JP2011502507A - 非天然アミノ酸を含有する蛋白質を使用する指向的進化 - Google Patents

非天然アミノ酸を含有する蛋白質を使用する指向的進化 Download PDF

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Abstract

本発明は非天然アミノ酸を含有する変異体を含むポリペプチドライブラリーをスクリーニングするための方法と組成物を提供する。更に、本発明は核酸をベクターにパッケージングするためのベクターパッケージングシステム及び方法を提供する。前記方法及びシステムにより作製されたベクター組成物も提供する。
【選択図】図１

Description

（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国予備特許出願第６１／００１，６８１号、発明の名称「非天然アミノ酸を含有する蛋白質を使用する指向的進化（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）」、発明者Ｌｉｕら、出願日２００７年１１月２日、米国予備特許出願第６１／１２７，２６２号、発明の名称「非天然アミノ酸を含有する蛋白質を使用する指向的進化（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）」、発明者Ｌｉｕら、出願日２００８年５月８日、及び米国予備特許出願第６１／１９４，７７３号、発明の名称「非天然アミノ酸を含有する蛋白質を使用する指向的進化（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）」、発明者Ｌｉｕら、出願日２００８年９月２９日の優先権と特典を主張し、その開示内容全体を全目的で本願に援用する。
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明は米国国立衛生研究所助成番号５Ｒ０１ＧＭ６２１５９と米国国立科学財団プレドクター奨学金による米国政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利をもつ。
（発明の技術分野）
本発明は蛋白質化学、例えば翻訳生化学の分野に関する。本発明は非天然アミノ酸を含有するポリペプチド変異体のライブラリーをスクリーニングするための方法と組成物に関する。本発明は更に非天然アミノ酸を組込んだベクター蛋白質及び／又は異種蛋白質を含むベクターを作製するためのシステム、組成物及び方法に関する。
蛋白質は光合成からシグナル伝達や免疫応答に至る複雑な生命プロセスのほぼ全てを行う。これらの複雑な活動を解明するためには、蛋白質がその機能を実施するために他の分子とどのように相互作用するかを突き止めることが有用であろう。ポリペプチドライブラリースクリーニング技術はこれらの分子相互作用を調査し、操作するのに非常に有用なツールである。一般に、ポリペプチドライブラリーのスクリーニングは複数のポリペプチド変異体を発現させた後に、該当機能を示す変異体、例えば特定リガンドと結合する変異体を単離増幅する方法に依存している。しかし、このような変異体の単離はライブラリーダイバーシティの維持に決定的に依存する。
ライブラリーのポリペプチド変異体間の発現率の変動はライブラリーダイバーシティの維持、従って、機能的配列の選択に有害であると思われる。例えば、スクリーニング基準に合致しているからではなく、単に増殖優位性により過剰発現されるという理由から、スクリーニング、単離及び増幅サイクルの反復後の集団で所定の高度に発現される変異体が増加する場合がある。その結果、低レベルで発現される望ましい変異体が過少評価されたり、場合によっては見落とされる場合もある。天然アミノ酸のみを含有する蛋白質に有利な固有のインビボ発現バイアスにより、特に非天然アミノ酸を含有するポリペプチド変異体ではこのような事態が発生する。
発現されるポリペプチド変異体の集団、特に非天然アミノ酸を含有する変異体を含む集団における変異体のダイバーシティに悪影響を与えずに、このような集団全体にわたって発現レベルを調節する新規ストラテジーが当分野で必要とされている。本発明は以下の開示から明らかなように、上記及び他の必要を満たすものである。
ユニークな官能基をもつ非天然アミノ酸をポリペプチドに部位特異的に組込むことにより、立体的、化学的又は生物学的性質を強化又は新規にしたポリペプチドを作製することが可能になった。非天然アミノ酸を含有する変異体を含むポリペプチドライブラリーをスクリーニングすることによりこのような望ましいポリペプチド候補を同定することができる。しかし、ライブラリーの全ポリペプチド変異体が制御下に発現されない場合には、望ましい変異体、特に非天然アミノ酸を含有する変異体は過少評価されたり見落とされる可能性がある。
発現されるペプチド変異体の集団全体にわたって発現レベルを調節する新規ストラテジーが必要とされている。本発明は非天然アミノ酸を含有する変異体を含むポリペプチドライブラリーの新規組成物と、このようなライブラリーの新規スクリーニング方法を提供する。更に、本発明は上記ポリペプチドライブラリーを開発するために使用することができる新規ベクターのパッケージング方法及びシステムも提供する。
本発明は１種以上の該当機能についてポリペプチド変異体のライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。前記方法は発現される変異体の平均比が１０：１以下となるように複数のポリペプチド変異体の発現を正規化する段階を含む。場合により、発現される変異体の比は５：１以下、又は１：１とすることができる。前記方法は更に、観測される該当機能の差異が変異体の活性の差異と相関するように、複数の変異体から該当機能を示す変異体を選択する段階を含む。ライブラリーは少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有する少なくとも１個のポリペプチド変異体を含む複数のポリペプチド変異体を含むことができる。場合により、複数のポリペプチド変異体は各々少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有することができる。ポリペプチド変異体のライブラリーをスクリーニングする段階は場合により本明細書に記載する各種ポリペプチド変異体のいずれか１種のライブラリーをスクリーニングする段階を含む。
前記方法では、変異体の発現を正規化すると、場合により選択の感度を改善することができる。該当機能を示す変異体を選択する段階は、発現される変異体の比が１：１０以下であるときに検出可能な該当機能の差異を選択する段階を含むことができる。場合により、該当機能を示す変異体を選択する段階は、発現される変異体の比が１：５以下であるときに検出可能な該当機能の差異を選択する段階を含むことができる。
本発明は更に複数の発現されるポリペプチド変異体を含む組換えポリペプチド発現ライブラリーを提供する。ライブラリー内の発現されるポリペプチド変異体は場合により本明細書に記載する各種ポリペプチド変異体のいずれか１種を含むことができる。複数の変異体の各々は場合により１０：１以下、５：１以下、又は１：１のモル比でライブラリーに存在することができる。例えば、組換えポリペプチド発現ライブラリーは、各ファージが組換えポリペプチド変異体（例えば抗体フラグメント変異体）をその外面に提示する複数の組換えＭ１３由来ファージを含むことができる。場合により、組換えポリペプチド発現ライブラリーは、各ファージが２個以上の同一の組換えポリペプチド変異体（例えば抗体フラグメント変異体）をその外面に提示する複数の多価組換えＭ１３由来ファージを含むことができる。
場合により、変異体の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、又は４個以上は少なくとも１個の非天然アミノ酸残基を含有することができる。ポリペプチド変異体の少なくとも１個は場合により少なくとも１個の非天然アミノ酸残基、少なくとも２個の異なる非天然アミノ酸残基、又は３個以上の異なる非天然アミノ酸残基を含有することができる。ポリペプチド変異体は場合により本明細書に記載する非天然アミノ酸のいずれかを含有することができる。
本発明は核酸発現ライブラリーも提供する。核酸発現ライブラリーは構築物のポリペプチド産物が１０：１以下、５：１以下、又は１：１の比でライブラリーに存在するように発現させることができる複数の組換え核酸発現構築物を含む。構築物により発現されるポリペプチド産物は場合により本明細書に記載する各種ポリペプチド変異体のいずれか１種を含むことができる。
発現構築物のうちの少なくとも１個のコーディング領域は、少なくとも１個の非天然アミノ酸残基がポリペプチド産物の少なくとも１個に組込まれるように、少なくとも１個のセレクターコドンを含むことができる。セレクターコドンとしては終止コドン、４塩基コドン、レアコドン、又は非コーディングコドンが挙げられる。組換え核酸発現構築物により発現されるポリペプチド産物の少なくとも１個に組込まれる非天然アミノ酸残基としては、場合により本明細書に記載する非天然アミノ酸のいずれかが挙げられる。
更に、本発明は複数のポリペプチド変異体を含む発現産物のライブラリーを提供する。ポリペプチド変異体は場合により本明細書に記載する各種ポリペプチド変異体のいずれか１種を含むことができる。ポリペプチド変異体は各々少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有することができる。非天然アミノ酸としては、場合により本明細書に記載する非天然アミノ酸のいずれかが挙げられる。変異体は場合により１０：１以下、５：１以下、又は１：１の比でライブラリーに存在することができる。
ポリペプチド変異体のライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用されている技術の１つはファージディスプレイ法であり、上記方法及び組成物で容易に使用することができる技術である。ファージディスプレイ法はポリペプチド変異体をコードする遺伝子をバクテリオファージコート又はキャプシド蛋白質の遺伝子と融合するインビトロ選択技術である。コードされる融合蛋白質は発現時にファージの外面に提示されるが、融合蛋白質残基をコードする核酸はファージ自体の内側に保持される。ファージディスプレイ法における表現型と遺伝子型の物理的関係は所望のポリペプチド変異体をコードするファージの選択的単離及び増幅を可能にするだけでなく、多数の変異体を同時にスクリーニングできるという理由から有利である。本発明の下記側面はベクターアセンブリ用の新規システム及び方法と、ファージディスプレイ法に有用な新規ベクターの組成物を提供する。
本発明はベクター核酸を含むベクターパッケージングシステムを提供する。ベクター核酸はパッケージング部位を含むか又はコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含む標的ポリペプチドをコードする。ベクターパッケージングシステムは更に少なくとも１個のセレクターコドンを含むパッケージング又は特異性ポリペプチドをコードする相補核酸を含む。場合により、このセレクターコドンは標的ポリペプチドによりコードされるセレクターコドンと同一とすることができる。ベクターのアセンブリ時にパッケージング又は特異性ポリペプチドをベクター核酸又はベクター核酸のコピーもしくは転写産物でパッケージングすることができる。更に、ベクターパッケージングシステムは非天然アミノ酸を負荷された直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む。Ｏ−ｔＲＮＡは標的ポリペプチド及び／又はパッケージングもしくは特異性ポリペプチドによりコードされるセレクターコドンを認識することができ、その翻訳を可能にする。
ベクターパッケージングシステムのベクター核酸は融合蛋白質を含む標的ポリペプチドをコードすることができる。融合蛋白質は場合によりリボソーム合成抗体フラグメント又はその誘導体、及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことができる。標的ポリペプチド及び／又はパッケージングもしくは特異性ポリペプチドによりコードされるセレクターコドンとしては、場合により終止コドン、４塩基コドン、レアコドン又は非コーディングコドンが挙げられる。ベクターパッケージングシステムのパッケージング又は特異性ポリペプチドはウイルスキャプシド又はエンベロープ蛋白質（例えばＭ１３ファージｐＩＩＩキャプシド蛋白質）から構成することができる。ベクターパッケージングシステムは場合によりインビトロ翻訳系から構成することができる。別の側面において、ベクターパッケージングシステムは場合により細胞（例えば哺乳動物、昆虫、細菌又は大腸菌細胞）から構成することができる。システムは直交ｔＲＮＡに非天然アミノ酸（例えばビピリジルアラニン）を負荷することが可能な直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、非天然アミノ酸（例えばビピリジルアラニン、ｐ−ボロノフェニルアラニン、スルホチロシン又はパラアセチルフェニルアラニン）を含むことができる。
１態様において、ベクターパッケージングシステムはＭ１３ファージパッケージング配列を含むファージミドを含む。ファージミドはセレクターコドンを含むことができる融合蛋白質（例えば少なくとも１個のセレクターコドンを含む抗体フラグメントを含む融合蛋白質）をコードすることができる。ベクターパッケージングシステムは更に少なくとも１個のセレクターコドン、場合により融合蛋白質と同一のセレクターコドンを含む突然変異体ｐＩＩＩポリペプチドをコードするプラスミドを含む。突然変異体ｐＩＩＩポリペプチドはファージミドのコピーでパッケージングされる。更に、ベクターパッケージングシステムは非天然アミノ酸残基を負荷された直交ｔＲＮＡを含む。負荷された直交ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、ベクターパッケージングシステムによる突然変異体ｐＩＩＩポリペプチドと抗体フラグメント融合蛋白質の翻訳を可能にする。
１関連側面において、本発明は標的ポリペプチドをコードするパッケージングされた核酸と、パッケージングされた核酸によりコードされる標的ポリペプチドを含むベクターを提供する。ベクターはウイルスキャプシドから構成することができ、哺乳動物ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、昆虫ウイルス、バキュロウイルス又はバクテリオファージ（例えば組換えＭ１３由来バクテリオファージ）に由来することができる。パッケージングされた核酸はパッケージング部位を含むか又はコードすることができ、パッケージングされた核酸によりコードされる標的ポリペプチドは融合蛋白質、例えばリボソーム合成抗体フラグメント、その誘導体及び／又は相補性決定領域を含む融合蛋白質から構成することができる。標的ポリペプチドは場合によりベクターの外面に提示される。更に、ベクターはベクターに宿主細胞特異性を付与し、少なくとも１個の非天然アミノ酸残基を含有する特異性ポリペプチドを含む。特異性ポリペプチドは場合によりウイルスキャプシド蛋白質（例えばＭ１３ファージｐＩＩＩ蛋白質）又はウイルスエンベロープ蛋白質から構成することができる。
別の態様において、ベクターは少なくとも１個のセレクターコドンを含む標的ポリペプチドをコードするパッケージングされた核酸と、少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有するパッケージングされた核酸によりコードされる標的ポリペプチドを含む。標的ポリペプチドは場合によりベクターの外面に提示される。更に、ベクターは核酸をパッケージングするか、又はベクターに宿主細胞特異性を付与するパッケージング又は特異性ポリペプチドを含む。パッケージング又は特異性ポリペプチドは少なくとも１個の非天然アミノ酸、場合により標的ポリペプチドと同一の非天然アミノ酸を含む。
例えば、ベクターは少なくとも１個のセレクターコドンを含む抗体フラグメントを含む融合蛋白質をコードするファージミドを含む組換えＭ１３由来ファージから構成することができる。ベクターは更に少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有する抗体フラグメントを含む融合蛋白質を含むことができる。融合蛋白質は組換えＭ１３由来ファージの外面に提示することができる。更に、ベクターは融合蛋白質と同一の少なくとも１個の非天然アミノ酸（例えば本明細書に記載する任意の非天然アミノ酸）を含有するｐＩＩＩポリペプチドを含むことができる。
本発明はベクター核酸のパッケージング方法を提供する。本方法はベクター核酸を発現させ、少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有する標的ポリペプチドを産生させる段階と、相補核酸を発現させ、標的ポリペプチドと同一の少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有するパッケージング又は特異性ポリペプチドを産生させる段階を含む。前記方法は更に、ベクター核酸又はそのコピーもしくは転写産物をパッケージング又は特異性ポリペプチドと標的ポリペプチドに結合させ、ベクター核酸をパッケージングする段階を含む。
前記方法において、発現させるベクター核酸はパッケージング部位と少なくとも１個のセレクターコドンを含む標的ポリペプチドを含むか又はコードすることができる。発現させる相補核酸は標的ポリペプチドと同一の少なくとも１個のセレクターコドンを含むパッケージング又は特異性ポリペプチドをコードする相補核酸から構成することができる。ベクター核酸及び／又は相補核酸はベクター核酸及び／又は相補核酸を細胞に形質転換、形質導入、共役、安定的トランスフェクション又は一過性トランスフェクションする等の各種アプローチのいずれかにより発現させることができる。ベクター核酸を発現させて標的ポリペプチドを産生させる段階又は相補核酸を発現させてパッケージングもしくは特異性ポリペプチドを産生させる段階は、標的ポリペプチド及び／又はパッケージングもしくは特異性ポリペプチドをコードするＲＮＡの合成を誘導する段階を含む。
ベクター核酸又はそのコピーもしくは転写産物をパッケージング又は特異性ポリペプチドと標的ポリペプチドに結合させる段階は、例えばベクター核酸を導入した大腸菌株を培養する段階と、大腸菌株に導入したベクター核酸を発現させ、標的ポリペプチドを産生させる段階と、例えば相補核酸を含むヘルパーファージを大腸菌に感染させることにより相補核酸を提供する段階と、相補核酸を発現させ、パッケージング又は特異性ポリペプチドを産生させる段階を含むことができる。ベクター核酸をパッケージングする段階は、ベクター核酸を別のポリペプチド（例えばポリメラーゼ、ウイルスマトリックス蛋白質又はウイルスコア蛋白質）と結合させる段階を含む。前記方法の各段階は場合により細胞（例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞又は大腸菌細胞）で実施される。
例えば、１態様において、ベクタープラスミドのパッケージング方法はベクタープラスミドを発現させ、抗体フラグメントを含む融合蛋白質を産生させる段階を含む。前記フラグメントは少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有することができる。前記方法は相補プラスミドを発現させ、融合蛋白質と同一の少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有する突然変異体ｐＩＩＩ蛋白質を産生させる段階を含む。ベクタープラスミドのコピーを突然変異体ｐＩＩＩと融合蛋白質に結合させ、ベクタープラスミドをパッケージングする。
キットも本発明の特徴である。キットは例えば本発明の方法を実施するための説明書と共に、例えば適当な容器にパッケージングされた本発明の組成物のいずれかを含むことができる。
当業者に自明の通り、本発明により提供される方法、キット、システム及び組成物は単独で使用してもよいし、併用してもよい。例えば、本明細書に記載する方法のいずれかにより、例えば各々少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有する正規化発現産物のライブラリーを含有する組成物をポリペプチド変異体の１種以上の該当機能についてスクリーニングすることができる。代替又は付加態様によると、これらのライブラリーは本発明により提供されるベクターパッケージングシステムのいずれかにより作製することができる。本明細書に記載する本発明の特徴のその他の組合せも当業者に理解されよう。
