CN112300981A - 一种体外培养毛囊的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种体外培养毛囊的方法，包括1）预先提供模拟毛囊细胞体内生长所需的微环境培养结构，2）预备好可促进毛囊生长的培养液，3）人工取出毛囊并放入微环境培养结构内，再加入培养液，4）对步骤3的微培养结构施加外力手段来调节毛干生长，5）对步骤4内的毛囊加入刺激电流促进毛囊生长；通过预先制得培养结构并取下毛囊放入培养液，辅以施加外力及刺激电流，促进毛囊生长，存活率高、生长快培养周期短，有效满足植发需求。

Description

一种体外培养毛囊的方法
技术领域
本发明属于植发领域，特别涉及一种通过体外培养的方法来促进毛囊生长。
背景技术
当今社会飞速发展，在发展的同时也为许多社会人带来不可避免的压力，我国患有脱发症状的患者人数也在逐渐上升，传统的毛囊移植植发是将后枕部存活的毛囊组织通过手术取出，直接移植到脱发部位，其主要缺点在于只能将现有的毛囊进行转移，且在取毛囊手术中会对患者后枕部带来一些不可避免的损伤。
如果能够只需取出患者极少数的毛囊组织，并将现有的毛囊组织体外培养，培养成功后，再对患者移植培养的毛囊，就会大大减少移植手术的复杂程度和工作量，同时也减轻了对患者身体健康的损伤，而组织工程学的发展使再生医学获得了更多的可能性，并将这种构想成为了可能，人类皮肤构建物（HSC）让大量的脱发症患者看到了治愈脱发疾病的美好愿景，也为治疗患有严重皮肤疾病患者提供了可实行的思考方向，如今，该领域存在几个比较大的难题：（1）如何将毛囊重新整合到人类皮肤构建物，并能够提供使其能够较好保存培养的外部微环境；（2）DPC细胞是毛囊重新构造的重要种子细胞，但是它的保存和持续增殖也是亟需解决的问题；（3）如何控制毛囊生长的方向和毛干的粗细程度；为了解决这些问题，我们设计了该项发明。
发明内容
本发明提供一种体外培养毛囊的方法，包括1）预先提供模拟毛囊细胞体内生长所需的微环境培养结构，2）预备好可促进毛囊生长的培养液，3）人工取出毛囊并放入微环境培养结构内，再加入培养液，4）对步骤3的微培养结构施加外力手段来调节毛干生长，5）对步骤4内的毛囊加入刺激电流促进毛囊生长。
作为对本发明的改进，所述微环境培养结构是上半部分为培养基微孔、下半部分为培养基凹槽的模具，所述模具包括上半模具和下半模具，所述上半模具和下半模具均采用3D打印得到，所述上半模具的上底座为扁平圆柱状且直径为4cm、高为0.2cm，所述上底座上的半球体半径为0.3cm，所述半球体上设有圆柱体的微孔企鹅直径为0.2cm、高为1.5cm，所述微孔之间的间隔为0.3cm，所述下半模具的下底座为扁平圆柱且直径为4cm、高为0.2cm，所述下底座上的半球体半径为0.3cm。
作为对本发明的进一步改进，所述培养液为1ug/ml EGCG的10%FBS (胎牛血清)的DEME(含各种氨基酸和葡萄糖)。
作为对本发明的进一步改进，所述人工取出毛囊具体过程为将 hsf细胞(人皮肤成纤维细胞)弃上清，留沉淀，将离心后的hsf细胞与matrigel基质胶充分混合，将混合好的基质倒圆柱体微环境培养结构中，在下部分培养基凹槽中加入DPC细胞，在上部分培养基微孔中加入hacat细胞。
作为对本发明的进一步改进，所述步骤4中的施加外力手段为给微环境培养结构外部施加一定压力，在构建好的微环境培养结构六面贴上ITO玻璃板，在ITO玻璃板上施加1~10N/cm2压强的压力，体系外部施加压力增加细胞之间的接触,调节毛干生长过程的粗细程度。
