪拌し、室温下に５分間放置
後、トルエン６mlを加えて強く攪拌する。上層（トルエ
ン層）５mlを別の試験管に移し、これに１０％炭酸ナト
リウム溶液５mlを加えて強く攪拌し、ＤＮＰ反応物を水
層に抽出する。下層（水層）３mlを別の試験管に取り、
これに４M 水酸化ナトリウム溶液１mlを加えて充分攪拌
した後、４７０nmにおける吸光度を測定する。酵素活性
は、予め、ピルビン酸カリウム（mM単位）で作成した検
量線の値（ＰmM）から、次の式により算出する。なお、
式中のｎは希釈倍率を表す。

【００２６】

【数２】

【００２７】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの他の
特性は、次の通りである。 (1) 作用：本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼは、酸素
の存在下Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、２−オキ
ソ酸およびアンモニアを生成する酵素であり、国際生化
学連合（ＩＵＢ）の分類ではＥＣ１．４．３．３に分類
される。酸化反応の一例として、Ｄ−アラニンが基質の
場合の反応式を次に示す。

【００２８】

【化１】 Ｄ−アラニン＋Ｏ₂ ＋Ｈ₂ Ｏ──→ ピルビン酸＋Ｈ₂ Ｏ₂ ＋ＮＨ₃

【００２９】(2) 基質特異性と基質親和性：前記の「過
酸化水素の比色検出法」において、Ｄ−アラニンの代わ
りに他の各種アミノ酸（いずれも終濃度３３mM）を使用
した場合の相対反応性（基質特異性）は、表１に示す通
りである。すなわち、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−
フェニルアラニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−イソロイシ
ン、Ｄ−ロイシン及びＤ−グルタミンに強く作用し、Ｄ
−セリン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−スレオニン及びＤ−
グルタミン酸にも作用する。しかし、データの記載を省
略したが、Ｄ−システイン、Ｄ−シスチン、Ｄ−チロシ
ン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アスパラ
ギン酸、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−ヒスチジ
ン、グリシン及びＬ−アミノ酸（１９種）には作用しな
い。また、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−フェニルア
ラニン、Ｄ−イソロイシンについての基質親和性（Ｋ
ｍ）と最大反応速度（Ｖｍａｘ）は、表１に示す通りで
ある。

【００３０】

【表１】 （＊Ｄ−アラニンの反応性を１００とした）

【００３１】(3) 至適 pH と pH 安定性 前記の「２オキソ酸のＤＮＰ検出法」において、緩衝液
として、図１に示した各種の pH を有するクエン酸緩衝
液、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グリシン緩衝
液を使用し、精製酵素の酵素活性を測定した。結果を図
１に示す。図１から、本酵素の至適 pH は、９〜１０で
あることが分かる。

【００３２】図２に示した各種の pH を有するクエン酸
緩衝液、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グリシン
緩衝液（各緩衝液とも５０mM）に精製酵素を溶解し、３
０℃で３０分処理後、前記の「過酸化水素の比色検出
法」により残存酵素活性を測定し、その結果を図２に示
す。図２から、本酵素の安定 pH 範囲は、７〜１０であ
ることが分かる。

【００３３】(4) 至適温度と熱安定性 「２オキソ酸のＤＮＰ検出法」において反応温度を変え
て精製酵素の酵素活性を測定し、その結果を図３に示
す。図３から、本酵素の至適温度は約３５℃であること
が分かる。また、２０mMトリス・塩酸緩衝液（pH８．
５）に精製酵素を溶解し、２０〜７０℃の各温度で１０
分処理後、「過酸化水素の比色検出法」により残存酵素
活性を測定し、その結果を図４に示す。図４から、本酵
素は、３５℃まで安定であることが分かる。

