RU2636464C2

RU2636464C2 - Способ получения и использования тканеинженерных конструкций на основе прогениторных клеток для лечения заболеваний сердца

Info

Publication number: RU2636464C2
Application number: RU2015150091A
Authority: RU
Inventors: Константин Владимирович Дергилев; Зоя Ивановна Цоколаева; Павел Игоревич Макаревич; Ирина Борисовна Белоглазова; Екатерина Сергеевна Зубкова; Мария Александровна Болдырева; Елизавета Израилевна Ратнер; Елена Викторовна Парфенова
Priority date: 2015-11-23
Filing date: 2015-11-23
Publication date: 2017-11-23
Also published as: RU2015150091A

Abstract

Изобретение относится к области клеточной и тканевой инженерии, конкретно к созданию тканеинженерных конструкций на основе прогениторных клеток миокарда и лечению заболеваний сердца. Способ включает высаживание на культуральные чашки прогениторных клеток сердца из расчета 100000-1000000 клеток на смплощади поверхности, культивирование до формирования микроткани при температуре 34-37°C в течение 12-240 часов в среде роста, открепление микроткани сердца от поверхности культуральной чашки, которое осуществляют посредством обработки микроткани сначала раствором, обеспечивающим удаление двухвалентных катионов кальция и магния при температуре раствора 18-37°C, затем нейтральным раствором при температуре 2-4°C с последующим механическим снятием микроткани с поверхности культуральной чашки. Полученную микроткань используют преимущественно для лечения заболеваний сердца, связанных с повреждением стенки левого и/или правого желудочков сердца при инфаркте миокарда, посредством трансплантации микроткани на зону повреждения в период фазы ранней дилатации стенки левого желудочка или в течение первых двух недель после инфаркта миокарда, после чего осуществляют послойное ушивание раны. Изобретение позволяет по упрощенной технологии получать микроткань сердца высокого качества за счет сохраненной архитектоники и межклеточных взаимодействий. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной и тканевой инженерии, и может быть использовано в медицине и ветеринарии для создания тканеинженерных конструкций (ТИК) (или микроткани сердца) на основе прогениторных клеток миокарда, лечения заболеваний сердца, моделирования патологических состояний, а также изучения механизмов межклеточных взаимодействий и регенерации миокарда.

Уровень техники

Репаративная регенерация является широко распространенным механизмом восстановления органов и тканей в организме человека и животных. Однако в ряде случаев, например, при обширных повреждениях (инфаркт миокарда и др.), хронических заболеваниях, старении, естественных компенсаторных реакций оказывается недостаточно, что ведет к нарушению функции и прогрессированию заболеваний. В последние годы появились убедительные данные о том, что тканевая инженерия может стать основой для восстановления и замещения поврежденных органов и тканей. Задачей тканевой инженерии является конструирование и выращивание вне организма человека тканевых эквивалентов, состоящих из собственных или донорских клеток и биосовместимой «натуральной» и/или синтетической матрицы, комбинация которых воспроизводит трехмерную структуру ткани. Возможности тканевой инженерии существенно расширяются за счет применения стволовых/прогениторных клеток организма, присутствующих во многих органах и участвующих в обновлении дифференцированных тканеспецифичных клеток.

Из уровня техники известно, что для задач тканевой инженерии могут быть использованы стволовые/прогениторные клетки, получаемые из костного мозга (гематопоэтические и мезенхимальные стромальные стволовые клетки, мультипотентных взрослых прогениторных клеток (МАРС клетки) и клетки SP-популяции, циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток (из периферической крови или костного мозга) и скелетных миобластов [Carvalho Е, Verma Р, Hourigan К, Banerjee R. Myocardial infarction: stem cell transplantation for cardiac regeneration. Regen Med. 2015 V. 7. - P. 13-26; Stoltz JF, de Isla N, Li YP, Bensoussan D, Zhang L, Huselstein C, Chen Y, Decot V, Magdalou J, Li N, Reppel L, He Y. Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century. Stem Cells Int. 2015]. Однако в результате проведенных экспериментальных и клинических исследований не было показано достаточно высокой эффективности клеточной терапии сердечной недостаточности, и, что самое главное, не была подтверждена возможность замещения утраченного миокарда за счет дифференцировки трансплантированных клеток (Lipinski MJ, Biondi-Zoccai GG, Abbate A, Khianey R, Sheiban I, Bartunek J, Vanderheyden M, Kim HS, Kang HJ, Strauer BE, Vetrovec GW. Impact of intracoronary cell therapy on left ventricular function in the setting of acute myocardial infarction: a collaborative systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials. J Am Coll Cardiol. 2007 Oct 30; 50(18):1761-7; Rubart M, Field LJ. Stem cell differentiation: cardiac repair. Cells Tissues Organs. 2008; 188(1-2):202-11). Эффекты, наблюдаемые при трансплантации стволовых клеток, были обусловлены, в основном, их паракринной активностью, подавляющей апоптоз кардиомиоцитов и стимулирующей ангиогенез и активность собственных резидентных клеток сердца (Pavo N, Charwat S, Nyolczas N, Jakab A, Murlasits Z, Bergler-Klein J, Nikfardjam M, Benedek I, Benedek T, Pavo IJ, Gersh BJ, Huber K, Maurer G,

M. Cell therapy for human ischemic heart diseases: critical review and summary of the clinical experiences. J Mol Cell Cardiol. 2014 Oct; 75:12-24). Более перспективным в настоящий момент представляется использование резидентных прогениторных клеток сердца (ПКС). ПКС локализуются в зрелом миокарде и участвуют в процессах поддержания клеточного гомеостаза взрослого органа путем замены стареющих/гибнущих клеток миокарда, а также восстанавливают клетки сердца после острых (инфаркт миокарда) и хронических повреждений (ИБС, кардиомиопатии) (Bearzi С, Rota М, Hosoda Т, Tillmanns J, Nascimbene A, De Angelis A, Yasuzawa-Amano S, Trofimova I, Siggins RW, Lecapitaine N, Cascapera S, Beltrami AP, D’Alessandro DA, Zias E, Quaini F, Urbanek K, Michler RE, Bolli R, Kajstura J, Leri A, Anversa P. Human cardiac stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2007 Aug 28; 104(35):14068-73; De Angelis Al, Piegari E, Cappetta D, Marino L, Filippelli A, Berrino L, Ferreira-Martins J, Zheng H, Hosoda T, Rota M.Urbanek K, Kajstura J, Leri A, Rossi F, Anversa P. Anthracycline cardiomyopathy is mediated by depletion of the cardiac stem cell pool and is rescued by restoration of progenitor cell function. Circulation. 2010 Jan 19; 121(2):276-92.). Перспективность использования ПКС для лечения пациентов с заболеваниями сердца подтверждается результатами проведенных клинических исследований SCIPIO (Bolli R, Chugh AR, D’Amario D, Loughran JH, Stoddard MF, Ikram S, Beache GM, Wagner SG, Leri A, Hosoda T, Sanada F, Elmore JB, Goichberg P, Cappetta D, Solankhi NK, Fahsah I, Rokosh DG, Slaughter MS, Kajstura J, Anversa P. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.Lancet. 2011 Nov 26; 378(9806): 1847-57) и CADUCEUS (Makkar RR1, Smith RR, Cheng K, Malliaras K, Thomson LE, Berman D, Czer LS,