作为对本发明的进一步改进，所述步骤5中加入刺激电流具体为在微环境培养结构圆柱孔中的10%FBS的DMEM培养液外部的ITO玻璃板上接通电刺激仪器,通入10ua~50ua强度电流，刺激毛囊细胞的生长。
作为对本发明的进一步改进，在刺激仪器上加入负反馈电路，在负反馈电路中加入运算放大器作为控制器件。
本发明的有益效果在于：通过预先制得培养结构并取下毛囊放入培养液，辅以施加外力及刺激电流，促进毛囊生长，存活率高、生长快培养周期短，有效满足植发需求。
附图说明
图1为本发明中上半模具3D侧视图。
图2为本发明中下半模具3D侧视图。
图3为本发明中上半模具横截面图。
图4为本发明中下半模具横截面图。
图5为使用模具后下半部分横截面图。
图6为加入DPC细胞的下半部分培养结构横截面图。
图7为压入模具后的上半部分培养结构横截面图。
图8为取出模具后的上半部分培养结构横截面图。
图9为加入hacat细胞悬液的上半部分培养结构横截面图。
图10为将上下两个部分培养结构整合的横截面图。
图11为向培养结构外部施加压力的截面图。
图12为电刺激仪器通入10ua~50ua强度电流的电路图。
具体实施方式
下面详细说明本发明的优选实施例。
一种体外培养毛囊的方法，包括1）预先提供模拟毛囊细胞体内生长所需的微环境培养结构，2）预备好可促进毛囊生长的培养液，3）人工取出毛囊并放入微环境培养结构内，再加入培养液，4）对步骤3的微培养结构施加外力手段来调节毛干生长，5）对步骤4内的毛囊加入刺激电流促进毛囊生长。
如图1至图4所示，所述微环境培养结构是上半部分为培养基微孔、下半部分为培养基凹槽的模具，所述模具包括上半模具和下半模具，所述上半模具和下半模具均采用3D打印得到，所述上半模具的上底座为扁平圆柱状且直径为4cm、高为0.2cm，所述上底座上的半球体半径为0.3cm，所述半球体上设有圆柱体的微孔企鹅直径为0.2cm、高为1.5cm，所述微孔之间的间隔为0.3cm，所述下半模具的下底座为扁平圆柱且直径为4cm、高为0.2cm，所述下底座上的半球体半径为0.3cm。
其中，所述培养液为1ug/ml EGCG的10%FBS (胎牛血清)的DEME(含各种氨基酸和葡萄糖)。
另外，所述人工取出毛囊具体过程为将 hsf细胞(人皮肤成纤维细胞)弃上清，留沉淀，将离心后的hsf细胞与matrigel基质胶充分混合，将混合好的基质倒圆柱体微环境培养结构中，在下部分培养基凹槽中加入DPC细胞，在上部分培养基微孔中加入hacat细胞。
还有，所述步骤4中的施加外力手段为给微环境培养结构外部施加一定压力，在构建好的微环境培养结构六面贴上ITO玻璃板，在ITO玻璃板上施加1~10N/cm2压强的压力，体系外部施加压力增加细胞之间的接触,调节毛干生长过程的粗细程度。
再有，所述步骤5中加入刺激电流具体为在微环境培养结构圆柱孔中的10%FBS的DMEM培养液外部的ITO玻璃板上接通电刺激仪器,通入10ua~50ua强度电流，刺激毛囊细胞的生长，在刺激仪器上加入负反馈电路，在负反馈电路中加入运算放大器作为控制器件。
具体操作时可参考如下：
获得毛乳头细胞
（1）术前消毒：手术前使用碘伏严格消毒手术器械，铺好无菌巾。
（2）组织获取：切除的组织标本迅速放置于无菌的含有无血清 DMEM 细胞培养液的1.5ml离心管中，盖上盖子。
（3）转移：将上述 1.5ml 离心管放入冰盒中，立即带至实验室。
（4）清洗：在生物安全柜中去除离心管内的DMEM 细胞培养液，使用含抗生素的PBS反复冲洗三遍。
（5）保存：将上述组织放置到含2% FBS 的DMEM 的管子中。
（6）补液：用相应的补充液将装有毛囊的管子内液体补满，拧紧盖子，上下颠倒没有明显气泡即可。
（7）封口：用封口膜将管子缠绕2-3圈。