（定義）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定装置又は生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの記載を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形の定冠詞はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）」と言う場合にはそうでないことが内容から明白である場合を除き、２個以上のＲＳ分子の組合せを含み、「細菌と言う場合には細菌の混合物を含み、他の用語についても同様である。
特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。本発明の試験の実施には本明細書に記載するものに類似又は等価の任意方法及び材料を使用することができるが、好ましい材料と方法は本明細書に記載するものである。本発明の記載及び特許請求の範囲において、以下の用語は以下の定義に従って使用される。
相補核酸：「相補核酸」なる用語はパッケージング又は特異性ポリペプチドをコードする核酸を意味する。相補核酸の１例としては、Ｍ１３ファージアセンブリ及び感染を可能にするｐＩＩＩ蛋白質をコードする組換えＭ１３由来ファージＭ１３ＫＯ７のゲノムが挙げられる。
コードする：本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列鎖とは異なる第２の分子又は配列鎖の生産を誘導するためにポリマー巨大分子又は配列鎖中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。所定側面において、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードさせるための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。別の側面において、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質をもつ第２の分子の生産を誘導するために第１の分子の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用する転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。更に、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスにおけるようにポリペプチドをコードすることができる。翻訳プロセスについて使用する場合に、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードするトリプレットコドンにも適用する。所定側面において、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用する逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面において、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用する「コードする」とは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を意味する。
融合蛋白質：本明細書で使用する「融合蛋白質」とは、天然では一緒になって１つの発現産物として発現されない２個以上の核酸分子の発現産物を意味する。例えば、天然では一緒になって１つの発現産物として発現されないサブユニットＡ及びサブユニットＢを含む天然蛋白質Ｘは融合蛋白質ではない。しかし、当分野で公知の組換えＤＮＡ法を使用し、サブユニットＡ及びＢを一緒に１つの発現産物として発現させると、サブユニットＢに融合したサブユニットＡを含む融合蛋白質が得られる。融合蛋白質は異種アミノ酸配列（例えば同一起源ではない配列、同一蛋白質ファミリーではない配列、機能的に類似しない配列等）から構成してもよい。
ライブラリー：「ライブラリー」なる用語は当分野でのその一般的な用法に従い、該当分子の集合を表すために使用される。例えば、ポリペプチドライブラリーとは発現されるポリペプチド又はポリペプチド変異体の集合である。本発明のポリペプチド変異体は場合により、各ライブラリーが関連ポリペプチドのレパートリーを含むか又はコードするようにランダムに変異又は選択的に変異した残基を含み、個々のポリペプチドは配列が相互に異なる。ファージディスプレイ等による選択用に開発されるライブラリーにも同一原理が適用される。
正規化ライブラリー：本明細書で使用する「正規化ライブラリー」なる用語は各分子の発現量がライブラリーの他の分子に対して平均で特定範囲内、例えば約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１又は約０．９：１となる該当分子の集合を含むライブラリーを意味する。
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共働するか、あるいは細胞の内在成分と共働できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、内在ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働する能力に比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は低効率（例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率）でしか共働できず、あるいは、内在ｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働する能力に比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は低効率でしか共働できないことを意味する。直交分子は細胞内に機能的に正常な相補的内在分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが該当細胞の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。第１の直交分子と共働する第２の「コグネイト」直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対照（例えば対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内在対、又は活性直交対（例えばチロシル直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対））の効率に比較して所定の効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞において共働する導入相補成分を含む。従って、Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ対は良好な効率で共働し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを妥当な効率でアミノアシル化するが、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡをアミノアシル化しないか又は内在ｔＲＮＡを少なくとも不良にしかアミノアシル化せず、Ｏ−ｔＲＮＡは内在ＲＳにより不良にしか又は全くアミノアシル化されない。
パッケージング部位：パッケージング部位とは、結合性ベクター粒子、例えばウイルスキャプシドの内側にベクター核酸を効率的且つ特異的に組込ませるベクター核酸の配列中のシス調節エレメントである。
パッケージング又は特異性ポリペプチド：本明細書で使用する「パッケージング又は特異性ポリペプチド」なる用語はベクター粒子の最も外側の構造の構成の必須成分であるか、及び／又はベクターの宿主範囲を決定するポリペプチドを意味する。パッケージング又は特異性ポリペプチドの例としては、Ｆ＋大腸菌のＭ１３ファージアセンブリとＭ１３感染の両者に中心的役割を果たすＭ１３ファージｐＩＩＩポリペプチド、λファージアセンブリに中心的役割を果たすλファージｇｐＥ、及びヘルペスウイルスキャプシドの安定性に不可欠であるヘルペスウイルスＶＰ５が挙げられる。
ポリペプチド：ポリペプチドは必ずしもそうでなくてもよいが、一般に共有ペプチド結合により結合した任意長のアミノ酸（天然又は非天然又はその組み合わせ）の任意オリゴマーである。ポリペプチドは任意起源に由来することができ、例えば天然に存在するポリペプチド、組換え分子遺伝技術により作製されたポリペプチド、細胞もしくは翻訳系に由来するポリペプチド、又は無細胞合成手段により作製されたポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドはそのアミノ酸配列（例えばその成分アミノ酸残基の一次構造）により特徴付けられる。本明細書で使用するポリペプチドのアミノ酸配列とは全長配列に限定されず、部分配列でも完全配列でもよい。更に、ポリペプチドは特定生理活性の有無により限定されない。本明細書で使用する「蛋白質」なる用語はポリペプチドと同義である。「ペプチド」なる用語は限定されないが、例えば２〜２５アミノ酸長の短いポリペプチドを意味する。
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン）等のナンセンスコドン、４塩基以上のコドン、レアコドン、天然もしくは非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
特異性ポリペプチド：本明細書で使用する「特異性ポリペプチド」なる用語はベクターの宿主範囲を決定するポリペプチドを意味する。特異性ポリペプチドの例としてはＭ１３を大腸菌に感染させるＭ１３ファージｐＩＩＩポリペプチドと、大腸菌のλ感染を可能にするλファージＪ蛋白質が挙げられる。
標的ポリペプチド：本明細書で使用する「標的ポリペプチド」なる用語はベクター核酸によりコードされるポリペプチド（例えばＭ１３におけるｐＩＩＩ融合蛋白質、バキュロウイルスにおけるｇｐ６４融合蛋白質、Ｔ７ファージにおける１０ｂ融合蛋白質、及びλファージにおけるＤ融合蛋白質）を意味する。
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種類の標準天然アミノ酸の１種又はセレノシステインもしくはピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体を意味する。例えば、本発明では非天然アミノ酸としてビピリジルアラニンとスルホチロシンを利用する。
ベクター：「ベクター」とは、核酸を含有しており、場合により単離した核酸を宿主細胞の内側に送達するために使用することができる組成物である。多数のベクターが当分野で公知であり、限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、バクテリオファージ、プラスミド及びウイルスが挙げられる。従って、ベクター」なる用語は限定されないが、自律複製プラスミド又はウイルスを包含し、パッケージングされたものでも裸のものでもよい。ウイルスベクターの例としては限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及び他の組換えウイルスが挙げられる。
ベクター核酸：本明細書で使用する「ベクター核酸」とは標的ポリペプチドをコードする核酸であり、前記核酸又はそのコピーもしくは転写産物をベクターの内側にパッケージングし、ベクターにより宿主細胞の内側に送達するものを意味する。
本発明により提供されるベクターパッケージングシステムの模式図である。
本発明により提供される方法により作製することができるベクターの１オプション態様を示す。
本発明により作製することができるベクターの第２のオプション態様を示す。
ファージがＦａｂをその外面に提示するか否かを判定するために実施した実験の結果を示す。
非天然アミノ酸を含有するＦａｂ変異体の３種類のライブラリーを作製するために使用したオリゴヌクレオチド配列を示す。
ニッケル樹脂と結合するＦａｂを単離するためのスクリーニングの結果を示す。
図７ａ〜ｄは実施例２に記載する実験で使用した４種類の非天然アミノ酸の構造を示す。図７ｅ〜ｆは非天然アミノ酸を含有するｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合蛋白質を実施例２で使用したＭ１３由来ファージの表面に提示できることを確認するために実施した実験の結果を示す。 図７ａ〜ｄは実施例２に記載する実験で使用した４種類の非天然アミノ酸の構造を示す。図７ｅ〜ｆは非天然アミノ酸を含有するｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合蛋白質を実施例２で使用したＭ１３由来ファージの表面に提示できることを確認するために実施した実験の結果を示す。
ケト−Ｘ−大腸菌、ＳＹ−Ｘ−大腸菌、Ｂｐｙ−Ｘ−大腸菌、又はボロ Ｘ−大腸菌でｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＮＮＫライブラリーからのファージ発現後にＴＡＧコドンを含むファージクローンの百分率を測定するために実施した実験の結果を示す。
初期ライブラリーと３回目の選択後のライブラリーからのファージ収率に比較して培養液１ｍＬ当たりの４１２ｄ−２ＳＹのファージ収率を測定するために実施した実験の結果を示す。
スルホチロシンをチロシンで置換した４１２ｄ−Ｙと比較したドープ４１２ｄライブラリーから選択した４１２ｄ−２ＳＹとのｇｐ１２０結合のファージＥＬＩＳＡの結果を示す。
図１１ａ〜ｂは各連続回の選択後にｇｐ１２０と結合することが可能なクローンが増加したことと、各連続回の選択後に非天然アミノ酸スルホチロシンを含有するクローンが増加したことを証明するために実施した実験の結果を示す。 図１１ａ〜ｂは各連続回の選択後にｇｐ１２０と結合することが可能なクローンが増加したことと、各連続回の選択後に非天然アミノ酸スルホチロシンを含有するクローンが増加したことを証明するために実施した実験の結果を示す。
初期ファージライブラリーと３回目の選択後のライブラリーからのファージ収率と比較して６６ＣＣ８−ＳＹを提示するファージの培養液１ｍＬ当たりの収率を測定するために実施した実験の結果を示す。
ｇｐ１２０に対する６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ、６６ＣＣ１４及び４１２ｄ−２ＳＹの親和性を測定するために実施したＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。 ｇｐ１２０に対する６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ、６６ＣＣ１４及び４１２ｄ−２ＳＹの親和性を測定するために実施したＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
図１４ａは抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰ抗体を使用し、金属増感型ＤＡＢキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させたプロテインＧ精製Ｆａｂのウェスタンブロット分析を示す。サンプルを変性ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）上に泳動させた。６６ＣＣ８−ＳＹ及び４１２ｄ−ＳＹでは、硫酸化抗体発現がスルホチロシンの存在に依存することを立証するために、スルホチロシンの不在下の発現に対応するレーンも示す。図１４ｂ〜ｆは夫々Ｆａｂ ６６ＣＣ１４、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ、４１２ｄ−ＳＹ及び４１２ｄ−ＹのＬＣＭＳ（ＥＳＩ陽性）スペクトルを示す。図１４ｇは精製Ｆａｂ ４１２ｄ−２ＳＹ、４１２ｄ−Ｙ、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８及び６６ＣＣ１４とｇｐ１２０の結合を測定するＥＬＩＳＡの結果を示す。 図１４ａは抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰ抗体を使用し、金属増感型ＤＡＢキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させたプロテインＧ精製Ｆａｂのウェスタンブロット分析を示す。サンプルを変性ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）上に泳動させた。６６ＣＣ８−ＳＹ及び４１２ｄ−ＳＹでは、硫酸化抗体発現がスルホチロシンの存在に依存することを立証するために、スルホチロシンの不在下の発現に対応するレーンも示す。図１４ｂ〜ｆは夫々Ｆａｂ ６６ＣＣ１４、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ、４１２ｄ−ＳＹ及び４１２ｄ−ＹのＬＣＭＳ（ＥＳＩ陽性）スペクトルを示す。図１４ｇは精製Ｆａｂ ４１２ｄ−２ＳＹ、４１２ｄ−Ｙ、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８及び６６ＣＣ１４とｇｐ１２０の結合を測定するＥＬＩＳＡの結果を示す。 図１４ａは抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰ抗体を使用し、金属増感型ＤＡＢキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させたプロテインＧ精製Ｆａｂのウェスタンブロット分析を示す。サンプルを変性ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）上に泳動させた。６６ＣＣ８−ＳＹ及び４１２ｄ−ＳＹでは、硫酸化抗体発現がスルホチロシンの存在に依存することを立証するために、スルホチロシンの不在下の発現に対応するレーンも示す。図１４ｂ〜ｆは夫々Ｆａｂ ６６ＣＣ１４、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ、４１２ｄ−ＳＹ及び４１２ｄ−ＹのＬＣＭＳ（ＥＳＩ陽性）スペクトルを示す。図１４ｇは精製Ｆａｂ ４１２ｄ−２ＳＹ、４１２ｄ−Ｙ、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８及び６６ＣＣ１４とｇｐ１２０の結合を測定するＥＬＩＳＡの結果を示す。 図１４ａは抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰ抗体を使用し、金属増感型ＤＡＢキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させたプロテインＧ精製Ｆａｂのウェスタンブロット分析を示す。サンプルを変性ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）上に泳動させた。６６ＣＣ８−ＳＹ及び４１２ｄ−ＳＹでは、硫酸化抗体発現がスルホチロシンの存在に依存することを立証するために、スルホチロシンの不在下の発現に対応するレーンも示す。図１４ｂ〜ｆは夫々Ｆａｂ ６６ＣＣ１４、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ、４１２ｄ−ＳＹ及び４１２ｄ−ＹのＬＣＭＳ（ＥＳＩ陽性）スペクトルを示す。図１４ｇは精製Ｆａｂ ４１２ｄ−２ＳＹ、４１２ｄ−Ｙ、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８及び６６ＣＣ１４とｇｐ１２０の結合を測定するＥＬＩＳＡの結果を示す。 図１４ａは抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰ抗体を使用し、金属増感型ＤＡＢキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させたプロテインＧ精製Ｆａｂのウェスタンブロット分析を示す。サンプルを変性ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）上に泳動させた。６６ＣＣ８−ＳＹ及び４１２ｄ−ＳＹでは、硫酸化抗体発現がスルホチロシンの存在に依存することを立証するために、スルホチロシンの不在下の発現に対応するレーンも示す。図１４ｂ〜ｆは夫々Ｆａｂ ６６ＣＣ１４、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ、４１２ｄ−ＳＹ及び４１２ｄ−ＹのＬＣＭＳ（ＥＳＩ陽性）スペクトルを示す。図１４ｇは精製Ｆａｂ ４１２ｄ−２ＳＹ、４１２ｄ−Ｙ、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８及び６６ＣＣ１４とｇｐ１２０の結合を測定するＥＬＩＳＡの結果を示す。 図１４ａは抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰ抗体を使用し、金属増感型ＤＡＢキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させたプロテインＧ精製Ｆａｂのウェスタンブロット分析を示す。サンプルを変性ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）上に泳動させた。６６ＣＣ８−ＳＹ及び４１２ｄ−ＳＹでは、硫酸化抗体発現がスルホチロシンの存在に依存することを立証するために、スルホチロシンの不在下の発現に対応するレーンも示す。図１４ｂ〜ｆは夫々Ｆａｂ ６６ＣＣ１４、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ、４１２ｄ−ＳＹ及び４１２ｄ−ＹのＬＣＭＳ（ＥＳＩ陽性）スペクトルを示す。図１４ｇは精製Ｆａｂ ４１２ｄ−２ＳＹ、４１２ｄ−Ｙ、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８及び６６ＣＣ１４とｇｐ１２０の結合を測定するＥＬＩＳＡの結果を示す。 図１４ａは抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰ抗体を使用し、金属増感型ＤＡＢキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させたプロテインＧ精製Ｆａｂのウェスタンブロット分析を示す。サンプルを変性ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）上に泳動させた。６６ＣＣ８−ＳＹ及び４１２ｄ−ＳＹでは、硫酸化抗体発現がスルホチロシンの存在に依存することを立証するために、スルホチロシンの不在下の発現に対応するレーンも示す。図１４ｂ〜ｆは夫々Ｆａｂ ６６ＣＣ１４、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ、４１２ｄ−ＳＹ及び４１２ｄ−ＹのＬＣＭＳ（ＥＳＩ陽性）スペクトルを示す。図１４ｇは精製Ｆａｂ ４１２ｄ−２ＳＹ、４１２ｄ−Ｙ、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８及び６６ＣＣ１４とｇｐ１２０の結合を測定するＥＬＩＳＡの結果を示す。