L, Mendizabal A, Johnston PV, Russell SD, Schuleri KH, Lardo AC,Gerstenblith G,

E. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 2012 Mar 10; 379(9819):895-904). Несмотря на видимые преимущества ПКС перед другими типами клеток, применяемых для кардиомиопластики (Koninckx R,

A, Windmolders S, Carlotti F, Mees U, Steels P, Rummens JL, Hendrikx M, Hensen K. Mesenchymal stem cells or cardiac progenitors for cardiac repair? A comparative study. Cell Mol Life Sci. 2011 Jun; 68(12):2141-56), возможность их широкого применения остается ограниченной. Существующие способы доставки клеточного материала в миокард (интрокоронарное или интрамиокардиальное введение) далеки от совершенства. Они не позволяют избежать повреждения клеток и обеспечить хорошую выживаемость клеточного материала после трансплантации. Альтернативой этим методам может служить использование тканеинженерных конструкций микроткани сердца (ТИК), созданной на основе низкодифференцированных стволовых клеток или клеток преддифференцированных в специфические сердечные клетки. ТИК представляет собой одно-/многослойные клеточные структуры, состоящие из клеток одного или нескольких видов и наработанного ими внеклеточного матрикса или искусственного матрикса. Эпикардиальная трансплантация стволовых клеток в составе ТИК является более эффективным и безопасным методом в сравнении с прямым введением клеток в миокард с помощью инъекций. ТИК снимают ограничения, связанные с объемом для инъекций, что позволяет проводить доставку большего количества клеток. Преимуществами использования стволовых клеток в виде ТИК является сохранение клеточных рецепторов, что обеспечивает более эффективную адгезию клеточных имплантов к поврежденному миокарду. Кроме того, способ создания ТИК дает возможность формировать in vitro многослойные клеточные конструкции с сохраненной архитектоникой и межклеточными взаимодействиями, что должно повлиять на возможность интеграции в поврежденный миокард. ТИК, в составе которой присутствуют резидентные ПКС, создают платформу для формирования новых кардиомиоцитов, которые будут интегрированы в поврежденный миокард левого желудочка, что позволит восстановить его стенку и предотвратить дальнейшее ремоделирование и развитие сердечной недостаточности. Образование межклеточных контактов новообразованных клеток с клетками реципиента будет способствовать развитию синхронных сокращений, что, возможно, будет вносить вклад в сократительную способность левого желудочка. Нельзя также исключить возможность образования новых клеток сосудов из c-kit+VEGFR+ПКС и/или прорастание существующих сосудов в ТИК с образования полноценной функциональной единицы сердца. Определенную роль в этом процессе могут выполнять ростовые факторы и цитокины, секретируемые стволовыми клетками сердца в норме и в условиях гипоксии.

Из уровня техники известен способ получения микроткани сердца путем культивирования эмбриональных кардиомиоцитов цыпленка в 96-луночных U-образных культуральных чашках (Garzoni LR, Adesse D, Soares MJ, Rossi MI, Borojevic R, de Meirelles Mde N. Fibrosis and hypertrophy induced by Trypanosoma cruzi in a three-dimensional cardiomyocyte-culture system. J Infect Dis. 2008 Mar 15; 197(6):906-Культивирование U-образных чашках способствует формированию сфероидов, состоящих из кардиомиоцитов. Полученные сфероиды инфицировали трипаносомой крузи (Tripanosoma Cruzi) для стимуляции продукции белков внеклеточного матрикса и индукции гипертрофии кардиомиоцитов. Сформированную МТС предложено использовать для изучения фармакологических препаратов, препятствующих развитию фиброза и гипертрофии миокарда.

Из уровня техники известны другие способы получения микроткани путем увеличения степени межклеточных взаимодействий и формирования объемных клеточных агрегатов. Для этой цели использованы культивирование на специальных вращающихся шейкерах (S.B. Watzka, et al. Selection of viable cardiomyocytes for cell transplantation using three-dimensional tissue culture Transplantation, 70 (2000), pp. 1310-1317; Kelm, J.M. et al. Design of artificial myocardial microtissues. Tissue Eng 83 (2003), pp. 173-180; K.S. Furukawa, et al. Formation of human fibroblast aggregates (spheroids) by rotational culture Cell Transplant., 10 (2001), pp. 441-445), в гипоадгезионных условиях (S. Kale, et al. Three-dimensional cellular development is essential for ex vivo formation of human bone Nat. Biotechnol., 18 (2000), pp. 954-958), с центрифугированием клеток при 500 g (А. Muraglia, et al. Formation of a chondro-osseous rudiment in micromass cultures of human bone-marrow stromal cells J. Cell Sci., 116 (2003), pp. 2949-2955), культивирование на пористых мембранах (S.B. Watzka, et al. Selection of viable cardiomyocytes for cell transplantation using three-dimensional tissue culture Transplantation, 70 (2000), pp. 1310-1317), культивирование в условиях естественной гравитации по типу «висячей капли» (Rismani Yazdi S et al. Adding the ‘heart’ to hanging drop networks for microphysiological multi-tissue experiments. Lab Chip.2015 Nov 7; 15(21):4138-47). Существенным недостатком описанных решений является использование эмбриональных или ранних постнатальных клеток сердца для получения микроткани из зрелых кардиомиоцитов, что не может быть использовано для человека по этическим соображениям. Кроме того, способы формирования клеточных агрегатов основаны на грубом механическом воздействии на клетки, что может оказывать существенное влияние на их выживаемость и сроки культивирования.