【００３４】(5) 阻害剤 上記の「２オキソ酸のＤＮＰ検出法」の系に、１mM濃度
になる様に表２及び３に示す各種の添加物を加え、精製
酵素の酵素活性を測定した。添加物無しのコントロ−ル
に対し、添加物により表２及び３に示す様な阻害効果や
増強効果が認められた。これらの結果から、本酵素は、
塩化鉛、塩化亜鉛、塩化カドミウム、塩化水銀、硝酸
銀、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸およびＮ−エチルマ
レインイミドによって強く阻害されることが分かる。

【００３５】

【表２】

【００３６】

【表３】

【００３７】(6) 分子量 本酵素のゲル濾過法で測定した分子量は、約１５０，０
００である。また、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミド電気泳動法で測定した分子量は約３９，００
０であり、単一のバンドを示した。従って、単一のサブ
ユニットから構成されていることが分かる。

【００３８】(7) 等電点 等電点電気泳動法で測定した本酵素の等電点（ｐＩ）は
４．９である。

【００３９】次に、本発明によって得られるＤ−アミノ
酸オキシダーゼの用途について説明する。Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼは、酸素の存在下にＤ−アミノ酸の酸化反
応を触媒し、過酸化水素、２−オキソ酸とアンモニアを
生成する酵素である。従って、斯かる反応による変化を
利用できる用途であれば、如何なる用途にも利用し得
る。

【００４０】直接的に反応生成物を利用する例として
は、２−オキソ酸の製造法が挙げられる。また、前駆原
料のＤ−アミノ酸の側鎖を酸化する抗生物質原料などの
製造法、例えば、セファロスポリンＣからの７−アミノ
セファロスポラン酸の製造法が挙げられる。

【００４１】また、間接的に反応生成物を利用する例と
しては、Ｄ・Ｌ−アミノ酸からＤ−体だけを酸化するＬ
−アミノ酸の製造法が挙げられる。また、反応生成物の
量的変化を直接または間接的にシグナルとして検出する
基質のＤ−アミノ酸や抗生物質などの測定法、Ｄ−アミ
ノ酸の生成を伴う別な酵素反応系の後にＤ−アミノ酸測
定法を結合した末端にＤ−アミノ酸を有する前駆基質
（例えばペプチド等）の測定法が挙げられる。また、上
記とは逆に、Ｄ−アミノ酸を有する合成ペプチドを基質
として添加するエクソプロテアーゼやペプチダーゼ等の
酵素活性の測定法、例えば、ロイシンアミノペプチダー
ゼ活性の測定法などが挙げられる。

【００４２】次に、基質を測定する方法の一例として、
Ｄ−アラニンの定量法について詳述する。Ｄ−アラニン
が基質の場合、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが触媒する反
応式を以下に示す。

【００４３】

【化２】 Ｄ−アラニン＋Ｏ₂ ＋Ｈ₂Ｏ──→ ピルビン酸＋Ｈ₂Ｏ₂ ＋ＮＨ₃

【００４４】上記の反応式から明らかなように、反応生
成物のピルビン酸、過酸化水素、アンモニアの何れを検
出してもＤ−アラニンを定量することが出来る。ピルビ
ン酸の検出法としては、通常の生化学検査で使用されて
いる乳酸脱水素酵素を利用したピルビン酸の測定方法、
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの酵素活性測定で前記した
「２オキソ酸のＤＮＰ検出法」などが利用できる。

【００４５】過酸化水素の検出法としては、公知の方
法、例えば、前記の「過酸化水素の比色検出法」を利用
することが出来る。アンモニアの検出法としては、通常
の測定法、例えば、グルタミン酸脱水素酵素を利用した
アンモニアの測定系を使用することが出来る。また、こ
れらの測定法は、反応速度上、レート法とエンドポイン
ト法の２つに分類されているが、その何れであってもよ
く、測定系、反応時間、基質のＤ−アラニンの濃度、検
体の種類などの条件により、適宜選択される。

【００４６】基質のＤ−アミノ酸を測定する場合は、基
質を含有する試料およびＤ−アミノ酸オキシダーゼを、
約 pH ７〜１２の緩衝液に加えて反応させればよい。Ｄ
−アミノ酸オキシダーゼは、溶液状態の他、必要に応じ
て、凍乾品、マイクロカプセル化したもの、または、担
体に固定し不溶化したものも使用することが出来る。緩
衝液としては、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グ
リシン緩衝液などが使用される。酵素は、通常１〜５０
０μM 濃度の基質に対し、０．５〜５０ units/ml 濃度
の割合で使用される。