本発明は非天然アミノ酸を含有するポリペプチドに不利な固有のインビボ発現バイアスを利用することにより、正規化ポリペプチド発現ライブラリーの作製を容易にする。この固有のバイアスにより、ライブラリーの非天然アミノ酸を含有するポリペプチド変異体は通常では過少発現されたり、見落とされたり、あるいは該当機能をスクリーニングするために使用されるアッセイで検出されない。しかし、本発明はライブラリーの全変異体を正規化するためにスクリーニング可能な部分に組込まれるものと同一の少なくとも１個の非天然アミノ酸を生存に必要なポリペプチドに組込む方法に依存する。
本発明により提供される方法と組成物はライブラリーに多量に存在するポリペプチド変異体の冗長度を低下させ、希少変異体（例えば該当特性を強化することができる非天然アミノ酸を含有する変異体）の発現を助長するのに有用であると思われる。ライブラリーダイバーシティの維持は大半のポリペプチド発現ライブラリーの作製とスクリーニングの大問題の１つであるため、本発明は広範な原核、真核及び古細菌ポリペプチドライブラリースクリーニングシステムに有用であり、一般に適用可能である。
本明細書に記載する好ましい１態様において、本発明はファージディスプレイライブラリーで利用される。これらのライブラリーとしては、例えば非天然アミノ酸を含有する提示されるｐＩＩＩ融合ポリペプチド変異体のサブセットと同一の少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有するＭ１３ファージｐＩＩＩポリペプチドが挙げられる。一般に、該当機能（例えばリガンドとの結合）を示すファージを単離し、細菌（例えば大腸菌）で増幅する複数回の選択によりこのようなライブラリーをスクリーニングする。本発明は正規化ポリペプチドライブラリーを作製するために使用することができる新規ベクターをパッケージングするための方法及びシステムを提供する。
正規化ポリペプチドライブラリー
１側面において、本発明はスクリーニング可能な変異体に組込まれるものと同一の少なくとも１個の非天然アミノ酸を生存に必要なポリペプチドに組込むことによりポリペプチドライブラリーの変異体の発現を正規化する方法に関する。その結果、通常では非天然アミノ酸残基を含有する変異体のみに生じると同一の増殖不良がライブラリーの全メンバーに生じる。本発明により提供される方法はライブラリーの複数のポリペプチド変異体の発現を正規化する段階を含み、発現される変異体の比は場合により約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、又は例えば約０．９：１である。前記方法は蛋白質プローブシステム、例えばλｇｔ１１、表面提示システム（例えばファージディスプレイシステム、バキュロウイルスディスプレイシステム、酵母細胞表面提示システム、哺乳動物細胞表面提示システム、昆虫細胞表面提示システム、大腸菌細胞表面提示システム、酵母と哺乳動物の２種ハイブリッドシステム等）で利用することができる。
好ましい１態様では、ファージディスプレイシステム（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９８５）“Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｈａｇｅ：ｎｏｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｄｉｓｐｌａｙ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１３１５−７，ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ｓｅｒｇｅｅｖａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）“Ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｄｒｕｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ．”Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８：１６２２−５４）を本発明により応用することができる。好ましい１態様では、ファージディスプレイライブラリー（例えば組換えＭ１３由来ファージディスプレイライブラリー）のポリペプチド変異体のサブセットに組込まれるものと同一の非天然アミノ酸残基をファージパッケージング又は特異性ポリペプチド（例えばＭ１３ ｐＩＩＩポリペプチド）にも組込む。ファージ生存性はキャプシドへのパッケージング又は特異性ポリペプチド（例えばｐＩＩＩ）のアセンブリにも依存するので、天然アミノ酸のみを含有するポリペプチド変異体はライブラリーでの過剰発現につながる増殖優位性をもたなくなる。ファージディスプレイ態様の更に詳しい説明については別の欄で後述する。
別の有用な態様では、同一原理により、非天然アミノ酸を含有するλｇｔ１１ライブラリー（Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９８３）“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｂｅｓ．”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：１１９４−８）により産生されるポリペプチド変異体の発現レベルを、天然アミノ酸のみを含有する変異体の発現レベルで正規化することができる。１態様では、温度感受性ｃＩ突然変異体であるｃＩ８５７をコードするλファージ遺伝子を、ライブラリーの変異体に含まれるものと同一の少なくとも１個の非天然アミノ酸を更に含む機能的温度感受性ｃＩ突然変異体をコードする対立遺伝子で置換することによりこれを実施することができる。
野生型遺伝子の機能を補完し、変異体に組込まれるものと同一の少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有する蛋白質を産生する突然変異体対立遺伝子で必須Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子（例えばＰＤＡ１）の内在コピーを置換することにより、非天然アミノ酸を含有する変異体を含む酵母２ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）「プレイ」ライブラリーのメンバーの発現レベルを正規化することができる。（酵母２ハイブリッドシステムはＦｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）“Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”Ｎａｔｕｒｅ．３４０：２４５−２４６；Ａｒｍｏｕｒ，Ｃ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）“Ｆｒｏｍ ｄｒｕｇ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｔａｒｇｅｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：２０−２４；及びＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）“Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２６１：２４７−２６２に詳細に説明されている）。同一システムの代替態様では、ＵＭＰ合成に必須の代謝遺伝子ＵＲＡ１の内在コピーを変異体に存在するものと同一の少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有する相補的対立遺伝子で置換し、ウラシル栄養要求体が増殖できない条件下でライブラリースクリーニングを実施することにより、Ｙ２Ｈ「プレイ」ライブラリーメンバーの発現レベルの正規化を実施することができる。
同様に、少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有する機能的アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ蛋白質をコードするＮｅｏ対立遺伝子を適当な細胞株のゲノムに導入することにより、例えば哺乳動物細胞表面提示ライブラリー（Ｗｏｌｋｏｗｉｃｚ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）“Ａ ｒａｎｄｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ＣＣＲ５ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｍｅｏｔｏｐｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｖｉａ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：１５１９５−１５２０１）におけるポリペプチド変異体の発現の正規化を実施することができる。その後、ゲンタマイシンを添加した適当な培地で細胞を増殖させることができる。細胞のゲンタマイシン耐性は非天然アミノ酸を含有するスクリーニング可能なポリペプチド変異体に組込まれるものと同一の少なくとも１個の非天然アミノ酸残基をアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼに組込むことに依存する。こうして、ライブラリーの各ポリペプチド変異体の増殖率、従って発現レベルはより均一になる。
本発明のこの側面はアンカー型及びアンカーなしのペリプラズム発現システム（米国特許第７，０９４，５７１号）のようにポリペプチド変異体の発現レベルの正規化が有用な他のシステム又は技術に一般に適用可能であり、同様に応用することができる。この技術では、ポリペプチド変異体のライブラリーを構築し、場合により内膜のペリプラズム面に固定可能な融合蛋白質として又はペリプラズム区画を標的とするポリペプチドとしてグラム陰性菌で発現させることができる。化学的、物理的、遺伝的又は他の処理により細胞外膜を透過性にすると、ポリペプチド変異体は膜に固定されるか又は外液に添加した標的蛋白質に接近可能になる。本発明におけるように、このようなライブラリーが非天然アミノ酸残基から構成される変異体を含む場合には、例えば非天然アミノ酸を含有する機能的β−ラクタマーゼをコードする遺伝子を適切な細菌株に導入し、アンピシリンを添加した培地でスクリーニングを実施することにより全変異体の発現を正規化することができる。
ファージディスプレイライブラリーの正規化
好ましい１態様において、本発明はポリペプチドライブラリースクリーニングプロトコルで広く使用されている技術であるファージディスプレイ法（例えばＭ１３ファージディスプレイ法）で利用される。例えばＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，Ｖ．Ａ．（１９９７）“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ．”Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：３９１−４１０；Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．（２００１）“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｍ１３ ｆｏｒ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ．”Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１８：５７−６３；Ｒｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｍａｌａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９）“Ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｆｉｎｄｉｎｇ ａ ｎｅｅｄｌｅ ｉｎ ａ ｖａｓｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈａｙｓｔａｃｋ．”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：８７−９３；及びＷｉｌｌａｔｓ，Ｗ．Ｇ．Ｔ．（２００２）“Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ｐｒａｃｔｉｃａｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．”Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５０：８３７−８５４参照。一般に、ファージディスプレイライブラリーのポリペプチド変異体の提示は該当ポリペプチド変異体をファージキャプシド（コート）蛋白質、又はキャプシド蛋白質のフラグメント、突然変異体もしくは他の変異体と融合することにより実施される。これらのキャプシド蛋白質としては、ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩ及びｐＩＸが挙げられる。本発明を実証する目的で、本明細書の実施例ではファージｐＩＩＩコート蛋白質アミノ酸配列を含むファージ提示融合ポリペプチドの作製について記載する。しかし、本発明は組換えＭ１３由来ファージディスプレイライブラリーのポリペプチド変異体の提示にｐＩＩＩポリペプチド配列を使用することに限定されない。
上記のように、組換えＭ１３由来ファージディスプレイライブラリーの正規化は通常では非天然アミノ酸残基を含有する変異体のみに生じると同一の増殖不良をライブラリーの全ポリペプチド変異体に生じさせる方法に依存する。従って、第１の側面において、本発明はライブラリーを構成する標的ポリペプチド（例えばｐＩＩＩ−ポリペプチド変異体融合蛋白質）への組込みと同様に、ベクター生存に必要なパッケージング又は特異性ポリペプチド（例えばｐＩＩＩ蛋白質）への少なくとも１個の非天然アミノ酸の組込みを可能にする新規ベクターパッケージングシステム（例えば組換えＭ１３由来ファージのパッケージングシステム）を提供する。本発明により提供されるベクターパッケージングシステムの１態様を図１に示す。図例の態様はベクター核酸（１００）と、相補核酸（１２０）と、非天然アミノ酸（１３５）を負荷された直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（１３０）を含む。
図１に示すように、ベクター核酸はベクターアセンブリ時にベクターの内部へのベクター核酸のパッケージングを可能にするパッケージング部位（１０５）を含むか又はコードする。ベクター核酸は更に、融合蛋白質（例えばポリペプチド変異体を含む融合蛋白質）から構成することができるコードされる標的ポリペプチド（１１０）も含むことができる。コードされる標的ポリペプチドは場合により、発現される標的ポリペプチドが場合により少なくとも１個の非天然アミノ酸残基を含有するように、少なくとも１個のセレクターコドン（１１５）を含むことができる。
更に図１に示すように、ベクターパッケージングシステムの相補核酸（１２０）は場合によりウイルスキャプシド又はエンベロープ蛋白質（例えばＭ１３ファージｐＩＩＩ蛋白質）又はベクター生存に必要な他の蛋白質から構成することができるパッケージング又は特異性ポリペプチド（１２５）をコードする。相補核酸は発現時にパッケージング又は特異性ポリペプチドが非天然アミノ酸を含有する標的ポリペプチドに存在する非天然アミノ酸と同一の少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有するように、少なくとも１個のセレクターコドン（１１５）を含む。
従って、図１に示すようなベクターパッケージングシステムは更に非天然アミノ酸（１３５）を負荷された直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（１３０）を含み、コードされるセレクターコドンに応答してパッケージング又は特異性ポリペプチドと場合により標的ポリペプチドへの非天然アミノ酸の組込みを容易にする。パッケージング又は特異性ポリペプチドに非天然アミノ酸を組込むことにより、そのアミノ酸組成に関係なく、ベクターライブラリーの全標的ポリペプチドの発現レベルの正規化が可能になる。
１関連側面において、本発明は例えばファージディスプレイライブラリーを構成する複数のベクター（例えば組換えＭ１３由来ファージ）を作製するためにベクターパッケージングシステムを使用する方法を提供する。一般に、前記方法はベクター核酸を発現させ、場合により非天然アミノ酸を含有していてもよい標的ポリペプチド（例えばｐＩＩＩ−ポリペプチド変異体融合蛋白質）を産生させる段階と、相補核酸を発現させ、非天然アミノ酸を含有するパッケージング又は特異性ポリペプチド（例えばｐＩＩＩ）を産生させる段階を含む。前記方法は更に標的ポリペプチドと非天然アミノ酸を含有するパッケージング又は特異性ポリペプチドにベクター核酸のコピー又は転写産物を結合させ、ベクター（例えば組換えＭ１３由来ファージ）を産生させる段階を含む。こうして、本発明により提供される方法により作製された全ベクターは通常では非天然アミノ酸を含有する標的ポリペプチドを含むベクターのみに生じると同一の増殖不良を生じる。
本発明は更に上記システム及び方法により作製することができる新規ベクターの組成物も提供する。正規化ベクターディスプレイライブラリー（例えば組換えＭ１３由来ファージディスプレイライブラリー）を構成するベクター（例えばファージ）のオプション態様を図２及び３に示す。図２はコードされる標的ポリペプチド（２１０）と標的ポリペプチド（２０５）（例えばｐＩＩＩ−ポリペプチド変異体融合蛋白質）を含むパッケージ核酸（２００）を含むベクターを示す。更に、図２のベクターは少なくとも１個の非天然アミノ酸残基（２２０）を含有する特異性ポリペプチド（２１５）（例えばｐＩＩＩ）を含む。図３は図３のベクターの標的ポリペプチド（３００）に非天然アミノ酸残基（３０５）を含有する以外はほぼ全ての点において図２と同一のベクターを示す。