Из уровня техники известен способ формирования микроткани сердца путем культивирования в биореакторе (Miklas JW et al. Bioreactor for modulation of cardiac microtissue phenotype by combined static stretch and electrical stimulation. Biofabrication. 2014 Jun; 6(2):024113). В основе изобретение лежит использование неонатальных кардиомиоцитов крысы, культивированных в коллагеновом геле при постоянной электрической и механической стимуляции в условиях биореактора. Существенным ограничением данного метода является применение неонатальных клеток сердца, коллагенового геля и необходимость приобретения дорогостоящего биореактора с соответствующими модулями, что существенно ограничивает применение данной модели в медицине.

Наиболее близким к заявляемому решению является способ получения микроткани сердца (WO 2013151755), в основе которого лежит использование культуральных чашек с наноструктурированной поверхностью, имеющей параллельные борозды и выступы. Наноструктурированная поверхность чашек способствует созданию особых анизотропных условий, позволяющих моделировать микроокружение в ткани взрослого сердца. В соответствии с изобретением низкодифференцированные клетки-предшественники кардиомиоцитов, полученные из эмбриональных или индуцированных стволовых клеток ,предлагается высаживать на культуральные чашки с наноструктурированным покрытием для формирования микроткани сердца. Культивирование в данных условиях способствует формированию слоя клеток (клеточной накладки), экспрессирующих транскрипционные факторы и белки зрелых кардиомиоцитов, взаимодействующих между собой через щелевые коннексинсодержащие контакты. Клетки в составе клеточной накладки формируют электромеханическое сопряжение и способны передавать волну возбуждения при соответствующей стимуляции.

Однако данный способ имеет ряд недостатков в сравнении с заявляемым решением.

1) В изобретении предложено использовать клетки-предшественники, полученные из эмбриональных (ЭСК) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), применение которых сопряжено с этическими проблемами и возможной иммунологической несовместимостью их дифференцированного потомства, что существенно ограничивает их практическое применение.

2) При использовании низкодифференцированных предшественников кардиомиоцитов из ЭСК и иПСК возникает необходимость в тестировании их тератогенных и онкогенных свойств при каждом использовании.

3) При использовании низкодифференцированных предшественников кардиомиоцитов из ЭСК и иПСК возникает необходимость в подборе условий и осуществлении контроля уровня специфической дифференцировки при каждом использовании.

4) При использовании низкодифференцированных предшественников кардиомиоцитов из ЭСК и иПСК возникает необходимость в подборе маркеров и условий для проведения селекции строго определенной популяции клеток из гетерогенной культуры.

5) Для получения микроткани сердца требуются специальное оборудование и разработка технологии наноструктурирования поверхности культуральных чашек.

6) Высокая стоимость чашек с наноструктурированной поверхностью.

7) Сложность в стандартизации процедур наноструктурирования поверхности и подготовки исходного клеточного материала (вариабельность в свойствах клонов ЭСК и иПСК).

8) Использование коммерческих чашек с наноструктурированным покрытием существенно ограничивает возможность получения тканеинженерной конструкции большой площади в сравнении с площадью культуральной чашки.

9) Необходимость в постоянном контроле процесса дифференцировки клеток на чашках с наноструктурированной поверхностью.

10) Длительность получения микроткани сердца (способ включает следующие этапы: получение индуцированных плюрипотентных клеток-характеристика клеток-отбор предшественников кардиомиоцитов-характеристика клеток - культивирование на чашках с наноструктурированной поверхностью - характеристика клеток).

Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения является создание усовершенствованного способа получения тканеинженерных конструкций (микроткани сердца) на основе прогениторных клеток миокарда. Полученная заявляемым способом микроткань сердца при ее трансплантации повышает эффективность лечения заболеваний сердца по сравнению с использованием тканеинженерных конструкций, полученных известными способами. Получаемые микроткани сердца также могут быть использованы для моделирования патологических состояний, изучения механизмов межклеточных взаимодействий и регенерации миокарда.

Поставленная задача решается тем, что способ получения микроткани сердца на основе прогениторных клеток сердца включает получение культуры прогениторных клеток сердца с последующим их высаживанием на культуральные чашки из расчета 100000-1000000 клеток на см² площади поверхности и культивированием до формирования микроткани при температуре 34-37°C в течение 12-240 часов в среде роста, с последующим откреплением микроткани сердца от поверхности культуральной чашки, которое осуществляют посредством обработки микроткани сначала раствором, обеспечивающим удаление двухвалентных катионов кальция и магния при температуре буферного раствора +18 - +37°C, затем нейтральным раствором при температуре +2 - +4°C с последующим механическим снятием микроткани с поверхности культуральной чашки.

В способе могут быть использованы культуральные чашки диаметром 10-100 мм без покрытия или с покрытием из коллагена, и/или фибронектина, и/или ламинина, и/или желатина, и/или фибрина в количестве 0,1-1000 мкг/см².

В качестве среды роста предпочтительно используют среду, содержащую 0,5-10% ФБС, 1-100 нг/мл bFGF, 1-100 нг/мл EGF, 2% В27, 1-5х инсулин-трансферрин селенита, например среду DMEM F12, или IMDM, или F12, или RPMI, или MEM, или DMEM, или Myelocult. Среда роста может дополнительно содержать 0,01-3% пенициллина-стрептомицина, и/или 0,01-1 мМ 2-меркаптоэтанола, и/или 0,1-5 мМ Л-глутамина.

Перед откреплением микроткани сердца от поверхности культуральной чашки ее, как правило, промывают раствором для удаления следовых количеств среды роста при температуре буферного раствора +18 - +37°C. Для этого может быть использован раствор Хэнкса, или раствор Эрла, или раствор Дульбекко.

В качестве раствора, обеспечивающего удаление двухвалентных катионов кальция и магния, может быть использован раствор Версена, при этом промывку раствором осуществляют в 1-10 этапов.

В качестве нейтрального (или «холодного») раствора используют раствор Хэнкса без Са++Mg++, или раствор Эрла, или раствор Дульбекко.

В одном из вариантов осуществления для механического снятия с поверхности культуральной чашки микроткань одним неотрывным движением обводят по периметру культуральной чашки для отсоединения ее краев от бортов чашки, затем движениями, направленными от периферии микроткани к центру, добиваются отслойки микроткани от чашки, после отсоединения 80-90% микроткани от поверхности культуральной чашки аккуратными постукивающими движениями по дну чашки добиваются его флотации в фосфатно-солевом буфере. Для механического снятия микроткани культуральную чашку помещают на лед.

