JPWO2018123901A1 - 消化速度が遅い高分子グルカン - Google Patents
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Abstract
Description
(i)重合度6〜10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度1〜5を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP1-5/DP6-10)×100)が33〜50%である。
(ii)重合度6〜10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度11〜15を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP11-15/DP6-10)×100)が80〜125%である。
(iii)重合度6〜10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度26〜30を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP26-30/DP6-10)×100)が16〜43%である。
項1. α−1,4−グルコシド結合による主鎖にα−1,6−グルコシド結合による分岐鎖が結合している高分子グルカンであって、
平均分子量が1万〜50万であり、
α−1,6−グルコシド結合をイソアミラーゼで消化することにより直鎖状の単位鎖長に分解した後に、HPAEC−PAD法によって単位鎖長分布を分析すると、下記特性(i)〜(iii)を満たす、高分子グルカン:
(i)重合度6〜10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度1〜5を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP1-5/DP6-10)×100)が33〜50%である。
(ii)重合度6〜10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度11〜15を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP11-15/DP6-10)×100)が80〜125%である。
(iii)重合度6〜10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度26〜30を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP26-30/DP6-10)×100)が16〜43%である。
項2. 更に、前記単位鎖長分布を分析すると、下記特性(iv)〜(vii)の内、少なくとも1つを満たす、項1に記載の高分子グルカン:
(iv)重合度6−10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度16−20を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP16-20/DP6-10)×100)が53〜85%である。
(v)重合度6−10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度21−25を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP21-25/DP6-10)×100)が31〜62%である。
(vi)重合度6−10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度31−35を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP31-35/DP6-10)×100)が8〜30%である。
(vii)重合度6−10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度36−40を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP36-40/DP6-10)×100)が3〜21%である。
項3. 下記in vitro消化性試験において求められる初期消化速度係数kが0.029未満であり、且つ酵素反応開始から120分間までに分解されない成分の割合が10%未満である、項1又は2に記載の高分子グルカン:
[in vitro消化性試験の方法]
5w/v%高分子グルカン水溶液100μL、1M酢酸バッファー(pH5.5)20μL、蒸留水716μLを混合し、更に250U/mLの濃度のブタ膵臓由来α−アミラーゼ液4μL、及びα−グルコシダーゼ活性で0.3U/mLに相当する濃度のラット小腸アセトンパウダー液160μLを添加して37℃で反応を開始する。経時的に、各反応液中のグルコース濃度を測定し、高分子グルカンから遊離したグルコース量を測定する。
初期消化速度係数kは、下記式に従って算出する。
項5. α−1,4−グルコシド結合による主鎖の非還元末端がα−1,6−グルコシド結合による分岐構造を有していない、項1〜4のいずれかに記載の高分子グルカン。
項6. 項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンを含む、飲食品。
項7. 血糖値及び/又は血中インスリン濃度の上昇抑制用である、項6に記載の飲食品。
項8. 項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンを含む、輸液。
項9. 項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンを含む、医薬品。