下記実施例ではＭ１３ＫＯ７ファージシステムを使用するが、本発明を特定システムに限定する意図はない。本発明は同様にＴ４（Ｊｉａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）“Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ａ ＰｏｒＡ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ｃａｐｓｉｄ ｓｕｒｆａｃｅ．” Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：４７７０−４７７７）、Ｔ７（Ｄａｎｎｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）“Ｔ７ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８：１２９５４−１９９５９）、Ｐ４（Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ，Ｂ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）“Ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｐ４．”ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１７：３３−３９）、及びλファージ（Ｋｏｎｇ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）“Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−ｐｒｏｎｅ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＰＰＡＲ ｇａｍｍａ ｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａ．”Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．２７：９１−９９）等の他のファージディスプレイシステムでも使用することができる。更に、本発明はバキュロウイルスディスプレイシステム（Ｏｋｅｒ−Ｂｌｏｍ，Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２００３）“Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｄ．Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ．２：２４４−２５３、及びＭａｋｅｌａ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）“Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｄｉｓｐｌａｙ：ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．”Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．６８：９１−１１２に概説）、アデノ随伴ウイルスディスプレイシステム（Ｗｏｒｋ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）“Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｅｄ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｔｒｏｐｉｓｍ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：６８３−６９３）及び新規に台頭中のレトロウイルスディスプレイシステム（Ｕｒｂａｎ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ３５）等の真核生物ウイルスディスプレイシステムでも使用することができる。
同様に、本発明を実証するために、下記実施例ではリボソーム由来抗体フラグメントの発現レベルを組換えＭ１３由来ファージディスプレイライブラリーで正規化できることを実証する。このモデル蛋白質の変異体を含むライブラリーの発現レベルの正規化に本発明を限定する意図はない。本明細書の開示に列挙したもの等のファージ提示される任意の該当ポリペプチドライブラリーの正規化が治療及び研究目的で多様な蛋白質の任意のものをスクリーニングするために有利である。
多価ファージディスプレイライブラリーの正規化
多価ファージディスプレイライブラリー（例えば多価Ｍ１３ファージディスプレイライブラリー）で使用するように本発明を応用することもできる。上記のように、組換えＭ１３由来ファージディスプレイライブラリーの正規化は天然アミノ酸のみを含有する変異体を過剰発現させる増殖優位性を排除する方法に依存する。他方、多価組換えＭ１３由来ファージはパッケージング又は特異性ポリペプチド（例えば野生型ｐＩＩＩポリペプチド）を含まない。多価Ｍ１３ファージをパッケージングする場合には、ｐＩＩＩ−ポリペプチド変異体融合蛋白質がｐＩＩＩの単独ソースである。従って、多価ファージディスプレイライブラリーの正規化は、例えば融合蛋白質の可変部分（例えばスクリーニング可能なポリペプチド変異体を含む部分）に組込むことができるものと同一の少なくとも１個の非天然アミノ酸をライブラリーの全ファージに共通の融合蛋白質の部分（例えばｐＩＩＩを含む部分）に組込むことにより実施することができる。こうして、多価ファージディスプレイライブラリーの全ポリペプチド変異体は通常では非天然アミノ酸残基を含有するスクリーニング可能なポリペプチド変異体を提示するファージのみに生じると同一の増殖不良を生じる。
多価ファージディスプレイライブラリーの正規化は、例えばファージ（例えば多価組換えＭ１３由来ファージ）が産生される増殖条件を操作することにより実施することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）６コピーとそのコグネイト直交アミノアシルｔＲＮＡ（Ｏ−ＲＳ）をコードするプラスミドを含む適切な大腸菌株をファージミドライブラリーで形質転換させ、株にハイパーファージを感染させ、過剰濃度（例えば１〜１５ｍＭ）の非天然アミノ酸、例えばスルホチロシン（１５ｍＭ）、パラアセチルフェニルアラニン（６ｍＭ）、ビピリジルアラニン（１ｍＭ）を含有する培地で感染させた培養液を３０℃にて一晩インキュベートすることにより、正規化多価ファージディスプレイライブラリーを作製することができる。これらの増殖条件は大腸菌株の倍加時間と透過性を同時に増加させ、翻訳機構（例えば非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡ）を標的ポリペプチドの合成に対応させることができる。これらの増殖条件では、非天然アミノ酸を含まない標的ポリペプチドを提示するファージと、１個以上のセレクター非天然アミノ酸を含む標的ポリペプチドを提示するランダムに選択されたファージの発現を比較することにより判定した場合に、５：１の正規化比で多価ファージライブラリー（例えば多価組換えＭ１３由来ファージライブラリー）を産生させることができる。
直交翻訳系成分
１側面において、本発明はポリペプチド（例えば標的ポリペプチド、例えばｐＩＩＩ−ポリペプチド変異体融合蛋白質）と、非天然アミノ酸を含有するパッケージング又は特異性ポリペプチド（例えばｐＩＩＩ）を含むベクターを作製する組成物、システム及び方法を提供する。別の側面において、本発明は非天然アミノ酸を含有するメンバーを含むポリペプチドライブラリーのスクリーニング用組成物及び方法を提供する。これらのポリペプチドへの非天然アミノ酸の組込みは所望非天然アミノ酸を認識し、セレクターコドン（例えば、アンバーナンセンスコドンＴＡＧ）に応答して蛋白質に組込むように直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を適応させることにより実施される。これらの直交成分は宿主細胞（例えば大腸菌）の翻訳機構の内在成分又は天然アミノ酸と交差反応しない。本発明の実施例で使用する直交成分としては、宿主細胞（例えば大腸菌）で直交対として機能するＯ−ＲＳ（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼに由来するＯ−ＲＳ）とＯ−ｔＲＮＡ（例えば突然変異体チロシルｔＲＮＡＣＵＡアンバーサプレッサー）が挙げられる。
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種類の遺伝的にコードされるαアミノ酸以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。２０種類の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ ｅｄ．１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。本発明の非天然アミノ酸は側鎖基が天然アミノ酸と異なるが、非天然アミノ酸は蛋白質を構成する２０種類のαアミノ酸以外の天然化合物でもよい。本発明で利用される非天然アミノ酸としては、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸（例えば糖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；酸化還元活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；及びプロリン以外の環状アミノ酸が挙げられる。
本発明は複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含む。例えば、本発明は更に別のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができ、第２のＯ−ＲＳは第２のＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識する。例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン、レアコドン等の多数の異なるセレクターコドンを遺伝子（例えばベクター核酸及び／又は相補核酸のコーディング配列）に導入することができる。これらの異なるセレクターコドンを使用して（例えば少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む）複数の非天然アミノ酸の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用することができる。
本発明で使用される直交翻訳系成分は非天然アミノ酸を含有する蛋白質を生産するために培養宿主細胞を利用することができるが、本発明が無傷の生存可能な宿主細胞を必要とするという意味ではない。例えば、本発明の直交翻訳系成分は細胞抽出液の存在下で無細胞系を利用することができる。実際に、蛋白質生産に無細胞インビトロ転写／翻訳系を使用することは定着技術である。本明細書に記載する直交翻訳系成分を使用して非天然アミノ酸を含有する蛋白質を生産するようにこれらのインビトロ系を応用することも本発明の範囲に含まれる。
ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳ、非天然アミノ酸、セレクターコドン、並びに１個以上の非天然アミノ酸を含有する蛋白質の作製に適した直交翻訳系を作製及び／又はその特異性を改変するための方法は一般に例えば国際公開番号ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝子コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；及びＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）に記載されている。これらの各出願の開示内容全体を本願に援用する。各々その開示内容全体を本願に援用するＷａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）；Ｄｅｉｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １５：１５２１−１５２４（２００５）；Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，９０２６−９０２７；及び国際公開ＷＯ２００６／０３４３３２（出願日２００５年９月２０日）も参照。その他の詳細は米国特許第７，０４５，３３７号、第７，０８３，９７０号、第７，２３８，５１０号、第７，１２９，３３３号、第７，２６２，０４０号、第７，１８３，０８２号、第７，１９９，２２２号、及び第７，２１７，８０９号に記載されている。
該当蛋白質及びポリペプチド
非天然アミノ酸を含有するメンバーを含むポリペプチド変異体の正規化ライブラリーの作製及びスクリーニング方法も本発明の特徴である。非天然アミノ酸の組込みは例えばポリペプチド構造及び／又は機能を改変するため、例えばサイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、ラベル又は反応基の組込み等を変化させるために実施することができる。非天然アミノ酸を含有するポリペプチドは触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、非天然アミノ酸をポリペプチドに組込むことにより、場合により毒性、電気的性質、構造的性質、分光学的性質、化学的及び／又は光化学的性質、触媒能、半減期、他の分子との（例えば共有又は非共有結合的）反応性等の性質を改変する。例えばＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）“Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｓ Ｐｒｏｂｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２参照。これらの性質のいずれも正規化ポリペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより同定可能な該当性質又は機能を構成することができる。しかし、本発明が上記性質のみのスクリーニングに限定されると解釈すべきではない。
所定側面において、ポリペプチドライブラリーの変異体は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸を含有することができる。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上の異なる非天然アミノ酸を含有する１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。数百種の公知ポリペプチドライブラリーを列挙するには及ばないが、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを含むように任意の利用可能な突然変異法を適応させることにより、１個以上の非天然アミノ酸を含有するように公知ライブラリーの任意メンバーを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
１個以上の非天然アミノ酸を含有するように改変することができるライブラリーを構成する治療用、診断用、及び他のスクリーニング可能なポリペプチド変異体の例としては限定されないが、国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝子コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ）」；及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ）」に記載されているものが挙げられる。１個以上の非天然アミノ酸を含有するように改変することができるライブラリーの治療用、診断用、及び他のポリペプチド変異体の例としては限定されないが、例えば抗体変異体、抗体フラグメント変異体、α１アンチトリプシン変異体、アンジオスタチン変異体、抗血友病因子変異体、アポリポ蛋白質変異体、アポ蛋白質変異体、心房性ナトリウム利尿因子変異体、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド変異体、心房性ペプチド変異体、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン変異体、Ｔ３９７６５変異体、ＮＡＰ−２変異体、ＥＮＡ−７８変異体、Ｇｒｏ−ａ変異体、Ｇｒｏ−ｂ変異体、Ｇｒｏ−ｃ変異体、ＩＰ−１０変異体、ＧＣＰ−２変異体、ＮＡＰ−４変異体、ＳＤＦ−１変異体、ＰＦ４変異体、ＭＩＧ変異体、カルシトニン変異体、ｃキットリガンド変異体、サイトカイン変異体、ＣＣケモカイン変異体、単球化学誘引蛋白質−１変異体、単球化学誘引蛋白質−２変異体、単球化学誘引蛋白質−３変異体、単球炎症性蛋白質−１α変異体、単球炎症性蛋白質−１β変異体、ＲＡＮＴＥＳ変異体、Ｉ３０９変異体、Ｒ８３９１５変異体、Ｒ９１７３３変異体、ＨＣＣ１変異体、Ｔ５８８４７変異体、Ｄ３１０６５変異体、Ｔ６４２６２変異体、ＣＤ４０変異体、ＣＤ４０リガンド変異体、Ｃキットリガンド変異体、コラーゲン変異体、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）変異体、補体因子５ａ変異体、補体阻害剤変異体、補体受容体１変異体、サイトカイン変異体、上皮好中球活性化ペプチド−７８変異体、ＧＲＯα変異体、ＭＧＳＡ変異体、ＧＲＯβ変異体、ＧＲＯγ変異体、ＭＩＰ１−α変異体、ＭＩＰ１−β変異体、ＭＣＰ−１変異体、表皮増殖因子（ＥＧＦ）変異体、上皮好中球活性化ペプチド変異体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）変異体、表皮剥離毒素変異体、ＩＸ因子変異体、ＶＩＩ因子変異体、ＶＩＩＩ因子変異体、Ｘ因子変異体、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）変異体、フィブリノーゲン変異体、フィブロネクチン変異体、Ｇ−ＣＳＦ変異体、ＧＭ−ＣＳＦ変異体、グルコセレブロシダーゼ変異体、ゴナドトロピン変異体、増殖因子変異体、増殖因子受容体変異体、ヘッジホッグ蛋白質変異体、ヘモグロビン変異体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）変異体、ヒルジン変異体、ヒト血清アルブミン変異体、ＩＣＡＭ−１変異体、ＩＣＡＭ−１受容体変異体、ＬＦＡ−１変異体、ＬＦＡ−１受容体変異体、インスリン変異体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）変異体、ＩＧＦ−Ｉ変異体、ＩＧＦ−ＩＩ変異体、インターフェロン変異体、ＩＦＮ−α変異体、ＩＦＮ−β変異体、ＩＦＮ−γ変異体、インターロイキン変異体、ＩＬ−１変異体、ＩＬ−２変異体、ＩＬ−３変異体、ＩＬ−４変異体、ＩＬ−５変異体、ＩＬ−６変異体、ＩＬ−７変異体、ＩＬ−８変異体、ＩＬ−９変異体、ＩＬ−１０変異体、ＩＬ−１１変異体、ＩＬ−１２変異体、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）変異体、ラクトフェリン変異体、白血病阻害因子変異体、ルシフェラーゼ変異体、ニュールチュリン変異体、好中球阻害因子（ＮＩＦ）変異体、オンコスタチンＭ変異体、骨形成蛋白質変異体、腫瘍遺伝子産物変異体、副甲状腺ホルモン変異体、ＰＤ−ＥＣＳＦ変異体、ＰＤＧＦ変異体、ペプチドホルモン変異体、ヒト成長ホルモン変異体、プレイオトロピン変異体、プロテインＡ変異体、プロテインＧ変異体、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣの変異体、リラキシン変異体、レニン変異体、ＳＣＦ／ｃキット変異体、可溶性補体受容体Ｉ変異体、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１変異体、可溶性インターロイキン受容体変異体、可溶性ＴＮＦ受容体変異体、ソマトメジン変異体、ソマトスタチン変異体、ソマトトロピン変異体、ストレプトキナーゼ変異体、スーパー抗原変異体、ブドウ球菌エンテロトキシン変異体、ＳＥＡ変異体、ＳＥＢ変異体、ＳＥＣ１変異体、ＳＥＣ２変異体、ＳＥＣ３変異体、ＳＥＤ変異体、ＳＥＥ変異体、ステロイドホルモン受容体変異体、スーパーオキシドジスムターゼ変異体、毒素性ショック症候群毒素変異体、チモシンα１変異体、組織プラスミノーゲンアクチベーター変異体、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）変異体、ＴＧＦ−α変異体、ＴＧＦ−β変異体、腫瘍壊死因子変異体、腫瘍壊死因子α変異体、腫瘍壊死因子β変異体、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）変異体、ＶＬＡ−４蛋白質変異体、ＶＣＡＭ−１蛋白質変異体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）変異体、ウロキナーゼ変異体、Ｍｏｓ変異体、Ｒａｓ変異体、Ｒａｆ変異体、Ｍｅｔ変異体、ｐ５３変異体、Ｔａｔ変異体、Ｆｏｓ変異体、Ｍｙｃ変異体、Ｊｕｎ変異体、Ｍｙｂ変異体、Ｒｅｌ変異体、エストロゲン受容体変異体、プロゲステロン受容体変異体、テストステロン受容体変異体、アルドステロン受容体変異体、ＬＤＬ受容体変異体、炎症性分子の変異体、シグナル伝達分子の変異体、転写アクチベーターの変異体、転写サプレッサーの変異体、ヒアルリン変異体、ＣＤ４４変異体、及びコルチコステロン変異体が挙げられる。