Сущность заявленного способа лечения заболеваний сердца, связанных с повреждением стенки левого и/или правого желудочков сердца при инфаркте миокарда, заключается в том, что в период фазы ранней дилатации стенки левого желудочка или в течение первых двух недель после инфаркта миокарда осуществляют трансплантацию микроткани, полученной по представленному выше способу, при этом имикроткань на зону повреждения наносят поверхностью, которая при культивировании размещалась на культуральной чашке, после чего осуществляют послойное ушивание раны. Ушивание раны, как правило, осуществляют через 5-40 минут после нанесения микроткани на зону повереждения, при этом микротканью сердца покрывают не менее 10-100% зоны повреждения.

Техническим результатом изобретения является получение in vitro ТИК (микроткани сердца или имплантата) высокого качества за счет сохраненной архитектоники и межклеточных взаимодействий при упрощении технологии получения. Технический результат достигается совокупностью существенных признаков, включающих используемый состав исходных клеток; условия формирования микроткани, при которых клетки не погибают в процессе взаимодействия между собой, при этом изменяют свой секреторный профиль, начиная больше синтезировать внеклеточного матрикса, что исключает необходимость внесения в состав получаемого продукта синтетического матрикса (который должен после трансплантации не вызывать иммунного ответа (быть биоразлагаемым)), а также при которых клетки вступают в дифференцировку в направлении кардиомиоцитов и клеток сосудов; а также признаков, характеризующих условия открепления сформированной на чашке Петри микроткани, при которых минимизируется риск разрушения матрикса и межклеточных взаимодействий в процессе снятия ТИК с поверхности культуральной чашки, что приводит к увеличению выживаемости клеток в составе имплантата in vitro и in vivo, активацию кардио- и эндотелиальной дифференцировки ПКС в составе конструкции, более эффективную адгезию микроткани к поврежденному миокарду, высокую степень интеграции имплантата в ткань миокарда с формированием графта, содержащего сосуды и кардиомиоциты.

В заявляемом изобретении матрикс, формируемый в процессе осуществления способа, является продуктом, вырабатываемым самими клетками, который обеспечивает, в т.ч. выживаемость клеток. Существенным условием формирования качественной ТИК является плотность посадки культуры прогениторных клеток сердца на поверхность культуральной чашки - от 100000 до 1000000 клеток на см². При меньших значениях плотности не будет формироваться целостная конструкция трансплантата, позволяющая переносить ее с одной чашки на другую без повреждения архитектоники и межклеточных взаимодействий, при больших значения плотности посадки клетки ухудшаются параметры получаемой микроткани (клетки не способны взаимодействовать с поверхностью, распластываться и синтезировать достаточное количество белков внеклеточного матрикса, кроме того, возникает недостаток факторов для роста клеток из сред культивирования) в связи с тем, что продукты распада одних клеток начинают подавлять жизнеспособность других клеток.

Кроме того, заявляемое изобретение характеризуется следующими преимуществами:

- использование прогениторных клеток сердца в качестве основы для создания микроткани сердца, которые наряду с паракринным действием способны к мультипотентной дифференцировки в кардиомиоциты и клетки сосудов;

- возможность получения микроткани сердца без использования чашек с наноструктурированной поверхностью, соответствующего оборудования для его нанесения или готовых коммерческих чашек с покрытием специфическими полимерами;

- возможность получения микроткани сердца произвольной площади без учета ограничений, связанных с размером коммерчески доступных наноструктурированных чашек или чашек с полимерным покрытием;

- высокая скорость открепления микроткани сердца от поверхности культуральной чашки с сохранением жизнеспособности клеток и целостности наработанного внеклеточного матрикса;

- возможность получения васкуляризированной микроткани сердца за счет ангиогенной дифференцировки составляющих клеток;

- возможность повышения интеграционной способности и электромеханического сопряжения конструкции с тканью миокарда за счет формирования кардиомиоцитоподобных клеток;

- возможность формирования «функциональной единицы» сердца из спецализированных клеток сердца, как модели для фармакологических исследований и/или изучения механизмов межклеточных взаимодействий и регенерации миокарда.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 представлены основные этапы получения с-kit + ПКС крысы. А - эксплант на поверхности культуральной чашки (3 день) культивирования; Б - образование монослоя фибробластоподобных клеток вокруг экспланта на 7 день культивирования; В - появления округлых клеток вокруг экспланта на 12 день культивирования; Г - c-kit + клетки через 24 часа после иммуномагнитной селекции; Д - c-kit + клетки через 72 часа после иммуномагнитной селекции; Е - культура c-kit + клеток через 10 дней культивирования.

На фигуре 2 представлена сформированная ТИК (микроткань сердца) на основе с-kit + ПКС. А - частичное открепление накладки от поверхности культуральной чашки после кратковременной обработки раствором Версена и механического открепления краев; Б - клеточная накладка после открепления от поверхности культуральной чашки; В - структура клеточной накладки при 10х увеличении.

На фигуре 3 представлены срезы микроткани сердца. А - окрашивание гемотоксилин-эозином; Б - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к коннексину 43 и актину. Коннексин 43 отмечен стрелками; В - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к Ki-67 и актину. Пролиферирующие клетки отмечены стрелками; Г - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к каспазе 3 и актину; Д - иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к Gata 4. Клетки, вступившие в дифференцировку, отмечены стрелками.

На фигуре 4 представлена ТИК (микроткань сердца) на основе ПКС после трансплантации на ишемизированный миокард крысы.

На фигуре 5 представлена васкуляризация ТИК (микроткани сердца) на 14 день после трансплантации. А - иммунофлуоресцентное окрашивание ткани миокарда крысы антителами к маркеру эндотелия сосудов CD31. Сформированные сосуды отмечены стрелками. Б - иммунофлуоресцентное окрашивание ткани миокарда крысы антителами к маркеру гладкомышечных клеток сосудов гладкомышечному актину. Сформированные сосуды отмечены стрелками. Трансплантированные клетки в составе накладки помечены Cell Tracker CM-DIL.

На фигуре 6 представлены признаки кардиомиоцитарной дифференцировки ПКС в составе ТИК (микроткани сердца) на 14 день после трансплантации. А - иммунофлуоресцентное окрашивание ткани миокарда крысы антителами к маркеру клеток-предшественников кардиомиоцитов Nkx 2,5. Клетки, вступившие в дифференцировку, отмечены стрелками. Б - иммунофлуоресцентное окрашивание ткани миокарда крысы антителами к маркеру зрелых кардиомиоцитов - тяжелые цепи миозина β. Новообразованные кардиомиоциты отмечены стрелками. Трансплантированные клетки в составе накладки помечены Cell Tracker CM-DIL.

Осуществление изобретения

В рамках настоящего изобретения под тканеинженерной конструкцией (микротканью сердца) понимается одно-/многослойные клеточные структуры, которые также в литературе встречаются как тканевые эквиваленты, клеточные конструкции, клеточные имплантаты, клеточные «заплатки».

