KR20200043375A - 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법, 측정용 시약 및 측정용 키트 - Google Patents

저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법, 측정용 시약 및 측정용 키트 Download PDF

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Abstract

환경에 대한 배려로부터, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 사용하지 않고, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 (LDL-C) 을 간편하게 또한 정확하게 측정하기 위한 방법을 제공한다.
검체와, (ⅰ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소의 조합, 또는, (ⅱ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소의 조합을, [a] 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ; 그리고, [b] 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 수성 매체 중에서 반응시키고, 그 반응으로 생성되는 물질 또는 소비되는 물질을 측정하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 LDL-C 의 측정 방법으로 한다.

Description

저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법, 측정용 시약 및 측정용 키트
본 발명은, 검체 중에 포함되는 저밀도 리포단백 (이하, LDL 이라고 한다) 중의 콜레스테롤 (이하, LDL-C 라고 약기한다.) 의 측정 방법, 측정용 시약 및 측정용 키트에 관한 것이다.
본원은, 2017년 9월 1일에, 일본에 출원된 특허출원 2017-168235호에 기초하여 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
LDL 은, 말초 세포에 콜레스테롤을 공급하는 역할을 갖고, 관동맥 경화증을 비롯한 각종 동맥 경화증의 직접적 인자이다. LDL-C 의 증가는 동맥 경화성 질환의 주요한 위험 인자의 하나이고, 분별 정량하는 것은 임상상 유용하다.
종래의 LDL-C 의 정량 방법은, 초원심법, 전기 영동법, 프리드왈드 (Friedewald) 식에 의한 연산 방법 등을 들 수 있다. 초원심법은, 리포단백의 비중의 차를 이용하여, 초원심 분리기를 사용하여 LDL 을 분리한 후, 그 콜레스테롤량을 측정하는 방법이다 (비특허문헌 1). 그러나, 초원심법에 의한 분리 조작은 번잡하고, 신속성, 간편성 등의 면에서 결점이 있다. 전기 영동법은, 리포단백의 전하의 차를 이용하여, 아가로오스 겔 등을 지지체로서 분리하는 방법이나 리포단백의 입자 사이즈의 차를 이용하여, 폴리아크릴아미드 겔을 지지체로서 분리하는 방법 등이 있다. 그러나, 전기 영동법은 정량성이 부족하고, 간편성, 경제성 등의 면에서 문제가 있다. 프리드왈드식에 의한 연산 방법에서는, 총콜레스테롤 (이하, T-C 라고 약기한다.), 고밀도 리포단백 (이하, HDL 이라고 한다) 중의 콜레스테롤 (이하, HDL-C 라고 약기한다.) 및 총트리글리세라이드 (이하, T-TG 라고 약기한다.) 의 측정치로부터, 다음의 계산식에 따라 LDL-C 량을 산출하는데 (비특허문헌 2), 이 방법은, 혈청 중의 T-TG 의 함유량이나 식사의 영향을 받기 때문에, 정확성에 문제가 있다.
(LDL-C) ＝ (T-C) － (HDL-C) － (T-TG)/5
또한 최근, 초원심법 등의 분리 조작을 필요로 하지 않고, 범용의 자동 분석기 장치에 탑재 가능한 LDL-C 의 정량 방법도 보고되어 있다.
그것들 중에서 LDL-C 를 정량하는 방법으로는, 이하의 방법이 알려져 있다.
LDL 이외의 리포단백에 작용하는 계면 활성제의 존재하에서, 콜레스테롤에스테라아제 및 콜레스테롤옥시다아제를 작용시키고, 발생한 과산화수소를 소거함으로써, 피검 시료 중의 HDL, 초저밀도 리포단백 (이하, VLDL 이라고 한다) 및 카이로마이크론의 각 리포단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 제 1 공정과, 이어서, 피검 시료 중의 잔존 콜레스테롤을 정량하는 제 2 공정으로 이루어지는 피검 시료 중의 LDL-C 의 정량 방법 (특허문헌 1).
혈청에 대하여, 폴리옥시에틸렌알킬렌페닐에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬렌트리벤질페닐에테르로부터 선택되는 계면 활성제, 그리고 콜레스테롤 측정용 효소 시약을 첨가하고, 리포단백 중의 콜레스테롤 중 HDL 중 및 VLDL 중의 콜레스테롤을 우선적으로 반응시킨 후에, 나머지 콜레스테롤의 반응량을 측정하는 LDL-C 의 정량 방법 (특허문헌 2).
생체 시료에 대하여, 폴리옥시에틸렌 유도체와 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 그리고 콜레스테롤 측정용 효소를 첨가하고, 리포단백 중의 콜레스테롤 중 LDL-C 를 선택적으로 측정하는 방법 (특허문헌 3).
생체 시료에 대하여, 디메틸-α-시클로덱스트린 또는/및 폴리-β-시클로덱스트린의 존재하에서 측정을 실시하는 것을 특징으로 하는, LDL-C 의 측정법 (특허문헌 4).
카이로마이크론, HDL, LDL, VLDL 중 어느 1 종 이상을 포함하는 시료 중의 콜레스테롤을 직접, 선택적으로 측정하는 방법에 있어서, 인지질, 인지질 유사기를 함유하는 화합물의 존재하, 시료 중의 LDL-C 를 정량하는 방법 (특허문헌 5).
검체와, 콜레스테롤 측정 효소를,
[a] 폴리옥시에틸렌·폴리옥시알킬렌알킬아릴에테르 ;
[b] 폴리옥시에틸렌·폴리옥시알킬렌 축합물, 폴리옥시에틸렌알케닐에테르, 폴리옥시에틸렌 분기 알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌·폴리옥시알킬렌 분기 알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ;
[c] 제 1 급 아민, 제 2 급 아민, 제 3 급 아민 및 제 4 급 암모늄으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ; 그리고,
[d] 폴리아니온
의 존재하에 반응시키고, 그 반응으로 생성되는 물질 또는 소비되는 물질을 측정하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법 (특허문헌 6).
최근, 옥틸페놀 등의 알킬페놀류가 내분비 교란 작용을 갖는 것이 보고되어 있고, 환경에 대한 배려로부터, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 등의 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제의 제조나 시약에 대한 사용이 회피되게 되었다.
또, 임상 검사에 있어서, 정상 검체뿐만 아니라, 여러 가지 이상 검체가 자주 검체로서 사용된다. 그러한 이상 검체의 하나에, 지질이 풍부한 검체가 있고, 지질에 의한 탁함이 측정에 영향을 미치는 것이 문제가 되고 있다.
일본 공개특허공보 평10-38888호 일본 공개특허공보 평9-313200호 WO2000/17388 팜플렛 일본 공개특허공보 평11-30617호 일본 공개특허공보 2002-202314호 WO2010/55916 팜플렛
어드밴스드·리피드·리서치 (Adv. Lipid Res.), 제 6 권, 1 페이지, 1968년 클리니컬·케미스트리 (Clin. Chem.), 제 18 권, 499 페이지, 1972년
본 발명의 과제는, 환경에 대한 배려로부터, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 등의 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 사용하지 않고, 검체 중의 LDL-C 를 간편하게 또한 정확하게 측정하기 위한 방법, 시약 및 키트를 제공하는 것에 있다.
또한, 본 발명의 과제는, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 등의 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 사용하지 않으며, 또한, 지질에 의한 탁함의 영향을 받지 않고, 검체 중의 LDL-C 를 간편하게 또한 정확하게 측정하기 위한 방법, 시약 및 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 LDL-C 의 측정 방법에 대하여 예의 검토를 거듭한 결과, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제 이외의 특정한 계면 활성제의 조합을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 수성 매체 중에서, 검체와, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소의 조합, 또는, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소의 조합을 반응시킴으로써, LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤의 소거, 및 리포단백의 물리적인 분획 조작을 실시하지 않고, 검체 중의 LDL-C 를 간편하게 또한 정확하게 측정할 수 있는 것을 알아내고, 본 발명을 완성시켰다.
또한, 본 발명자들은 LDL-C 의 측정 방법에 대하여 예의 검토를 거듭한 결과, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제 이외의 특정한 계면 활성제의 조합, 및 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 수성 매체 중에서, 검체와, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소의 조합, 또는, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소의 조합을 반응시킴으로써, LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤의 소거, 및 리포단백의 물리적인 분획 조작을 실시하지 않고, 또한, 지질에 의한 탁함의 영향을 받지 않고, 검체 중의 LDL-C 를 간편하게 또한 정확하게 측정할 수 있는 것을 알아내고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은, 하기 (1) ∼ (24) 에 관한 것이다.
(1) 검체와, (ⅰ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소의 조합, 또는, (ⅱ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소의 조합을,
[a] 폴리옥시에틸렌알킬에테르 (이하, POE 알킬에테르라고 약기한다) 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르 (이하, POEPOP 알킬에테르라고 약기한다) 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ; 그리고,
[b] 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 (이하, POEPOP 축합물이라고 약기한다)
을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 수성 매체 중에서 반응시키고, 그 반응으로 생성되는 물질 또는 소비되는 물질을 측정하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 LDL-C 의 측정 방법.
(2) [a] POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르에 있어서의 알킬이, 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬인, (1) 에 기재된 방법.
(3) 수성 매체가, 추가로, [c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체를 함유하는, (1) 또는 (2) 에 기재된 방법.
(4) [c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체가, 폴리프로필렌글리콜 또는 폴리옥시프로필렌글리세릴에테르인, (3) 에 기재된 방법.
(5) 생성되는 물질이 과산화수소인 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(6) 과산화수소의 측정이, 과산화수소 측정용 시약을 사용하여 실시되는 (5) 에 기재된 방법.
(7) 생성되는 물질이 환원형 보효소인 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(8) 환원형 보효소의 측정이, 환원형 보효소 측정용 시약을 사용하여 실시되는 (7) 에 기재된 방법.