種々の精製／蛋白質精製法が当分野で周知であり、正規化ポリペプチドライブラリーのスクリーニングに基づいて同定されたポリペプチド変異体の精製分析に適用することができる。これらの技術及びポリペプチド分析に必要な他の技術としては、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ＣＤ−ＲＯＭ版 Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；とその引用文献に記載されているものが挙げられる。
該当ポリペプチドの突然変異誘導体の作製
例えば正規化ポリペプチドライブラリーを構成するように変異体集団を作製するために、本明細書に記載する該当蛋白質及びポリペプチドの突然変異誘導体を標準方法により作製することができる。突然変異フォーマットに関するその他の情報はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌと、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）に記載されている。以下の刊行物及び文献には突然変異フォーマットに関するその他の詳細が記載されている：Ａｒｎｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４５０−４５５；Ｂａｓｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）．“Ｍｕｔａｎｔ Ｔｒｐ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２４０−２４５；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ＆ Ｓｈｏｒｔｌｅ．（１９８５）．“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ（１９８５）．“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３；Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）．“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；Ｃａｒｔｅｒ（１９８７）．“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３；Ｄａｌｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８６）“Ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ．”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：５１１５；Ｆｒｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９；Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ ‘ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６；Ｋｕｎｋｅｌ，“Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．ａｎｄ Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ，（１９８５）“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ ａｌ．“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５４，３６７−３８２（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）“Ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ ＆ Ｆｒｉｔｚ“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）“Ｐｏｉｎｔ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ．”Ｃｅｌｌ ３８：８７９−８８７；Ｋｒａｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８）；Ｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）“Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．”Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８；Ｌｏｒｉｍｅｒ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３０６７−８；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，（１９８６）“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：７１７７−７１８１；Ｎａｋａｍａｙｅ ＆ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，（１９８６）“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｎｃｉ Ｉ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８；Ｎａｍｂｉａｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）“Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９−１３０１；Ｓａｋａｍａｒ ａｎｄ Ｋｈｏｒａｎａ，（１９８８）“Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｄ ｏｕｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）．”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２；Ｓａｙｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）“Ｙ−Ｔ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２；Ｓａｙｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）“Ｓｔｒａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ．”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４；Ｓｉｅｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：４５６−４６０；Ｓｍｉｔｈ，（１９８５）“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．”Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９−９１（１９９４）；Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）“Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｎｉｃｋｅｄ ＤＮＡ．”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４；Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）“Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ．”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７；Ｗｅｌｌｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）“Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ．”Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ ３１７：４１５−４２３；Ｗｅｌｌｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）“Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ．”Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ，（１９８２）“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ，（１９８３）“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００；及びＺｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ，（１９８７）“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０。部位特異的突然変異誘発法、部分的ランダム突然変異誘発法、又は完全ランダム突然変異誘発法によりポリペプチド変異体を作製するために、これらの文献に記載されている方法を使用することができる。上記方法の多くに関するその他の詳細はＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １５４に記載されており、同文献は更に各種突然変異誘発法に伴う問題のトラブルシューティングの有用な管理についても記載している。核酸を単離、クローニング及び増幅するためによく使用されている方法を以下に詳細に記載する。
ベクターパッケージングシステムのベクター核酸及び／又は相補核酸の提供と発現
非天然アミノ酸を含有するポリペプチド変異体のライブラリーを構成することができるベクターを作製するベクターパッケージングシステムも本発明の特徴である。本発明はベクター核酸及び／又は相補核酸を提供する段階と、ベクター核酸及び／又は相補核酸を発現させ、夫々標的ポリペプチド（例えばｐＩＩＩ融合ポリペプチド）とパッケージング又は特異性ポリペプチド（例えばｐＩＩＩ）を産生させる段階を含むベクターパッケージング方法も提供する。
ベクター核酸及び／又は相補核酸は核酸（例えば直鎖状２本鎖ＤＮＡフラグメント、環状ＤＮＡ等）の形質転換をはじめとする多数の方法でベクターパッケージングシステムに提供することができる。原核系では、このような方法としては宿主細胞（例えば大腸菌）をプラスミド、ファージミド等で形質転換する方法や、Ｆ’因子のファージ形質導入又は共役が挙げられる。真核系では、プラスミドの形質転換や、安定的又は一過性形質導入等により、ベクター核酸及び／又は相補核酸をベクターパッケージングシステムに提供することができる。精製ベクター核酸及び／又は相補核酸を単にインビトロ転写／翻訳系に添加すればよい。
ベクター核酸及び／又は相補核酸を発現させ、それらにコードされるポリペプチドを産生させる段階は、多数の方法で実施することができる。しかし、最も広く使用されている方法は標的ポリペプチド及び／又はパッケージングもしくは特異性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの転写レベルを増加する方法である。標的ポリペプチド及び／又はパッケージングもしくは特異性ポリペプチドをコードする配列を誘導プロモーターの下流にクローニングすると、適切なインデューサー（例えばＩＰＴＧ）を培養液又はインビトロ転写／翻訳系に添加後にこれらの遺伝子の転写レベルは増加する。
核酸を単離、クローニング及び増幅する手順と、細胞及び無細胞系に核酸構築物を供給し、発現させる手順は文献に詳細に記載されており、ベクター核酸及び／又は相補核酸をベクターパッケージングシステムに提供し、発現させるために本発明で使用することができる。これらの技術の更に詳細については、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｒａｌｐｈ Ｒａｐｌｅｙ（ｅｄ）（２０００）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ（Ｒａｐｌｅｙ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００７年補遺版）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄ）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ １９２）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｖｉｌｊｏｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＰＣＲ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；及びＤｅｍｉｄｏｖ ａｎｄ Ｂｒｏｕｄｅ（ｅｄｓ）（２００５）ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，ＵＫに記載されている。例えばその後の核酸単離のための例えば細胞単離及び培養に関する他の有用な参考文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
細胞からプラスミド又は他の該当核酸を精製するためのキットも多数市販されている（例えばＥａｓｙＰｒｅｐ（登録商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（登録商標）（いずれもＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製品）；ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製品）；及びＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ製品）参照）。単離及び／又は精製した任意核酸を更に操作して他の核酸を作製し、細胞にトランスフェクションするために使用し、発現の目的で生物に感染させるために関連ベクターに導入し、及び／又は同等の操作を行うことができる。典型的なクローニングベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを構成する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ａｕｓｕｂｅｌ及びＢｅｒｇｅｒ参照。更に、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）等の各種販売会社のいずれかからほぼ任意核酸を特別注文又は標準注文することができる。
キット
キットも本発明の特徴である。例えば、このようなキットはキットコンポーネントを保持するための容器、本明細書に記載する任意方法をキットで実施するため又は正規化ポリペプチドライブラリー（例えば場合により本明細書に記載するベクターパッケージングシステムのいずれかにより作製される例えば本明細書に記載するライブラリーのいずれか）を作製するための説明書等の本発明の組成物を使用するためのコンポーネントを含むことができる。例えば少なくとも１個のポリペプチド変異体が少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有する正規化ポリペプチドライブラリーを作製するためのキットは、Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸と、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む核酸と、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの発現と正規化ポリペプチドライブラリーの発現に適した原核（例えば細菌（例えば大腸菌））又は真核（例えば酵母又は哺乳動物）宿主細胞株を含むことができる。当業者に自明の通り、キットは場合により本明細書に記載する方法のいずれかで使用するための本発明により提供されるシステム及び組成物の任意組合せを含むことができる。
以下、実施例により本発明を例証するが、以下の実施例により本発明を限定するものではない。
正規化ファージディスプレイライブラリーの作製
本実施例は例えば正規化ファージディスプレイライブラリーの１例を作製するための組成物と方法について記載する。本実施例に記載するアプローチは各種ポリペプチドライブラリースクリーニングシステムで各種ポリペプチドのいずれかをスクリーニングするために使用するように応用することができる。
生殖細胞系列ＶＨ３−２３／ＤＨ３−１０／ＪＨ４−ＰＩＩＩ融合蛋白質とＶＫＡ２７−ＪＫ１ドメインを含むＦａｂをコードする遺伝子をｌａｃプロモーターの転写制御下に置くファージミドを構築した。更に、このファージミドのＣＤＲ３にＴＡＧセレクターコドンを付加した。ｐ−アセチルフェニルアラニンを負荷することが可能な直交ｔＲＮＡ（ＯｔＲＮＡ）及びＯ−ｔＲＮＡにｐ−アセチルフェニルアラニンを負荷することが可能な直交アミノアシルｔＲＮＡ（Ｏ−ＲＳ）６コピーをコードするプラスミドを導入した大腸菌株と、スルホチロシンを負荷することが可能なＯ−ｔＲＮＡ及びコードされるＯ−ｔＲＮＡにスルホチロシンを負荷することが可能なＯ−ＲＳ６コピーをコードするプラスミドを導入した大腸菌株にこのファージミドを形質転換した。ＩＰＴＧと適切な非天然アミノ酸（ＵＡＡ）、例えばｐ−アセチルフェニルアラニン（ケト）又はスルホチロシン（スルホ）を添加した培地で株を増殖させた。ＩＰＴＧのみを添加した培地で対照培養物を増殖させた。
ファージミドで形質転換した大腸菌株にセレクターコドンＴＡＧを含むｐＩＩＩ遺伝子の突然変異体対立遺伝子をそのゲノムに含むＭ１３ＫＯ７−ＴＡＧヘルパーファージを感染させることにより、Ｆａｂ−ｐＩＩＩ融合蛋白質を提示するファージを作製した。Ｍ１３ファージアセンブリ及び感染性は機能的ｐＩＩＩの入手可能性に依存するので、Ｍ１３ＫＯ７−ＴＡＧヘルパーファージに由来するｐＩＩＩ（例えばｐ−アセチルフェニルアラニン又はスルホチロシンを含有するｐＩＩＩ）を組込んだファージのみが生存可能になる。４種類の培養液の各々によりファージを１８時間産生させた後、回収した。
４種類の培養液の各々からの上清の力価を測定した処、適切なＵＡＡを添加した培地で増殖させた株はＵＡＡの不在下で増殖させた株の５０倍のファージを産生することが判明した。特筆すべき点として、ＵＡＡ不含系では１２時間未満で同等力価のファージを産生させることができる。
ファージミドによりコードされるＦａｂが回収したファージの表面に提示されるか否かを判定するために、抗ｐＩＩＩ抗体のウェスタンブロットを実施した。ウェスタンブロットの結果を図４Ａに示す。Ｆａｂ−ｐＩＩＩ融合蛋白質はｐＩＩＩのカルボキシ末端部分しか含まないので、融合蛋白質は還元条件下では野生型（ＷＴ）ｐＩＩＩよりも速く移動すると予想される。還元条件下でＦａｂ−ｐＩＩＩに対応する新規バンドがＷＴ ｐＩＩＩの下に検出された。このバンドはヘルパーファージに由来する抽出液では検出されなかったので、このバンドはＦａｂ−ｐＩＩＩ融合体を発現する構築物に対して特異性があると判断される（例えば図４ａ参照、レーン１をレーン２及び３と比較）。