Основой для создания микроткани сердца выступают прогениторные клетки сердца (ПКС). Термином ПКС обозначается популяция клеток миокарда, которые способны к самообновлению и дифференцировке в функционирующие клетки сердца. Кроме того, ПКС способны секретировать ростовые факторы и цитокины, которые обеспечивает выживаемость клеток, препятствуют развитию гипертрофии кардиомиоцитов и фиброза в зоне повреждения. Для получения культуры ПКС необходимо выполнение 2 этапов: получение первичной клеточной суспензии и проведение селекции строго определенной популяции клеток. Суспензия клеток может быть получена из образцов миокарда человека и животных с помощью одного или комбинации методов, например ферментативной диссоциации ткани, методом эксплантной культуры, ретроградной перфузией сердца по Лангендорфу. Следующим этапом получения ПКС является проведение иммуномагнитной селекции/клеточного сортинга с антителами к специфическим маркерам, например: c-kit (CD117) и/или sca-1/sca-1like и/или Islet-1 и/или SSEA-4 или культивирование в виде клеточных агрегатов (клетки кардиосфер). Для последующей посадки на культуральные чашки для формирования микроткани сердца ПКС могут быть взяты 1-10 пассажей. В одном из вариантов осуществления изобретения культура ПКС может быть получена по технологии, подробно представленной в материалах патента на изобретение № RU 2505602 «Способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего из образцов миокарда».

Для получения ТИК (микроткани сердца) ПКС высаживают на культуральные чашки °°°Петри диаметром 10-100 мм из расчета 100000-1000000 кл/см² площади поверхности без покрытия. Культивирование клеток проводят при температуре 34-37°C в атмосфере 5% CO₂в течение 12-240 часов в среде, содержащей 0,5-10% ФБС, 1-100 нг/мл bFGF, 1-100 нг/мл EGF, 2% В27, 1-5х инсулин-трансферрин селенита. Наиболее предпочтительным является культивирование ПКС в течение 72-240 часов (в зависимости от требуемой толщины тканеинженерной конструкции) в среде DMEM F12 («Invitrogen», США), содержащей 10% ФБС, 1-100 нг/мл bFGF, 1-100 нг/мл EGF, 2% В27, 1-5х инсулин-трансферрин селенита или IMDM, F12, RPMI, MEM, DMEM, Myelocult. При этом среда дополнительно может содержать 0,01-3 об.% пенициллина-стрептомицина и/или 0,01-1 мМ 2-меркаптоэтанола и/или 0,1-5 мМ Л-глутамина. Культивирование ПКС в состоянии высокой плотности в специальной среде способствует формированию межклеточных взаимодействий, активации продукции белков внеклеточного матрикса и индукции кардиомиоцитарной и эндотелиальной дифференцировки клеток. Таким образом происходит формирование 3D многослойной клеточной конструкции (микроткани сердца), состоящей из белков синтезированного внеклеточного матрикса и клеток преддифференцированных в карди- и эндотелиальном направлениях.

После окончания процесса культивирования полученную ТИК (микроткань сердца) промывают в 2-10 этапов теплым раствором Хэнкса (HBSS) без Са++ Mg++ (температура буферного раствора +18 - +37C) для удаления следовых количеств среды культивирования и сыворотки. В качестве раствора для обработки ТИК может быть также использован теплый раствор Эрла (EBSS) или раствор Дульбекко (dPBS). Промывку ТИК проводят путем нанесения теплого раствора Хэнкса (0,1-0,5 мл/см²) струйно на бортик культуральной чашки (для предотвращения смещения клеток), инкубации длительностью 5-300 секунд и удаления раствора с помощью насоса.

Для открепления поверхности культуральной чашки микроткань промывают в 1-10 этапов теплым раствором Версена (температура буферного раствора +18 - +37°C) для удаления двухвалетных катионов кальция и магния, способствующих началу процесса открепления микроткани сердца от поверхности культуральной чашки. Промывку ТИК проводят путем нанесения теплого раствора Версена (0,1-0,5 мл/см²) струйно на бортик культуральной чашки (для предотвращения смещения клеток), инкубации длительностью 5-300 секунд и удаления раствора с помощью насоса. После этого в культуральную чашку добавляют холодный раствор Хэнкса без Са++ Mg++ (температура буферного раствора +2 - +4°C), что приводит к изменению формы клеток (в составе тканеинженерной конструкции) за счет реорганизации их актинового цитоскелета и адгезивных контактов при холодовом воздействии (используют 1-10 этапов обработки раствором, время инкубации с раствором 5-300 секунд) В качестве раствора для обработки ТИК может быть также использован холодный раствор Эрла (EBSS) или раствор Дульбекко (dPBS). Холодный раствор Хэнкса (0,1-0,5 мл/см²) наносят струйно на бортик культуральной чашки (для предотвращения смещения клеток). Далее, культуральную чашку помещают на лед и проводят механическое снятие с помощью шпателя или стандартного пластикового наконечника для пипетки. Для этого ТИК одним неотрывным движением обводят по периметру культуральной чашки (для отсоединения его краев от бортов чашки). Затем короткими по 1-10 мм движениями, направленными от периферии конструкта к центру, добиваются его отслойки от чашки. После того как 80-90% ТИК отсоединено от поверхности культуральной чашки аккуратными постукивающими движениями по дну чашки (1-1000 раз) добиваются его флотации в растворе Хэнкса. Перенос клеточной накладки в другую культуральную чашку или область трансплантации проводят с использованием синтетической мембраны или пинцета. Следует обратить внимание, что предложенный способ получения тканеинженерных конструкций не требует ферментативной обработки пластов клеток или использования специальных чашек с термочувствительным покрытием, что обеспечивает простоту, легкость и низкую стоимость получения готового имплантата. Кроме того, предложенный способ обеспечивает лучшие показатели выживаемости клеток, сохранение внеклеточного матрикса и целостности ТИК в сравнении с использованием ферментативного метода открепления. Таким образом, за счет использования щадящего способа открепления микроткани от поверхности культуральной чашки (без применения ферментов) сохраняются адгезивные контакты на поверхности клеток тканеинженерных конструкций, что позволяет обеспечить более качественное «прилипание» конструкции к ткани миокарда и более быструю миграцию клеток микроткани в ткань миокарда.