(9) [a] POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ;
[b] POEPOP 축합물 ; 그리고,
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 LDL-C 의 측정용 시약.
(10) 추가로, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소와 검체의 반응으로 생성되는 물질을 측정하기 위한 시약을 함유하는, (9) 에 기재된 시약.
(11) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소와 검체의 반응으로 생성되는 물질이, 과산화수소인, (10) 에 기재된 시약.
(12) [a] POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ;
[b] POEPOP 축합물 ; 그리고,
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
(13) 추가로, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소와 검체의 반응으로 생성되는 물질을 측정하기 위한 시약을 함유하는, (12) 에 기재된 시약.
(14) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소와 검체의 반응으로 생성되는 물질이, 환원형 보효소인, (13) 에 기재된 시약.
(15) [a] POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르에 있어서의 알킬이, 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬인, (9) ∼ (14) 중 어느 하나에 기재된 시약.
(16) 추가로, [c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체를 함유하는, (9) ∼ (15) 중 어느 하나에 기재된 시약.
(17) [c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체가, 폴리프로필렌글리콜 또는 폴리옥시프로필렌글리세릴에테르인, (16) 에 기재된 시약.
(18) 과산화수소 측정용 시약을 포함하는 제 1 시약, 및 콜레스테롤 산화 효소를 포함하는 제 2 시약을 함유하고,
[a] POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ;
[b] POEPOP 축합물 ; 그리고,
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 각각을 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 시약에도 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 LDL-C 의 측정용 키트.
(19) 추가로, 과산화수소 측정용 시약을 제 2 시약에 함유하는 (18) 에 기재된 키트.
(20) 산화형 보효소를 포함하는 제 1 시약, 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 포함하는 제 2 시약을 함유하고,
[a] POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ;
[b] POEPOP 축합물 ; 그리고,
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 각각을 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 시약에도 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 LDL-C 의 측정용 키트.
(21) 추가로, 환원형 보효소 측정용 시약을 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유하는 것을 특징으로 하는, (20) 에 기재된 키트.
(22) [a] POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르에 있어서의 알킬이, 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬인, (18) ∼ (21) 중 어느 하나에 기재된 키트.
(23) 추가로, [c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체를 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유하는, (18) ∼ (22) 중 어느 하나에 기재된 키트.
(24) [c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체가, 폴리프로필렌글리콜 또는 폴리옥시프로필렌글리세릴에테르인, (23) 에 기재된 키트.
본 발명에 의해, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 등의 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 사용하지 않고, 검체 중의 LDL-C 를 간편하게 또한 정확하게 측정하기 위한 방법, 시약 및 키트가 제공된다.
또한, 본 발명에 의해, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 등의 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 사용하지 않으며, 또한, 지질에 의한 탁함의 영향을 받지 않고, 검체 중의 LDL-C 를 간편하게 또한 정확하게 측정하기 위한 방법, 시약 및 키트가 제공된다.
1. LDL-C 의 측정 방법
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법은, 콜레스테롤 측정용 효소를 사용하여, 검체 중의 LDL-C 를 측정하는 방법으로서, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 사용하지 않고, 검체 중의 LDL-C 를 측정하는 방법이다. 본 발명의 LDL-C 측정 방법은 또한, 원심 분리 등의 물리적 방법에 의한 리포단백의 분획 조작을 필요로 하지 않고, LDL-C 의 측정에 앞서 검체 중의 LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 소거하지 않고, 검체 중의 LDL-C 를 측정하는 방법이다. 여기서, 콜레스테롤 측정용 효소란, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 산화형 보효소, 콜레스테롤 탈수소 효소를 의미한다.
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법은, 검체와, (ⅰ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소의 조합, 또는, (ⅱ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소의 조합을,
[a] POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ; 그리고,
[b] POEPOP 축합물
을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 수성 매체 중에서 반응시키고, 그 반응으로 생성되는 물질 또는 소비되는 물질을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법이고, 이하의 공정을 포함하는 방법이다.
[1] 검체와, (ⅰ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소의 조합, 또는, (ⅱ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소의 조합을,
[a] POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ; 그리고,
[b] POEPOP 축합물
을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 수성 매체 중에서 반응시키는 공정 ;
[2] 상기 [1] 의 공정에서 생성되는 물질 또는 소비되는 물질을 측정하는 공정 ;
[3] 미리, LDL-C 농도가 이미 알려진 검체를 사용하여 상기 [1] 및 [2] 를 실시함으로써 작성된, LDL-C 농도와, 그 생성되는 물질 또는 그 소비되는 물질 유래의 정보량과의 관계를 나타내는 검량선과, 상기 [2] 에서의 측정치를 상관시키는 공정 ; 및,
[4] 검체 중의 LDL-C 농도를 결정하는 공정.
또한, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법은, 검체와, (ⅰ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소의 조합, 또는, (ⅱ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소의 조합을,
[a] POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ;
[b] POEPOP 축합물 ; 그리고,
[c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체
를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 수성 매체 중에서 반응시키고, 그 반응으로 생성되는 물질 또는 소비되는 물질을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법이고, 이하의 공정을 포함하는 방법이다.
[1] 검체와, (ⅰ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소의 조합, 또는, (ⅱ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소의 조합을,
[a] POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ;
[b] POEPOP 축합물 ; 그리고,
[c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체
를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 수성 매체 중에서 반응시키는 공정 ;
[2] 상기 [1] 의 공정에서 생성되는 물질 또는 소비되는 물질을 측정하는 공정 ;
[3] 미리, LDL-C 농도가 이미 알려진 검체를 사용하여 상기 [1] 및 [2] 를 실시함으로써 작성된, LDL-C 농도와, 그 생성되는 물질 또는 그 소비되는 물질 유래의 정보량과의 관계를 나타내는 검량선과, 상기 [2] 에서의 측정치를 상관시키는 공정 ; 및,
[4] 검체 중의 LDL-C 농도를 결정하는 공정.
본 발명에 있어서 사용되는 수성 매체는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 수성 매체이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있고, 완충액이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 있어서의 pH 는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 pH 이면 어느 것이어도 되지만, 예를 들어 pH 4 ∼ 10 을 들 수 있다. 수성 매체로서 완충액을 사용하는 경우에는, 설정하는 pH 에 따른 완충제를 사용하는 것이 바람직하다. 완충액에 사용하는 완충제로는, 예를 들어 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충제, 인산 완충제, 붕산 완충제, 굿의 완충제 등을 들 수 있다.
굿의 완충제로는, 예를 들어 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), 비스(2-하이드록시에틸)이미노트리스(하이드록시메틸)메탄 (Bis-Tris), N-(2-아세트아미드)이미노이아세트산 (ADA), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES), N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판술폰산 (MOPSO), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES), 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (TES), 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 (HEPES), 3-[N,N-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시프로판술폰산 (DIPSO), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-하이드록시-3-아미노프로판술폰산 (TAPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판술폰산) (POPSO), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-하이드록시프로판술폰산 (HEPPSO), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산 [(H)EPPS], N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신 (Tricine), N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신 (Bicine), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산 (CHES), N-시클로헥실-3-아미노-2-하이드록시프로판술폰산 (CAPSO), N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산 (CAPS) 등을 들 수 있다.
완충액의 농도는 측정에 적절한 농도이면 특별히 제한은 되지 않지만, 0.001 ∼ 2.0 mol/L 가 바람직하고, 0.005 ∼ 1.0 mol/L 가 보다 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 있어서, 검체와, (ⅰ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소의 조합과의 반응으로 생성되는 물질로는, 예를 들어 과산화수소 등을 들 수 있고, 검체와, (ⅱ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소의 조합과의 반응으로 생성되는 물질로는, 예를 들어 환원형 보효소 등을 들 수 있다. 검체와, (ⅰ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소의 조합과의 반응으로 소비되는 물질로는, 예를 들어 산소 분자 등을 들 수 있고, 검체와, (ⅱ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소의 조합과의 반응으로 소비되는 물질로는, 예를 들어 산화형 보효소 등을 들 수 있다. 생성된 과산화수소는, 예를 들어 과산화수소 전극이나 후술하는 과산화수소 측정용 시약을 사용하여 측정할 수 있다. 생성된 환원형 보효소는, 예를 들어 환원형 보효소의 흡광도를 측정하는 방법이나 후술하는 환원형 보효소 측정용 시약을 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 소비되는 산소 분자는, 예를 들어 산소 전극을 사용하여 측정할 수 있다. 소비되는 산화형 보효소는, 예를 들어 산화형 보효소의 흡수 파장에서의 흡광도로 측정할 수 있다.
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 있어서 사용되는 검체로는, 예를 들어 전혈, 혈장, 혈청 등을 들 수 있고, 혈장 및 혈청이 바람직하다. 또, 본 발명의 측정 방법에 있어서는, 정상인 유래의 검체뿐만 아니라, 지질이 풍부한 검체도 사용할 수 있다. 지질이 풍부한 검체로는, 예를 들어 트리글리세라이드 (TG) 가 높은 고 TG 검체 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로는, 콜레스테롤에스테르를 가수 분해하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤에스테라아제, 리포프로테인리파아제 외에, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜레스테롤에스테라아제, 리포프로테인리파아제 등도 사용할 수 있다.
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로는, 무수식의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 외에, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소도 사용할 수 있다. 또, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로는 시판품을 사용할 수도 있다.
시판되는 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로는, 콜레스테롤에스테라아제 (COE-311 ; 토요보사 제조), 리포프로테인리파아제 (LPL-311 ; 토요보사 제조), 콜레스테롤에스테라아제 “Amano” 2 (CHE-2 ; 아마노 엔자임사 제조) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명에 있어서는, 2 종류 이상의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 조합하여 사용할 수도 있다.