非還元条件下では、ファージミドを含有する調製物のみで移動度の遅い分子量約６０ｋＤａのバンドが検出された（例えば図４ａ，レーン５及び６参照）。これらのレーンの〜６０ｋＤａバンドは抗κ抗体と反応することも判明したので、回収したファージ粒子の表面に完全に結合したＦａｂが存在していると判断された。ヘルパーファージを感染させなかったＦａｂ−ｐＩＩＩ融合蛋白質を発現する大腸菌細胞に由来する抽出液でも同一の〜６０ｋＤ蛋白質が検出され（例えば図４ｂ，レーン２及び４参照）、〜６０ｋＤａ ｐＩＩＩ反応性バンドはヘルパーファージに由来しないと判断された。更に、このバンドも抗κ抗体と反応した。ファージ粒子１００個当たり１個が１個のＦａｂ−ｐＩＩＩ融合体を提示すると推定される。
ＵＡＡの不在下で増殖させた培養液から回収したファージ粒子を検出し、アミコン１００ｋＤａ ＭＷＣＯフィルターで濃縮後に力価を測定することができる。例えばＯ−ＲＳを進化させた元の天然アミノ酸であるチロシンの組込みによりこれらのファージがその表面にＦａｂを提示するのか、又はこれらのファージが「表面非提示」であるのか、例えばＦａｂを全く提示しないのかを判定するために、例えば培地＋ｐ−アセチルフェニルアラニンで増殖させたケトＲＳ細胞、培地−ｐ−アセチルフェニルアラニンで増殖させたケトＲＳ細胞、培地＋スルホチロシンで増殖させたスルホＲＳ細胞、培地−スルホチロシンで増殖させたスルホＲＳ細胞の４種類の培養液の各々から回収した等力価のファージをサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析した。マイクロタイタープレートを抗κ抗体でコーティングし、ブロックし、力価を増しながらファージと結合させた。ファージコート蛋白質ｐＶＩＨと反応する抗体を使用し、マイクロタイタープレートと結合したファージの量を検出した。陰性対照ヘルパーファージを除き、全実験群でκと結合したファージの特異的検出が認められた（例えば図４Ｃ参照）。同様に、直接ＥＬＩＳＡでも、蛋白質Ｇ−ＨＲＰ試薬はヘルパーファージを除く全ファージでＦａｂを検出することができた。従って、ＵＡＡの存在下でファージを増殖させる場合に得られる収率の１／２０ではあるが、ＦａｂはＵＡＡの不在下でもファージに提示されるようである。ＵＡＡの不在下で増殖させたファージの提示メカニズムはＯ−ＲＳによるチロシンの組込みであると思われる。この結果、ライブラリーから選択したどのＦａｂにもその表現型にＵＡＡが必要であることを確認することが有用であると考えられる。
Ｆａｂが適切にファージ粒子上に提示されることが判明したので、次に上記ファージミドを使用し、ＣＤＲ３にセレクターコドンを含むＦａｂ変異体をコードするファージミドのライブラリーを作製した。変形オーバーラップ発現ＰＣＲプロトコルを使用して３種類の異なるライブラリーを作製した。第１のライブラリー、即ち生殖細胞系列／ＴＡＧ−ＣＤＲ３では、Ｆａｂ遺伝子配列のチロシンコドンをＴＡＧに突然変異させ、通常ではチロシン残基が組込まれる位置に各々１個の非天然アミノ酸を含有するファージミド変異体の集団を作製した。他のＮＮＫコドンをこのライブラリーのＦａｂコーディング配列のサブセットのＶＨ−ＤＨとＤＨ−ＪＨの間に付加し、インビボＶ（Ｄ）Ｊ組換え時に行われるＮ領域付加を模倣した。第２のライブラリー、即ちＮＮＫ／ＴＡＧ−ＣＤＲ３は各ライブラリーメンバーの異なるアミノ酸位置にＴＡＧコドンを組込み、ＣＤＲ３の３個の異なる部分をコードするＦａｂ遺伝子変異体とした。第３のライブラリー、即ちＮＮＫ−ＣＤＲ３は２１種類のアミノ酸のいずれかを任意位置に組込むことができるＦａｂ遺伝子変異体とした。
各ライブラリーを作製するために設計したオリゴヌクレオチドを図５に示す。これらの配列はヒトＤＨ１〜ＤＨ３ファミリーに由来し、各ファミリー全体を縮重コードするように設計した。Ｖ−Ｄ及びＤ−Ｊ境界に付加したコドンを下線で示す。ＣＤＲ３の付近の配列を示す。実際のオリゴヌクレオチドは５’及び３’末端の両側に約１０塩基延びている。縮重コドンについては、Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ；Ｂ＝Ｃ，Ｇ，Ｔ；Ｄ＝Ａ，Ｇ，Ｔ；Ｈ＝Ａ，Ｃ，Ｔ；Ｖ＝Ａ，Ｃ，Ｇ；Ｒ＝Ａ，Ｇ；Ｙ＝Ｃ，Ｔ；Ｋ＝Ｇ，Ｔ；Ｍ＝Ａ，Ｃ；Ｓ＝Ｇ，Ｃ，Ｗ＝Ａ，Ｔである。
各「ナイーブ」ライブラリーからの少なくとも２０個のクローンを配列決定し、変異体間のコドン提示に関してバイアスが存在しないことを確認すると共に、変異体が全長Ｆａｂフラグメントをコードすることを確認した。３個のライブラリーの各々の概算理論ダイバーシティは１０７〜１０８であった。形質転換効率によると、各ライブラリーの実際の独立したライゲーションイベントは＞１０９であり、各ライブラリーがダイバーシティに完全に対応することが分かった。
ビピリジルアラニンに特異的なＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ６コピーをコードするプラスミドを導入した適切な大腸菌株にファージミド変異体の各ライブラリーを形質転換した。効率的な金属キレート化特性をもつと予想される非天然アミノ酸であるビピリジルアラニンを添加した培地で形質転換株を増殖させた。
ファージミドで形質転換した大腸菌株に上記のようにセレクターコドンＴＡＧを含むｐＩＩＩ遺伝子の突然変異体対立遺伝子を含むＭ１３ＫＯ７−ＴＡＧヘルパーファージを感染させることによりＦａｂ−ｐＩＩＩ融合蛋白質を提示するファージを作製した。各大腸菌株により１８時間ファージを産生させた後、回収した。
ビピリジルアラニンを含むファージ提示されたＦａｂをライブラリーから単離することができるか否かを判定するために、天然アミノ酸のみを含有する金属結合性抗体の選択用システムとして従来記載されているモデルシステムを使用した（Ｔｒｉｓｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００７）“Ａ Ｍｅｔａｌｌｏａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈａｔ Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ Ｂｉｎｄｓ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎｔｉｇｅｎ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８２：２６３４４−２６３５３）。第２及び第３のファージミドライブラリーで形質転換した大腸菌により産生されたファージをニッケル樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）の存在下で５分間インキュベート後、５カラム容量のＴＢＳＴ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ＝８，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２５％ ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄後、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ及び５００ｍＭのステップ勾配のイミダゾール１カラム容量（０．２ｍｌ）で溶出させた。溶出したファージを使用して大腸菌に感染させた後、アンピシリンを添加した寒天培地に撒いた。コロニーを釣菌し、培養し、各コロニーから回収した各ファージミドＤＮＡを配列決定した。
各イミダゾール溶出フラクションからの数個のコロニーを配列決定した。たった１回の選択後でも、例えば少なくとも１個のＴＡＧコドンをコードする少なくとも１個のビピリジルアラニン残基をＣＤＲ３に含む数個のＦａｂ変異体が各ライブラリーから単離された。各ライブラリーからの複数のクローンを配列決定し、ＴＡＧの頻度を測定し、予め選択したライブラリーと比較した（例えば図６参照）。ＮＮＫ−ＴＡＧ−ＣＤＲ３ライブラリーの全メンバーはＴＡＧを含むので、２個のＴＡＧを含むクローンの頻度を数えた。ＣＤＲ３におけるＴＡＧコドンの頻度はイミダゾール溶出ストリンジェンシーの増加と共に増加した（例えば図６参照）。
ヒスチジンは天然にポリペプチドに組込まれる公知金属結合性アミノ酸である。内部陽性対照として、ＣＤ３におけるヒスチジンコドンの頻度もモニターした処、単離されたクローンのＣＤＲ３におけるヒスチジンコドン数もイミダゾール溶出ストリンジェンシーの増加と共に増加することが判明した（例えば図６ｂ参照；ＵＡＡ位置をアステリスクで示す）。
正規化多価ファージディスプレイライブラリーの作製
本実施例は例えば正規化多価ファージディスプレイライブラリーの１例を作製するための組成物と方法について記載する。本実施例に記載するアプローチも各種ポリペプチドライブラリースクリーニングシステムで各種ポリペプチドのいずれかをスクリーニングするために使用するように応用することができる。これらのアプローチに関する更に詳細については、本明細書に援用するＬｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２００８）“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ．”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（印刷中）に記載されている。
セレクターコドンＴＡＧを含むｓｃＦｖをコードするように、従来記載されているファージミド（例えばＲｏｎｄｏｔ，ｅｔ ａｌ．（２００１）“Ａ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：７５−７８参照）を構築した。非天然アミノ酸（例えばパラアセチルフェニルアラニン、ビピリジルアラニン、スルホチロシン又は４−ボロノフェニルアラニン）を負荷することが可能な直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、Ｏ−ｔＲＮＡに非天然アミノ酸（例えばパラアセチルフェニルアラニン、ビピリジルアラニン、スルホチロシン又は４−ボロノフェニルアラニン）を負荷することが可能な直交アミノアシルｔＲＮＡ（Ｏ−ＲＳ）６コピーをコードするプラスミドを導入した大腸菌株にこのファージミドを形質転換した。ボロンアミノ酸の遺伝的組込みに関する更に詳細については、本明細書に援用するＢｒｕｓｔａｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８）“Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｂｏｒｏｎａｔｅ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ．”Ａｇｎｅｗ Ｃｈｅｍ １２０：８３４４−８３４７に記載されている。非天然アミノ酸を添加しない培地に比較して非天然アミノ酸（例えばパラアセチルフェニルアラニン、ビピリジルアラニン、スルホチロシン又は４−ボロノフェニルアラニン）を添加した培地におけるファージ産生を特性決定するために（方法の項に記載したように）実験を実施した。ファージを回収し、（下記のように）力価を測定した処、非天然アミノ酸を添加した培地で増殖させた培養液はＵＡＡの不在下で増殖させた培養液よりも３００倍のファージを産生することが判明した。
各変異体のＣＤＲ３ループに６個のランダムＮＮＫコドンを挿入した生殖細胞系列抗体変異体のファージミドライブラリーを作製した。このファージミドライブラリーを使用し、非天然アミノ酸スルホチロシンに特異的なＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ６コピーをコードするプラスミドを導入した適切な大腸菌株を形質転換し、１５ｍＭスルホチロシンを添加した培地で形質転換株を増殖させた。ファージミドで形質転換した大腸菌株にｐＩＩＩをコードする遺伝子を欠失させたハイパーファージを感染させることにより、抗体変異体−ｐＩＩＩ融合蛋白質を提示する多価ファージを作製した（例えばＲｏｎｄｏｔ，ｅｔ ａｌ．（２００１）“Ａ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：７５−７８参照）。大腸菌株により１８時間ファージを産生させた後、回収した。実施例１に記載したようにウェスタンブロットを実施した処、抗体変異体がファージ粒子上に適切に提示されることが判明した。
回収したファージを次にＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、硫酸化受容体と結合するＨＩＶエンベロープ糖蛋白質であるｇｐ１２０と結合することが可能な抗体変異体を提示するファージを同定単離した。このアッセイ中に単離した抗体変異体はＴＡＧコドンが増加していることが判明し、このアッセイでは硫酸化抗体変異体（例えば非天然アミノ酸スルホチロシンを含有する抗体変異体）が優先的に選択されたと判断された。以下、更に詳細に記載する。
拡張遺伝子コードによる蛋白質進化
本発明者らは拡張遺伝子コードを蛋白質進化に利用できるようなファージディスプレイシステムを考案した。この結果、２０種類の標準アミノ酸のみを含有する配列よりも機能的に勝るように、非天然アミノ酸を含有する蛋白質配列を進化させることが可能になる。数個の非天然アミノ酸による機能的進化に適合するようにこのシステムを最適化し、抗ｇｐ１２０抗体の選択によりその有用性を立証する。ＶＨＣＤＲ３における６個の残基をランダム突然変異させたナイーブ生殖細胞系列ｓｃＦｖ抗体ライブラリーから選択されたこのような抗体の１つはスルホチロシンを含み、ヒト血清から単離した公知硫酸化抗体よりも高い親和性でｇｐ１２０と結合する。拡張「合成」遺伝子コードは特定性質をもつ蛋白質の指向的進化を助長することができる。
少数の例外を除き、生物の遺伝子コードは蛋白質合成に２０種類の標準アミノ酸しか指定しない。しかし、特に２０種類の天然選択は集団進化パラダイムとダーウィン進化パラダイムの遷移点に任意に固定された後、コードの慣性により維持することができるので、他のアミノ酸とその化学的機能が進化学的に優位になることも全く可能である（１）。更に、数千年にわたる一般生物適応ではなく短期間の１種又は少数の特定機能に絞った限定範囲の実験用指向的進化では、他のアミノ酸の選択的優位性を容易に予想することができる。本発明者らの研究室の最近の開発により、この可能性を検討することが可能である。具体的には、ユニークナンセンスコドンとフレームシフトコドンに応答して各種非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことが可能な直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）対を大腸菌の翻訳機構に付加した（２）。２０種類の標準構成要素ではなく２１種類の構成要素を利用できるこれらの大腸菌（Ｘ−大腸菌）を蛋白質機能の進化に使用できるようになった。
先ず、そのユニークな化学的性質に基づいて数種類の非天然アミノ酸を本発明者らのシステムで使用するのに選択した。例えば、金属イオン結合には予め体系化された第１及び第２のリガンドシェルは必要ないので、２座金属キレート化アミノ酸ビピリジルアラニン（３，米国特許出願第１１／６６５，０８３号、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）」、発明者Ｓｃｈｕｌｔｚら、出願日４／１０／２００７；ＷＯ／２００６／１１０１８２、出願日２００５年１０月２６日も参照）を遺伝的にコードするＸ−大腸菌は酸化還元及び加水分解触媒の進化に好適である。同様に、ボロン酸基はジオール又は反応性セリン残基と高親和性錯体を形成することができるので、反応性４−ボロノフェニルアラニン（４，米国予備特許出願第６１／１３７，６８９号、出願日２００８年８月１日；及び６１／１８９，７３９号、出願日２００８年８月２２日）をコードするＸ−大腸菌は糖蛋白質又はセリンプロテアーゼに特異的な抗体の進化に好適である。更に、スルホチロシン（５，米国特許出願第１１／９０３，４９９号、発明の名称「ユウバクテリウム属における選択的硫酸化蛋白質の遺伝的にプログラムされた発現（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）」、発明者Ｌｉｕら、出願日２００７年９月２０日；ＷＯ／２００８／０３６３９２、出願日２００７年９月２０日も参照）等の他の翻訳後修飾アミノ酸を遺伝的にコードするＸ−大腸菌は所与翻訳後修飾のユニークな化学的特徴を利用する性質の進化に使用することができ、しかも、通常ではこのような修飾を制限する宿主生物及び配列の制約を伴わない（６）。最後に、パラアセチルフェニルアラニン等のケトアミノ酸を使用するＸ−大腸菌はイミニウム中間体を介する反応（例えば付加、異性化又は脱炭酸反応）の触媒の進化に有利であると思われる（７）。この骨格を念頭におき、Ｘ−大腸菌によりコードされる非天然アミノ酸をファージ提示ライブラリーに組込む蛋白質進化用システムを開発した。このシステムは非天然アミノ酸を含有する配列と２０種類の標準アミノ酸のみを含有する配列の両方を含む集団から機能に基づいて非天然アミノ酸を含有する配列を選択できるように設計されている。このシステムを抗ｇｐ１２０抗体の進化に使用した処、スルホチロシンを含む特定配列は標準アミノ酸のみを含有する配列も含めて集団で発現される他の全配列よりも優れたものとして出現することが判明した。これらの試験は拡張遺伝子コードが非天然アミノ酸の機能的寄与により選択的優位性を付与できることを初めて立証するものである。
非天然アミノ酸を含有する蛋白質はファージミドフォーマットでファージコート上に正確に提示される。
ファージディスプレイは多様な蛋白質機能の指向的進化用の汎用プラットフォームであると思われる（８−１３）。ファージディスプレイ進化の制約下で、機能的進化には２つの基本的条件がある。第１に、大腸菌により産生されるファージは進化を受ける蛋白質を適正且つ有効に提示しなければならず、第２に、選択的優位性（例えば増加）が機能的性能にできるだけ密接に関係していなければならない。このためには、機能に基づかない所定分類の配列に不利な系統的バイアスの軽減が必要である。非天然アミノ酸は野生型Ｍ１３ファージでシングルペプチドとして提示されている（１４）が、このようなシステムはこれらの制約下の指向的進化実験には不適当であった。そこで、標準アミノ酸と非天然アミノ酸の両方でこれらの２つの条件を満たすと思われたファージミドディスプレイ、特に多価ハイパーファージファージミドディスプレイ（１５，１６）に注目した。
ファージミドにコードされる非天然アミノ酸含有蛋白質配列をファージの表面に提示できるか否かを試験するために、ｐＩＩＩを共通のヒトＶＨ３−２３及びＶＬＡ２７生殖細胞系列配列に由来するｓｃＦｖのＣ末端に融合した。アンバーコドンをＶＨＣＤＲ３ループの１１１位に置換し、この構築物をｐＳＥＸファージミドに挿入し、ｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＧを作製した。次に、いずれもアンバーコドンに応答してスルホチロシンをコードするもの（ＳＹ−Ｘ−大腸菌）（５）、パラアセチルフェニルアラニンをコードするもの（ケト−Ｘ−大腸菌）（７）、ビピリジルアラニンをコードするもの（Ｂｐｙ−Ｘ−大腸菌）（３）、及び４−ボロノフェニルアラニン（４）をコードするもの（ボロ−Ｘ−大腸菌）の４種類の異なるＸ−大腸菌にこのプラスミドを形質転換した。ファージパッキングに用いるｐＩＩＩの唯一のソースはファージミドにコードされる抗体−ｐＩＩＩ融合体である（１６）ので、ファージはｐＩＩＩの上流のアンバーコドンが抑圧される場合のみに産生される筈である。次にハイパーファージを使用してこれらのクローンから夫々のファージ提示ｓｃＦｖを作製した。夫々の非天然アミノ酸の存在下と不在下でファージ収率を測定した（図７ａ〜ｄ）。対応する非天然アミノ酸を増殖培地に添加すると、ファージ収率は不在下の収率の１０００倍となり（図７ｅ）、非天然アミノ酸を含有する蛋白質配列をこのシステムで提示できることが確認された。沈降した全長ファージのＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット分析を使用し、全長ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合体が有効に提示されたことを確認した（図７ｆ）。
指向的進化を可能にするように、非天然アミノ酸を含有する配列に不利なファージ収率バイアスを最小限にすることができる。