（8）收到人毛囊组织样本后，置于生物安全柜中。
（9）弃去PBS，洗涤2-3次，加入2.4 U/mL的DispaseⅡ，4 ℃消化过夜。
（10）吸去DispaseⅡ，PBS冲洗两遍，将毛囊组织样本转移至含PBS的10 cm细胞培养皿中。挤出消化松动的毛干，并以PBS冲洗去除毛干。
（11）在上述组织中加入5倍体积的0.2% I型胶原酶溶液，并转移至15 mL离心管中，放入恒温培养箱中，37 ℃轻微震荡消化0.5 h。
（12）纯化毛囊乳突细胞：以枪头旋转式搅拌，使纤维纠缠于枪头上，1500 rpm 离心上述消化后产物5 min，保留管底沉淀并以 DMEM 稀释 。吹吸沉淀的纤维组织并不断搅拌，使包裹在纤维网内的毛乳头释放到DMEM 内，1500 rpm离心5 min，弃上清，留沉淀。重复上述步骤3-4 次，即可得到纯化的毛囊乳突细胞。
4.制备培养基与培养液
（1）下半部分培养基的制作：将hsf细胞以1500 rpm离心5 min，弃上清，留沉淀，将离心后的hsf细胞与matrigel基质胶充分混合，比例为每毫升matrigel基质胶含1.25×105个hsf细胞，将混合好的基质倒入直径4cm，高6cm的圆柱体培养皿中，并将下半部分模具对准培养皿上方慢慢压入，直到半球体完全压入基质中为止，将带有模具的培养皿放置于37°C恒温箱中30分钟左右,基质凝固，取出培养皿，缓缓移除下半部分模具，得到如图5所示的下半部分培养基。
（2）上半部分培养基的制作：将hsf细胞以1500 rpm离心5 min，弃上清，留沉淀，将离心后的hsf细胞与matrigel基质胶充分混合，比例为每毫升matrigel基质胶含1.25×105个hsf细胞，将混合好的基质倒入直径4cm，高3cm的圆柱体培养皿中，并将上半部分模具对准培养皿上方慢慢压入，直到微孔完全接触到培养皿底部为止，如图7所示，将带有模具的培养皿放置于37°C恒温箱中30分钟左右,基质凝固，取出培养皿，缓缓移除上半部分模具，如图8所示。
将构建体在具有10%FBS的DMEM中培养过夜,以形成聚集体,然后在向每个微孔中添加约10x105个hacat细胞(人永生化角质形成细胞)悬液，由于毛细作用，悬液停留在微孔中，如图9所示。
5.以适当密度接种毛囊乳突细胞
向下半部分基质添加密度为每微孔3000个DPC的100ul DPC细胞悬浮液，接种完毕后，使用镊子将上半部分构建体缓慢移入下半部分培养皿中，轻轻地压合上下两部分，使hacat细胞悬液与DPC细胞充分接触，如图10所示。
6.加入培养液
在10% FBS的DMEM 液体中加入1ug/ml的EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）水溶液将构建体在培养，24 h 后更换相同的培养液，进一步去除悬浮的上皮细胞及其他杂质，继续培养，每 2-3 天更换培养液一次，约第七天亚融合状态下传代培养。
7.外部施加一定的压力
根据增殖增长和密度需求，在构建好的培养体系六面贴上4cmx4cm ，厚0.5cm的ITO玻璃板，在培养过程中，在ITO玻璃板上对培养基微囊模型施加1N/cm2压强的压力，如图11所示。
8. 使用直流电刺激毛囊细胞生长，在构建体圆柱孔中的10%FBS的DMEM培养液外部ITO玻璃上接通电刺激仪,通入50ua强度电流，刺激毛囊细胞的生长。
3.刺激电路
当接收到微小直流电刺激时，毛囊细胞内部的电解质将发生电离和电解等极化作用，电极间电阻增大，为达到维持电流一定的目的，我们选用负反馈电路，在负反馈电路中加入运算放大器作为控制器件，设计电路如图12所示，该电路由R_1-R_7，R_X八个电阻，C_1，C_2两个电容和三个运算放大器组成，改电路能够通过改变可变电阻R_X来选择在10-50ua的恒定电流，该恒定电流源提供的可选电流强度能够达到uA级别，代表毛囊细胞培养体系的负载电阻R_L的阻值在一定取值内也不会因为恒定电流的改变而改变。
