JP2010541023A - 生体試料を顕微鏡構成内で位置決めするための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１つの好ましくは生体試料（２）を顕微鏡構成の試料空間内で位置決めするための方法及び装置に関する。方法及び装置は、検出用対物レンズ（１３）の光軸に対する試料（２）の向きを複数回変えたときに、各検出方向から試料（２）に向かってほぼ遮蔽されない視野が確保されるように試料（２）を保持する。種々の変形形態において、試料（２）は、接着力によって支持装置の外面または内面に保持される。または、試料（２）は、流体媒体によって支持装置の外面または内面に保持される。または、試料（２）は、毛細管作用によって流体媒体用の毛細管の開口に保持される。または、透明ゲル（１）からなるゲル体に少なくとも１つの試料（２）が埋め込まれ、回転可能な保持装置（３）によってゲル体が試料空間内に固定され、保持装置（３）が回転されることによって所定の回転角だけ検出方向が変えられる。

Description

本発明は、少なくとも１つの好ましくは生体試料を顕微鏡構成の試料空間内で位置決めするための方法に関する。さらに、本発明の対象は、この方法を実施するための装置である。

本発明による試料保持具は、特に、ＳＰＩＭ（単平面照明顕微鏡法、選択的平面照明顕微鏡法とも呼ばれる）に関連して使用することができる。共焦点レーザ走査顕微鏡法では、試料が複数の異なる深さの面内で点ごとに走査され、そこから試料の３次元の画像情報が取得されるのに対し、ＳＰＩＭ技術は、広視野顕微鏡に基づき、試料の様々な面を通る光学断面に基づいて試料の３次元画像表現を可能にする。

ここで、ＳＰＩＭ技術の利点は、とりわけ、画像取得が行われる速度がより高いこと、生体試料の褪色がより少ないこと、および試料内への焦点の浸透深さがより深いことである。

ＳＰＩＭ技術は、例えば、非特許文献１，２および特許文献１，２に記載されている。
これらの刊行物から、とりわけ、様々な視線方向からの３次元画像データの取得に関して、試料の最適な向き調整を可能にする試料ホルダが知られている。さらに、試料は、円柱体に成形されたゲルの中に埋め込まれ、このゲル円柱体が、浸漬媒体、例えば水を充填された試料室内に入れられる。このとき、ゲルの屈折率は、周囲を取り巻く浸漬媒体の屈折率と実質的に異なっていてはならない。

ここで、試料から出た検出光を収集する検出用対物レンズの光軸は、ゲル円柱体の回転軸に実質的に垂直に向きを調整される。
その際、画像情報から高品質の３Ｄ像を算出することができるように、検出方向の頻繁な変化にもかかわらず、試料から取得される画像情報が重畳するように試料を試料空間内で位置決めするのは難しいことが多い。さらに、特に注目すべき試料部分を最適に視野内へ動かすことができるように試料を位置決めすべきである。さらに、試料をできるだけ長く生きた状態で観察することができ、可能なら、検出後にもさらなる用途のために生きた状態を保つことができることが望ましい。

さらに、多数の同様の試料を、時間単位当たり高い処理量で順次に検出することが求められることもよくある。

ドイツ特許出願公開第１０２５７４２３Ａ１号 ＷＯ２００４／０５３０５５８Ａ１

Ｓｔｅｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒ ３１，１４７７（２００６） Ｓｔｅｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，１００７（２００４）

以上のことから、本発明の目的は、より高い効率で、少なくとも１つの好ましくは生体試料を顕微鏡構成の試料空間内で位置決めすることができるようにする方法および装置を提案することにある。

この目的は、検出用対物レンズの光軸に対する試料の向きを複数回変え、試料の向きを変えたときに、各検出方向から試料または試料の一部分に向かってほぼ妨げられない視野が確保されるように試料を保持することによって解決される。その様々な変形形態において、
試料を、接着力によって支持装置の外面または内面に保持する、
試料を、流体媒体によって支持装置の外面または内面に保持する、
試料を、毛細管作用によって流体媒体用の毛細管の開口に保持する、または、
透明ゲルからなるゲル体の中に少なくとも１つの試料を埋め込み、回転可能な保持装置によってゲル体を試料空間内に固定し、保持装置を回転させることによって所定の回転角だけ検出方向を変える。

最後に挙げた事例では、試料を入れるための凹部を設けたゲル体にゲルを予め成形し、その後、試料を凹部に入れて該凹部の内部で位置決めすることが好ましい。
ゲル体に中空円錐形の凹部を設けることが特に好ましい。試料は、中空円錐体の頂点に位置決めされ、試料の生存に悪影響を及ぼさない小さい力の作用によって試料が中空円錐体の頂点に保持される。

例えば、試料を含むゲル体は、保持装置が回転するときにも重力の作用によって試料が中空円錐体の頂点に保持されるように保持装置に固定される。これは、ゲル体の対応する位置調整によって達成される。

この変形形態は、凹部内にある試料が比較的自由に動くことができ、試料の環境面でさらに成長することができるという利点を有するだけでなく、観察または検出の終了後に試料を再びゲル体から取り出すことができ、それによりさらなる検査に使用することもできる。

代替方法として、本発明による１つの方法は、試料を入れた後に凹部を覆う、または試料を入れた後に凹部に透明な媒体を注入し、この媒体によって試料を凹部内で所定位置に、好ましくは中空円錐体の頂点に保持することである。

このために、初めは流体であるが、ある時間の経過後に所定の温度の下で硬化する媒体を使用することが特に有利であり、それにより、硬化後に試料が凹部の内部で所定位置に固定される。

複数の試料を検出する際により高い処理量を達成するために、本発明によれば、まず、ゲルをゲル体に予め成形し、予め成形されたゲル体に、試料の数に対応する数の凹部を設け、その後、各凹部にそれぞれ１つの試料を入れて各凹部の内部で位置決めし、場合によっては固定するようになされる。