非天然アミノ酸を含有する配列をファージコート上に提示させるのに成功したが、初期実験ではｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＧからの総ファージ収率はアンバーコドンを１個の指定チロシンで置換したｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＴからの配列の提示に比較して低かった（下表１ａ参照）。これは組換えａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を使用した非天然アミノ酸の抑圧効率が内在機構を使用する標準アミノ酸による抑圧よりも低いためであると予想された。しかし、非天然アミノ酸を含有する蛋白質を進化させるためには、非天然アミノ酸を含有する配列に不利な大きな系統的発現バイアスを許容しないというシナリオに従い、非天然アミノ酸を含有する配列を２０種類の標準アミノ酸のみを含有する配列に対して多数回の選択にわたって競合させることができなければならない。そこで、非天然アミノ酸を提示するファージの収率が天然アミノ酸を提示するファージの収率と同等となるように、数種類のＸ−大腸菌の増殖条件（ファージ産生温度、発現時間、及びｔＲＮＡ／ａａＲＳ対をコードするプラスミド）と非天然アミノ酸濃度を最適化した（表１ａ）。最適化にはファージパッケージング及びアセンブリ工程の他の段階の速度に比較して全長融合体−ｐＩＩＩ蛋白質発現速度を増加させるだけでよく、アンバーコドン抑圧効率を増加させる必要はないので、増殖条件とアミノ酸濃度だけで最適化を達成できるのではないかと推測した。（下記）表１ｂに示すように、最適化条件下において、標準アミノ酸のみを含有する配列に有利な収率／発現バイアスは試験した４種類のＸ−大腸菌で＜３倍であった。従って、非天然アミノ酸を含有する配列が天然アミノ酸のみを含有する最も競合性の高い配列に対して少なくとも〜３倍機能的に優れているならば、不利なバイアスでも増加すると言える。
下表１ａはモデルｓｃＦｖに基づくファージ収率を最適化するために試験した条件を示す。「使用株」とはこの株に特異的な非天然アミノ酸とシンテターゼを導入した株を意味する。ファージ発現中に指定濃度の非天然アミノ酸を培地に直接添加した。収率比はｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＧから発現されたファージ（非天然ファージ）の力価をｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＴから発現されたファージ（天然ファージ）の力価で割った値とした。本発明者らの最適化法は非天然アミノ酸を含有するｐＩＩＩ−融合蛋白質の総産生率を増加すると同時に、アセンブリやパッケージング等のファージ産生プロセスの別の段階の速度を低下させたと予想される。
表１ｂはＴＡＧコドン（天然ファージ）の代わりにＴＡＴコドンを付加した試験ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩを発現するファージに有利な最終最適化条件及び収率バイアスを示す。
表１ｃはケト−Ｘ−大腸菌、ＳＹ−Ｘ−大腸菌、Ｂｐｙ−Ｘ−大腸菌、又はボロ−Ｘ−大腸菌（ｎ＝５０又は１００）でｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＮＮＫライブラリーからファージ発現後にＴＡＧコドンを含むクローン数と、対応するχ２値を示し、集団レベルのバイアスが個々のクローンのバイアスに代表されることを示す。ファージ発現開始前とは、ファージ産生前の初期ライブラリーに存在するクローンを意味する。
次に、個々のクローンで測定されたバイアスが集団レベルにも当てはまることを裏付けるために、これらの最適化条件を抗体のファージミドライブラリーで試験した。従って、ＮＮＫを使用する部位飽和突然変異誘発法により完全にランダム突然変異させた６個の連続残基をＶＨ３−２３ＣＤＲ３ループに挿入し、ランダムプライマーを使用するオーバーラップＰＣＲにより残基１０１〜１０６に置換した。その後、これをｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＴベクターにクローニングし、ライブラリーｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＮＮＫを作製した（方法の項参照）。Ｔｏｐ１０Ｆ’への形質転換後に、５×１０８の最大複雑度が実験的に達成され、シーケンシングの結果、クローンの約１８％（ｎ＝５０，任意ＮＮＫランダム突然変異部位でＴＡＧを検出する１／３２確率を使用した２項分布による予測値１７．３％）がファージ産生前にアンバーコドンを含んでいることが判明した。ＳＹ−Ｘ−大腸菌、ケト−Ｘ−大腸菌、Ｂｐｙ−Ｘ−大腸菌、又はボロ−Ｘ−大腸菌でファージ産生後に、得られたファージ集団はアンバーコドンを含むクローンの７〜１６％を含んでいることがシーケンシングにより判明した（ｎ＝１００）。集団レベルでは、これは標準アミノ酸のみを含有する配列に有利な１．１〜２．５倍の発現バイアスに相当し、個々のクローンの典型的なバイアスに一致する（図８）。図８はケト−Ｘ−大腸菌、ＳＹ−Ｘ−大腸菌、Ｂｐｙ−Ｘ−大腸菌、又はボロ−Ｘ−大腸菌（ｎ＝１００）でｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＮＮＫライブラリーからファージ発現後に１個以上のＴＡＧコドンを含むファージクローンの百分率を示す。予想値は１７．３％であり、偏差は２０種類の標準アミノ酸のみを含有する配列に有利なバイアスに相当する。最適化条件下でファージを産生させた。χ２試験によると、これらの値は個々のクローンの典型的なバイアスに一致するようである（表１ｃ）。この弱い発現バイアスは機能的性能により容易に解決されるはずである。
ＳＹ−Ｘ−大腸菌を使用してドープランダムライブラリーから公知のスルホチロシン含有抗ｇｐ１２０抗体を選択することができる。
ＨＩＶ感染にはｇｐ１２０とＣＣＲ５共受容体の結合が必要であること、この相互作用を増強するためにはＣＣＲ５の硫酸化が不可欠であること、更に血清から単離された抗ｇｐ１２０硫酸化ヒト抗体の中和はこの特徴を利用することが知られている（１７，１８）。実際に、ｇｐ１２０と結合したこのような抗体の１例である４１２ｄの最近の結晶構造分析によると、その２個のスルホチロシンが総被覆表面積の約２０％を占め、２個のうちの１個がほぼ１００Ａ２に相当することが判明した（１９）。そこで、複雑な真核生物で翻訳後修飾の結果として得られる硫酸化チロシンを大腸菌の任意配列に非天然アミノ酸として組込むことができるので、ＳＹ−Ｘ−大腸菌で高親和性抗ｇｐ１２０抗体を進化させることができるのではないかと推論した。
先ず、２個のスルホチロシン（残基１００及び１００ｃ）を含有する抗体４１２ｄをｇｐ１２０に対する親和性に基づいてランダムライブラリーから選択できるか否かを調べるために試験進化実験を実施した。４１２ｄをファージに適応させるために、２個のヒト４１２ｄチロシン硫酸化部位（ｓｃＦｖ抗体の残基１０４及び１０７）に２個のアンバーコドンを導入したｓｃＦｖ４１２ｄ−２ＳＹをｐＳＥＸバックボーンにクローニングし、ｐＳＥＸ−４１２ｄ２ＴＡＧを作製した。次にＳＹ−Ｘ−大腸菌を使用して４１２ｄ−２ＳＹをファージ上に提示させた。４１２ｄライブラリーを作製するために、スルホチロシンに近接する残基Ｐｒｏ１０１、Ａｓｎ１０５、Ａｌａ１０８、Ｐｒｏ１０９、Ｇｌｙ１１２、Ｍｅｔ１１３と、硫酸化が生じる残基１０４及び１０７の２つの位置でＮＮＫによる部位飽和突然変異誘発法により、４１２ｄ ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩコーディング配列をランダム突然変異させた（方法の項参照）（２０）。得られたファージミドライブラリー（実験最大複雑度２×１０８）をＳＹ−Ｘ−大腸菌に形質転換後、ファージを産生させた。４１２ｄ−２ＳＹを提示するファージをこのファージ集団にライブラリーファージ２０００に対して４１２ｄ−２ＳＹファージ１の比でスパイクし、マイクロタイタープレートに固定化したｇｐ１２０に対してパニングした。各回後にＳＹ−Ｘ−大腸菌でファージ増幅を実施して４回選択後に、集団は１個の配列４１２ｄ−２ＳＹに収束し、ＳＹ−Ｘ−大腸菌におけるｇｐ１２０結合の進化により非天然アミノ酸を含有する配列が得られることが立証された。実際に、３回目後の集団（４回目の選択後にほぼ完全な収束が生じた）もスパイクしたファージではなく、ライブラリーに由来するスルホチロシン含有配列を有していた（下表２参照）。このことから、単に４１２ｄ−２ＳＹだけではなく非天然アミノ酸を含有する新規配列もｇｐ１２０と結合するように進化していることが明らかである。表２は４１２ｄ−２ＳＹをドープした４１２ｄ系ライブラリーから選択した配列のリストを示す。ＮＮＫでランダム突然変異させた位置を下線で示す。
その機能的利点に基づいて４１２ｄ−２ＳＹを選択したことを裏付けるために、４１２ｄ−２ＳＹを提示するファージの発現レベルを特性決定し、どちらも非天然アミノ酸を含まない若干〜多数の配列を含む初期ライブラリーファージと３回目のライブラリーファージの発現レベルに比較した。この比較の結果、４１２ｄ−２ＳＹを提示するファージはライブラリーファージよりも低収率で産生されることが判明した（図９）ため、４１２ｄ−２ＳＹファージの増加は一般的な発現優位性ではなく機能的優位性に起因すると考えられる。図９は初期ファージライブラリーと３回目のライブラリーからのファージ収率と比較して培養液１ｍＬ当たりの４１２ｄ−２ＳＹのファージ収率を示す。ＳＹ−Ｘ−大腸菌を使用して全ファージを産生させた。４１２ｄ−２ＳＹでは、３個の別個のファージ調製物からの力価を平均し、誤差棒は＋標準偏差を表す。４１２ｄ−２ＳＹでは、スルホチロシンを培地に添加しない場合には、ファージ収率は〜１×１０６個／ｍＬであった。更に酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりｇｐ１２０結合を試験するために４１２ｄ−２ＳＹファージを単離した。自然比較として、２個のスルホチロシンをチロシン（４１２ｄ−Ｙ）で置換したｐＳＥＸ−４１２ｄ２ＴＡＴからの４１２ｄを提示するファージを作製し、同様に試験した。図１０に示すように、４１２ｄ−２ＳＹはＢＳＡ対照よりも有効にｇｐ１２０と結合する。更に、ＥＬＩＳＡシグナルは４１２ｄ−Ｙに比較して４１２ｄ−２ＳＹのｇｐ１２０結合が〜１０倍である。従って、２個のスルホチロシン残基に直接起因するその結合親和性に基づいて４１２ｄ−２ＳＹを選択した。
ＳＹ−Ｘ−大腸菌でナイーブな生殖細胞系列ライブラリーから抗ｇｐ１２０抗体について選択すると、硫酸化抗体が得られる。
次に、任意の公知ｇｐ１２０結合配列に基づくライブラリーの代わりに完全にナイーブな生殖細胞系列抗体ライブラリーをｇｐ１２０との結合について選択するｇｐ１２０結合の進化実験を実施した。このライブラリーを特定標的に偏らせたくなかったので、ヒトゲノムＤＮＡからヒト生殖細胞系列重鎖可変領域の混合物を増幅し、オーバーラップＰＣＲを使用してＡ２７生殖細胞系列軽鎖と結合し、ＣＤＲ３ループ領域の６個の連続残基をＮＮＫによる部位飽和突然変異誘発により完全にランダム突然変異させたｓｃＦｖに挿入した（方法の項参照）。ＶＨ遺伝子領域は末端がインフレームにならないので、天然境界のダイバーシティに似せるように、これらの６個の残基の両側の２個の部分的にランダム突然変異させた残基を挿入した。次にライブラリーをファージミドベクターにクローニングし、２×１０９の実験最大複雑度を得た。ＤＮＡシーケンシングの結果、クローンの予想される〜１７％が少なくとも１個のアンバーコドンを含むことが判明した。
次にＳＹ−Ｘ−大腸菌を使用し、このライブラリーからファージを作製した後、ｇｐ１２０に対してパニングした。結合したファージをＳＹ−Ｘ−大腸菌で増幅し、同一ストリンジェンシー下で実施した次の各回が前の回よりもｇｐ１２０結合を増加するようにこのプロセスを合計４回反復した（図１１ａ）。配列決定の結果、配列決定したクローンではスルホチロシンが同時に増加していることが判明した（図１１ｂ）。図１１ａは各回後のファージ溶出量により判断したｇｐ１２０結合の増加を示す。各クローンのコピーが少数しか存在しない場合に潜在的ヒットの無原則な減少を最小限にするために、１回目の選択は後続回よりも著しく低いストリンジェンシーで実施した（方法の項参照）。図１１ｂはシーケンシングにより判定した各回後のスルホチロシン含有クローンの百分率の増加を示す（ｎ＝１５〜３０）。
３回後に、ファージ集団の〜４０％はスルホチロシンを含んでおり、４回後にライブラリーはこれらのスルホチロシン含有抗体のうちで主に配列．．．Ｅ ｓＹ Ｇ Ｓ Ｐ Ｒ Ｇ Ｙ．．．（ｓＹ＝スルホチロシン；部分ランダム突然変異の位置に対応するアミノ酸をイタリックで示し；完全ランダム突然変異の位置に対応するアミノ酸を下線で示す）と重鎖Ｖ領域ＶＨ３−３８をもつ１個の抗体に収束した。このクローンは集団（ｎ＝２０）の６０％に相当した。スルホチロシンの存在下でこのｓｃＦｖ（６６ＣＣ８−ＳＹ）を提示するファージの収率はスルホチロシンの不在下のファージの収率の＞１００倍であり、スルホチロシンの特異的組込みが確認された（５）。６６ＣＣ８−ＳＹを提示するファージの収率を更に初期ライブラリーを提示するファージの収率と３回目のライブラリーからの収率とに比較した処、６６ＣＣ８−ＳＹが非天然アミノ酸を含むという事実から予想される通り、どちらの場合も６６ＣＣ８−ＳＹを提示するファージの産生量は少なかった（図１２）。図１２は初期ファージライブラリーと３回目のライブラリーからのファージ収率に比較した培養液１ｍＬ当たりの６６ＣＣ８−ＳＹのファージ収率を示す。全ファージをＳＹ−Ｘ−大腸菌で産生させた。６６ＣＣ８−ＳＹでは、３個の別個のファージ調製物からの力価を平均し、誤差棒は＋標準偏差を表す。６６ＣＣ８−ＳＹでは、非天然アミノ酸を培地に添加しない場合には、ファージ収率は〜５×１０６であった。従って、結合親和性に基づき、標準アミノ酸のみを含有する配列を含む他の配列よりも６６ＣＣ８−ＳＹを選択した。この結果、スルホチロシンをコードする株でバイアスのないナイーブなライブラリーを使用して進化させると、ｇｐ１２０結合の回答として硫酸化抗体が得られることが立証された。
次に、６６ＣＣ８−ＳＹによるＧｐ１２０結合をＥＬＩＳＡにより特性決定した。図１３に示すように、６６ＣＣ８−ＳＹはＢＳＡ対照よりも特異的にｇｐ１２０と結合し、更に公知抗体４１２ｄ−２ＳＹの約５倍の性能である。同一選択から天然アミノ酸のみを含有する抗体で結合量が最大のもの（配列．．．Ｅ Ｒ Ｒ Ｇ Ｒ Ｅ Ｇ Ｈ．．をもち、４回目の選択後の集団の２０％に相当する抗体６６ＣＣ１４，ｎ＝２０）に比較すると、６６ＣＣ８−ＳＹは約４倍の親和性であった（図１３）。実際に、６６ＣＣ１４は相当量のＢＳＡ結合を示すので、集団におけるその存在は非特異的相互作用が一因であると考えられる。更に、硫酸残基が６６ＣＣ８−ＳＹの親和性に特異的に寄与することを立証するために、スルホチロシンをチロシンで置換したその類似体（６６ＣＣ８−Ｙ）と６６ＣＣ８−ＳＹを比較した。ＴＡＧに応答してチロシンをコードするａａＲＳを使用して６６ＣＣ８−Ｙを産生させ、６６ＣＣ８−ＳＹを提示するファージと比較して得られたファージのｇｐ１２０結合をＥＬＩＳＡにより試験した。図１３に示すように、ファージに提示された６６ＣＣ８−ＳＹは６６ＣＣ８−Ｙに比較してｇｐ１２０結合に〜５倍のＥＬＩＳＡシグナルを発生することから、スルホチロシンがファージに適正に提示されたと判断され、硫酸残基は６６ＣＣ８−ＳＹの親和性に特異的に寄与することが実証された。６６ＣＣ８−ＳＹの出現元である出発ライブラリー集団には６６ＣＣ８−Ｙと多数の関連配列が存在していたはずなので、この結果は予想通りである。なお、これらの全ての場合で、ファージ上のｓｃＦｖの提示レベルはハイパーファージの強制的多価によりクローン全体で一致しているので、サンプル間の比較が簡単になる。
次に、ファージと融合せずに遊離ｓｃＦｖを発現させ、特性決定しようとした。スルホチロシンに特異的な直交ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対を使用してｓｃＦｖ６６ＣＣ８−ＳＹを発現させると、６６ＣＣ８−Ｙ（〜７ｍｇ／Ｌ）の発現と同等の収率が得られたが、産生された全蛋白質は不溶性であり、何度もリフォールディングを試みたが、うまくいかなかった。Ｆａｂフォーマットに変換すると、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ及び６６ＣＣ１４（夫々精製収率０．８、１．０及び１．０ｍｇ／ｍＬ）はｇｐ１２０結合活性が低下した（図１４）。これらの選択抗体に対応する生殖細胞系列可変領域は不安定であり、ｓｃＦｖリンカーが必要であると考えられ、Ｆａｂフォーマットに変換後の活性低下と遊離ｓｃＦｖフォーマットでリフォールディングしにくいことが同時に説明される。これは遊離４１２ｄ−２ＳＹ及び４１２ｄ−Ｙ（夫々精製Ｆａｂ収率０．２５及び０．７ｍｇ／ｍＬ）の発現と対照的であり、これらはいずれも折り畳まれたｓｃＦｖの収率が高く、Ｆａｂフォーマットに変換した場合にｇｐ１２０結合の全活性を維持した。比較となるＫｄ値は文献に見当たらないが、Ｆａｂ４１２ｄ−２ＳＹはｇｐ１２０と有効且つ硫酸依存的に結合し、ＥＬＩＳＡによると、Ｆａｂ４１２ｄ−Ｙの＞１５倍の親和性であった（図１４）。図１４ａは抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰ抗体を使用し、金属増感型ＤＡＢキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させたプロテインＧ精製Ｆａｂのウェスタンブロット分析を示す。変性ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）上にサンプルを泳動させた。６６ＣＣ８−ＳＹ及び４１２ｄ−ＳＹでは、硫酸化抗体発現がスルホチロシンの存在に依存することを立証するために、スルホチロシンの不在下の発現に対応するレーンも示す。図１４ｂ〜ｆはＦａｂ６６ＣＣ１４、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ、４１２ｄ−ＳＹ及び４１２ｄ−ＹのＬＣＭＳ（ＥＳＩ陽性）スペクトルを示す。図１４ｇは夫々精製Ｆａｂ６６ＣＣ１４、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ、４１２ｄ−２ＳＹ及び４１２ｄ−Ｙとｇｐ１２０の結合を測定したＥＬＩＳＡの結果を示す。これは硫酸化されている場合のみにｇｐ１２０を免疫沈降させる哺乳動物硫酸化４１２ｄと同様である。安定性について選択するか又はナイーブ生殖細胞系列ｓｃＦｖではなくＦａｂに由来するライブラリーを使用すると、このようなフォールデイングとフォーマット変換の問題を防ぐことができる。
考察
２０種類の標準アミノ酸以外の非天然アミノ酸を蛋白質機能空間の研究に利用可能な蛋白質進化システムを開発した。指向的進化実験に非天然ないし非標準アミノ酸を使用する従来の試み（２１，２２）とは対照的に、本発明者らのシステムにおける非天然アミノ酸は遺伝的にコードされ、部位特異的組込みにユニークコドンＴＡＧしか必要としない。従って、非天然アミノ酸による翻訳は天然アミノ酸による翻訳と同一の基本的パラダイムを利用するので、２１種類のアミノ酸の蛋白質が無制限に進化する。しかし、収率バイアスは天然アミノ酸のみを含有する配列に有利であるという１つの制限がある。従って、標準アミノ酸のみを含有する配列と共に非天然アミノ酸を含有する配列を含む集団を生じる多様化ストラテジーを機能進化の対象にできるように、このバイアスを軽減するように本発明者らのファージ系システムを最適化する。収率バイアスは最小限になるが、完全には除去されないので、本発明者らが記載した全選択を含む選択では非天然アミノ酸を含有する配列が集団に維持されるように非天然アミノ酸が機能に寄与する必要がある。
４種類の非天然アミノ酸を組込んだＸ−大腸菌株を増殖条件の操作によりファージミド指向的進化に合わせて最適化し、バイアスのないナイーブな生殖細胞系列抗体ライブラリーからｇｐ１２０結合抗体を進化させるために、非天然アミノ酸スルホチロシンをコードする１個の株を使用した。本実験では、抗体集団はｇｐ１２０結合親和性に直接寄与するスルホチロシンを含有する新規クローンに収束した。完全にナイーブなライブラリーからこのクローンを選択し、拡張遺伝子コードが非天然アミノ酸の機能的寄与により選択的優位性を付与できることを初めて立証する。
ただ１個の非天然アミノ酸を含有する配列を使用し、バイアスを最小限にするようにこのシステムの最適化を実施した。従って、２個以上の非天然アミノ酸を含有する配列に不利なファージ収率バイアスは増加すると思われるので、このような配列が複数回にわたって優勢になるためにはより顕著な機能的優位性が必要になる。複数の非天然アミノ酸を含有する配列の選択に不利なこのような全バイアスは反復選択実験により解決することができる。例えば、所与選択で最適な配列が１個の非天然アミノ酸を含む場合には、成功配列からの非天然アミノ酸を固定し、他の周囲のアミノ酸をランダム突然変異させる２回目の選択実験を実施することができる。集団の全メンバーが既に第１の非天然アミノ酸を含んでいるので、この制限ライブラリーを使用すると、第２の非天然アミノ酸の組込みもバイアスが最小限になる。当然のことながら、複数の非天然アミノ酸をもつ機能的優位性が付随する発現バイアスを解決する場合には、このアプローチは省略できる。例えば、本発明のシステムを使用し、天然アミノ酸のみを含有する配列が当初は優勢である４１２ｄ系ライブラリーから非天然アミノ酸スルホチロシン２個を含む４１２ｄ−２ＳＹを直接選択する。