【００４７】過酸化水素の検出法としては、上記の他、
公知の比色法、蛍光法、化学発光法、電極法なども使用
できる。比色法では、ペルオキシダーゼ等の触媒によ
り、過酸化水素でペルオキシダーゼの基質を酸化発色さ
せ、発色濃度を分光光度計で測定する。ペルオキシダー
ゼの基質としては、０−フェニレンジアミン、５−アミ
ノサリチル酸、４−アミノアンチピリンとフェノール、
２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−
６−スルフォン酸）、ビス〔３−ビス（４−クロロフェ
ニル）メチル−４−ジメチル−アミノフェニル〕アミン
等が利用できる。

【００４８】蛍光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒に
より、過酸化水素で基質を酸化して蛍光物質を生成さ
せ、その蛍光強度を蛍光光度計で測定する。ペルオキシ
ダーゼの基質としては、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、
ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などが利用でき
る。

【００４９】化学発光法では、ペルオキシダーゼ等の触
媒により、過酸化水素で基質を酸化して発光させ、その
発光強度をルミノメーターで測定する。化学発光する基
質としては、ルミノール化合物、ルシゲニン、アリルシ
ュウ酸エステル類の化合物などが利用できる。また、Ｄ
−アミノ酸オキシダーゼとＤ−アミノ酸の検出に必要な
前記の試薬成分を含む試薬を調製し、Ｄ−アミノ酸の測
定キットとして診断薬に組み立てることが出来る。

【００５０】

【実施例】以下、本発明を実施例によって更に詳細に説
明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の
実施例に限定されるものではない。

【００５１】実施例１（クルブラリア属の菌によるＤ−
アミノ酸オキシダーゼの製造） ポリペプトン：１重量％（以下、単に％と略記する）、
酵母エキス：０．５％、MgSO₄ ・7H₂ O ：０．０５％、
KH₂ PO₄ ：０．１％、Ｄ−アラニン：０．２％、グルコ
−ス：１％を含有し、 pH ６の培地１００mlを５００ml
の培養フラスコに分注し、１２０℃で２０分間殺菌した
後、クルブラリア属の菌「ＮＦ ０２２０１」株（生命
工学工業技術研究所寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４０１
７）を一白金耳接種し、２７℃で４８時間、振とう培養
して種培養液とした。

【００５２】上記と同じ組成の培地４００mlを入れた２
リットルの培養フラスコ４本を１２０℃で２０分間殺菌
して冷却した後、上記の種培養液をそれぞれ４mlずつ分
注接種し、２７℃で４８時間、振とう培養して前培養液
とした。次に、上記と同じ培地組成に消泡剤０．０１％
を添加した培地１６０リットルを、２００リットルのジ
ャーファーメンターに入れ、１２０℃で３０分間殺菌し
て冷却した後、上記の前培養液１．６リットルを接種
し、２７℃で４８時間、１５０リットル／分の通気量と
２００rpm の攪拌速度の条件下で培養した。培養終了
後、培養液をろ過して湿菌体１２Kgを得た。

【００５３】得られた菌体のうち２Kgを３倍容の１mMジ
チオスレイトール含有２０mMトリス・塩酸緩衝液（ pH
８．５）に懸濁し、冷却下に摩砕装置「ダイノミル」で
菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して菌体残渣を除
き、粗酵素液６２００mlを得た。この粗酵素液に硫安を
４０％飽和になる様に加え、一昼夜放置した後、析出し
た沈殿物を遠心分離により除去し、得られた上清液に５
５％飽和となる様に硫安を追加し、再度、一昼夜放置
し、遠心分離により析出した沈殿物を回収した。