任意選択で、試料を、順次にまたは同時に凹部に入れ、試料を入れた後、凹部を蓋で閉じることができる。
さらなる特定の１つの形態では、まず、試料を入れるべき凹部の領域内でゲル体を加熱し、次いで試料を入れ、その後、初めは流体であるが、後で硬化する媒体を凹部に入れ、その後、前もって試料が装填され且つ硬化性の媒体が充填されたこの凹部の領域内でゲル体を冷却することによって硬化を加速する、すなわち硬化工程の期間を所定の時間だけ短縮するようになされる。

この場合、第１の凹部の領域内でゲル体を所定の周期で加熱し、次いで試料を第１の凹部に入れ、硬化性の媒体を第１の凹部に注入すると同時に第２の凹部の領域内でゲルを加熱し、その後、第１の凹部の領域内でゲルを冷却すると同時に試料を第２の凹部に入れ、硬化性の媒体を注入し、第３の凹部の領域内でゲルを予熱し、その後、第２の凹部の領域内でゲルを冷却すると同時に試料を第３の凹部に入れ、硬化性の媒体を注入し、第４の凹部の領域内でゲルを予熱し、各凹部に１つの試料が含まれ固定されるまで以下同様に続けると有利である。

試料を凹部に入れることに関して、複数の試料を試料リザーバ内に保存し、試料リザーバから試料を個別に取り出し、凹部に入れ、試料の個別化および凹部への送入が自動的に行われるようにすることが好ましい。

試料リザーバから装填位置への試料の搬送、および凹部への送入は、カニューレを通して行うと有利である。また、試料を、カニューレを通して、支持装置の外面もしくは内面における、または毛細管の開口における所定位置に導くと有利である。

複数の試料をゲル体の中に入れる方法の代わりに、各試料を個別に、割り当てられた凹部に埋め込み、それぞれ１つの試料を含むゲル体を、個別にまたは順次に試料空間内に搬送し、それぞれ封じ込められた試料の検出が終了した後、再び試料空間から搬出するようにすることができる。

本発明によれば、第１の部分量のゲルを、長手方向に沿って分割されたカニューレの第１の半体内に置き、次いで、この第１の部分量の上に試料を載せ、その後、試料の上に第２の部分量のゲルを載せ、分割されたカニューレの第２の半体を、圧力をかけながら載せる。その結果、この両方の半体の間に中空の円筒形ができ、ゲルが、カニューレの内径に相当する外径を有するとともに、その中に試料が封じ込められたゲル体として成形される。これによって、ゲルからなるゲル体の中に試料を埋め込むことができる。

当然ながら、カニューレが、長手方向ではなく別の様式で分割される場合や、またはカニューレではなく、同様に成形された物体を利用する場合にも、同じ目的が達成される。
次いで、埋め込まれた試料の位置をゲル体の内部で位置合わせすることが望まれる場合、封じ込められた試料を含むがまだ硬化していない状態のゲルからなるゲル体を監視ステーション内に入れ、監視ステーションによってゲル体の中での試料の位置を評価し、この評価の結果に応じて、重力の作用により試料がゲル体の中で所望の位置に沈下するように重力に対してゲル体の向きを調整する。

この場合、監視ステーションは、使用者が目で監視できるように、またはセンサおよび評価回路によって光電子的に監視できるように設計することができる。
また、より大きな寸法の生体物質または他の物質から抽出される試料も検出することができるように、本発明では、物質に向いて鋭利に研がれたカニューレの端部を物質中に押し込み、次いで、カニューレの内部を移動できるように案内されるとともに摺動棒と接続されたスタンプによって、物質からカニューレを引き抜くときに部分量をカニューレ（３５）内に留め、その後、その部分量を含むカニューレを試料空間内に入れ、そこで、摺動棒およびスタンプによって、部分量の一部分だけをカニューレから押し出し、押し出された部分は試料として検出され、残りの部分はカニューレによって保持される。

試料が埋め込まれるゲルとして、また硬化性の媒体として、例えばアガロースゲルが考慮される。
本発明の目的は、さらに、以下の様々な変形形態に記載される装置によって解決される。

すなわち、少なくとも１つの生体試料を顕微鏡構成の試料空間内で位置決めするための装置の第１の変形形態は、
各ゲル体にそれぞれ１つの試料が封じ込められる、同じ形状および大きさを有するゲル体のリザーバと、
試料空間内にあるゲル体の保持装置と、
ゲル体リザーバからゲル体を個別に取り出し、ゲル体を保持装置に貯蔵するための取出しおよび貯蔵装置と、
保持装置からゲル体を取り出し、搬出するための取出しおよび搬出装置と、
を備える。

任意選択で、この装置は、さらに、画像評価装置と、画像評価の結果に応じて制御可能な分類装置とを備えることもでき、この分類装置によって、ゲル体は、保持装置から取り出された後に、様々な貯蔵ホルダに分けて入れられる。

また、少なくとも１つの生体試料を顕微鏡構成の試料空間内で位置決めするための本発明による装置の第２の変形形態は、
複数の試料が封じ込められる１つのゲル体と、
ゲル体を受け取る前送り装置とを備え、前送り装置の作動により、ゲル体が移動して、封じ込められた試料が順次に試料空間に通され、各試料から３次元像が取得される。

この第２の変形形態では、任意選択でさらに、画像評価装置と、前送り装置用のモータ駆動装置と、画像評価装置および駆動装置と接続された制御回路とを備えることができ、制御回路は、３次元像が完全に生成された後に、駆動装置に対して制御命令が生成され、駆動装置が前送り移動を開始し、それにより試料空間内で試料を取り替えるように設計される。

本発明による装置の第３の変形形態では、
それぞれ１つの試料を入れるための凹部を複数の位置に有するゲル体と、
試料リザーバから個々の試料を取り出すため、および試料を装填位置に搬送するための供給装置と、
ゲル体を受け取る前送り装置とを備え、前送り装置の作動により、凹部が順次に装填位置に導かれ、装填位置で凹部にそれぞれ１つの試料が入れられるように、ゲル体が移動される。