ТИК (микроткань сердца) может быть использована для лечения заболеваний сердца, связанных с повреждением стенки левого и/или правого желудочков сердца при инфаркте миокарда (ИМ), возникшем вследствие тромбоза коронарной артерии. ТИК следует трансплантировать в период фазы ранней дилатации стенки левого желудочка (в течение первых 48 часов) или в течение первых 2 недель после ИМ. Известно, что на 2-3 сутки в зону инфаркта происходит миграция лейкоцитов, что приводит к лизису некротических миоцитов сердечной стенки. В результате разрушения коллагена и миоцитов прочность стенки миокарда к этому времени значительно снижается, что может привести к формированию аневризмы или разрыву сердца. Повышение прочности стенки ЛЖ за счет использования ТИК (микроткани сердца) является одной из основных задач данного изобретения. Клетки ТИК после трансплантации формируют очаги неокардиогенеза, а новообразованные сосуды образуют единую сеть коллатерального кровоснабжения. ПКС способны секретировать ростовые факторы и цитокины, которые обеспечивает выживаемость клеток, препятствуют развитию гипертрофии кардиомиоцитов и фиброза в зоне повреждения. Паракринное действие клеток в составе ТИК будет способствовать сохранению гибернирующего миокарда в периинфарктной зоне, что является обязательным условием для предотвращения развития истинной аневризмы левого желудочка в период позднего ремоделирования (2-8 недель после ИМ). ТИК (микроткань) сердца наносят на зону некроза и/или периинфарктную зону с помощью синтетической гипоадгезионной мембраны при строгом соблюдении ориентации конструкции (поверхность ТИК раннее прикрепленная на чашке должна быть «контактной» при размещении на миокарде). После размещения ТИК на эпикардиальной поверхности миокарда ее расправляют с помощью игольчатого пинцета. ТИК наносят для обеспечения покрытия не менее 10-100% зоны повреждения. Послойное ушивание раны проводят не ранее 5-40 минут после нанесения ТИК (для обеспечения адгезии клеточной конструкции).

Полученная микроткань может быть использована также при проникающих ранениях сердца (после ушивания раны), после хирургического иссечения аневризмы сердца, а также при хронической сердечной недостаточности и кардиомиопатиях.

Изобретение поясняется следующими примерами конкретного осуществления.

Пример 1. Получение прогениторных клеток сердца крысы.

Для реализации изобретения были использованы образцы миокарда от самцов крыс линии Вистар массой 250-300 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. При проведении экспериментов руководствовались рекомендациями о гуманном отношении к лабораторным животным, изложенными в Приказе МЗ СССР за №755 от 12 августа 1977 г. Ткань миокарда была измельчена ножницами до размера кусочков 2-3 мм³, затем промыта раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ) 3 раза. Далее проведена обработка ткани раствором ферментов (0,1% коллагеназы A («Roche diagnostics)), США) и 0,2% трипсина («Invitrogen», США) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ)) при 37°C в течение 15 минут при постоянном покачивании на шейкере. После инкубации к раствору ферментов с кусочками ткани добавлен тройной объем среды IMDM, содержащей 10%» фетальной сыворотки теленка (ФБС) («Hyclone», США) и проведено центрифугирование 10 мин со скоростью 1000 оборотов/мин (200 g). Затем кусочки ткани миокарда были промыты 3 раза раствором ФСБ и помещены на пластиковые культуральные чашки, предварительно покрытые фибронектином, в среду культивирования (IMDM («Invitrogen», США), содержащей 10% ФБС, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мML-глутамина) (фиг. 1А). Каждые три дня проводилась частичная замена среды (1/2 объема). Экспланты культивировали до момента появления прозрачных округлых клеток, находящихся на слое фибробластов (Фиг. 1Б, В). С помощью среды для открепления клеток Accutase («IСТ», США) клетки «снимали» с чашек, фильтровали через нейлоновые мембраны («BD Pharmingen», США) с размером пор 40 микрон и далее использовали для иммуномагнитной селекции. В качестве маркера для получения СКС был использован с-kit (рецептор фактора стволовых клеток (SCF)), который характеризует популяцию резидентных клеток сердца с высоким регенеративным потенциалом (Beltramietal., 2003). Для иммуномагнитной селекции с-kit клеток использованы поликлональные антитела к антигену CD45 («Аbcam», США), с-kit крысы («SantaCruz», США) и вторичные антитела к Fc-фрагменту кроличьих IgG («Dynal», США), конъюгированные с магнитными бусинами. Сортинг клеток проводился в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя наборов для иммуномагнитной селекции («Dynal», США). Полученные c-kit + клетки культивировали в среде DMEM F12 («Invitrogen», США), содержащей 10% ФБС, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 20 нг/мл bFGF, 20 нг/мл EGF, 10 нг/мл LIF, 2% В27, 1х инсулин-трансферрин селенита (Фиг. 1Г, Д, Е).

Пример 2. Получение ТИК (микроткани сердца).

C-kit+ клетки 3-го пассажа высаживали на культуральные чашки без покрытия площадью 3,8 см² из расчета 300000 кл/см2 площади поверхности. Далее клетки культивировали в течение 96 часов в среде DMEM F12 («Invitrogen», США), содержащей 10%) ФБС, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 20 нг/мл bFGF, 20 нг/мл EGF, 2% В27, 1х инсулин-трансферрин селенита, при температуре 37°C. Далее выполнили 2 промывки теплым раствором Хэнкса (HBSS) без Са++ Mg++ (температура раствора +37°C) для удаления следовых количеств среды культивирования и сыворотки. Промывку ТИК проводили путем нанесения теплого раствора Хэнкса (0,2 мл/см²) струйно на бортик культуральной чашки (для предотвращения смещения клеток), затем инкубировали в растворе 30 секунд и удаляли раствор с помощью насоса. Для открепления клеточных накладок с поверхности культуральной чашки проводили 2 промывки теплым раствором Версена (температура раствора +37°C) для удаления двухвалетных катионов кальция и магния. Промывку ТИК проводили путем нанесения теплого раствора Версена (0,2 мл/см²) струйно на бортик культуральной чашки (для предотвращения смещения клеток), затем инкубировали 30 секунд и удаляли раствор с помощью насоса. После этого в культуральную чашку добавляли струйно холодный раствор Хэнкса без Са++ Mg++ (температура раствора +4C; 0,2 мл/см²). Далее, культуральную чашку помещали на лед и проводили механическое снятие ТИК с помощью шпателя или стандартного пластикового наконечника для пипетки. Для этого ТИК одним неотрывным движением обводили по периметру культуральной чашки (для отсоединения его краев от бортов чашки). Затем короткими по 2 мм движениями, направленными от периферии конструкта к центру, добивались его отслойки от чашки. После того как 90% ТИК было отсоединено от поверхности культуральной чашки аккуратными постукивающими движениями по дну чашки (11 раз) добивались его флотации в растворе Хэнкса (Фиг. 2) Перенос клеточной накладки на область трансплантации проводили с использованием синтетической гипоадгезионной мембраны и пинцета.