如三个运算放大器都在理想状态下工作，则按照图12所示
I_L=R_2 R_4 V_i/[R_1 R_3 R_x+R_1 R_L （R_3-R_2 R_4/R_5）
当R_3 R_5=R_2 R_4
则I_L=R_2 R_4 V_i/R_1 R_3 R_X
V_L=R_L I_L=R_2 R_4 R_L V_i/（R_1 R_3 R_X）
其中,V_i为输入控制电压，V_L为负载电阻R_L的电压，I_L为流过负载电阻R_L的电流（即刺激电流），R_X为选择电阻。其中R_L代表毛囊细胞培养环境。
选择设置电流强度分别为10UA，30Ua和50uA，每次通电刺激时长为3小时，每日一次，持续一周。
本发明的有益效果在于：通过预先制得培养结构并取下毛囊放入培养液，辅以施加外力及刺激电流，促进毛囊生长，存活率高、生长快培养周期短，有效满足植发需求。
上述实施例并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。

Claims (7)

1.一种体外培养毛囊的方法，其特征在于：包括1）预先提供模拟毛囊细胞体内生长所需的微环境培养结构，2）预备好可促进毛囊生长的培养液，3）人工取出毛囊并放入微环境培养结构内，再加入培养液，4）对步骤3的微培养结构施加外力手段来调节毛干生长，5）对步骤4内的毛囊加入刺激电流促进毛囊生长。
2.根据权利要求1所述的一种体外培养毛囊的方法，其特征在于：所述微环境培养结构是上半部分为培养基微孔、下半部分为培养基凹槽的模具，所述模具包括上半模具和下半模具，所述上半模具和下半模具均采用3D打印得到，所述上半模具的上底座为扁平圆柱状且直径为4cm、高为0.2cm，所述上底座上的半球体半径为0.3cm，所述半球体上设有圆柱体的微孔企鹅直径为0.2cm、高为1.5cm，所述微孔之间的间隔为0.3cm，所述下半模具的下底座为扁平圆柱且直径为4cm、高为0.2cm，所述下底座上的半球体半径为0.3cm。
3.根据权利要求1所述的一种体外培养毛囊的方法，其特征在于：所述培养液为1ug/mlEGCG的10%FBS (胎牛血清)的DEME(含各种氨基酸和葡萄糖)。
4.根据权利要求1所述的一种体外培养毛囊的方法，其特征在于：所述人工取出毛囊具体过程为将 hsf细胞(人皮肤成纤维细胞)弃上清，留沉淀，将离心后的hsf细胞与matrigel基质胶充分混合，将混合好的基质倒圆柱体微环境培养结构中，在下部分培养基凹槽中加入DPC细胞，在上部分培养基微孔中加入hacat细胞。
5.根据权利要求1所述的一种一种体外培养毛囊的方法，其特征在于：所述步骤4中的施加外力手段为给微环境培养结构外部施加一定压力，在构建好的微环境培养结构六面贴上ITO玻璃板，在ITO玻璃板上施加1~10N/cm2压强的压力，体系外部施加压力增加细胞之间的接触,调节毛干生长过程的粗细程度。
6.根据权利要求1所述的一种体外培养毛囊的方法，其特征在于：所述步骤5中加入刺激电流具体为在微环境培养结构圆柱孔中的10%FBS的DMEM培养液外部的ITO玻璃板上接通电刺激仪器,通入10ua~50ua强度电流，刺激毛囊细胞的生长。
7.根据权利要求6所述的一种体外培养毛囊的方法，其特征在于：在刺激仪器上加入负反馈电路，在负反馈电路中加入运算放大器作为控制器件。
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