項10. 項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンの製造方法であって、
分岐状グルカンを基質として、ブランチングエンザイム100〜4,000U/g基質と、4−α−グルカノトランスフェラーゼとを、同時に又は任意の順で段階的に反応させ、項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止する、
高分子グルカンの製造方法。
項11. 項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンの製造方法であって、
分岐状グルカンを基質として、ブランチングエンザイム100〜4,000U/g基質を反応させ、次いでエキソ型アミラーゼを反応させ、項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止する、
高分子グルカンの製造方法。
項12. 前記4−α−グルカノトランスフェラーゼが、アミロマルターゼ及び/又はシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼである、項10に記載の製造方法。
項13. 前記エキソ型アミラーゼが、β−アミラーゼである、項11に記載の製造方法。
項14. 前記分岐状グルカンが、ワキシー澱粉である、項10〜13のいずれかに記載の製造方法。
項15. 血糖値及び/又は血中インスリン濃度の上昇抑制剤を製造するための、項1〜4のいずれかに記載の高分子グルカンの使用。
項16. 血糖値及び/又は血中インスリン濃度の上昇の抑制が求められる人に、項1〜4のいずれかに記載の高分子グルカンを投与する、血糖値及び/又は血中インスリン濃度の上昇抑制方法。
本明細書において、「低消化速度」とは、経口摂取後に高分子グルカンが消化される速度が遅いことを指し、例えば、後述するin vitro消化性試験における初期消化速度係数kが0.029未満であることが挙げられる。
イソアミラーゼ1U:カキグリコーゲンから1分間に1μmolの還元糖を生成する酵素量。
α−アミラーゼ1U:可溶性澱粉から3分間に1mgのマルトースを生成する酵素量。
グルコアミラーゼ1U:可溶性澱粉から30分間に10mgのグルコースを生成する酵素量。
α−グルコシダーゼ1U:p-ニトロフェニル-α-D-グルコピラノシドから1分間に1μmolの4−ニトロフェノールを遊離する酵素量。
本発明の高分子グルカンは、α−1,4−グルコシド結合による主鎖にα−1,6−グルコシド結合による分岐鎖が結合している高分子グルカンであって、分子量が1万〜50万であり、α−1,6−グルコシド結合をイソアミラーゼで消化することにより直鎖状の単位鎖長に分解すると特定の単位鎖長分布を示すことを特徴とする。以下、本発明の高分子グルカンについて詳述する。
本発明の高分子グルカンは、α−1,6−グルコシド結合を持つ分岐状α−1,4−グルカンである。
本発明の高分子グルカンの平均分子量は1万〜50万である。本発明の高分子グルカンの一態様として、平均分子量が、好ましくは約5万以上、更に好ましくは約10万以上が挙げられる。また、本発明の高分子グルカンの一態様として、平均分子量が、好ましくは約30万以下、更に好ましくは約20万以下が挙げられる。本発明の高分子グルカンの好適な態様として、平均分子量が、好ましくは約5万〜約30万、更に好ましくは約10万〜約20万が挙げられる。本発明の高分子グルカンは、このような平均分子量を満たすことによって、飲料に添加しても浸透圧の上昇を抑制することが可能になり、また、配合される各種製品における還元糖量の増加を抑制することも可能になる。
澱粉等のα−1,6−グルコシド結合を持つ分岐状α−1,4−グルカンは、イソアミラーゼなど適切な酵素処理によりα−1,6−グルコシド結合のみを完全に分解し、直鎖状α−1,4−グルカンのみに変換することができる。このように分岐状α−1,4−グルカンが分解された直鎖状α−1,4−グルカンは、分岐状α−1,4−グルカンの単位鎖といい、その重合度を単位鎖長という。分岐状α−1,4−グルカンから得られる単位鎖は、様々の重合度を持ち、HPAEC−PAD法等によって各重合度の単位鎖長の濃度分布(単位鎖長分布)を得ることができる。
(i)重合度6〜10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度1〜5を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP1-5/DP6-10)×100;以下、「DP1-5率」と表記することがある)が33〜50%である。
(ii)重合度6〜10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度11〜15を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP11-15/DP6-10)×100;以下、「DP11-15率」と表記することがある)が80〜125%である。
(iii)重合度6〜10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度26〜30を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP26-30/DP6-10)×100;以下、「DP26-30率」と表記することがある)が16〜43%である。
(iv)重合度6−10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度16−20を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP16-20/DP6-10)×100;以下、「DP16-20率」と表記することがある)が53〜85%である。