この第３の変形形態では、さらに、硬化性の媒体を供給し、試料を入れた後に媒体を凹部に注入するための供給装置を備えることができる。
これに関連して、ゲル体と熱的に接続された加熱ステーションおよび／または冷却ステーションが存在してもよく、加熱ステーションおよび／または冷却ステーションは、媒体を注入する前に少なくとも特定の凹部の領域内でゲル体を加熱し、および／または媒体を注入した後に少なくとも特定の凹部の領域内でゲルを冷却する。

ここで、装填過程にわたって一様な前送り速度が実現されるように、試料を装填するための期間と、媒体を注入するための期間と、硬化性の媒体の特性を考慮しながら加熱または冷却するための期間が互いに調節されると特に有利である。

また、特に、本発明による装置の第２および第３の変形形態が、試料を受け入れるための凹部をゲル体内で削り出すための切削装置を備えていてもよい。
この切削装置は、例えば、ゲルの円錐形部分または円柱形部分をゲル体からくり抜くための回転刃を備えることができる。

また、この切削装置には、削り出された凹部内にただ１つの試料を供給するためのカニューレが割り当てられると有利である。凹部の削り出しと、同じ位置への試料の送入により、予め成形されたゲル体への試料の装填を時間を節約して行うことが可能である。

透明なゲルの中への試料の埋込みの１つの例と、支持装置の外面または内面での試料の保持に関する複数の例を示す図。 毛細管作用による試料の保持の１つの例を示す図。 試料を入れるための凹部を設けた、予め成形されたゲル体の１つの例を示す図。 試料を入れるための複数の凹部を設けた、予め成形されたゲル体の１つの例を示す図。 試料を入れた後に凹部を閉じるための機構を備える、試料を入れるための複数の凹部を設けた、予め成形されたゲル体の１つの例を示す図。 個々の試料用の供給装置および加熱・冷却ステーションに接続された、試料を入れるための複数の凹部を設けた、予め成形されたゲル体の１つの例を示す図。 各ゲル体の中に１つの試料が封じ込められる、試料空間に個別のゲル体を供給するための供給装置の１つの例を示す図。 注入作用によって試料を個別化および供給する装置の第１の例を示す図。 注入作用によって試料を個別化および供給する装置の第２の例を示す図。 ゲル体の中に試料を埋め込むための方法および関連の装置の１つの例を示す図。 図１０によるゲル体の内部で試料の規定の位置決めを行うための方法および関連の装置の１つの例を示す図。 検査対象の物質から、検出に用いる特定の試料を抽出するための方法の１つの例を示す図。

以下、様々な例示的実施形態に基づいて、本発明をより詳細に説明する。図１は、好ましくは、特に選択的平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）に従って試料の３次元像を取得するために、顕微鏡構成の試料空間内に生体試料を、生きた状態で位置決めするための様々な例示的実施形態を示す。

図１ａにおいて、直径ｄの円柱体に成形されたゲル１の中に、試料２、例えばゼブラフィッシュ胚が埋め込まれる。ゲル１からなる円柱体は、顕微鏡構成の試料空間内にある試料ホルダ３に装着される。試料空間とは、本発明の文脈では、顕微鏡対物レンズ（本発明に関連して検出用対物レンズとも呼ぶ）の検出領域内の１つの領域を表す。

図１ａに基づいて説明する、透明なゲル１の中に単一の試料２を埋め込む方法は、従来技術に属する。この方法では、試料２の自由な動きおよび試料２の成長の可能性が制限されるので、試料２の寿命がかなり限られるという欠点がある。さらに、顕微鏡検査後にも試料２を生きた状態に保ち、試料２をさらなる観察に使用できるようにすることが望まれることも多い。これは、上記の方法では成しえない。それに加えて、さらなる欠点は、ゲルが、環境、例えば周囲を取り巻く浸液とは異なる屈折率を有し、したがって、そのとき達成される画像品質に関して、試料の像が望みに適っていないことである。

これらの欠点をほぼなくす本発明による装置が、図１ｂに示されている。ここでは、例として３つの試料２、例えばやはりゼブラフィッシュ胚が、支持装置としての役割をする棒４に接着力によって付けられる。棒４も同様に透明な材料、例えば硬化したゲルからなり、試料２と共に浸液中、例えば水中にある。

ここでは、試料２の数（３つ）は、単に例として選択されている。
利点は、各試料２が自由に動くことができ、また各試料２の成長が制限されないことである。また、試料を簡単に棒４から再び取り外すことができることにより、観察が終わった後、生きた状態を容易に保つことができる。

図１ｃは、接着力によって試料２が内壁に留められた中空体５を示す。ここでは、自由に動くことができ、かつ成長が制限されないという利点に加えて、試料２が浸液に触れないという利点がある。この場合にも、観察が終了した後または顕微鏡撮像が終了した後、試料２を生きた状態で容易に保つことができる。

図１ａおよび図１ｂと同様に、この中空体５も試料ホルダ３に位置決めされる。中空体５の囲壁は、浸液の屈折性にできるだけ近い屈折性を有する透明な材料、例えばやはり硬化したゲルからなる。

図１ｄには、やはり中空体６が示されているが、この中空体６は、試料ホルダ３側の端部でも、試料ホルダ３とは反対側の端部でも開いており、試料ホルダ３から矢印方向Ｓに流体または気体媒体が通り抜ける。

流体媒体は、試料２を、フィルタ７に達するまで運ぶ。フィルタ７は、流体媒体を通すが、試料２は通さない。試料２を生きた状態に保つことおよび試料２をさらに使用することに関して、図１ｂおよび図１ｃによる実施形態の場合とほぼ同じ利点が得られる。