【００５４】上記の沈殿物を、１mMジチオスレイトール
含有２０mMトリス・塩酸緩衝液（ pH ８．５）１５０ml
に溶解した後、透析膜を使用し、同組成の緩衝液にて脱
塩した。脱塩液を、予め、１mMジチオスレイトール含有
２０mMトリス・塩酸緩衝液（pH ８．５）で平衡化した
「ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００カラム」（直径
４．０cm×長さ１２cm）に通して酵素を吸着させ、同組
成の緩衝液で洗浄後、１mMジチオスレイトール含有２０
mMトリス・塩酸緩衝液（ pH ８．５）から５００mMのＮ
ａＣｌと１mMジチオスレイトールを含有する１００mMト
リス・塩酸緩衝液（ pH ８．５）への直線グラジエント
で溶出し、酵素の活性画分を集めた。

【００５５】上記の活性画分の溶出液に硫安を５５％飽
和となる様に加え、一昼夜放置した後、遠心分離により
沈殿物を回収した。この沈殿物を、１mMジチオスレイト
ール含有２０mMトリス・塩酸緩衝液（ pH ８．５）５ml
に溶解した後、透析膜を使用し、同組成の緩衝液にて脱
塩した。この脱塩液に硫安を加え３０％飽和となる様に
調整した後、予め、３０％飽和硫安と１mMジチオスレイ
トールを含有する２０mMトリス・塩酸緩衝液（ pH ８．
５）で平衡化した「ブチルトヨパール６５０Ｍカラム」
（直径０．８cm×長さ２．５cm）に通して酵素を吸着さ
せ、同組成の緩衝液で洗浄した後、３０％飽和硫安と１
mMジチオスレイトールを含有する２０mMトリス・塩酸緩
衝液（ pH ８．５）から１mMジチオスレイトール含有２
０mMトリス・塩酸緩衝液（ pH ８．５）への直線グラジ
エントで溶出し、酵素の活性画分を集めた。

【００５６】上記の活性画分を限外ろ過膜（ザルトリウ
ス社製、セントリザルトＩ：分画分子量２万）で濃縮し
た後、この濃縮液を高速液体クロマトグラフィーの分析
用カラム「ショーデックスプロテインＫＷ−８０３」
（直径０．８cm×長さ３０cm）に通し、移動相：２００
mM NaCl 含有１００mMリン酸カリウム緩衝液（ pH ７．
０）、流速：０．８ml／分の条件で活性画分を分取し
た。分取した酵素は、ＳＤＳ電気泳動で単一なバンドを
示した。

【００５７】

【表４】 各精製工程の収率と比活性 ─────────────────────────────────── 精製工程 総活性 総蛋白 比活性 収率 (units) (mg) (units/mg) （％） ─────────────────────────────────── (1) 粗酵素液 6240 9860 0.63 100 (2) 硫安分画 5010 1480 3.39 80.3 (3) ＤＥＡＥ−セルロファイン 4990 380 13.1 80.0 Ａ−５００クロマト (4) ブチルトヨパール 1700 15.0 113 27.2 ６５０Ｍクロマト (5) ショーデックスプロテイン 303 1.18 257 4.9 ＫＷ−８０３クロマト ───────────────────────────────────

【００５８】実施例２（ロビラーダ属の菌によるＤ−ア
ミノ酸オキシダーゼの製造） 実施例１の菌株をロビラーダ（Robillarda）属の菌「Ｍ
ＥＴ００６」に変え、実施例１と同様に操作し、実施例
１と同じ組成の培地４００mlを入れた２リットルの培養
フラスコ４本を、２７℃で４８時間培養した。粗酵素液
中のＤ−アミノ酸オキシダーゼは、５８０units/リット
ルであった。

【００５９】実施例３（ミロセシウム・トリアティスポ
リウム属の菌によるＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造） 実施例１の菌株をミロセシウム・トリアティスポリウム
（Myrothecium striatisporum)属の菌「ＭＥＴ０９３」
に変え、実施例１と同様に操作し、実施例１と同じ組成
の培地４００mlを入れた２リットルの培養フラスコ４本
を、２７℃で４８時間培養した。粗酵素液中のＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼは、３２０units/リットルであった。