(v)重合度6−10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度21−25を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP21-25/DP6-10)×100;以下、「DP21-25率」と表記することがある)が31〜62%である。
(vi)重合度6−10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度31−35を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP31-35/DP6-10)×100;以下、「DP31-35率」と表記することがある)が8〜30%である。
(vii)重合度6−10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度36−40を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP36-40/DP6-10)×100;以下、「DP36-40率」と表記することがある)が3〜21%である。
本発明の高分子グルカンは、前述する特性を備えることによって、生体内では緩やかに消化され、血糖値やインスリン値を急激に上昇させない低消化速度と、難消化性成分をほとんど有しないことによる高消化性との2つの消化特性を併せ持つことができる。
[in vitro消化性試験の方法]
Englystら(European Journal of Clinical Nutrition、1992、46、S33〜S50)の方法を基に改変した方法を用いた。5w/v%高分子グルカン水溶液100μL、1M酢酸バッファー(pH5.5)20μL、蒸留水716μLを混合し、更に250U/mLの濃度のブタ膵臓由来α−アミラーゼ液4μL、及びα−グルコシダーゼ活性で0.3U/mLに相当する濃度のラット小腸アセトンパウダー抽出液160μLを添加して37℃で反応を開始する。ラット小腸アセトンパウダー抽出液は、ラット小腸アセトンパウダー150mgを50mM酢酸バッファー(pH5.5)3mLに懸濁し、遠心上清をラット小腸粘膜酵素の粗酵素液として調製する。経時的に、各反応液中のグルコース濃度を測定し、高分子グルカンから遊離したグルコース量を測定する。より具体的な試験方法は、実施例の欄に記載の通りである。なお、前記ブタ膵臓由来α−アミラーゼ及びラット小腸アセトンパウダーとしては、例えば、Sigma社製のものを使用できる。
本発明の高分子グルカンは、従来の澱粉と同様の用途に使用することができる。具体的には、本発明の高分子グルカンは、飲食品、輸液、食品添加剤、医薬品、接着剤等の各種製品に配合して使用することができる。また、本発明の高分子グルカンは、水に溶解させた際の糊液の粘度が低いという特性があり、生物崩壊性プラスチックの原料、澱粉からシクロデキストリン等を製造する際の中間物質、澱粉加工工業における原料等としても好適にも使用できる。
本発明の高分子グルカンの製造方法については、特に制限されないが、好適な例として、(1)分岐状グルカンを基質として、ブランチングエンザイム100〜4,000U/g基質と、4−α−グルカノトランスフェラーゼとを、同時に又は任意の順で段階的に反応させ、本発明の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止する方法(以下、第1法)、(2)分岐状グルカンを基質として、ブランチングエンザイム100〜4,000U/g基質を反応させ、次いでエキソ型アミラーゼを反応させ、本発明の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止する方法(以下、第2法)が挙げられる。以下、当該第1法及び第2法を用いた本発明の高分子グルカンの製造方法について詳述する。
3−1−1.基質
第1法では、基質として分岐状グルカンを使用する。本発明で使用される分岐状グルカンは、D−グルコースがα−1,4−グルコシド結合により連結した直鎖状グルカンが、α−1,6−グルコシド結合により分岐しているグルカンである。本発明では、分岐状グルカンとして、α−1,6−グルコシド結合以外の結合によって分岐されていないものが好ましい。α−1,6−グルコシド結合以外の結合による分岐構造が多いと、当該構造部分が合成される高分子グルカンに残存して難消化性を示し、高消化性を有する高分子グルカンが得られなくなる。また、基質として使用される分岐状グルカンは、イソアミラーゼ処理及びプルラナーゼ処理をされていないことが望ましい。
本発明において、「澱粉」とは、アミロースとアミロペクチンとの混合物をいう。基質として使用される澱粉としては、アミロペクチン含量の高いものが好ましい。澱粉としては、通常市販されている澱粉であればどのような澱粉でも用いることができる。澱粉に含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、澱粉を産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有する澱粉のほとんどはアミロペクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロペクチンを含まない澱粉は、通常の植物からは得られない。澱粉は、天然の澱粉、澱粉分解物、及び化工澱粉に区分される。これらの澱粉の中でも、本発明で使用される基質として、好ましくは、天然の澱粉、及び天然の澱粉の分解物、更に好ましくは天然の澱粉が挙げられる。
アミロペクチンとは、α−1,4−グルコシド結合によって連結されたグルコース単位に、α−1,6−グルコシド結合でグルコース単位が連結された分岐状分子である。アミロペクチンは天然の澱粉中に含まれる。アミロペクチンとして、例えば、アミロペクチン100%からなるワキシーコーンスターチを用いることができる。
グリコーゲンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、高頻度の枝分かれを有するグルカンである。グリコーゲンは、動物の貯蔵多糖として殆どのあらゆる細胞に顆粒状態で広く分布している。グリコーゲンは、植物中では、例えば、トウモロコシのスイートコーン種の種子に存在している。グリコーゲンは、代表的には、グルコースのα−1,4−グルコシド結合の糖鎖に対して、グルコースおよそ3単位おきに1本程度の割合で、平均重合度12〜18のグルコースのα−1,4−グルコシド結合の糖鎖がα−1,6−グルコシド結合で結合している。α−1,6−グルコシド結合で結合している分枝鎖にも同様にグルコースのα−1,4−グルコシド結合の糖鎖がα−1,6−グルコシド結合で結合している。そのため、グリコーゲンは網状構造を形成する。
デキストリンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、澱粉とマルトースとの中間の複雑さをもつグルカンである。デキストリンは、澱粉を酸、アルカリまたは酵素によって部分的に分解することによって得ることができる。
酵素合成分岐グルカンとは、酵素を使用して合成された分岐状グルカンをいう。SP−GP法でのアミロースの合成(国際公開第WO02/097107号パンフレット(第127頁−第134頁)、H.Waldmannら、Carbohydrate Research, 157 (1986) c4−c7)の際に反応液中にブランチングエンザイムを加えることにより、分岐構造を有するグルカンを合成することができる。分岐の程度はブランチングエンザイムの添加量によって適宜調整可能である。
高度分岐環状グルカンとは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカンであり、特許第3107358号に記載される方法によって製造される。特許第3107358号に記載される方法では、BE、4−α−グルカノトランスフェラーゼ又はシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ(CGTase)を単独で使用するため、高度分岐状環状グルカンの鎖長分布は、本発明の高分子グルカンが備える鎖長分布とは異なっている。高度分岐環状グルカンは、分子全体として少なくとも1つの分岐を有すればよい。
ブランチングエンザイム(BE)
ブランチングエンザイム(系統名:1,4−α−D−グルカン:1,4−α−D−グルカン 6−α−D−(1,4−α−D−グルカノ)−トランスフェラーゼ、EC 2.4.1.18;以下、BEと表記することもある)は、α−1,4−グルコシド結合を切断し、別のグルコース残基の6位OH基に転移することにより、α−1,6−グルコシド結合を形成する酵素である。BEは当該分野において1,4−α−グルカン分枝酵素、枝作り酵素又はQ酵素とも呼ばれている。BEは、動物、植物、糸状菌、酵母および細菌に広く分布しており、グリコーゲン又は澱粉の分岐結合合成を触媒している。
4−α−グルカノトランスフェラーゼは、供与体分子の非還元末端からグルコシル基又は2個以上のグルコースからなるユニットを受容体分子の非還元末端に転移する酵素である。本発明で用いられる4−α−グルカノトランスフェラーゼは、国際生化学分子生物学連合の定める酵素番号EC 2.4.1.25に分類される酵素、及び/又は酵素番号EC 2.4.1.19に分類される酵素を利用し得る。酵素番号EC 2.4.1.25に分類される酵素(以下、MalQと表記することもある)は、アミロマルターゼ、ディスプロポーショネーティングエンザイム、D−酵素、不均化酵素などとも呼ばれる酵素である。微生物由来のMalQはアミロマルターゼと呼ばれ、植物由来のMalQはD−酵素と呼ばれている。酵素番号EC 2.4.1.19に分類される酵素(以下、CGTaseと表記することもある)は、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼと呼ばれており、供与体分子の非還元末端の6〜8個のグルコース鎖を認識してこの部分を環状化させるように転移反応を行い、重合度6〜8個のシクロデキストリンと非環状リミットデキストリンとを生成し得る酵素である。
第1法では、基質となる分岐状グルカンに対して、BEを100〜4,000U/g基質と、4−α−グルカノトランスフェラーゼとを、同時に又は任意の順で段階的に反応させ、本発明の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止させる。
態様1:BE及び4−α−グルカノトランスフェラーゼの双方を同時に添加して反応させる。
態様2:最初に4−α−グルカノトランスフェラーゼのみを添加し、ある程度反応が進んだ時点でBEを添加して反応させる。
態様3:最初にBEのみを添加し、ある程度反応が進んだ時点で4−α−グルカノトランスフェラーゼを添加して反応させる。
態様4:最初に4−α−グルカノトランスフェラーゼのみを添加し、ある程度反応が進んだ時点で一度酵素を失活させ、次いでBEを添加して反応させる。
態様5:最初にBEのみを添加し、ある程度反応が進んだ時点で一度酵素を失活させ、次いで4−α−グルカノトランスフェラーゼを添加して反応させる。
前記酵素反応によって得られた本発明の高分子グルカンは、必要に応じて精製工程の供される。精製することにより除去される不純物の例は、BE、4−α−グルカノトランスフェラーゼ、副生し得る低分子量グルカン、無機塩類等である。
3−2−1.基質
第2法でも、基質として分岐状グルカンを使用する。第2法で使用される基質の種類、好適なもの等については、第1法で使用されるものと同様である。
ブランチングエンザイム(BE)
第2法で使用されるBEの特性、由来等は、第1法で使用されるものと同様である。
β−アミラーゼとは、非還元性末端からα−1,4−グルコシド結合をマルトース単位で順次加水分解するエキソ型アミラーゼである。