図１ｅは、図１ｄによる方法を逆にしたものを示す。相違点は、ここでは、試料２が中空体８の外にあり、流体または気体媒体の流れが、逆向きに、フィルタ９を通り中空体８を通過して試料ホルダ３に至るように向けられることだけである。流体媒体により、試料２がフィルタ９に保持される。

図２は、毛細管作用による試料２の保持の１例を示す。その原理を、図２ａに基づいて示す。ここでは、流体媒体が充填された毛細管１０が、試料ホルダ３に位置決めされる。単一の試料２が、毛細管の開口に保持されている。

図２ｂは、本発明による装置のそのような実施形態の利点を示す。ここでは、試料保持具３が、毛細管１０および試料２と共に位置決め装置１１に固定され、位置決め装置１１は、試料２の向きに関して好ましくは６自由度で動くことができる。それにより、試料２を、光シート１２および検出用対物レンズ１３に対して様々な向きに保つことができる。

図３は、やはりゲル１による試料２の保持および位置決めの１つの例を示し、ゲル１は、やはり直径ｄの円柱体に成形され、試料ホルダ３に固定されている。しかし、このゲル円柱体からゲル１の一部分が抜き取られており、それにより中空円錐形の凹部１４ができている。

その際、中空円錐体の頂点は回転軸１５上にあり、試料ホルダ３は、回転軸１５周りを回転可能に支持される。凹部１４に試料２が入れられ、重力に対してゲル円柱体の向きが適宜調整されると、試料２は、中空円錐体の頂点に沈下し、したがって回転軸１５に心合わせされた位置に来る。

したがって、試料ホルダ３の回転によって、ゲル円柱体および試料２が回転し、それにより、回転によって角度範囲０°〜３６０°で変えることができる視角で、方向Ｄからの検出が可能になる。

この場合も、観察が終了した後または検出が終わった後に試料２をゲル円柱体から取り出すことができ、さらなる用途に使用できるという利点がある。
図４には、透明なゲル１から予め成形されたゲル体が示されており、このゲル体は、それぞれ１つの試料２を入れるための、中空円錐形の複数の凹部１４を有する。このように構成された本発明による装置は、凹部１４に入れられた試料２が重力の作用によって中空円錐体の頂点に沈下し、観察中または画像情報の取得中にもそこに留まるように位置決めすることができる。

これに関して、この装置が前送り装置（図示せず）と接続されると有利であり、この前送り装置は、例えば使用者または制御回路が発する制御命令により、方向Ｖへ前送り移動させる。

この前送り移動により、それぞれ１つの試料２が占めた凹部１４が、順次に検出用対物レンズの光軸上に進められる。
図４ａでの選択状態では、検出用対物レンズの光軸が、したがって検出方向も、紙面に垂直に向けられている。紙面に垂直な検出方向は、図３と同様にここでも符号Ｄで示される。

ここで、図３に基づいて既に説明したように、保持装置３を旋回装置に取り付けることができ、旋回装置は、紙面内にある回転軸１５周りでの試料２の回転を可能にする。このとき、回転軸１５は、検出方向Ｄを直角に横切る。しかし、ここで、ゲル１内に含まれる残りの試料によって一部で影ができるので、検出方向の設定が制限される。

例えば図４ｂによる装置は、この欠点に対処するものである。ここでは、同様にゲル体に予め成形されたゲル１の中に複数の試料２が埋め込まれ、埋め込まれたすべての試料２が回転軸１５上に位置する。

この場合も図４ａの場合と同様に、検出方向Ｄは、回転軸１５と直角を成し、紙面に垂直に向けられている。
しかし、ここでは、試料２は、重力によって凹部１４の中空円錐体の頂点に保持されない。この場合であっても、中空円錐体の頂点での試料２の位置決めを保証するために、凹部１４は、既に硬化しているゲルからなる予め成形された栓１６で閉じられ、あるいは、初めは流体であり、後で硬化するゲル１７を充填される。

ゲル１７の充填は、図４ａに示されるゲル体の向きに行われ、初めに、試料２が、重力の作用により中空円錐体の頂点に落ちる。すべての凹部１４に硬化したゲルが設けられ、それにより試料２が中空円錐体の頂点に固定された後に、ゲル体が図４ｂに示される姿勢にされる。

試料２を含む凹部を順次に検出方向に位置決めするために、ここでも同様に前送り装置（図示せず）が提供され、この前送り装置が、ゲル体を方向Ｖに押し進める。
図５は、いくつかの凹部１４を設けたゲル体の装填装置の変形形態を示す。ここでは、初めに、ゲル１が、装填用の開口１９を有する管１８によって取り囲まれる。このとき、装填用開口１９の数は、凹部１４の数に対応する。

ゲル体は、管１８の内部で移動可能であり、それにより、装填用開口１９に対する凹部１４の位置を変えることができる。図５ａでは、装填用開口１９が凹部１４の上に位置決めされ、それにより、初めに、すべての装填用開口１９を通してそれぞれ１つの試料２を入れることができ、次いで、意図されており必要である範囲で、硬化性のゲルを注入することができる。

試料２および硬化性のゲルが凹部１４内に装填された後、ゲル体がスタンプ２０によって管１８の内部で方向Ｖに移動されて、図５ｂによる配置になり、ここでは、装填用開口１９が凹部１４に対してずれており、したがって凹部１４は閉じられている。

装填後、ゲル体は、管１８から抜き取られ、図４に基づいて説明したように取り扱われ、あるいはゲル体は、管１８内に位置したままであり、管１８が、ゲル体および試料２と共に保持装置（図５には図示せず）に取り付けられ、それにより、ここにも同様に示される回転軸１５周りでの回転を行うことができる。

ただし、これは、管１８が、ゲル１および試料空間内に存在する浸液と実質的に同じ屈折率を有する透明な材料から作製されていることを前提とする。図４に基づいて既に説明したように、試料２は、検出のために、検出用対物レンズの光軸上に順次に進められる。