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 화학 수식에 있어서 당해 효소를 수식하는 기 (화학 수식기) 로는, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 수용성 다당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 술포부틸기, 폴리우레탄기, 킬레이트 기능을 갖는 기 등을 들 수 있지만, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기가 바람직하다. 수용성 다당류로는, 예를 들어 덱스트란, 풀루란, 가용성 전분 등을 들 수 있다.
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 화학적으로 수식하기 위한 시약 (화학 수식제) 으로는, 상기의 화학 수식기와, 효소의 아미노기, 카르복실기, 술프하이드릴기 등과 반응할 수 있는 관능기 또는 구조를 겸비하는 화합물 등을 들 수 있다. 효소 중의 아미노기와 반응할 수 있는 관능기 또는 구조로는, 예를 들어 카르복실기, 활성 에스테르기 (N-하이드록시숙신이미드기 등), 산 무수물, 산 염화물, 알데히드, 에폭시드기, 1,3-프로판술톤, 1,4-부탄술톤 등을 들 수 있다. 효소 중의 카르복실기와 반응할 수 있는 관능기 또는 구조로는, 예를 들어 아미노기 등을 들 수 있다. 효소 중의 술프하이드릴기와 반응성이 있는 기 또는 구조로는, 예를 들어 말레이미드기, 디술파이드, α-할로에스테르 (α-요오드에스테르 등) 등을 들 수 있다.
화학 수식제로서 시판품을 사용할 수도 있다. 시판되고 있는 화학 수식제로는, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기와 N-하이드록시숙신이미드기를 갖는 산브라이트 VFM-4101, 산브라이트 ME-050AS, 산브라이트 DE-030AS (모두 니치유사 제조), 폴리알킬렌글리콜을 주성분으로 하는 기와 산 무수물 구조를 갖는 산브라이트 AKM 시리즈 (예를 들어, 산브라이트 AKM-1510 등), 산브라이트 ADM 시리즈, 산브라이트 ACM 시리즈 (모두 니치유사 제조), 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기와 에폭시드기를 갖는 EPOX-3400, M-EPOX-5000 (모두 Shearwater Polymers 사 제조), 킬레이트 기능을 갖는 기와 산 무수물 구조를 갖는 디에틸렌트리아민-N,N,N',N'',N''-펜타 무수 이아세트산 (DTPA anhydride ; 도진 화학 연구소사 제조) 등을 들 수 있다.
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 화학 수식은, 예를 들어 이하의 방법으로 실시할 수 있지만, 본 방법에 한정되는 것은 아니다. 먼저, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소를 pH 8.0 이상의 완충액 (예를 들어 HEPES 완충액) 에 용해시키고, 0 ∼ 55 ℃ 에서 0.01 ∼ 500 배 몰량의 화학 수식제를 첨가하고, 5 분간 ∼ 5 시간 교반한다. 효소 반응에 있어서는, 화학적으로 수식된 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소로서, 이 반응액 자체뿐만 아니라, 필요에 따라 한외 여과막 등에 의해 미반응의 화학 수식제 등을 제거한 것도, 사용할 수도 있다.
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 있어서의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 농도로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 반응액 중의 농도는 통상 0.001 ∼ 800 kU/L 이고, 0.01 ∼ 300 kU/L 가 바람직하다.
본 발명에 있어서의 콜레스테롤 산화 효소로는, 콜레스테롤을 산화하여 과산화수소를 생성하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤옥시다아제 외에, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜레스테롤옥시다아제 등도 사용할 수 있고, 콜레스테롤옥시다아제 (CHODI ; 키코만사 제조), 콜레스테롤옥시다아제 (CHO-CE ; 키코만사 제조), 콜레스테롤옥시다아제 (COO-321 ; 토요보사 제조) 등의 시판품을 사용할 수도 있다. 또, 본 발명에 있어서는, 2 종류 이상의 콜레스테롤 산화 효소를 조합하여 사용할 수도 있다.
콜레스테롤 산화 효소는, 무수식의 효소여도 되고, 화학적으로 수식된 효소여도 된다. 화학적으로 수식된 콜레스테롤 산화 효소는, 예를 들어 전술한 화학 수식제를 사용하여, 전술한 화학 수식 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 있어서의 콜레스테롤 산화 효소의 농도로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 반응액 중의 농도는 통상 0.001 ∼ 800 kU/L 이고, 0.01 ∼ 300 kU/L 가 바람직하다.
본 발명에 있어서의 콜레스테롤 탈수소 효소로는, 산화형 보효소의 존재하에 콜레스테롤을 산화하여 환원형 보효소를 생성하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤데히드로게나아제 외에, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜레스테롤데히드로게나아제 등도 사용할 수 있다. 콜레스테롤데히드로게나아제 “Amano” 5 (CHDH-5 ; 아마노 엔자임사 제조) 등의 시판품을 사용할 수도 있다. 또, 본 발명에 있어서는, 2 종류 이상의 콜레스테롤 탈수소 효소를 조합하여 사용할 수도 있다. 콜레스테롤 탈수소 효소는, 무수식의 효소여도 되고, 화학적으로 수식된 효소여도 된다. 화학적으로 수식된 콜레스테롤 탈수소 효소는, 예를 들어 전술한 화학 수식제를 사용하여, 전술한 화학 수식 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 LDL-C 측정 방법에 있어서의 콜레스테롤 탈수소 효소의 농도로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 반응액 중의 농도는 통상 0.001 ∼ 800 kU/L 이고, 0.01 ∼ 300 kU/L 가 바람직하다.
본 발명의 콜레스테롤 탈수소 효소를 사용한 측정법에 있어서는, 산화형 보효소가 사용된다. 산화형 보효소로는, 예를 들어 NAD, NADP, 티오 (thio)-NAD, 티오 (thio)-NADP 등을 들 수 있다. 또, 산화형 보효소의 농도는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 0.01 ∼ 10 g/L 가 바람직하다.
본 발명에 있어서의 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제로는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 (이하, POE 알킬페닐에테르라고 약기한다), 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬페닐에테르 (이하, POEPOP 알킬페닐에테르라고 약기한다) 등을 들 수 있다. POE 알킬페닐에테르 및 POEPOP 알킬페닐에테르에 있어서의 알킬로는, 예를 들어 옥틸, 노닐 등을 들 수 있다.
POE 알킬페닐에테르의 구체예로는, 예를 들어 트리톤 X-100 (POE 옥틸페닐에테르 ; 시그마 알드리치사 제조) 등을 들 수 있다.
POEPOP 알킬페닐에테르의 구체예로는, 예를 들어 에마르겐 L40 (카오사 제조), 아크로네세스 KP189R (니치유사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르에 있어서의 알킬로는 예를 들어 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬을 들 수 있고, 탄소수 9 ∼ 18 의 알킬이 바람직하고, 탄소수 9 ∼ 16 의 알킬이 보다 바람직하고, 탄소수 10 ∼ 13 의 알킬이 특히 바람직하다. 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬로는, 예를 들어 옥틸, 이소옥틸, 노닐, 이소노닐, 데실, 이소데실, 운데실, 이소운데실, 도데실(라우릴), 이소도데실, 트리데실, 이소트리데실, 테트라데실(미리스틸), 이소테트라데실, 펜타데실, 이소펜타데실, 헥사데실(세틸), 이소헥사데실, 헵타데실, 이소헵타데실, 옥타데실(스테아릴), 이소옥타데실, 노나데실, 이소노나데실, 이코실, 이소이코실 등을 들 수 있다. 탄소수 9 ∼ 18 의 알킬로는, 예를 들어 노닐, 이소노닐, 데실, 이소데실, 운데실, 이소운데실, 도데실(라우릴), 이소도데실, 트리데실, 이소트리데실, 테트라데실(미리스틸), 이소테트라데실, 펜타데실, 이소펜타데실, 헥사데실(세틸), 이소헥사데실, 헵타데실, 이소헵타데실, 옥타데실(스테아릴), 이소옥타데실 등을 들 수 있다. 탄소수 9 ∼ 16 의 알킬로는, 예를 들어 노닐, 이소노닐, 데실, 이소데실, 운데실, 이소운데실, 도데실(라우릴), 이소도데실, 트리데실, 이소트리데실, 테트라데실(미리스틸), 이소테트라데실, 펜타데실, 이소펜타데실, 헥사데실(세틸), 이소헥사데실 등을 들 수 있다. 탄소수 10 ∼ 13 의 알킬로는, 예를 들어 데실, 이소데실, 운데실, 이소운데실, 도데실(라우릴), 이소도데실, 트리데실, 이소트리데실 등을 들 수 있다. POEPOP 알킬에테르에 있어서의 POEPOP 의 중합 양식으로는 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 블록 중합형, 랜덤 중합형의 중합 양식의 것을 들 수 있다. 블록 중합형으로는, 예를 들어 디 블록 코폴리머, 트리 블록 코폴리머, 테트라 블록 코폴리머 등을 들 수 있다.