第2法では、基質となる分岐状グルカンに対して、ブランチングエンザイム100〜4,000U/g基質を反応させ、次いでエキソ型アミラーゼを反応させ、本発明の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止させる。
態様I:最初にBEのみを添加し、ある程度反応が進んだ時点でエキソ型アミラーゼを添加して反応させる。
態様II:最初にBEのみを添加し、ある程度反応が進んだ時点で一度酵素を失活させ、次いでエキソ型アミラーゼを添加して反応させる。
反応後に生じた本発明の高分子グルカンの精製方法については、第1法の場合と同様である。
(1)高分子グルカンの分子量の測定
高分子グルカンの重量平均分子量はGPC−MALS法によって測定した。具体的には、GPC−MALS法は、多角度レーザー光散乱光度計(MALS、ワイアットテクノロジー社製、HELEOS II)と示差屈折計(株式会社島津製作所製、RID−20A)の検出器と高速液体クロマトグラフィー(HPLC)システム(カラム:昭和電工株式会社製、OHPAK SB−804HQもしくはSB−806M HQ)を組み合わせた分析装置を利用して分子量分析を行った。溶媒には100mM硝酸ナトリウム水溶液を使用した。測定手順は、先ず、高分子グルカンの粉末50mgを10mLの100mM硝酸ナトリウム水溶液に溶解しサンプルの調整をした。サンプルを孔径0.45μmの膜でろ過を行い、得られた濾液のうちの100μLを上記HPLCシステムに注入した。
高分子グルカンの分岐頻度はα−1,6−グルコシド結合の数と分子中のグルコース単位総数を測定することにより算出した。α−1,6−グルコシド結合の数は、グルカンの非還元末端当量測定により求めた。具体的には、20mM酢酸バッファー(pH5.5)溶液中で、高分子グルカン0.25w/v%にPseudomonas由来イソアミラーゼ(Megazyme社製)10U/mLを、37℃で18時間作用させた後の還元力を改変パークジョンソン法(Hizukuriら、Starch,Vol.,35,pp.348−350,(1983))にて測定することにより、非還元末端当量を求めた。
高分子グルカンの分子内の直線状α‐1,4‐グルカン(単位鎖長)を、長さ(重合度)によって分離し、各重合度の単位鎖長の濃度分布を分析した。具体的には、先ず、20mM酢酸バッファー(pH5.5)溶液中で、高分子グルカン0.25w/v%に、Pseudomonas由来イソアミラーゼ(Megazyme社製)10U/mLを37℃で18時間作用させて、高分子グルカンのα‐1,6−グルコシル結合を完全に消化させた。次いで、イソアミラーゼによる消化産物を、HPAEC−PAD法によって単位鎖長分布の分析を行った。
高分子グルカンの末端構造をメチル化法により分析した。メチル化法は箱守のThe Journal of Biochemistry,1964, 55(2),p205−208に記載されている手法に従って行った。高分子グルカン1mgを試験管にとり、1gのジメチルスルフォキシド(DMSO)に20mgの水酸化ナトリウムを加えて調製した溶液を500μL加え、さらにヨウ化メチルを200μL加えて、室温で15分攪拌しメチル化した。水とクロロホルムを加えて液液抽出を3回行い、クロロホルム相をエバポレーターで溶媒除去した。メチル化された高分子グルカンに2Mトリフルオロ酢酸500μL加えて、90℃で1時間攪拌して加水分解した。その後、トルエンを200μL加えてエバポレーターで溶媒除去した。加水分解後、250mM水素化ホウ酸ナトリウム水溶液を500μL加えて、室温で一晩攪拌し還元した。更に、酢酸を泡が出なくなるまで加え、トルエンを200μL加えてエバポレーターで溶媒除去した。最後に、ピリジン200μLと無水酢酸200μLを加え、90℃で20分攪拌してアセチル化を行った。反応後、トルエンを200μL加えてエバポレーターで溶媒除去し、水とクロロホルムを加えて液液抽出を3回行い、クロロホルム相を回収して、エバポレーターで溶媒除去し、部分メチル化糖を合成した。
高分子グルカンの結合様式を酵素法により分析した。イソアミラーゼはα−1,6−グルコシド結合を加水分解し、α−アミラーゼおよびβ−アミラーゼはα−1,4−グルコシド結合を加水分解する。また、イソアミラーゼは非還元末端部分のα−1,6−グルコシド結合を加水分解することができない。この3種類の酵素を作用させることでα−1,4−グルコシド結合およびα−1,6−グルコシド結合以外のグルコシド結合の有無及び、非還元末端部分の分岐の有無を確認した。
本試験では、消化速度試験として、生体内における糖質の消化性をin vitroにて模擬的に評価する加水分解試験を採用した。本試験方法は、Englystら(European Journal of Clinical Nutrition、1992、46S33〜S50)の方法を基に改変した方法で、糖質に消化酵素(ブタ膵臓由来α-アミラーゼおよびラット小腸粘膜酵素)を作用させ、分解によって放出されるグルコース量を経時的に測定する方法である。消化酵素と試験物質は以下のように調製した。Sigma社製のブタ膵臓由来α−アミラーゼを50mM酢酸バッファー(pH5.5)で懸濁し、活性250U/mLの酵素溶液に調製した。また、Sigma社製のラット小腸アセトンパウダー150mgを50mM酢酸バッファー(pH5.5)3mLに懸濁し、遠心した上清をラット小腸アセトンパウダー抽出液として得た。この抽出液をラット小腸粘膜酵素液として使用した。測定対象となる高分子グルカンは蒸留水で5w/v%に調整し、100℃、5分加熱して完全溶解させた。50mg/mLのラット小腸アセトンパウダーに含まれるα−グルコシダーゼの活性は0.3U/mLであった。
10時間以上絶食(水以外)した健常な成人を対象にクロスオーバー・オープン試験を実施した。被験サンプルである高分子グルカン又は対照糖質のグルコースを50g経口摂取させ、摂取前空腹時と糖質摂取後10分、20分、30分、45分、60分、75分、90分、及び120分の血糖値及び血中インスリン値を測定した。
(1)Aquifex aeolicus由来BEの製造