図６に基づいて説明する装填装置のさらなる変形形態では、ゲル１がやはり管１８の中にあり、しかしここでは、装填用の開口１９は１つだけである。装填用開口１９は、やはり、それぞれ１つの試料２を凹部１４の１つに供給するためのものである。ここでも同様にスタンプ２０が提供され、このスタンプ２０は、手動または自動で生成される制御命令に従って、ゲル１を方向Ｖに所定の値だけ押し進める。

図５による図とは異なり、ここでは、さらに加熱ステーション２１および冷却ステーション２２が存在する。加熱ステーション２１および冷却ステーション２２は、管１８の周りを囲う。装填用の開口１９は、加熱ステーション２１と冷却ステーション２２との間にある。

この装填装置は、以下のように作動する。装填用の開口１９を通して試料２が凹部１４に入れられる間、ゲル１は、加熱ステーション２１によって取り囲まれた凹部１４の領域内で予熱される。それと同時に、ゲル１は、冷却ステーション２２によって周りを囲われた凹部１４の領域内で冷却される。

試料２が、加熱ステーション２１と冷却ステーション２２との間で装填用の開口１９を通して凹部１４に入れられた後、ゲル１は、２つの凹部１４の間の距離に相当する量だけスタンプ２０によって押し進められ、それにより、ここで、今装填された凹部１４が、冷却ステーション２２の領域内に来て冷却され、これまで加熱ステーション２１の領域内で予熱されていた凹部１４が、加熱ステーション２１と冷却ステーション２２との間の装填用開口１９の下に来て、その次の凹部１４が、加熱ステーション２１の領域内に移動してここで予熱される。

任意選択で、この装填装置は、試料２の直後に硬化性のゲルも装填用の開口１９を通して注入されるように作動することもできる。このようにすると、それぞれ、予熱され、加熱ステーション２１から出て、装填用開口１９の下に押し進められた凹部１４が、硬化性のゲルを受け入れることができるようになり、それによりゲルは、中空円錐形の凹部１４内で初めに低い粘稠度で保たれ、凹部１４を完全に満たし、凹部１４内に含まれている試料２をその定位置に固定することができる。充填された凹部１４を冷却ステーション２２の領域内に移動させた後、冷却により硬化が加速される。

この装填装置が制御回路と接続されると有利であり、この制御回路により、２つの凹部１４間の距離だけゲル１が方向Ｖに移動されるその時々の時間間隔が、試料２の装填のための時間間隔、および注入されたゲルの硬化に合わせて調節される。さらに、加熱温度および冷却温度の高さを適宜規定することによって、予熱および冷却のための工程時間がこの時間間隔に合わせて調節される。

図７は、本発明による装置の１つの実施形態を示し、この実施形態では、円柱体に成形されたゲル１によって、それぞれただ１つの試料２が取り囲まれ、多数のそのようなゲル体が、図７に示されるゲル体リザーバ２３内にある。この装置が作動するとき、ゲル体は、ゲル体リザーバ２３から個別に取り出され、管路２４を通して、試料空間２５内に送られ、試料空間２５内で、試料２が光軸上に、すなわち検出用対物レンズの検出方向に位置するように保持装置３上で位置決めされる。

観察または検出が終わった後、当該のゲル体は、やはり管路２４を通して試料空間２５から搬出される。
この工程が自動的に行われることで、試料２の高い処理量を達成することもできる。

図８は、注入作用を利用することによって試料２を個別化して供給する装置の第１の例を示す。ここでは、例えば、管１８を通して方向Ｖに押し進められるゲル１の吸引作用により、試料２が供給カニューレ２５から出て運ばれる。

図９は、注入作用を使用するための装置のさらなる実施形態を示し、ここでは、ゲル１ではなく、流体２６、特別な場合には浸液が吸引作用をもたらす。
ゲル１の中に試料２を埋め込むための有利な方法および関連の装置を図１０に示す。

ここでは、初めに、長手方向に沿って分割されたカニューレの第１の半体に相当する下側部品２７内に、硬化はするが初めはまだ軟らかい比較的少量のゲル１が入れられ、位置合わせツール３９によって、このゲル量の上に試料２が載せられる（図１０ａ参照）。

その後、図１０ｂに示されるように、試料２は、まだ軟らかいさらなる量のゲル１で覆われ、ゲル１の両方の部分がつながって試料２を封じ込める。次に、一端にスタンプ２９が固定された押し棒２８が、ゲル１と、ゲル１とは反対側の下側部品２７の端部との間にスタンプ２９が来るように、下側部品２７内に置かれる。

次いで、長手方向に沿って分割されたカニューレの第２の半体に相当する上側部品３０が、適切な圧力の作用により下側部品２７の上に載せられ、これら両方の部品の間に中空の円筒形が生じる結果、ゲル１は、カニューレの内径に相当する外径を有するゲル体に成形される。

このとき、試料２は、ゲル１によって完全に取り囲まれている。次いで、押し棒２８を方向Ｖに押し進めることにより、ゲル体は、スタンプ２９によって押し出され、例えば図７に基づいて説明した本発明による装置の変形形態に関連してさらなる用途に使用できる。

しかし、試料２を中心合わせする、すなわちそのようにして作製されたゲル体の長手軸上に位置決めすることも保証するために、図１１によれば、ゲル体の中での試料２の位置を確認し、場合によっては修正する、それも、そのような修正がもはやできなくなる程にゲル１が硬化してしまう前に修正するための方法および装置が提案される。

これに関連して、試料２が取り囲まれているゲル体を、押し棒２８またはスタンプ２９によってカニューレ３１内に押し進めるようになされており、カニューレ３１は、その長手軸周りで回転するように支持され、回転運動を発生させるために回転駆動装置３２と結合される。