POE 알킬에테르의 구체예로는, 예를 들어 파인서프 D-35, 파인서프 D-45, 파인서프 D-60, 파인서프 D-65, 파인서프 D-85, 세프티컷 ID-1033, 세프티컷 ID-1087 (이상, POE 이소데실에테르 ; 아오키 유지 공업사 제조), 파인서프 TD-30, 파인서프 TD-50, 파인서프 TD-70, 파인서프 TD-80, 파인서프 TD-85, 파인서프 TD-90, 파인서프 TD-100, 파인서프 TD-120, 파인서프 TD-150, 파인서프 TD-200 (이상, POE 트리데실에테르 ; 아오키 유지 공업사 제조), NIKKOL BL-2, NIKKOL BL-4.2, NIKKOL BL-9EX, NIKKOL BL-21, NIKKOL BL-25 (이상, POE 라우릴에테르 ; 닛코 케미컬즈사 제조), NIKKOL BC-2, NIKKOL BC-5.5, NIKKOL BC-7, NIKKOL BC-10, NIKKOL BC-15, NIKKOL BC-20, NIKKOL BC-23, NIKKOL BC-25, NIKKOL BC-30, NIKKOL BC-40 (이상, POE 세틸에테르 ; 닛코 케미컬즈사 제조), EMALEX 703, EMALEX 705, EMALEX 707, EMALEX 709, EMALEX 710, EMALEX 712, EMALEX 715, EMALEX 720, EMALEX 725, EMALEX 730, EMALEX 750 (이상, POE 라우릴에테르 ; 니혼 에멀전사 제조), EMALEX 102, EMALEX 103, EMALEX 104, EMALEX 105, EMALEX 107, EMALEX 112, EMALEX 115, EMALEX 117, EMALEX 120, EMALEX 125, EMALEX 130 (이상, POE 세틸에테르 ; 니혼 에멀전사 제조), 논이온 ID-203, 논이온 ID-206, 논이온 ID-209 (이상, POE 이소데실에테르 ; 니치유사 제조), 논이온 K-204, 논이온 K-220, 논이온 K-230 (이상, POE 라우릴에테르 ; 니치유사 제조), 논이온 P-208, 논이온 P-210, 논이온 P-213 (이상, POE 세틸에테르 ; 니치유사 제조) 등을 들 수 있다.
POEPOP 알킬에테르의 구체예로는, 예를 들어 원더서프 NDR-800, 원더서프 NDR-1000, 원더서프 NDR-1400 (이상, POEPOP 데실에테르 ; 아오키 유지 공업사 제조), 원더서프 ID-50, 원더서프 ID-70, 원더서프 ID-90, 파인서프 IDEP-608, 파인서프 IDEP-604, 파인서프 IDEP-802 (이상, POEPOP 이소데실에테르 ; 아오키 유지 공업사 제조), 원더서프 RL-80, 원더서프 RL-100, 원더서프 RL-140, 원더서프 80, 원더서프 100, 원더서프 140 (이상, POEPOP 라우릴에테르 ; 아오키 유지 공업사 제조), 원더서프 S-800, 원더서프 S-1000, 원더서프 S-1400, 파인서프 TDP-0633K, 파인서프 TDE-1033, 파인서프 TDE-1055 (이상, POEPOP 트리데실에테르 ; 아오키 유지 공업사 제조), NIKKOL PBC-31, NIKKOL PBC-33, NIKKOL PBC-34, NIKKOL PBC-44 (이상, POEPOP 세틸에테르 ; 닛코 케미컬즈사 제조), EMALEX DAPE-0203, EMALEX DAPE-0205, EMALEX DAPE-0207, EMALEX DAPE-0210, EMALEX DAPE-0212, EMALEX DAPE-0215, EMALEX DAPE-0220, EMALEX DAPE-0230 (이상, POEPOP 데실에테르 ; 니혼 에멀전사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 있어서의 POE 알킬에테르의 농도로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 반응액 중의 농도는 통상 0.0001 ∼ 20 ％ (w/v) 이고, 0.001 ∼ 5 ％ (w/v) 가 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 있어서의 POEPOP 알킬에테르의 농도로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 반응액 중의 농도는 통상 0.0001 ∼ 20 ％ (w/v) 이고, 0.001 ∼ 5 ％ (w/v) 가 바람직하다.
POEPOP 축합물에 있어서의 POEPOP 의 중합 양식으로는 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 블록 중합형, 랜덤 중합형의 중합 양식의 것을 들 수 있다. 블록 중합형으로는, 예를 들어 디 블록 코폴리머, 트리 블록 코폴리머, 테트라 블록 코폴리머 등을 들 수 있다. POP 의 분자량으로는, 500 ∼ 7000 이고, 바람직하게는 1000 ∼ 6000 이다. POEPOP 축합물의 분자량으로는, 600 ∼ 12000 이고, 바람직하게는 1500 ∼ 8000 이다.
POEPOP 축합물의 구체예로는, 플루로닉 L-101, 플루로닉 L-121, 플루로닉 P-103, 플루로닉 F-108 (이상, ADEKA 사 제조), 프로논 201, 프로논 204, 프로논 208 (이상, 니치유사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 있어서의 POEPOP 축합물의 농도로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 반응액 중의 농도는 통상 0.0001 ∼ 20 ％ (w/v) 이고, 0.001 ∼ 5 ％ (w/v) 가 바람직하다.
본 발명에 있어서의 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시프로필렌글리세릴에테르 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체의 분자량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 분자량이면 특별히 제한은 없고, 통상 500 ∼ 4000 이고, 1000 ∼ 3500 이 바람직하고, 1200 ∼ 3000 이 특히 바람직하다.
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체의 구체예로는, 예를 들어 유니올 D-700, 유니올 D-1000, 유니올 D-1200, 유니올 D-2000, 유니올 D-4000 (이상, 폴리프로필렌글리콜 ; 니치유사 제조), 유니올 TG-1000R, 유니올 TG-3000 (이상, 폴리옥시프로필렌글리세릴에테르 ; 니치유사 제조), 폴리프로필렌글리콜 디올형 1,000, 폴리프로필렌글리콜 디올형 2,000, 폴리프로필렌글리콜 디올형 3,000 (이상, 폴리프로필렌글리콜 ; 와코 순약 공업사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 있어서의, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체의 농도로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 반응액 중의 농도는 통상 0.0001 ∼ 5 ％ (w/v) 이고, 0.001 ∼ 1 ％ (w/v) 가 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 있어서의 반응 온도는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 온도이면 특별히 제한은 없지만, 10 ∼ 50 ℃ 가 바람직하고, 30 ∼ 40 ℃ 가 보다 바람직하다. 범용의 자동 분석 장치에서 설정되는 반응 온도는 통상 37 ℃ 이다.
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 있어서의 반응 시간은, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 반응 시간이면 특별히 제한은 없지만, 1 ∼ 60 분간이 바람직하고, 2 ∼ 30 분간이 보다 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 있어서, LDL-C 의 측정은, 예를 들어 반응에 의해 생성된 과산화수소나 환원형 보효소를 측정함으로써 실시할 수 있다. 또, 반응에 있어서 소비되는 산소량을 측정함으로써 실시할 수도 있다.
생성된 과산화수소의 양은, 예를 들어 과산화수소 전극이나 과산화수소 측정용 시약을 사용하여 측정할 수 있다. 과산화수소 측정용 시약은, 생성된 과산화수소를 검출 가능한 물질로 변환하기 위한 시약이다. 검출 가능한 물질로는, 예를 들어 색소, 발광 등을 들 수 있지만, 색소가 바람직하다. 검출 가능한 물질이 색소인 경우에는, 과산화수소 측정용 시약은, 산화 발색형 색원체 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질을 함유한다. 산화 발색형 색원체로는, 예를 들어 후술하는 산화 발색형 색원체를 들 수 있다. 검출 가능한 물질이 발광인 경우에는, 과산화수소 측정용 시약은, 화학 발광 물질을 함유한다. 화학 발광 물질로는, 예를 들어 루미놀, 이소루미놀, 루시게닌, 아크리디늄에스테르 등을 들 수 있다.
과산화수소 측정용 시약으로서, 산화 발색형 색원체 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질을 함유하는 시약을 사용하는 경우에는, 과산화수소는, 과산화 활성 물질의 존재하에 산화 발색형 색원체와 반응하여 색소를 생성하고, 생성한 색소를 측정함으로써, 측정할 수 있다. 또, 화학 발광 물질을 함유하는 과산화수소 측정용 시약을 사용하는 경우에는, 과산화수소는, 화학 발광 물질과 반응하여 포톤을 발생하고, 발생한 포톤을 측정함으로써, 측정할 수 있다.
산화 발색형 색원체로는, 예를 들어 로이코형 색원체, 산화 커플링 발색형 색원체 등을 들 수 있다.
로이코형 색원체는, 과산화수소 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질의 존재하, 단독으로 색소로 변환되는 물질이다. 구체적으로는, 테트라메틸벤지딘, o-페닐렌디아민, 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨염 (DA-64), 10-N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 나트륨염 (DA-67), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA) 등을 들 수 있다.
산화 커플링 발색형 색원체는, 과산화수소 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질의 존재하, 2 개의 화합물이 산화적 커플링하여 색소를 생성하는 물질이다. 2 개의 화합물의 조합으로는, 커플러와 아닐린류의 조합, 커플러와 페놀류의 조합 등을 들 수 있다.
커플러로는, 예를 들어 4-아미노안티피린 (4-AA), 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라존 등을 들 수 있다.
아닐린류로는, N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOPS), N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-디(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린 (F-DAOS), N-[2-(숙시닐아미노)에틸]-2-메톡시-5-메틸아닐린 (MASE), N-에틸-N-[2-(숙시닐아미노)에틸]-2-메톡시-5-메틸아닐린 (Et-MASE) 등을 들 수 있다.
페놀류로는, 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-하이드록시-2,4,6-트리요오드벤조산 (HTIB) 등을 들 수 있다.
과산화수소의 측정에 있어서, 과산화 활성 물질의 농도는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없지만, 과산화 활성 물질로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우에는, 1 ∼ 100 kU/L 가 바람직하다. 또, 산화 발색형 색원체의 농도는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 0.01 ∼ 10 g/L 가 바람직하다.