Пример 3. Характеристика ТИК (микроткани сердца) методом иммунофлуоресцентного окрашивания

Криосрезы ТИК (7 мкм) промывали в фосфатно-солевом буфере и фиксировали 4% формалином в течение 15 минут. Для снижения неспецифического связывания антител с клетками препараты инкубировали в блокирующем растворе (1% бычьего сывороточного альбумина/10% сыворотки донора вторых антител/фосфатно-солевой буфер) в течение 30 минут. После удаления излишка блокирующего раствора клетки инкубировали в течение 60 мин с первичными антителами (в концентрациях рекомендованных изготовителем) в растворе (1% бычий сывороточный альбумин/фосфатно-солевой буфер). Использовали первичные антитела против Ki67 («Abcam», США), коннексина 43 («Sigma», США), каспазы 3 («Cell signalling)), США), Gata 4 («SantaCruz», США), срезы отмывали от излишков антител 3 раза в фосфатно-солевом буфере, затем инкубировали клетки в течение 60 минут с вторичными антителами Alexa Fluor («Invitrogen», США), меченными FITC в стандартном разведении 1:2000 в растворе (1% бычьего сывороточного альбумина/фосфатно-солевой буфер). Срезы отмывали от излишков антител в в фосфатно-солевом буфере 3 раза. Ядра клеток докрашивали DAPI. После отмывки в фосфатно-солевом буфере срезы клеточных агрегатов заключали в Aquapolymount («Polysciencesinc», США). Полученные таким образом препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М («Zeiss», Германия). Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRC («Zeiss», Германия) и обработки изображения в программах Axiovision 3.1 («Zeiss», Германия) и AdobePhotoShop («AdobeSystems», США).

Анализ полученных ТИК (микроткани сердца) с помощью гистологического и иммунофлуоресцентного окрашивания срезов показали, что они состоят из нескольких слоев клеток (Фиг. 3), взаимодействующих между собой при помощи коннексин -43 содержащих щелевых контактов. Около 10-12% процентов клеток в составе ТИК экспрессировали маркер пролиферации Ki-67. Пролиферация клеток накладок в совокупности с отсутствием маркеров апоптоза (каспаза 3) указывают, что данные условия культивирования поддерживают жизнеспособность клеток. Культивирование с-kit+ клеток в составе ТИК на культуральных чашках без фибронектина и в отсутствии факторов, способствующих сохранению низкодифференцированного состояния стволовых/прогениторных клеток, вызывало повышение экспрессии транскрипционного фактора Gata 4, который не экспрессировался в культуре c-kit+ клеток после иммуномагнитной селекции. Появление экспрессии Gata 4 указывает на индукцию кардиомиогенной дифференцировики в c-kit + клетках при культивировании в составе 3D культуры клеточной накладки. Gata 4 является наиболее ранним кардиоспецифичным транскрипционным фактором, который определяет формирование миокарда в период эмбрионального развития (Holtzinger A, Evans Т. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 2005 Sep; 132(17):4005-14). Маркер Gata 4+ характеризует мультипотентные c-kit+ прогениторные клетки миокарда, которые способны образовывать не только кардиомиоцитарные клетки-предшественниками, но и клетки сосудов (Bearzi С, Leri A, Lo Monaco F, Rota M, Gonzalez A, Hosoda T, Pepe M, Qanud K, Ojaimi C, Bardelli S, D’Amario D, D’Alessandro DA, Michler RE, Dimmeler S, Zeiher AM, Urbanek K, Hintze TH, Kajstura J, Anversa P. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart. Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Sep 15; 106(37): 15885-90). Было показано, что помимо дифференцировки c-kit + Gata 4+ прогениторные клетки сердца участвуют в регенерации миокарда путем паракринной секреции биологически активных факторов, привлекающих другие стволовые клетки и подавляющие апоптоз кардиомиоцитов (Kawaguchi N, Smith AJ, Waring CD, Hasan MK, Miyamoto S, Matsuoka R, Ellison GM. c-kitpos GATA-4 high rat cardiac stem cells foster adult cardiomyocyte survival through IGF-1 paracrine signalling. PLoS One. 2010 Dec 13; 5(12):e14297). Co-культивирование c-kit+Gata 4 + клеток со взрослыми кардиомиоцитами крысы повышало выживаемость кардиомиоцитов in vitro и стимулировало их сократительную активность. Эти эффекты были связаны с секрецией IGF-1 c-kit+Gata 4 + клетками, который активировал IGF-1R/Akt сигнальный каскад кардиомиоцитов и подавлял их апоптоз (Kawaguchi N, Smith AJ, Waring CD, Hasan MK, Miyamoto S, Matsuoka R, Ellison GM. c-kitpos GATA-4 high rat cardiac stem cells foster adult cardiomyocyte survival through IGF-1 paracrine signalling.PLoS One. 2010 Dec 13; 5(12):e14297).

Пример 3. Трансплантация ТИК (микроткани сердца) на модели инфаркта миокарда у крысы

В эксперименте использованы крысы линии Вистар массой 250-300 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. При проведении экспериментов руководствовались рекомендациями о гуманном отношении к лабораторным животным, изложенными в Приказе МЗ СССР за №755 от 12 августа 1977 г. Моделирование инфаркта миокарда проведено в соответствии с подходом, опубликованном ранее (TraktuevDO, Tsokolaeva ZI, Shevelev AA, Talitskiy KA, Stepanova VV, Johnstone BH, Rahmat-Zade TM, Kapustin AN, Tkachuk VA, March KL, Parfyonova YV. Urokinase gene transfer augments angiogenesis in ischemic skeletal and myocardial muscle. Mol Ther. 2007 Nov; 15(11): 1939-46). Животных интубировали через трахеотомическое отверстие и подключали к аппарату искусственной вентиляции легких (ИВЛ). Вентиляцию легких осуществляли комнатным воздухом с частотой дыхания 60-65 уд/мин с помощью аппарата ИВЛ. Левостороннюю торакотомию проводили в пятом межреберье на 2-3 мм кнаружи от грудины. В образовавшееся отверстие «вывихивали» сердце. Лигатуру накладывали на левую переднюю нисходящую коронарную артерию на 2-3 мм ниже предсердия и возвращали сердце обратно в грудную полость. Коронарную окклюзию верифицировали по появлению эпикардиального цианоза. Перед проведением трансплантации клетки в составе ТИК были помечены красным флуоресцентным красителем CellTracker CM DIL (Invitrogen). Через 10 минут после перевязки левой передней нисходящей коронарной артерии клеточную накладку помещали на эпикардиальную поверхность миокарда (поверхность ТИК ранее прикрепленная к чашке была «контактной» при размещении на миокарде) и расправляли с помощью пинцета (Фиг. 4). Послойное ушивание хирургической раны проводили через 20 минут после трансплантации ТИК.