【００６０】

【発明の効果】以上説明した本発明によれば、臨床診断
薬として極めて有用なＤ−アミノ酸オキシダーゼ及びそ
の工業的生産に適した製造法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの至適 pH
を示すグラフである。

【図２】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの pH 安定
性を示すグラフである。

【図３】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの至適温度
を示すグラフである。

【図４】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの温度安定
性を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 薮内 正彦 東京都練馬区小竹町１−40−５

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の(1) 〜(8) に記載の理化学的性質を
   有することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼ。 (1) 作用：酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸
   化水素、２−オキソ酸およびアンモニアを生成する。 (2) 基質特異性：Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−フェ
   ニルアラニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ
   −ロイシン及びＤ−グルタミンに強く作用し、Ｄ−セリ
   ン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−スレオニン及びＤ−グルタ
   ミン酸にも作用するが、Ｄ−システイン、Ｄ−シスチ
   ン、Ｄ−チロシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−プロリ
   ン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニ
   ン、Ｄ−ヒスチジン、グリシン及びＬ−アミノ酸には作
   用しない。 (3) 至適 pH と pH 安定性：至適 pH は９〜１０であ
   り、３０℃で３０分処理の安定 pH 範囲は７〜１０であ
   る。 (4) 至適温度と熱安定性：至適温度は約３５℃であり、
   pH ８．５における１０分間の処理では３５℃まで安定
   である。 (5) 阻害剤：塩化鉛、塩化亜鉛、塩化カドミウム、塩化
   水銀、硝酸銀、ｐ−クロロマーキュリー安息香酸および
   Ｎ−エチルマレインイミドで強く阻害される。 (6) 分子量：ゲル濾過法で測定した分子量が約１５０，
   ０００、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
   電気泳動法で測定した分子量が約３９，０００であり、
   単一のサブユニットから構成されている。 (7) 等電点：４．９ (8) 基質親和性（Ｋｍ値）：Ｄ−アラニン：２．０６ｍ
   Ｍ、Ｄ−バリン：１．５８ｍＭ、Ｄ−フェニルアラニ
   ン：０．８５５ｍＭ、
2. 【請求項２】 不完全糸状菌クルブラリア（Curvulari
   a）属、ロビラーダ（Robillarda）属またはミロセシウ
   ム（Myrothecium ) 属に属し、Ｄ−アミノ酸オキシダー
   ゼ生産能を有する微生物を培養し、培養物からＤ−アミ
   ノ酸オキシダーゼを採取することを特徴とするＤ−アミ
   ノ酸オキシダーゼの製造法。
3. 【請求項３】 不完全糸状菌クルブラリア（Curvulari
   a）属に属し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有す
   る微生物を培養し、培養物からＤ−アミノ酸オキシダー
   ゼを採取することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダー
   ゼの製造法。
4. 【請求項４】 不完全糸状菌ロビラーダ（Robillarda）
   属に属し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する微
   生物を培養し、培養物からＤ−アミノ酸オキシダーゼを
   採取することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼの
   製造法。
5. 【請求項５】 不完全糸状菌ミロセシウム（Myrotheciu
   m ) 属に属し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有す
   る微生物を培養し、培養物からＤ−アミノ酸オキシダー
   ゼを採取することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダー
   ゼの製造法。
6. 【請求項６】 不完全糸状菌クルブラリア（Curvulari
   a）に属する「ＮＦ０２２０１」株（生命工学工業技術
   研究所寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４０１７）又はその変
   異株を培養し、培養物からＤ−アミノ酸オキシダーゼを
   採取することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼの
   製造法。
7. 【請求項７】 不完全糸状菌クルブラリア（Curvulari
   a）に属しＤ−アミノ酸オキシダーゼ産性能を有する
   「ＮＦ ０２２０１」株（生命工学工業技術研究所寄託
   番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４０１７）又はその変異株。