환원형 보효소의 측정 방법으로는, 예를 들어 생성된 환원형 보효소의 흡광도를 측정하는 방법, 환원형 보효소 측정용 시약을 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 환원형 보효소의 흡광도를 측정하는 방법에 있어서의 흡광도로는, 300 ∼ 500 ㎚ 가 바람직하고, 330 ∼ 400 ㎚ 가 보다 바람직하고, 340 ㎚ 부근이 특히 바람직하다. 환원형 보효소 측정용 시약은, 생성된 환원형 보효소를 검출 가능한 물질로 변환하기 위한 시약이다. 검출 가능한 물질로는, 예를 들어 색소 등을 들 수 있다. 검출 가능한 물질이 색소인 경우의 환원형 보효소 측정용 시약으로는, 예를 들어 디아포라아제, 전자 캐리어 및 환원 발색형 색원체를 함유하는 시약을 들 수 있다. 전자 캐리어로는, 예를 들어 1-메톡시-5-메틸페나듐메틸술페이트 등을 들 수 있다. 환원형 보효소 측정용 시약으로서, 디아포라아제, 전자 캐리어 및 환원 발색형 색원체를 함유하는 시약을 사용하는 경우에는, 환원 발색형 색원체가 변환되어 생성된 색소를 정량함으로써, 환원형 보효소를 정량할 수 있다.
환원 발색형 색원체로는, 예를 들어 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드 (MTT), 2-(4-요오드페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨 모노나트륨염 (WST-1), 2-(4-요오드페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨 모노나트륨염 (WST-3) 등을 들 수 있다. 또, 환원 발색형 색원체의 농도는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 0.01 ∼ 10 g/L 가 바람직하다.
2. LDL-C 측정용 시약 및 LDL-C 측정용 키트
본 발명의 LDL-C 측정용 시약은, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 사용되는 시약이다. 본 발명의 LDL-C 측정용 시약은, 보존, 유통 및 사용에 적절한 키트의 형태를 취할 수 있다. 본 발명의 LDL-C 측정용 키트는, 본 발명의 LDL-C 측정 방법에 사용되는 키트이다. 본 발명의 LDL-C 측정용 키트의 형태로는, 예를 들어 2 시약계의 키트, 3 시약계의 키트 등을 들 수 있지만, 제 1 시약과 제 2 시약으로 이루어지는 2 시약계의 키트가 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 키트로서, 2 시약계 키트를 사용하여 검체 중의 LDL-C 를 측정하는 경우에는, 먼저, 반응 셀에, 검체와 제 1 시약을 첨가하고, 일정 시간, 일정 온도에서 반응 (1 차 반응) 을 실시한 후, 제 2 시약을 첨가하고, 추가로, 일정 시간, 일정 온도에서 반응 (2 차 반응) 을 실시하고, 2 차 반응에 의해 생성된 물질 또는 소비되는 물질을 측정함으로써, LDL-C 를 측정할 수 있다.
본 발명의 LDL-C 측정용 시약은, 동결 건조된 상태여도 되고, 수성 매체에 용해된 상태여도 된다. 동결 건조된 상태의 LDL-C 측정용 시약을 사용하여 검체 중의 LDL-C 를 측정하는 경우에는, 사전에 당해 시약을 수성 매체에 용해시켜, LDL-C 의 측정에 사용된다. 그 수성 매체로는, 예를 들어 전술한 수성 매체 등을 들 수 있다.
본 발명의 LDL-C 측정용 시약 및 측정용 키트에 있어서의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 산화형 보효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제, POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 과산화수소 측정용 시약, 환원형 보효소 측정용 시약으로는, 전술한 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 산화형 보효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제, POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 과산화수소 측정용 시약, 환원형 보효소 측정용 시약을 각각 들 수 있다.
제 1 시약과 제 2 시약으로 이루어지는 2 시약계의 LDL-C 측정용 키트에 있어서는, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않고, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소는, 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유된다. 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 사용하는 LDL-C 측정에 사용되는 2 시약계의 LDL-C 측정용 키트에 있어서는, 콜레스테롤 산화 효소는 제 1 시약에 함유되지 않고, 제 2 시약에 함유된다. 또, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 보효소를 사용하는 LDL-C 측정에 사용되는 2 시약계의 LDL-C 측정용 키트에 있어서는, 콜레스테롤 탈수소 효소는 제 1 시약에 함유되지 않고, 제 2 시약에 함유되고, 산화형 보효소는 적어도 제 1 시약에 함유된다.
POE 알킬에테르는, 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유되어도 되지만, 제 2 시약에 함유되는 양태가 바람직하다.
POEPOP 알킬에테르는, 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유되어도 되지만, 제 2 시약에 함유되는 양태가 바람직하다.
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체는, 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유되어도 되지만, 제 2 시약에 함유되는 양태가 바람직하다.
과산화수소 측정용 시약은, 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유되어도 되지만, 적어도 제 1 시약에 함유되는 것이 바람직하다. 과산화수소 측정 시약이 산화 커플링형 색원체를 함유하는 경우에는, 산화 커플링형 색원체의 2 개의 화합물, 즉, 커플러와 아닐린류, 또는, 커플러와 페놀류는 각각 별개의 시약에 함유되는 양태가 바람직하다. 환원성 보효소 측정용 시약은, 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유되어도 되지만, 제 1 시약, 제 2 시약의 양방에 함유되는 것이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 키트가, 3 시약 이상의 시약으로 이루어지는 키트인 경우, 당해 키트를 구성하는 어느 시약에도, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 포함되지 않는다.
본 발명의 LDL-C 측정용 시약 및 측정용 키트에는, 필요에 따라, 수성 매체, 안정화제, 방부제, 방해 물질의 영향 회피제, 반응 촉진제 등이 함유되어도 된다. 수성 매체로는, 예를 들어 전술한 수성 매체 등을 들 수 있다. 안정화제로는, 예를 들어 에틸렌디아민사아세트산 (EDTA), 수크로오스, 염화칼슘 등을 들 수 있다. 방부제로는, 예를 들어 아지화나트륨, 항생 물질 등을 들 수 있다. 방해 물질의 영향 회피제로는, 예를 들어 아스코르브산의 영향을 회피하기 위한 아스코르브산옥시다아제, 빌리루빈의 영향을 회피하기 위한 페로시안화칼륨 등을 들 수 있다. 반응 촉진제로는, 예를 들어 코리파아제, 포스포리파아제 등의 효소, 황산나트륨, 염화나트륨 등의 염류 등을 들 수 있다.
이하에, 본 발명의 LDL-C 측정용 시약의 구체적 양태를 기재하지만, 본 발명의 LDL-C 측정용 시약은 이들에 한정되지 않는다.
·시약 1
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 2
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 3
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 4
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 5
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 6
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 7
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 8
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 9
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 10
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 11
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 12
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 13
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 14
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 15
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 16
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 17
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 18
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 19
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 20
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 21
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 22
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 23
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
·시약 24
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 환원형 보효소 측정용 시약을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 시약.
본 발명의 LDL-C 측정용 시약에 있어서의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.001 ∼ 800 kU/L 가 되는 함량이고, 0.01 ∼ 300 kU/L 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 시약에 있어서의 콜레스테롤 산화 효소의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.001 ∼ 800 kU/L 가 되는 함량이고, 0.01 ∼ 300 kU/L 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 시약에 있어서의 콜레스테롤 탈수소 효소의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.001 ∼ 800 kU/L 가 되는 함량이고, 0.01 ∼ 300 kU/L 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 시약에 있어서의 POE 알킬에테르의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.0001 ∼ 20 ％ (w/v) 가 되는 함량이고, 0.001 ∼ 5 ％ (w/v) 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 시약에 있어서의 POEPOP 알킬에테르의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.0001 ∼ 20 ％ (w/v) 가 되는 함량이고, 0.001 ∼ 5 ％ (w/v) 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 시약에 있어서의 POEPOP 축합물의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.0001 ∼ 20 ％ (w/v) 가 되는 함량이고, 0.001 ∼ 5 ％ (w/v) 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 시약에 있어서의, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.0001 ∼ 5 ％ (w/v) 가 되는 함량이고, 0.001 ∼ 1 ％ (w/v) 가 되는 함량이 바람직하다.
이하에, 본 발명의 LDL-C 측정용 키트의 구체적 양태를 기재하지만, 본 발명의 LDL-C 측정용 키트는 이들에 한정되지 않는다.