特開2008−95117の製造例1に記載された組換えプラスミドpAQBE1を保持する大腸菌TG−1株を用いて、同特許文献に示された方法に従って、Aquifex aeolicus由来BE(AqBE)を含む酵素液(AqBE酵素液)を得た。
Teradaら(Applied and Enviromental Microbiology、65巻、910−915(1999))に記載されたプラスミドpFGQ8を保持する大腸菌MC1061株を用いて、同文献に示された方法に従って、Thermus aquaticus由来アミロマルターゼ(TaqMalQ)を含む酵素液(TaqMalQ酵素液)を得た。
CGTase(コンチザイム、天野エンザイム株式会社)及びβ−アミラーゼ(ナガセケムテック社製、#1500)を購入し、CGTase酵素液及びβ−アミラーゼ酵素液を準備した。
ワキシーコーンスターチ(三和澱粉工業株式会社製)200gを1Lの20mMクエン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、懸濁液を100℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は6.5%であり、平均重合度は約1×105であり、重量平均分子量は約2×107であった。次いで、約70℃まで冷却した糊液に、AqBE酵素液を200U/g基質(実施例1−1)、300U/g基質(実施例1−2)、700U/g基質(実施例1−3)、1000U/g基質(実施例1−4)、2000U/g基質(実施例1−5)となるように添加し、同時にTaqMalQ酵素液を0.5U/g基質となるように添加して70℃で24時間反応させた。また、約70℃まで冷却した糊液に、AqBE酵素液を200U/g基質及びTaqMalQ酵素液を0.25U/g基質となるよう同時に添加して70℃で24時間反応させた(実施例1−6)。反応後、反応液を100℃で20分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の高分子グルカンを得た。
ワキシーコーンスターチ(三和澱粉工業株式会社製)200gを1Lの20mMクエン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、懸濁液を100℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た(比較例1−1)。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は6.5%であり、平均重合度は約1×105であり、重量平均分子量は約2×107であった。約70℃まで冷却した糊液に、AqBE酵素液を50U/g基質(比較例1−2)、100U/g基質(比較例1−3)、200U/g基質(比較例1−4)、500U/g基質(比較例1−5)、700U/g基質(比較例1−6)、5000U/g基質(比較例1−7)、又は10000U/g基質(比較例1−8)となるように添加して70℃で24時間反応させた。反応後、反応液を100℃で20分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の分岐状グルカンを得た。
ワキシーコーンスターチ(三和澱粉工業株式会社製)200gを1Lの20mMクエン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、懸濁液を100℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は6.5%であり、平均重合度は約1×105であり、重量平均分子量は約2×107であった。約70℃まで冷却した糊液に、AqBE酵素液を50U/g基質(比較例2−1)、又は5000U/g基質(比較例2−2)となるように添加し、同時にTaqMalQ酵素液を0.5U/g基質となるように添加して70℃で24時間反応させた。反応後、反応液を100℃で20分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の分岐状グルカンを得た。
特開2008−95117号公報に記載の手法に従って合成された酵素合成分岐グルカンについて、重量平均分子量、分岐頻度、還元糖量、及び単位鎖長分布の測定を行った。
牛肝臓由来のグリコーゲン(Sigam社製)及び牡蠣由来のグリコーゲン(MB Biomedicals社製)について、重量平均分子量、分岐頻度、還元糖量、及び単位鎖長分布の測定を行った。
タピオカ澱粉(東海澱粉株式会社製)200gを1Lの20mMクエン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、懸濁液を100℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したタピオカ澱粉の分岐頻度は4.8%であり、平均重合度は約3×104であり、重量平均分子量は約5×106であった。約70℃まで冷却した糊液に、AqBE酵素液を1400U/g基質となるように添加し、同時にTaqMalQ酵素液を0.25U/g基質となるように添加して70℃で24時間反応させた。反応後、反応液を100℃で20分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の高分子グルカンを得た。
ワキシーコーンスターチ(三和澱粉工業株式会社製)200gを1Lの20mMクエン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、懸濁液を100℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は6.5%であり、平均重合度は約1×105であり、重量平均分子量は約2×107であった。次いで、約70℃まで冷却した糊液に、AqBE酵素液を700U/g基質となるように添加し、同時にCGTase(コンチザイム、天野エンザイム株式会社)酵素液を10U/g基質(実施例3−1)又は50U/g基質(実施例3−2)となるように添加して60℃で24時間反応させた。反応後、反応液を100℃で20分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の高分子グルカンを得た。