このカニューレ３１内で、試料２を含むゲル体は、監視ステーション３３に達するまで押し進められ、監視ステーション３３は、使用者が目で監視できるように構成され、または以下に例として示すように、光電子手段を使用して、例えばライトボックスの形態で構成することができる。その場合、ライトボックスの光源と検出器は、カニューレ３１の両側に対置され、カニューレ３１は、少なくともこの監視ステーション３３の領域内で、光源から発する光が透過できる外壁を有する。

ここで、この装置は、ゲル体が押し進められる間に初めはカニューレ３１が回転されないように作動される。次いで、試料２がライトボックスの領域内に来たとき、ライトボックスによって、試料２が長手軸上に位置決めされているかどうか監視される。試料が長手軸よりも下にある場合、試料２が長手軸、すなわち回転軸よりも上に来るまで、カニューレ３１がゲル体と共に回転される。ゲル１はまだ硬化していないので、試料２は、重力の作用により沈下し、その際に回転軸または長手軸に近づき、その一方で、ゲル１の硬化工程は続く。

試料２が回転軸上の所望の位置に留まる程にはゲル１の硬化が進まず、試料２が再び回転軸よりも下に沈下する場合、カニューレ３１が１８０°回転され、それにより、試料２が、ここで再び回転軸よりも上に来て、回転軸に向かって再び沈下し、この方法工程は、最終的に、硬化しきったゲル１の中で試料２が回転軸上に固定されるまで繰り返される。その後、試料は、押し棒２８またはスタンプ２９によって押し出され、図７に基づいて説明した装置での用途に使用できる。

以上、本発明による方法および関連の装置を、例えばゼブラフィッシュ胚など比較的小さい寸法を有する試料２に基づいてここまで説明してきたが、より大きな寸法を有する生体物質または別の物質から抽出された試料を検査するのに適した方法および装置も本発明の概念に含まれる。

これに関連する方法と、関連の装置を図１２に示す。
生体物質３４、例えば脳組織から部分量として試料４０を抽出するために、物質３４に向いた端部３６を鋭利に研がれたカニューレ３５が、方向Ｖで物質３４に挿入される（図１２ａ参照）。その際、試料４０は、物質３４から切り取られ、カニューレ３５によって取り囲まれ、カニューレ３５を方向Ｖに引き抜くことによって物質３４から抽出される（図１２ｂおよび図１２ｃ参照）。引抜きは、場合によっては、カニューレ３５の内部に案内された図１０および図１１で既に示したスタンプ２９を有する押し棒２８の支援によって、それを用いてカニューレ３５内で低圧を発生させ、それにより、物質３４からカニューレ３５を抜き取るときに試料４０をカニューレ内に保持する、またカニューレ内に留めておくことによって行うことができる。

図１２ｄに基づいて示されるように、ここで試料４０を含むカニューレ３５は、試料４０の検出のために顕微鏡構成の試料空間内に入れられ、試料４０の一部分が検出用対物レンズ３７の検出領域内に来るが、残りの部分はまだカニューレ３５の内部に保持されている状態になるまで、押し棒２８またはスタンプ２９によって試料４０がカニューレ３５から押し出される。

特定の１つの実施形態では、カニューレ３５が、さらに回転軸３８周りで回転可能に支持される場合、この回転軸３８を中心としてカニューレ３５を回転させることにより、様々な検出方向に調節可能である。

１ ゲル
２ 試料
３ 試料ホルダ
４ 棒
５、６ 中空体
７ フィルタ
８ 中空体
９ フィルタ
１０ 毛細管
１１ 位置決め装置
１２ 光シート
１３ 検出用対物レンズ
１４ 凹部
１５ 回転軸
１６ 栓
１７ ゲル
１８ 管
１９ 装入開口
２０ スタンプ
２１ 加熱ステーション
２２ 冷却ステーション
２３ ゲル体リザーバ
２４ 管路
２５ 試料空間
２６ 流体
２７ 下側部品
２８ 押し棒
２９ スタンプ
３０ 上側部品
３１ カニューレ
３２ 回転駆動装置
３３ 監視ステーション
３４ 物質
３５ カニューレ
３６ 端部
３７ 検出用対物レンズ
３８ 回転軸
３９ 位置合わせツール
４０ 試料
ｄ 直径
ｓ、Ｄ、Ｖ 方向

Claims (36)