·키트 1
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물
제 2 시약
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 2
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 과산화수소 측정용 시약
제 2 시약
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 과산화수소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 3
제 1 시약
과산화수소 측정용 시약
제 2 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 과산화수소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 4
제 1 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물
제 2 시약
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 5
제 1 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 과산화수소 측정용 시약
제 2 시약
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 과산화수소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 6
제 1 시약
과산화수소 측정용 시약
제 2 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 과산화수소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 7
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물
제 2 시약
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 8
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 과산화수소 측정용 시약
제 2 시약
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 과산화수소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 9
제 1 시약
과산화수소 측정용 시약
제 2 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 과산화수소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 10
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물
제 2 시약
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 11
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 과산화수소 측정용 시약
제 2 시약
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 과산화수소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 12
제 1 시약
과산화수소 측정용 시약
제 2 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 과산화수소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 13
제 1 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물
제 2 시약
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 14
제 1 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 과산화수소 측정용 시약
제 2 시약
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 과산화수소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 15
제 1 시약
과산화수소 측정용 시약
제 2 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 과산화수소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 16
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물
제 2 시약
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 17
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 과산화수소 측정용 시약
제 2 시약
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 과산화수소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 18
제 1 시약
과산화수소 측정용 시약
제 2 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 과산화수소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 19
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 산화형 보효소
제 2 시약
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 20
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약
제 2 시약
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 보효소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 21
제 1 시약
산화형 보효소
제 2 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 22
제 1 시약
산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약
제 2 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 보효소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 23
제 1 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 산화형 보효소
제 2 시약
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 24
제 1 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약
제 2 시약
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 보효소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 25
제 1 시약
산화형 보효소
제 2 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 26
제 1 시약
산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약
제 2 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 보효소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 27
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 산화형 보효소
제 2 시약
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 28
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약
제 2 시약
콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 보효소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 29
제 1 시약
산화형 보효소
제 2 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 30
제 1 시약
산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약
제 2 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 보효소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 31
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 산화형 보효소
제 2 시약
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 32
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약
제 2 시약
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 보효소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 33
제 1 시약
산화형 보효소
제 2 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 34
제 1 시약
산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약
제 2 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 보효소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 35
제 1 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 산화형 보효소
제 2 시약
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 36
제 1 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약
제 2 시약
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 보효소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 37
제 1 시약
산화형 보효소
제 2 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 38
제 1 시약
산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약
제 2 시약
POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 보효소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 39
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 산화형 보효소
제 2 시약
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 40
제 1 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약
제 2 시약
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 보효소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 41
제 1 시약
산화형 보효소
제 2 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
·키트 42
제 1 시약
산화형 보효소, 환원형 보효소 측정용 시약
제 2 시약
POE 알킬에테르, POEPOP 알킬에테르, POEPOP 축합물, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 환원형 보효소 측정용 시약
또한, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제는 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 것에도 함유되지 않는다
본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 구성하는 제 1 시약에 있어서의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.002 ∼ 1600 kU/L 가 되는 함량이고, 0.02 ∼ 600 kU/L 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 구성하는 제 2 시약에 있어서의 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.004 ∼ 3200 kU/L 가 되는 함량이고, 0.04 ∼ 1200 kU/L 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 구성하는 제 2 시약에 있어서의 콜레스테롤 산화 효소의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.004 ∼ 3200 kU/L 가 되는 함량이고, 0.04 ∼ 1200 kU/L 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 구성하는 제 2 시약에 있어서의 콜레스테롤 탈수소 효소의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.004 ∼ 3200 kU/L 가 되는 함량이고, 0.04 ∼ 1200 kU/L 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 구성하는 제 1 시약에 있어서의 POE 알킬에테르의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.0002 ∼ 40 ％ (w/v) 가 되는 함량이고, 0.002 ∼ 10 ％ (w/v) 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 구성하는 제 2 시약에 있어서의 POE 알킬에테르의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.0004 ∼ 40 ％ (w/v) 가 되는 함량이고, 0.004 ∼ 20 ％ (w/v) 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 구성하는 제 1 시약에 있어서의 POEPOP 알킬에테르의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.0002 ∼ 40 ％ (w/v) 가 되는 함량이고, 0.002 ∼ 10 ％ (w/v) 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 구성하는 제 2 시약에 있어서의 POEPOP 알킬에테르의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.0004 ∼ 40 ％ (w/v) 가 되는 함량이고, 0.004 ∼ 20 ％ (w/v) 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 구성하는 제 1 시약에 있어서의 POEPOP 축합물의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.0002 ∼ 40 ％ (w/v) 가 되는 함량이고, 0.002 ∼ 10 ％ (w/v) 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 구성하는 제 2 시약에 있어서의 POEPOP 축합물의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.0004 ∼ 40 ％ (w/v) 가 되는 함량이고, 0.004 ∼ 20 ％ (w/v) 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 구성하는 제 1 시약에 있어서의, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.0002 ∼ 10 ％ (w/v) 가 되는 함량이고, 0.002 ∼ 2 ％ (w/v) 가 되는 함량이 바람직하다.
본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 구성하는 제 2 시약에 있어서의, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체의 함량으로는, 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법을 가능하게 하는 함량이면 특별히 제한은 없고, 수성 매체로 용해되었을 때의 농도가 통상 0.0004 ∼ 20 ％ (w/v) 가 되는 함량이고, 0.004 ∼ 4 ％ (w/v) 가 되는 함량이 바람직하다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 전혀 한정하지 않는다. 또한, 본 실시예, 비교예에 있어서는, 하기 메이커의 시약 및 효소를 사용하였다.
PIPES (도진 화학 연구소사 제조), EMSE (다이토 케믹스사 제조), 아스코르브산옥시다아제 (아사히 화성 파마사 제조), 4-AA (아크텍사 제조), 염화칼슘 (와코 순약 공업사 제조), 페로시안화칼륨 (칸토 화학사 제조), LPL-311 (콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 ; 토요보사 제조), CHO-CE (콜레스테롤 산화 효소 ; 키코만사 제조), 퍼옥시다아제 (토요보사 제조), 플루로닉 L-121 (POEPOP 축합물 ; ADEKA 사 제조)
세프티컷 ID-1087 (POE 이소데실에테르 ; 아오키 유지 공업사 제조), 파인서프 TD-200 (POE 트리데실에테르 ; 아오키 유지 공업사 제조), 원더서프 ID-70 (POEPOP 이소데실에테르 ; 아오키 유지 공업사 제조), 원더서프 ID-90 (POEPOP 이소데실에테르 ; 아오키 유지 공업사 제조), 원더서프 S-1400 (POEPOP 트리데실에테르 ; 아오키 유지 공업사 제조)
레오돌 TW-L120 (폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 ; 카오사 제조), 에마논 1112 (폴리에틸렌글리콜모노라우레이트 ; 카오사 제조), 나이민 L-207 (폴리옥시에틸렌라우릴아민 ; 니치유사 제조), 유니글리 MK-278 (폴리옥시에틸렌야자유지방산글리세릴 ; 니치유사 제조), 유니옥스 HC-100 (폴리옥시에틸렌경화피마자유 ; 니치유사 제조)
유니올 D-1200 (폴리프로필렌글리콜 ; 니치유사 제조), 유니올 D-2000 (폴리프로필렌글리콜 ; 니치유사 제조), 폴리프로필렌글리콜 디올형 3,000 (폴리프로필렌글리콜 ; 와코 순약 공업사 제조), 유니올 TG-3000 (폴리옥시프로필렌글리세릴에테르 ; 니치유사 제조), PEG＃2000 (폴리에틸렌글리콜 ; 니치유사 제조)
생리 식염수 (오오츠카 제약 공장사 제조), 인트라리포즈 수액 10 ％ (정제 대두유 ; 오오츠카 제약 공장사 제조), 데타미나 L TCII (콜레스테롤 측정용 키트 ; 교와 메덱스사 제조), 메타볼리드 LDL-C (LDL-C 측정용 키트 ; 교와 메덱스사 제조), 데타미나 표준 혈청 지질 측정용 (데타미나 L TCII 와 조합하여 사용하는 표준품 ; 교와 메덱스사 제조, 이하 콜레스테롤 표준품이라고 약기한다), 메타볼리드 표준 혈청 HDL·LDL-C 측정용 (메타볼리드 LDL-C 와 조합하여 사용하는 표준품 ; 교와 메덱스사 제조, 이하 LDL-C 표준품이라고 약기한다)
[참고예 1] 리포단백 분획의 조제와 콜레스테롤 농도의 결정
(1) 리포단백 분획의 조제
교와 메덱스 주식회사 소속의 정상인으로부터 채취한 전혈을, 3,000 rpm, 25 ℃ 에서 20 분간 원심 분리하고, 인간 혈청을 조제하였다. 이어서, “신생 화학 실험 강좌 4 지질 I 중성 지방과 리포단백질” (도쿄 화학 동인, ISBN : 4-8079-1080-9) 에 기재된 초원심 분리 조작에 따라, 당해 인간 혈청으로부터 VLDL (비중 1.006 이하), LDL (비중 1.006 ∼ 1.063), HDL (비중 1.063 이상) 을 각각 분리하고, 각 리포단백 분획을 조제하였다.
(2) 콜레스테롤 농도 결정을 위한 검량선의 작성
콜레스테롤 측정용 키트로서 데타미나 L TCII 를 사용하고, 시료로서 콜레스테롤 농도가 결정되어 있는 콜레스테롤 표준품을 사용하여, 이하의 순서에 의해, 콜레스테롤 표준품에 대한 흡광도를 측정하였다. 반응 셀에, 당해 표준품 (2 μL) 과 데타미나 L TCII 의 제 1 시약 (150 μL) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 반응시키고, 반응액의 흡광도 (E1) 을 주파장 600 ㎚, 부파장 800 ㎚ 로 측정하였다. 이어서, 이 반응액에 데타미나 L TCII 의 제 2 시약 (50 μL) 을 첨가하고, 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 반응시키고, 반응액의 흡광도 (E2) 를 주파장 600 ㎚, 부파장 800 ㎚ 로 측정하였다. E2 로부터 E1 을 감산하여, 흡광도차 ΔE표준품 을 산출하였다.
당해 표준품 대신에 생리 식염수를 사용하는 것 이외에는 동일한 방법에 의해, 흡광도차 ΔE블랭크 를 산출하였다.
당해 표준품에 대한 흡광도차 ΔE표준품 과, 생리 식염수에 대한 흡광도차 ΔE블랭크 로부터, 콜레스테롤 농도 (mg/dL) 와 흡광도 사이의 관계를 나타내는 검량선을 작성하였다.
(3) 각 리포단백 분획에 있어서의 콜레스테롤 농도의 결정
콜레스테롤 측정용 키트로서 데타미나 L TCII 를 사용하고, 시료로서 (1) 에서 조제한 각 리포단백 분획을 사용하여, (2) 와 동일한 순서에 의해, 각 리포단백 분획에 대한 흡광도차를 산출하였다. 산출한 흡광도차와 (2) 의 검량선으로부터, 각 리포단백 분획에 있어서의 콜레스테롤 농도 (mg/dL) 를 결정하였다.
[실시예 1]
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 LDL-C 측정용 키트 (키트 1A ∼ 1E) 를 조제하였다.
제 1 시약
PIPES (pH 7.0) 50 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
아스코르브산옥시다아제 4 kU/L
제 2 시약
PIPES (pH 7.0) 50 mmol/L
4-AA 0.5 g/L
염화칼슘 0.1 g/L
페로시안화칼륨 0.02 g/L
LPL-311 3 kU/L
CHO-CE 2 kU/L
퍼옥시다아제 20 kU/L
플루로닉 L-121 7 g/L
계면 활성제 A ∼ E (표 1 참조)
[비교예 1]
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 LDL-C 측정용 키트 (키트 1a ∼ 1e) 를 조제하였다.