ワキシーコーンスターチ(三和澱粉工業株式会社製)200gを1Lの20mMクエン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、懸濁液を100℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は6.5%であり、平均重合度は約1×105であり、重量平均分子量は約2×107であった。次いで、約60℃まで冷却した糊液に、AqBE酵素液を700U/g基質となるように添加し、同時にCGTase酵素液を2U/g基質及びTaqMalQ酵素液を0.2U/g基質(実施例4−1)、或はCGTase酵素液を5U/g基質及びTaqMalQ酵素液を0.2U/g基質(実施例4−2)となるように添加して、60℃で24時間反応させた。反応後、反応液を100℃で20分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の高分子グルカンを得た。
ワキシーコーンスターチ(三和澱粉工業株式会社製)200gを1Lの20mMクエン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、懸濁液を100℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は6.5%であり、平均重合度は約1×105であり、重量平均分子量は約2×107であった。次いで、約60℃まで冷却した糊液に、AqBE酵素液を700U/g基質となるように添加し、同時にTaqMalQ酵素液を0.2U/g基質(比較例5−1)又はCGTase酵素液を5U/g基質(比較例5−2)、或はCGTase酵素液を2U/g基質及びTaqMalQ酵素液を0.1U/g基質(比較例5−3)となるように添加して、60℃で24時間反応させた。反応後、反応液を100℃で20分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液を凍結乾燥し、粉末状の分岐状グルカンを得た。
ワキシーコーンスターチ(三和澱粉工業株式会社製)200gを1Lの20mMクエン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、懸濁液を100℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は6.5%であり、平均重合度は約1×105であり、重量平均分子量は約2×107であった。次いで、約70℃まで冷却した糊液に、AqBE酵素液を100U/g基質となるように添加し、70℃で24時間反応させた。反応後、反応液を100℃で20分間加熱してBEを失活させた。その後、37℃まで冷却し、β−アミラーゼ酵素液を15U/g基質となるように添加して、37℃で1時間(実施例5−1)又は2時間(実施例5−2)反応させた。反応後、反応液を100℃で20分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液に当量のエタノールを加え、沈殿物を遠心して回収した(エタノール沈殿)。エタノール沈殿は3回繰り返した後、回収した沈殿物を水に溶解させ、この溶液を凍結乾燥し、粉末状の高分子グルカンを得た。
ワキシーコーンスターチ(三和澱粉工業株式会社製)200gを1Lの20mMクエン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、懸濁液を100℃に加熱することにより糊化させて糊液を得た。使用したワキシーコーンスターチの分岐頻度は6.5%であり、平均重合度は約1×105であり、重量平均分子量は約2×107であった。次いで、約70℃まで冷却した糊液に、AqBE酵素液を100U/g基質となるように添加し、70℃で24時間反応させた。反応後、反応液を100℃で20分間加熱してBEを失活させた。その後、37℃まで冷却し、β−アミラーゼ酵素液を15U/g基質となるように添加して、37℃で3時間(比較例6−1)、4時間(比較例6−2)、又は6時間(比較例6−3)反応させた。反応後、反応液を100℃で20分間加熱した後、活性炭、陽イオン交換クロマトカラム、及び陰イオン交換クロマトカラムに通液した。回収された溶液に当量のエタノールを加え、沈殿物を遠心して回収した(エタノール沈殿)。エタノール沈殿は3回繰り返した後、回収した沈殿物を水に溶解させ、この溶液を凍結乾燥し、粉末状の分岐状グルカンを得た。
実施例1〜5の高分子グルカン、比較例1、2、5、及び6の分岐状グルカン、比較例3の酵素合成分岐グルカン、並びに比較例4の天然グリコーゲンについて、in vitro消化性試験を行い、初期分解速度係数k、並びに易消化性画分、緩消化性画分、及び難消化性画分の各割合(%)を求めた。
実施例1−3の高分子グルカン及びグルコースを用いて、健常人10名により、経口摂取した際の血糖値および血中インスリン値の測定をクロスオーバー・オープン試験にて実施した。被験者は10時間以上水以外絶食した状態で高分子グルカンまたはグルコースを摂取した。
実施例1−1の高分子グルカンと比較例1−3の分岐状グルカンを用いて、健常人1名により、経口摂取した際の血糖値および血中インスリン値の測定をクロスオーバー・オープン試験にて実施した。被験者は10時間以上水以外絶食した状態で高分子グルカンまたは分岐状グルカンを摂取した。
Claims (14)
- α−1,4−グルコシド結合による主鎖にα−1,6−グルコシド結合による分岐鎖が結合している高分子グルカンであって、
平均分子量が1万〜50万であり、