Пример 4. Оценка васкуляризации и кардиомиоцитарной дифференцировки ПКС в составе тканеинженерной конструкции после трансплантации

На 14 день после трансплантации тканеинженерных конструкций животных умерщвляли. Сердца животных извлекали из грудной полости и готовили криосрезы. Криосрезы клеточных накладок (7 мкм) промывали в фосфатно-солевом буфере и фиксировали 4% формалином в течение 15 минут. Для снижения неспецифического связывания антител с клетками препараты инкубировали в блокирующем растворе (1% бычьего сывороточного альбумина/10% сыворотки донора вторых антител/фосфатно-солевой буфер) в течение 30 минут. После удаления излишка блокирующего раствора клетки инкубировали в течение 60 мин с первичными антителами (в концентрациях рекомендованных изготовителем) в растворе (1% бычий сывороточный альбумин/фосфатно-солевой буфер). Использовали первичные антитела против CD31 («BD Pharmingen», США), α-гладкомышечного актина («Sigma», США), Nkx 2,5 («Abcam», США), МНС («SantaCruz», США), срезы отмывали от излишков антител 3 раза в фосфатно-солевом буфере, затем инкубировали клетки в течение 60 минут с вторичными антителами Alexa Fluor («Invitrogen», США), меченными FITC в стандартном разведении 1:2000 в растворе (1% бычьего сывороточного альбумина/фосфатно-солевой буфер). Срезы отмывали от излишков антител в фосфатно-солевом буфере 3 раза. Ядра клеток докрашивали DAPI. После отмывки в фосфатно-солевом буфере срезы клеточных агрегатов заключали в Aquapolymount («Polysciencesinc», США). Полученные таким образом препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М («Zeiss», Германия). Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRC («Zeiss», Германия) и обработки изображения в программах Axiovision 3.1 («Zeiss», Германия) и AdobePhotoShop («AdobeSystems», США).

При оценке влияния трансплантации ТИК (микроткани сердца) на ремоделирование левого желудочка, одним из показателей которого является толщина стенки в области инфаркта, было обнаружено, что трансплантация имплантата из ПКС позволяет почти вдвое увеличить этот показатель, что является важнейшим фактором, уменьшающим постинфарктное ремоделирование левого желудочка и развитие сердечной недостаточности. Причем ТИК (микроткань сердца) не только интегрировалась с подлежащей тканью стенки левого желудочка, но и хорошо васкуляризировалась: содержала большое количество артериальных и венозных кровеносных сосудов разного диаметра (Фиг. 5). Часть клеток ТИК, меченных Cell Tracker CM-DIL, экспрессировали маркеры клеток-предшственников кардиомиоцитов - Nkx 2,5 и зрелых кардиомиоцитов - тяжелые цепи миозина β (Фиг. 6), что указывает на дифференцировку ПКС в составе имплантата в кардиомиоцитарном направлении.

Claims

1. Способ получения микроткани сердца на основе прогениторных клеток сердца, включающий высаживание на культуральные чашки прогениторных клеток сердца из расчета 100000-1000000 клеток на см² площади поверхности и культивирование их до формирования микроткани при температуре 34-37°C в течение 12-240 часов в среде роста с последующим откреплением микроткани сердца от поверхности культуральной чашки, которое осуществляют посредством обработки микроткани сначала раствором, обеспечивающим удаление двухвалентных катионов кальция и магния при температуре раствора 18-37°C, затем нейтральным раствором при температуре 2-4°C с последующим механическим снятием микроткани с поверхности культуральной чашки.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют культуральные чашки с покрытием из коллагена, и/или фибронектина, и/или ламинина, и/или желатина, и/или фибрина в количестве 0,1-1000 мкг/см².

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют культуральные чашки диаметром 10-100 мм.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве среды роста используют среду, содержащую 0,5-10% ФБС, 1-100 нг/мл bFGF, 1-100 нг/мл EGF, 2% В27, 1-5х инсулин-трансферрин селенита.

5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что в качестве среды роста используют среду DMEM F12, или IMDM, или F12, или RPMI, или MEM, или DMEM, или Myelocult.

6. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что среда роста дополнительно содержит 100 ед/мл пенициллина-стрептомицина и/или 2 мМ Л-глутамина.

7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что перед откреплением микроткани сердца от поверхности культуральной чашки ее промывают раствором для удаления следовых количеств среды роста при температуре буферного раствора +18-+37°C.

8. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что для промывки используют раствор Хэнкса, или раствор Эрла, или раствор Дульбекко.

9. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве раствора, обеспечивающего удаление двухвалентных катионов кальция и магния, используют раствор Версена, при этом промывку раствором осуществляют в 1-10 этапов.

10. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве нейтрального раствора используют раствор Хэнкса без Ca++ Mg++, или раствор Эрла, или раствор Дульбекко.

11. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что для механического снятия микроткани культуральную чашку помещают на лед.

12. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что для механического снятия с поверхности культуральной чашки микроткань одним неотрывным движением обводят по периметру культуральной чашки для отсоединения ее краев от бортов чашки, затем движениями, направленными от периферии микроткани к центру, добиваются отслойки микроткани от чашки, после отсоединения 80-90% микроткани от поверхности культуральной чашки аккуратными постукивающими движениями по дну чашки добиваются его флотации в фосфатно-солевом буфере.

13. Способ лечения заболеваний сердца, связанных с повреждением стенки левого и/или правого желудочков сердца при инфаркте миокарда, включающий получение микроткани сердца способом по п. 1 и трансплантацию полученной ткани в период фазы ранней дилатации стенки левого желудочка или в течение первых двух недель после инфаркта миокарда, при этом микроткань на зону повреждения наносят поверхностью, которая при культивировании размещалась на культуральной чашке, после чего осуществляют послойное ушивание раны.

14. Способ по п. 13, характеризующийся тем, что ушивание раны осуществляют через 5-40 минут после нанесения микроткани на зону повреждения.

15. Способ по п. 13, характеризующийся тем, что микротканью сердца покрывают не менее 10-100% зоны повреждения.