제 1 시약
PIPES (pH 7.0) 50 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
아스코르브산옥시다아제 4 kU/L
제 2 시약
PIPES (pH 7.0) 50 mmol/L
4-AA 0.5 g/L
염화칼슘 0.1 g/L
페로시안화칼륨 0.02 g/L
LPL-311 3 kU/L
CHO-CE 2 kU/L
퍼옥시다아제 20 kU/L
플루로닉 L-121 7 g/L
계면 활성제 a ∼ e (표 1 참조)
[실시예 2]
LDL-C 측정용 키트로서 실시예 1 의 키트 1A 를 사용하고, 시료로서 참고예 1 의 (1) 에서 조제한 각 리포단백 분획을 사용하여, 이하의 순서에 의해, 각 리포단백 분획 중의 콜레스테롤의 반응률을 결정하였다. 또, LDL-C 측정용 키트로서 실시예 1 의 키트 1A 및 메타볼리드 LDL-C 를 사용하고, 시료로서 후술하는 (4) 에서 조제한 인간 혈청 20 개를 사용하여, 이하의 순서에 의해, 실시예 1 의 키트 1A 를 사용한 측정 방법 및 메타볼리드 LDL-C 를 사용한 측정 방법 사이의 상관 관계를 검증하고, 상관 계수를 결정하였다.
(1) LDL-C 농도 결정을 위한 검량선의 작성
LDL-C 측정용 키트로서 실시예 1 의 키트 1A 를 사용하고, 시료로서 LDL-C 농도가 결정되어 있는 LDL-C 표준품을 사용하여, 이하의 순서에 의해, LDL-C 표준품에 대한 흡광도를 측정하였다. 반응 셀에, 당해 표준품 (2.5 μL) 과 실시예 1 의 키트 1A 의 제 1 시약 (150 μL) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 반응시키고, 반응액의 흡광도 (E1) 을 주파장 600 ㎚, 부파장 700 ㎚ 로 측정하였다. 이어서, 이 반응액에 실시예 1 의 키트 1A 의 제 2 시약 (50 μL) 을 첨가하고, 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 반응시키고, 반응액의 흡광도 (E2) 를 주파장 600 ㎚, 부파장 700 ㎚ 로 측정하였다. E2 로부터 E1 을 감산하여, 흡광도차 ΔE표준품 을 산출하였다.
당해 표준품 대신에 생리 식염수를 사용하는 것 이외에는 동일한 방법에 의해, 흡광도차 ΔE블랭크 를 산출하였다.
당해 표준품에 대한 흡광도차 ΔE표준품 과, 생리 식염수에 대한 흡광도차 ΔE블랭크 로부터, LDL-C 농도 (mg/dL) 와 흡광도 사이의 관계를 나타내는 검량선을 작성하였다.
(2) 각 리포단백 분획에 있어서의 콜레스테롤 농도의 결정
실시예 1 의 키트 1A 를 사용하고, 시료로서 참고예 1 의 (1) 에서 조제한 각 리포단백 분획을 사용하여, (1) 과 동일한 순서에 의해, 각 리포단백 분획 중의 콜레스테롤에 대한 흡광도차를 산출하였다. 산출한 흡광도차와 (1) 의 검량선으로부터, 각 리포단백 분획에 있어서의 콜레스테롤 농도 (mg/dL) 를 결정하였다.
(3) 각 리포단백 분획 중의 콜레스테롤의 반응률의 결정
참고예 1 의 (3) 에서 결정한 각 리포단백 분획에 있어서의 콜레스테롤 농도와, 상기 (2) 에서 결정한 각 리포단백 분획에 있어서의 콜레스테롤 농도로부터, 이하의 식 (Ⅰ) 에 의해, 실시예 1 의 키트 1A 에 있어서의 각 리포단백 분획 중의 콜레스테롤의 반응률을 결정하였다.
Figure pct00001
결정한 각 리포단백 분획 중의 콜레스테롤의 반응률에 대하여, 0 ％ ∼ 10 ％ 미만을 “－”, 10 ％ 이상 ∼ 20 ％ 미만을 “±”, 20 ％ 이상 ∼ 40 ％ 미만을 “＋” 및 40 ％ 이상을 “＋＋”로서 나타내고, 그 결과를 표 1 에 나타낸다.
(4) 인간 혈청에 있어서의 LDL-C 농도의 결정
교와 메덱스 주식회사 소속의 정상인으로부터 채취한 전혈을, 3,000 rpm, 25 ℃ 에서 20 분간 원심 분리하고, 인간 혈청 20 검체를 조제하였다. 이어서, LDL-C 측정용 키트로서 실시예 1 의 키트 1A 및 메타볼리드 LDL-C 를 사용하고, 시료로서 당해 인간 혈청 20 검체를 사용하여, (1) 과 동일한 순서에 의해, 각 인간 혈청에 대한 흡광도차를 산출하였다. 산출한 흡광도차와 (1) 의 검량선으로부터, 각 인간 혈청에 있어서의 LDL-C 농도 (mg/dL) 를 결정하였다.
(5) 본 발명의 측정 키트를 사용한 측정 방법 및 메타볼리드 LDL-C 를 사용한 측정 방법 사이의 상관 계수의 결정
LDL-C 측정용 키트로서 실시예 1 의 키트 1A 를 사용하여 (4) 에서 결정한 각 인간 혈청에 있어서의 LDL-C 농도 (mg/dL) 와, LDL-C 측정용 키트로서 메타볼리드 LDL-C 를 사용하여 (4) 에서 결정한 각 인간 혈청에 있어서의 LDL-C 농도 (mg/dL) 로부터, 실시예 1 의 키트 1A 를 사용한 측정 방법 및 메타볼리드 LDL-C 를 사용한 측정 방법 사이의 상관 관계를 검증하고, 상관 계수를 결정하였다. 그 결과를 표 1 에 나타낸다.
[실시예 3]
실시예 1 의 키트 1A 대신에 실시예 1 의 키트 1B, 1C, 1D 및 1E 의 각 키트를 LDL-C 측정용 키트로서 사용하는 것 이외에는, 실시예 2 와 동일한 순서에 의해, 당해 각 키트의 각 리포단백 분획 중의 콜레스테롤에 대한 반응률 및 당해 각 키트를 사용한 측정 방법과 메타볼리드 LDL-C 를 사용한 측정 방법 사이의 상관 계수를 결정하였다. 그 결과를 표 1 에 나타낸다.
[비교예 2]
실시예 1 의 키트 1A 대신에 비교예 1 의 키트 1a, 1b, 1c, 1d 및 1e 의 각 키트를 LDL-C 측정용 키트로서 사용하는 것 이외에는, 실시예 2 와 동일한 순서에 의해, 당해 각 키트에 있어서의 각 리포단백 분획 중의 콜레스테롤의 반응률 및 당해 각 키트를 사용한 측정 방법과 메타볼리드 LDL-C 를 사용한 측정 방법 사이의 상관 계수를 결정하였다. 그 결과를 표 1 에 나타낸다.
Figure pct00002
참고예 1 의 (1) 에 기재된 바와 같이, 측정에 사용한 각 리포단백 분획은, VLDL, LDL 및 HDL 을 초원심법에 의해 각각 분리하여 조제한 것이다. 따라서, VLDL 분획 중의 콜레스테롤 및 HDL 분획의 콜레스테롤의 반응률이 낮으며, 또한, LDL 분획 중의 콜레스테롤의 반응률이 높은 LDL-C 측정 키트일수록, 검체 중의 LDL-C 를 정확하게 측정할 수 있는 것을 의미한다. 표 1 로부터 분명한 바와 같이, 실시예 1 의 키트 1A ∼ 1E 의 각 키트를 사용하는 측정에 있어서는, 비교예 1 의 키트 1a ∼ 1e 의 각 키트를 사용하는 측정과 비교하여, VLDL 분획 및 HDL 분획의 반응률이 낮으며, 또한 LDL 분획의 반응률이 높은 것이 판명되었다. 따라서, POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 및 POEPOP 축합물을 포함하는, 본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 사용하는 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 의해, 검체 중의 LDL-C 를 정확하게 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
또, 표 1 로부터 분명한 바와 같이, 실시예 1 의 키트 1A ∼ 1E 의 각 키트를 사용한 측정 방법과 메타볼리드 LDL-C 를 사용한 측정 방법 사이의 상관 계수가 0.95 이상이 되어, 양측정 사이에 양호한 상관 관계가 확인되었다. 한편, 비교예 1 의 키트 1a ∼ 1e 의 각 키트를 사용한 측정 방법과 메타볼리드 LDL-C 를 사용한 측정 방법 사이에 있어서는, 양호한 상관 관계가 확인되지 않았다. 따라서, POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 및 POEPOP 축합물을 포함하는, 본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 사용하는 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 의해, 검체 중의 LDL-C 를 정확하게 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
[실시예 4]
교와 메덱스 주식회사 소속의 정상인으로부터 채취한 전혈을, 3,000 rpm, 25 ℃ 에서 20 분간 원심 분리하고, 인간 혈청 5 검체를 조제하였다. 이어서, LDL-C 측정용 키트로서 실시예 1 의 키트 1E 및 메타볼리드 LDL-C 를 사용하고, 시료로서 당해 인간 혈청 5 검체를 사용하여, 실시예 2 의 (1) 및 (2) 와 동일한 순서에 의해, 각 인간 혈청에 있어서의 LDL-C 농도 (mg/dL) 를 결정하였다. 그 결과를 표 2 에 나타낸다.