1. 少なくとも１つの試料（２）を顕微鏡構成の試料空間内で位置決めするための方法であって、
   検出用対物レンズの光軸に対する試料（２）の向きを複数回変え、
   前記向きを変えたときに生じる各検出方向から、前記試料（２）の画像情報を取得し、
   前記取得の際に、各検出方向から前記試料（２）または前記試料の一部分に向かってほぼ遮蔽されない視野が保証されるように前記試料（２）を保持する、
   方法。
2. 前記試料（２）が接着力によって支持装置の外面または内面に保持される、請求項１に記載の方法。
3. 前記試料は流体媒体が前記試料に及ぼす動圧によって支持装置の外面または内面に保持される、請求項１に記載の方法。
4. 前記試料（２）が毛細管作用によって流体媒体用の毛細管の開口に保持される、請求項１に記載の方法。
5. 透明なゲル（１）の中に前記試料（２）を埋め込み、
   前記ゲル（１）をゲル体に成形し、
   前記検出用対物レンズの光軸に垂直な回転軸（１５）周りに回転可能な保持装置（３）によって前記ゲル体を試料空間（２５）内に固定し、
   前記保持装置（３）を回転させることにより前記検出方向を変える、
   請求項１に記載の方法。
6. 前記試料（２）を入れるための凹部（１４）を備えたゲル体に前記ゲル（１）を予め成形した後に前記試料（２）を前記凹部（１４）に入れて前記凹部（１４）の内部で位置決めすることによって、前記試料（２）を前記ゲル（１）の中で所定位置に位置決めする、請求項５に記載の方法。
7. 前記ゲル体に中空円錐形の凹部（１４）を設け、
   前記試料（２）を前記中空円錐体に入れ、
   前記試料（２）の生存に悪影響を及ぼさない小さい力の作用の下で前記試料（２）を前記中空円錐体の頂点に保持する、
   請求項６に記載の方法。
8. 前記保持装置（３）が回転するときにも重力の作用によって前記試料（２）が前記中空円錐体の頂点に保持されるように前記ゲル体を前記保持装置（３）に固定する、請求項７に記載の方法。
9. 前記試料（２）を前記凹部（１４）に入れた後に前記凹部に透明な媒体を注入し、
   前記注入された媒体によって前記試料（２）を前記中空円錐体の頂点に保持する、
   請求項７に記載の方法。
10. 初めは流体であるが時間の経過によって所定の温度の下で硬化する媒体を前記凹部（１４）に入れ、
    硬化した前記媒体によって前記試料（２）が前記凹部（１４）の内部で所定位置に固定される、
    請求項９に記載の方法。
11. 前記試料（２）を１つずつ入れるための凹部（１４）を備えるゲル体に前記ゲル（１）を予め成形した後に各試料（２）をそれぞれの凹部（１４）に入れて各凹部（１４）内部で位置決めすることによって、複数の試料（２）を前記ゲル（１）の中で位置決めする、請求項６乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 各試料（２）を順次にまたは同時に前記凹部（１４）に入れて前記凹部（１４）内部で位置決めする、請求項１１に記載の方法。
13. 前記試料（２）を入れた後、前記凹部（１４）を個別の蓋または全体を覆う蓋によって閉じる、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 試料（２）を入れるべき凹部（１４）の領域内でまず前記ゲル体を加熱し、
    次いで前記試料（２）を入れ、
    その後、初めは流体であるが時間の経過によって所定の温度の下で硬化する媒体を前記凹部（１４）に入れ、
    その後、前記時間を短縮するべく前記凹部（１４）の領域内で前記ゲル体を冷却する、
    請求項１１または１２に記載の方法。
15. 第１の凹部（１４）の領域内で前記ゲル体を所定の周期で加熱し、
    次いで、前記試料（２）を前記第１の凹部（１４）に入れて当該第１の凹部（１４）の内部で位置決めし、
    その後、前記硬化性の媒体を前記第１の凹部（１４）に注入し、これと同時に第２の凹部（１４）の領域内で前記ゲル（１）を加熱し、
    その後、前記第１の凹部（１４）の領域内で前記ゲル（１）を冷却し、これと同時に試料（２）を前記第２の凹部（１４）に入れて当該第２の凹部（１４）の内部で位置決めし、前記硬化性の媒体を注入し、第３の凹部（１４）の領域内で前記ゲル（１）を予熱し、
    その後、前記第２の凹部（１４）の領域内で前記ゲル（１）を冷却し、これと同時に試料（２）を前記第３の凹部（１４）に入れて位置決めし、前記硬化性の媒体を注入し、第４の凹部（１４）の領域内で前記ゲル（１）を予熱し、
    各凹部（１４）に１つの試料（２）が含まれ、位置決めされ、硬化した前記媒体によって固定されるまで以下同様に続ける、
    請求項１４に記載の方法。
16. 複数の試料（２）を試料リザーバ内に保存し、前記試料リザーバから前記試料（２）を個別に取り出し、各試料（２）を、割り当てられた凹部（１４）に入れ、前記試料（２）の個別化および前記凹部（１４）内への導入が自動的に行われる、請求項６乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
17. まず前記試料（２）を個別化し、
    次いで、前記試料（２）を同じ形状および寸法の個別のゲル体に個別に埋め込み、
    続いて、それぞれ１つの試料（２）を含む前記ゲル体を前記試料空間（２５）内に順次に搬送し、
    試料（２）の検出が終了した後、再び前記試料空間（２５）から搬出される、
    請求項５乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記試料（２）が個別にカニューレを通して、支持装置の外面または内面における所定位置か、毛細管の開口における所定位置か、またはゲル体の中における所定位置に導かれる、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
19. ゲル（１）からなるゲル体の中に試料（２）を埋め込むための方法であって、
    第１の部分量のゲル（１）を、長手方向に沿って分割されたカニューレの第１の半体内に置き、
    次いで、前記第１の部分量の上に試料（２）を載せ、
    その後、前記試料（２）の上に第２の部分量の前記ゲル（１）を載せ、
    前記分割されたカニューレの第２の半体を圧力をかけながら載せ、
    前記両方の半体の間に中空の円筒形が生じる結果、前記ゲル（１）が前記カニューレの内径に相当する外径を有するとともに、その中に前記試料（２）が封じ込められたゲル体として成形される、方法。
20. 硬化性のゲル（１）からなるゲル体に埋め込まれた試料（２）の位置をゲル体の内部の中心に合わせるための方法であって、
    埋め込まれた試料（２）を含むがまだ硬化していない状態のゲル（１）からなるゲル体を、監視ステーション（３３）内に入れ、
    前記監視ステーション（３３）によって、前記ゲル体の中での前記試料（２）の位置を評価し、