α−1,6−グルコシド結合をイソアミラーゼで消化することにより直鎖状の単位鎖長に分解した後に、HPAEC−PAD法によって単位鎖長分布を分析すると、下記特性(i)〜(iii)を満たす、高分子グルカン:
(i)重合度6〜10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度1〜5を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP1-5/DP6-10)×100)が33〜50%である。
(ii)重合度6〜10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度11〜15を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP11-15/DP6-10)×100)が80〜125%である。
(iii)重合度6〜10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度26〜30を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP26-30/DP6-10)×100)が16〜43%である。 - 更に、前記単位鎖長分布を分析すると、下記特性(iv)〜(vii)の内、少なくとも1つを満たす、請求項1に記載の高分子グルカン:
(iv)重合度6−10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度16−20を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP16-20/DP6-10)×100)が53〜85%である。
(v)重合度6−10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度21−25を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP21-25/DP6-10)×100)が31〜62%である。
(vi)重合度6−10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度31−35を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP31-35/DP6-10)×100)が8〜30%である。
(vii)重合度6−10を示す各ピークのエリア面積の合計値に対して、重合度36−40を示す各ピークのエリア面積の合計値の割合((DP36-40/DP6-10)×100)が3〜21%である。 - 下記in vitro消化性試験において求められる初期消化速度係数kが0.029未満であり、且つ酵素反応開始から120分間までに分解されない成分の割合が10%未満である、請求項1又は2に記載の高分子グルカン:
[in vitro消化性試験の方法]
5w/v%高分子グルカン水溶液100μL、1M酢酸バッファー(pH5.5)20μL、蒸留水716μLを混合し、更に250U/mLの濃度のブタ膵臓由来α−アミラーゼ液4μL、及びα−グルコシダーゼ活性で0.3U/mLに相当する濃度のラット小腸アセトンパウダー液160μLを添加して37℃で反応を開始する。経時的に、各反応液中のグルコース濃度を測定し、高分子グルカンから遊離したグルコース量を測定する。
初期消化速度係数kは、下記式に従って算出する。
- 前記in vitro消化性試験において、酵素反応開始から20分間までに分解される成分の割合が45%未満であり、且つ酵素反応開始20分後から120分間後までの間で分解される成分の割合が50%以上である、請求項1〜3のいずれかに記載の高分子グルカン。
- α−1,4−グルコシド結合による主鎖の非還元末端がα−1,6−グルコシド結合による分岐構造を有していない、請求項1〜4のいずれかに記載の高分子グルカン。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンを含む、飲食品。
- 血糖値及び/又は血中インスリン濃度の上昇抑制用である、請求項6に記載の飲食品。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンを含む、輸液。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンを含む、医薬品。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンの製造方法であって、
分岐状グルカンを基質として、ブランチングエンザイム100〜4,000U/g基質と、4−α−グルカノトランスフェラーゼとを、同時に又は任意の順で段階的に反応させ、請求項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止する、
高分子グルカンの製造方法。 - 請求項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンの製造方法であって、
分岐状グルカンを基質として、ブランチングエンザイム100〜4,000U/g基質を反応させ、次いでエキソ型アミラーゼを反応させ、請求項1〜5のいずれかに記載の高分子グルカンが生成している時点で反応を停止する、
高分子グルカンの製造方法。 - 前記4−α−グルカノトランスフェラーゼが、アミロマルターゼ及び/又はシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼである、請求項10に記載の製造方法。
- 前記エキソ型アミラーゼが、β−アミラーゼである、請求項11に記載の製造方法。
- 前記分岐状グルカンが、ワキシー澱粉である、請求項10〜13のいずれかに記載の製造方法。
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