Figure pct00003
표 2 로부터 분명한 바와 같이, LDL-C 측정용 키트로서 실시예 1 의 키트 1E 를 사용하는 측정에 있어서 결정한 LDL-C 농도 (mg/dL) 는, LDL-C 측정용 키트로서 메타볼리드 LDL-C 를 사용하는 측정에 의해 결정한 LDL-C 농도 (mg/dL) 와 거의 동일하였다. 따라서, POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 및 POEPOP 축합물을 포함하는, 본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 사용하는 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 의해, 검체 중의 LDL-C 를 정확하게 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
[실시예 5]
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 LDL-C 측정용 키트 (키트 2A ∼ 2D) 를 조제하였다.
제 1 시약
PIPES (pH 7.0) 50 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
아스코르브산옥시다아제 4 kU/L
제 2 시약
PIPES (pH 7.0) 50 mmol/L
4-AA 0.5 g/L
염화칼슘 0.1 g/L
페로시안화칼륨 0.02 g/L
LPL-311 3 kU/L
CHO-CE 2 kU/L
퍼옥시다아제 20 kU/L
플루로닉 L-121 7 g/L
원더서프 S-1400 4 g/L
폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체 A ∼ D (표 3 참조)
[비교예 3]
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 LDL-C 측정용 키트 2a 를 조제하였다.
제 1 시약
PIPES (pH 7.0) 50 mmol/L
EMSE 0.3 g/L
아스코르브산옥시다아제 4 kU/L
제 2 시약
PIPES (pH 7.0) 50 mmol/L
4-AA 0.5 g/L
염화칼슘 0.1 g/L
페로시안화칼륨 0.02 g/L
LPL-311 3 kU/L
CHO-CE 2 kU/L
퍼옥시다아제 20 kU/L
플루로닉 L-121 7 g/L
원더서프 S-1400 4 g/L
PEG＃2000 3.6 g/L
비교예 3 의 LDL-C 측정용 키트 2a 는, 제 2 시약 중의 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체 대신에 PEG＃2000 을 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 LDL-C 측정용 키트 (키트 2A ∼ 2D) 와 동일하다.
[실시예 6]
LDL-C 측정용 키트로서 실시예 5 의 키트 2A 를 사용하고, 시료로서 인트라리포즈를 혈청에 첨가하여 조제한 인트라리포즈 첨가 혈청, 및 생리 식염수를 혈청에 첨가하여 조제한 생리 식염수 첨가 혈청을 사용하여, 이하의 순서에 의해, 인트라리포즈 첨가 혈청 중의 LDL-C 농도 및 생리 식염수 첨가 혈청 중의 LDL-C 농도를 결정하고, 인트라리포즈의 영향을 평가하였다.
(1) 인트라리포즈 첨가 혈청 및 생리 식염수 첨가 혈청의 조제
인간 혈청과 인트라리포즈 수액 10 ％ 를, 9 : 1 의 비율로 혼합하여, 인트라리포즈 첨가 혈청을 조제하였다. 동일하게, 인간 혈청과 생리 식염수를, 9 : 1 의 비율로 혼합하여, 생리 식염수 첨가 혈청을 조제하였다.
(2) 인트라리포즈 첨가 혈청 중 및 생리 식염수 첨가 혈청 중의 LDL-C 농도의 결정
LDL-C 측정용 키트로서 실시예 5 의 키트 2A 를 사용하고, 검체로서 (1) 에서 조제한 인트라리포즈 첨가 혈청 및 생리 식염수 첨가 혈청을 사용하여, 실시예 2 의 (1) 및 (2) 와 동일한 순서에 의해, 당해 혈청 중의 LDL-C 농도 (mg/dL) 를 결정하였다.
(3) LDL-C 측정에 있어서의 인트라리포즈의 영향의 평가
LDL-C 측정용 키트로서 실시예 5 의 키트 2A 를 사용하여 (2) 에서 결정한 인트라리포즈 첨가 혈청 중의 LDL-C 농도 (mg/dL) 와, 생리 식염수 첨가 혈청에 있어서의 LDL-C 농도 (mg/dL) 로부터, 이하의 식 (Ⅱ) 에 의해, 실시예 5 의 키트 2A 를 사용하는 LDL-C 측정에 있어서의 인트라리포즈의 영향을 평가하였다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다.
Figure pct00004
[실시예 7]
실시예 5 의 키트 2A 대신에 실시예 5 의 키트 2B, 2C, 2D 및 1E 의 각 키트를 LDL-C 측정용 키트로서 사용하는 것 이외에는, 실시예 6 과 동일한 순서에 의해, 당해 각 키트를 사용하는 LDL-C 측정에 있어서의 인트라리포즈의 영향을 평가하였다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다.
[비교예 4]
실시예 5 의 키트 2A 대신에 비교예 3 의 키트 2a 를 LDL-C 측정용 키트로서 사용하는 것 이외에는, 실시예 6 과 동일한 순서에 의해, 당해 각 키트를 사용하는 LDL-C 측정에 있어서의 인트라리포즈의 영향을 평가하였다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다.
Figure pct00005
인트라리포즈는 대두유에 의한 트리글리세라이드를 주성분으로 하는 지방 유제이고, 임상 검사용 시약에 있어서의 검체 중의 지질의 탁함에 의한 영향의 평가에 자주 사용된다. 여기서, 인트라리포즈 첨가 혈청 중의 LDL-C 농도의, 생리 식염수 첨가 혈청 중의 LDL-C 농도에 대한 비율이 100 ％ 에 가까울수록, 인트라리포즈의 영향을 받지 않고, 정확한 LDL-C 의 측정이 가능해지는 것을 의미한다.
표 3 으로부터 분명한 바와 같이, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체를 포함하지 않는 키트 1E, 및 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체 대신에 폴리옥시에틸렌글리콜을 포함하는 비교예 3 의 키트 2a 와 비교하여, 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체를 포함하는, 실시예 5 의 키트 2A ∼ 2D 의 각 키트에 있어서의, 인트라리포즈 첨가 혈청 중의 LDL-C 농도의, 생리 식염수 첨가 혈청 중의 LDL-C 농도에 대한 비율은 모두 70 ％ 이상으로 높았다. 따라서, POE 알킬에테르 및 POEPOP 알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제, POEPOP 축합물, 및 분자 내에 폴리옥시에틸렌을 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체를 포함하는, 본 발명의 LDL-C 측정용 키트를 사용하는 본 발명의 LDL-C 의 측정 방법에 의해, 지질에 의한 탁함의 영향을 받지 않고, 검체 중의 LDL-C 를 정확하게 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의해, 메타볼릭 신드롬이나 동맥 경화 등의 진단에 유용한 LDL-C 의 측정 방법, 측정용 시약 및 측정용 키트가 제공된다.

Claims (24)

  1. 검체와, (ⅰ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소의 조합, 또는, (ⅱ) 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소의 조합을,
    [a] 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ; 그리고,
    [b] 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물
    을 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 수성 매체 중에서 반응시키고, 그 반응으로 생성되는 물질 또는 소비되는 물질을 측정하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    [a] 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르에 있어서의 알킬이, 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬인, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    수성 매체가, 추가로, [c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체를 함유하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    [c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체가, 폴리프로필렌글리콜 또는 폴리옥시프로필렌글리세릴에테르인, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생성되는 물질이 과산화수소인, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    과산화수소의 측정이, 과산화수소 측정용 시약을 사용하여 실시되는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생성되는 물질이 환원형 보효소인, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    환원형 보효소의 측정이, 환원형 보효소 측정용 시약을 사용하여 실시되는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법.
  9. [a] 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ;
    [b] 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 ; 그리고,
    콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
  10. 제 9 항에 있어서,
    추가로, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소와 검체의 반응으로 생성되는 물질을 측정하기 위한 시약을 함유하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
  11. 제 10 항에 있어서,
    콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소와 검체의 반응으로 생성되는 물질이, 과산화수소인, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
  12. [a] 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ;
    [b] 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 ; 그리고,
    콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
  13. 제 12 항에 있어서,
    추가로, 콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소와 검체의 반응으로 생성되는 물질을 측정하기 위한 시약을 함유하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
  14. 제 13 항에 있어서,
    콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소, 산화형 보효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소와 검체의 반응으로 생성되는 물질이, 환원형 보효소인, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
  15. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    [a] 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르에 있어서의 알킬이, 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬인, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
  16. 제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로, [c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체를 함유하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
  17. 제 16 항에 있어서,
    [c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체가, 폴리프로필렌글리콜 또는 폴리옥시프로필렌글리세릴에테르인, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
  18. 과산화수소 측정용 시약을 포함하는 제 1 시약, 및 콜레스테롤 산화 효소를 포함하는 제 2 시약을 함유하고,
    [a] 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ;
    [b] 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 ; 그리고,
    콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 각각을 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 시약에도 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
  19. 제 18 항에 있어서,
    추가로, 과산화수소 측정용 시약을 제 2 시약에 함유하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
  20. 산화형 보효소를 포함하는 제 1 시약, 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 포함하는 제 2 시약을 함유하고,
    [a] 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 이상의 계면 활성제 ;
    [b] 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 축합물 ; 그리고,
    콜레스테롤에스테르 가수 분해 효소의 각각을 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유하고, 알킬페놀 구조를 갖는 계면 활성제를 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 시약에도 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
  21. 제 20 항에 있어서,
    추가로, 환원형 보효소 측정용 시약을 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
  22. 제 18 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    [a] 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르에 있어서의 알킬이, 탄소수 8 ∼ 20 의 알킬인, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
  23. 제 18 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로, [c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체를 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 일방 또는 양방에 함유하는, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
  24. 제 23 항에 있어서,
    [c] 폴리옥시에틸렌을 분자 내에 포함하지 않는 폴리옥시프로필렌 유도체가, 폴리프로필렌글리콜 또는 폴리옥시프로필렌글리세릴에테르인, 검체 중의 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
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