    前記評価の結果に応じて、重力の作用の下で前記試料（２）が前記ゲル体の中で所望の位置に沈下するように重力に対して前記ゲル体の向きを調整する、方法。
21. 生体物質（３４）から抽出された部分量を試料（４０）として顕微鏡構成の試料空間内で位置決めするための方法であって、
    生体物質（３４）に向いて鋭利に研がれたカニューレ（３５）の端部（３６）を前記生体物質（３４）に押し入れ、
    前記カニューレ（３５）の内部に移動可能に案内され、押し棒（２８）と接続されたスタンプ（２９）によって、前記生体物質（３４）から前記カニューレを引き抜くときに前記部分量を前記カニューレ（３５）内に保持し、
    前記部分量を含む前記カニューレ（３５）を前記試料空間内に入れ、
    前記押し棒（２８）および前記スタンプ（２９）によって、前記部分量の一部分だけを前記カニューレ（３５）から押し出し、
    前記押し出された部分が試料（４０）として検出され、残りの部分が前記カニューレ（３５）によって保持される、方法。
22. ゲル（１）として、また硬化性の媒体として、アガロースゲルが使用される、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 少なくとも１つの生体試料（２）を、前記試料（２）を検出するために顕微鏡構成の試料空間（２５）内で位置決めするための装置であって、
    それぞれ１つの試料（２）が封じ込められる同じ形状および大きさのゲル体のリザーバ（２３）と、
    顕微鏡構成の試料空間（２５）内にある、それぞれ１つの前記ゲル体用の保持装置（２３）と、
    前記ゲル体リザーバ（２３）から個々のゲル体を取り出し、前記ゲル体を前記保持装置（３）に貯蔵するための取出しおよび貯蔵装置と、
    前記保持装置（３）から前記ゲル体を取り出し、搬出するための取出しおよび搬出装置と、
    を備える装置。
24. 画像評価装置と、
    画像評価の結果に応じて制御可能な分類装置とを備え、前記分類装置によって、前記個々のゲル体が、前記保持装置（３）から取り出された後に、様々な貯蔵ホルダに分けて入れられる、
    請求項２３に記載の装置。
25. 少なくとも１つの生体試料（２）を、前記試料（２）を検出するために顕微鏡構成の試料空間（２５）内で位置決めするための装置であって、
    複数の試料（２）が封じ込められる１つのゲル体と、
    前記ゲル体を受け取る前送り装置とを備え、前記前送り装置の作動により、前記ゲル体が移動されて、前記封じ込められた試料（２）が順次に前記試料空間（２５）に通され、前記試料空間（２５）に通されるときに各試料（２）から３次元像が取得される、装置。
26. 画像評価装置と、
    前送り装置用のモータ駆動装置と、
    前記画像評価装置および前記駆動装置と接続された制御回路とを備え、
    前記制御回路が、
    前記画像評価の終了後に、前記駆動装置に対して制御命令が生成され、前記制御命令に従って前記駆動装置が前送り移動を行うことで前記試料空間（２５）内の前記試料（２）が取り替えられるように設計されている、
    請求項２５に記載の装置。
27. 少なくとも１つの生体試料（２）を、前記試料（２）を検出するために顕微鏡構成の試料空間（２５）内で位置決めするための装置であって、
    それぞれ１つの試料（２）を入れるための凹部（１４）を複数の位置に有するゲル体と、
    試料リザーバから個々の試料（２）を取り出し、前記試料を前記凹部（１４）に装填するための取出しおよび装入装置と、
    前記ゲル体を受け取る前送り装置とを備え、前記前送り装置の作動により前記ゲル体が移動されて、前記凹部（１４）が順次に装填位置（１９）に導かれ、前記装填位置（１９）で前記凹部（１４）にそれぞれ１つの試料（２）が入れられる、装置。
28. 初めは流体であるが後で硬化する媒体を凹部（１４）の形状および大きさに対応する量だけ供給し、前記試料（２）を入れた直後に前記媒体を前記凹部（１４）それぞれに注入するための供給装置を備える請求項２７に記載の装置。
29. 前記ゲル体と熱的に接続された加熱ステーション（２１）および／または冷却ステーション（２２）を備え、前記加熱ステーション（２１）および／または冷却ステーション（２２）が、前記凹部（１４）の１つに前記媒体を注入する前に少なくとも当該凹部（１４）の領域内でゲル（１）を加熱し、および／または前記凹部（１４）の１つに前記媒体を注入した後に少なくとも当該凹部（１４）の領域内でゲル（１）を冷却する、請求項２８に記載の装置。
30. 前送り速度と、加熱および／または冷却温度とが前記媒体の硬化に必要な時間に合わせて調節される、請求項２９に記載の装置。
31. 試料を受け入れるための凹部（１４）を前記ゲル体中で削り出すための切削装置が装備される、請求項２３乃至３０のいずれか１項に記載の装置。
32. 前記切削装置が、前記ゲル（１）の円錐形部分または円柱形部分を前記ゲル体から削り出すための回転刃を備える、請求項３１に記載の装置。
33. 前記切削装置に、前記削り出された凹部（１４）内に単一の試料（２）を供給するためのカニューレが割り当てられる、請求項３２に記載の装置。
34. ゲル（１）からなるゲル体に試料（２）を埋め込むための装置であって、
    ゲル（１）および試料（２）を受け入れるための、長手方向に沿って２つの半体に分割されたカニューレと、
    前記カニューレ（３５）の内部で移動可能に案内され、前記試料（２）を取り囲む１つのゲル体として成形されるゲル（１）を押し出すための押し棒（２８）と接続されたスタンプ（２９）と
    を備える、装置。
35. 硬化性のゲル（１）からなるゲル体に埋め込まれた試料（２）の位置を前記ゲル体の内部で中心に位置合わせするための装置であって、
    回転駆動装置（３２）と接続され、埋め込められた試料（２）を含むがまだ硬化されていないゲル（１）からなる前記ゲル体の中に押し入れられるカニューレ（３１）と、
    前記カニューレ（３１）の周りを囲み、前記ゲル体の内部での前記試料（２）の位置を評価する監視ステーション（３３）と、
    前記回転駆動装置（３２）を制御する制御回路であって、前記評価の結果に応じて、重力の作用により前記試料（２）が前記ゲル体の中で所望の位置に沈下するように重力に対して前記ゲル体の向きを調整する前記制御回路と
    を備える装置。
36. 生体物質（３４）から抽出された部分量を試料（４０）として顕微鏡構成の試料空間内で位置決めするための装置であって、
    生体物質（３４）に向かって鋭利に研がれた端部（３６）を有するカニューレ（３５）と、
    前記カニューレ（３５）の内部で移動可能に案内される棒（２８）と接続されたスタンプ（２９）と、
    を備える装置。

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