そのユニークな化学的機能に基づいて選択したスルホチロシン、ビピリジルアラニン、４−ボロノフェニルアラニン及びパラアセチルフェニルアラニンの４種類の非天然アミノ酸で進化させるようにこのシステムを最適化したが、まだ完全に特性決定することが必要なものを含め、直交ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対により組込まれる任意非天然アミノ酸（現段階では約４５種類）で拡張遺伝子コードによるファージ進化を場合により使用することができる。この事実をファージディスプレイの汎用性と一連の利用可能なライブラリー設計及び多様化ストラテジー（１３）に結び付けると、達成可能な機能の範囲と種類を非天然アミノ酸で拡張する新規結合方式、触媒活性及び構造の進化が可能になった。
方法
Ｘ−大腸菌プラスミド設計及び構築
ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対をｐＣＤＦプラスミドにコードさせた。ｐＣＤＦプラスミドはＣｌｏＤＦ１３（２３）に由来するレプリコンをもち、ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡと、ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡに非天然アミノ酸を特異的に負荷する突然変異体ＭｊＴｙｒＲＳをコードする。ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡにパラアセチルフェニルアラニンを負荷する突然変異体ａａＲＳをコードするｐＣＤＦ−ケトを構築するために、プライマー：
ＭＴ０１：５’−ＧＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＧＣＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＧＧＴＣ−３’及び
ＭＴ０２：５’−ＧＴＴＧＴＴＧＡＧＣＴＣＧＡＴＡＡＡＴＴＧＣＡＣＴＧＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＴＴＣ−３’
を使用してＣｌｏＤＦ１３レプリコンをもつインサート遺伝子をベクターｐＣＤＦ−１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）からＰＣＲにより増幅した。次にインサートを制限酵素ＡｃｃＩ及びＳａｃＩで消化し、精製し、ＡｃｃＩ／ＳａｃＩて切断したｐＳｕｐベクターにライゲーションした（２４）。配列決定の結果、プラスミドの２番目のｔＲＮＡカセットのｐｒｏＫプロモーターにＧ→Ａ突然変異が判明し、機能的に活性な生存能力の高いクローンが得られた。従って、この突然変異を維持させた。ｐＣＤＦ−ケトを作製後、他のシンテターゼに交換して制限部位ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩを使用し、いずれもアンバーコドンに応答してビピリジルアラニンを組込んだｐＣＤＦ−Ｂｐｙ、スルホチロシンを組込んだｐＣＤＦ−ＳＹ、及び４−ボロノフェニルアラニンを組込んだｐＣＤＦ−１ＢＧｌｌを作製した。次にこれらのｐＣＤＦプラスミドの各々をＴｏｐ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、ケト−Ｘ−大腸菌、Ｂｐｙ−Ｘ−大腸菌、ＳＹ−Ｘ−大腸菌、及びボロ−Ｘ−大腸菌を作製し、抗生物質クロラムフェノコール（３０μｇ／ｍＬ）及びテトラサイクリン（３０μｇ／ｍＬ）上に維持した。
ｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＧ及びｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＴプラスミド構築
ＶＨ３−２３とＶＬＡ２７を含み、ＶＨＣＤＲ３ループにＴＡＧを付加したＦａｂフォーマット抗体をＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ社で合成した。ｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＧを構築するために、先ずプライマー：
ＬＣ１：５’−ＧＣＡＣＧＣＧＴＡＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧ−３’及び
ＬＣ２：５’−ＣＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣ−３’
を使用してこの合成Ｆａｂ抗体遺伝子から軽鎖遺伝子を増幅した。次に軽鎖遺伝子をＭｌｕとＢａｍＨＩで消化後、同様に消化したｐＳＥＸ８１（Ｐｒｏｇｅｎ）に挿入し、ｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＡ２７を作製した。次にプライマー
ＨＣ１：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ−３’及び
ＨＣ２：５’−ＣＴＴＣＡＡＧＣＴＴＴＧＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＧ−３’
を使用して合成Ｆａｂ抗体遺伝子から重鎖遺伝子を増幅した後、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。この配列を同様に消化したｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＡ２７に挿入し、ｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＧを作製した。Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）部位特異的突然変異誘発法を使用し、ｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＧのＴＡＧコドンをＴＡＴコドンで置換したｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＴを作製した。
これらのｐＳＥＸプラスミドでは、ｓｃＦｖとｐＩＩＩの間にトリプシン部位が存在するので、提示されたｓｃＦｖを除去し、感染性ｐＩＩＩを暴露することができる。これは溶出と感染に重要である。
ｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＮＮＫライブラリー構築
プライマー
ＶＨ−２３−Ｆ：５’ＴＣＴＣＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ−３’及び
ＶＨ３−２３Ｒ：５’−ＴＣＴＴＴＣＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＴＡＣＧＧ３’
を使用して合成Ｆａｂ抗体遺伝子からＶＨ３−２３を含む重鎖遺伝子フラグメントを増幅した。プライマー
ＮＮＫ１：５’−ＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＡＮＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧ−３’及び
ＮＮＫ２：５’−ＡＧＣＣＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡＧ−３’
（上記配列中、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣであり、Ｋ＝Ｇ又はＴである）を使用するオーバーラップＰＣＲにより、ランダム突然変異させたＣＤＲ３ループをこのフラグメントに付加した。次にプライマー
ＨＣ１：５’−ＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ−３’及び
ＨＣ２：５’−ＣＴＴＣＡＡＧＣＴＴＴＧＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧＧ−３’
を使用して全長重鎖ライブラリーを含む最終遺伝子産物を増幅した。
産物の制限部位ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＨＩを消化し、同様に消化したｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＴに挿入し、ライブラリーｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＮＮＫを作製した。ライゲーション混合物を沈降させ、産物をエレクトロコンピテントＴｏｐ１０Ｆ’細胞に形質転換し、合計５×１０８個の形質転換細胞を得た。アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン３０μｇ／ｍＬ、及びグルコース１％を添加した２ＹＴで一晩増殖後、スーパーコイルＤＮＡを単離した。次に集団のファージディスプレイ試験のためにこのＤＮＡをケト−Ｘ−大腸菌、Ｂｐｙ−Ｘ−大腸菌、ＳＹ−Ｘ−大腸菌及びボロ−Ｘ−大腸菌に形質転換した。
ｐＳＥＸ−４１２ｄ２ＴＡＴ及びｐＳＥＸ−４１２ｄ２ＴＡＧ構築
プライマー
４１２ｄＦ：５’ＣＡＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧ−３’及び
４１２ｄＢ：５’−ＣＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＡ−３’
を使用して哺乳動物４１２ｄ発現ベクター（１８）からｓｃＦｖコーディング領域を増幅した。得られたｓｃＦｖをＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化し、同様に消化したｐＳＥＸ８１に挿入し、ｐＳＥＸ−４１２ｄ２ＴＡＴを得た。Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）部位特異的突然変異誘発法を使用し、２個の哺乳動物チロシン硫酸化位置（残基１０４及び１０７）をアンバーコドンで置換し、ｐＳＥＸ−４１２ｄ２ＴＡＧを得た。
４１２ｄライブラリーの作製
残基Ｐｒｏ１０１、Ｔｙｓ１０４、Ａｓｎ１０５、Ｔｙｓ１０７、Ａｌａ１０８、Ｐｒｏ１０９、Ｇｌｙ１１２及びＭｅｔ１１３をランダム突然変異させた４１２ｄライブラリーを作製するために、先ずプライマー
４１２ｄＬｉｂ１：５’−ＣＣＧＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ−３’及び
４１２ｄＬｉｂ２：５’−ＧＴＡＡＧＧＧＣＴＣＧＣＡＣＡＧＴＡＡＡＡＴＡＣＧＧＣＣ−３’
を使用してｐＳＥＸ−４１２ｄ２ＴＡＧから重鎖フラグメントを増幅した。次にプライマー
４１２ｄＬｉｂ３：５’−ＧＣＣＧＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＣＣＣＴＴＡＣＮＮＫＡＡＴＧＡＣＮＮＫＮＮＫＧＡＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＧＧＡＧＮＮＫＮＮＫＡＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＣＴＣＴＧ−３’及び
４１２ｄＬｉｂ４：ＣＡＧＡＧＡＴＣＧＡＡＧＴＡＣＣＡＧＣＴ
（上記配列中、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣであり、Ｋ＝Ｇ又はＴである）を使用し、得られた産物をオーバーラップＰＣＲにより伸長させた。プライマー
４１２ｄＬｉｂ５：ＡＧＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＣＴＣＴＧ及び
４１２ｄＬｉｂ６：ＣＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡ
を使用してｐＳＥＸ−４１２ｄ２ＴＡＧから第２のフラグメントを増幅し、オーバーラップＰＣＲにより２個のフラグメントを結合し、４１２ｄ遺伝子ライブラリーを得た。このライブラリーを次にＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化し、同様に消化したｐＳＥＸ８１ベクターに挿入した。ライゲーション産物をｔＲＮＡにより沈降させ、Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞に形質転換し、合計２×１０８個の形質転換細胞を得た。アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン３０μｇ／ｍＬ、及びグルコース１％を添加した２ＹＴで一晩増殖後、スーパーコイルＤＮＡを単離した。次に抗ｇｐ１２０抗体のファージディスプレイと選択のためにこのＤＮＡをＳＹ−Ｘ−大腸菌に形質転換した。
抗ｇｐ１２０抗体の選択用のナイーブ生殖細胞系列抗体ライブラリーの作製
プライマー
ＶＨ−Ｍｉｘ−Ｆ：５’−ＴＣＴＣＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧ−３’及び
ＶＨ−Ｍｉｘ−Ｒ：５’−ＴＣＴＣＴＣＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＣＧＧＣＣＧ−３’
を使用してヒトｃＤＮＡから生殖細胞系列ＶＨフラグメントの混合物を増幅した。このＰＣＲ反応のアニール温度は５６℃とした。プライマー
ＮＮＫ１：５’−ＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＮＮＮＫＮＮＫＫＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧ−３’及び
ＮＮＫ２：５’−ＡＧＣＣＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣ ＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡＧ−３’
（上記配列中、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣであり、Ｋ＝Ｇ又はＴである）を使用するオーバーラップＰＣＲにより、ランダム突然変異させたＣＤＲ３ループをこれらのフラグメントに付加した。次にプライマー
ＶＨ６６ＣＣ−Ｆ：５’−ＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧ−３’及び
ＶＨ６６ＣＣ−Ｒ：５’ＣＴＴＣＡＡＧＣＴＴＴＧＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＴ−３’
を使用して最終遺伝子産物を増幅した。このＰＣＲライブラリーをＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に消化したｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＴに挿入し、ナイーブ生殖細胞系列ｓｃＦｖのライブラリーを作製した。ライゲーション混合物を沈降させ、エレクトロコンピテントＴｏｐ１０Ｆ’細胞に形質転換し、合計２×１０９個の形質転換細胞を得た。アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン３０μｇ／ｍＬ及びグルコース１％を添加した２ＹＴで一晩増殖後、スーパーコイルＤＮＡを単離した。次に抗ｇｐ１２０抗体のファージディスプレイと選択のためにこのＤＮＡをＳＹ−Ｘ−大腸菌に形質転換した。
ファージ産生
最適化条件下で実施した全実験で以下のファージ発現プロトコルを使用した。先ず、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン３０μｇ／ｍＬ、クロラムフェノコール３０μｇ／ｍＬ及びグルコース１％を添加した２ＹＴでファージミドライブラリー又はシングルファージミドクローンＤＮＡで形質転換したＸ−大腸菌培養液を一晩増殖させる。飽和に達した後、最終ファージ発現容量の１２．５％に等しい合計容量を培養液から除去し、遠心し、最終ファージ発現容量の２５％に等しい容量の２ＹＴに再懸濁する。２ＹＴにアンピシリン１００μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン３０μｇ／ｍＬ、及びクロラムフェノコール３０μｇ／ｍＬを添加する。この培養液にハイパーファージ（Ｐｒｏｇｅｎ）を２０ＭＯＩ（ＭＯＩ＝感染多重度）で加える。得られた培養液を次に１００ｒｐｍで１時間３７℃にてインキュベートした後、細胞を遠心し、培地を除去する。次にアンピシリン１００μｇ／ｍＬ、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ、及びクロラムフェノコール３０μｇ／ｍＬを添加した所望の最終ファージ発現容量の２ＹＴにファージを再懸濁する。使用したＸ−大腸菌に対応する非天然アミノ酸を培地に直接添加し、ファージ培養液を２８０ｒｐｍで１８時間３０℃にてインキュベートする。ケト−Ｘ−大腸菌、Ｂｐｙ−Ｘ−大腸菌、ＳＹ−Ｘ−大腸菌、及びボロ−Ｘ−大腸菌では、非天然アミノ酸を夫々８ｍＭ、１５ｍＭ、１．５ｍＭ、及び６．５ｍＭ（ラセミ混合物１３ｍＭ）加える。Ｂｐｙ−Ｘ−大腸菌では、鉄消耗に伴う毒性を防ぐために２０ｍＭ ＦｅＳＯ４も加えた。ボロ−Ｘ−大腸菌では、２５ｍＭ ＮａＯＨを加えてアミノ酸を可溶化した。パラアセチルフェニルアラニンは公開手順（７）に基づいてＳｙｎｃｈｅｍにより合成し、スルホチロシンはＳｅｎｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｂａｃｈｅｍから購入し、４−ボロノフェニルアラニンはＡｌｄｒｉｃｈからＤ異性体とＬ異性体の混合物として購入した。ビピリジルアラニンの合成については、下記参照。
ファージ産生後、培地を採取し、細胞を捨てた。次に１０ｋＤカットオフコンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して培地を適切な容量まで濃縮した。次に５倍量のファージ沈殿用緩衝液（２０％ＰＥＧ ８０００，２．５ｍＭ ＮａＣｌ）の添加により、濃縮ファージを沈降させ、適切な容量のリン酸緩衝食塩水，ｐＨ７（ＰＢＳ）に溶解した。２回沈降させた。
ビピリジルアラニンの合成
５−メチル−２，２’−ピピリジン。２−ブロモ−５−メチルピリジン（５．０ｇ，２９ｍｍｏｌ）と、２−トリブチルスタニルピリジン（１０ｇ，２７ｍｍｏｌ）と、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（２．０ｇ，１．７ｍｍｏｌ）を無水トルエン（２５０ｍＬ）に加えた混合物を４８時間１１０℃にて撹拌した。反応混合物をセライトで濾過し、減圧蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０．５％ＭｅＯＨ）により、メチル−２，２’−ピピリジン（３．５ｇ，７５％）を無色油状物として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．４７（ｓ，３Ｈ），７．３５（ｄｄ，１Ｈ），７．７０（ｄｄ，１Ｈ），７．８７（ｍ，１Ｈ），８．３６（ｄ，１Ｈ），８．４３（ｄ，１Ｈ），８．５８（ｄ，１Ｈ），８．７４（ｄｄ，１Ｈ）。
２−（２，２’−ビピリジン−５−イルメチル）−２−アセトアミドマロン酸ジエチル。水とベンゼン（１：１）の混合溶媒（１００ｍＬ）中でメチル−２，２−ピピリジン（１．７ｇ，１０ｍｍｏｌ）にハロゲンランプ（１５０Ｗ）を照射し、還流した。臭素（１．６ｇ，１０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を３０分間加熱還流した。溶液を減圧濃縮し、ＥｔＯＡｃに溶解した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮し、粗臭素化生成物を得た。アセトアミドマロン酸ジエチル（２．６ｇ，１２ｍｍｏｌ）と水素化ナトリウム（０．４８ｇ，１２ｍｍｏｌ，鉱油中６０％）を無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）に加えた混合物を３０分間０℃で撹拌した。溶液に粗生成物の０℃の無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液を加え、混合物を１時間室温で撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、１０％チオ硫酸水溶液（２×１５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中０．５％ＭｅＯＨ）により精製し、２−（２，２’−ビピリジン−５−イルメチル）−２−アセトアミドマロン酸ジエチル（２．５ｇ，６５％）を白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．３８（ｍ，６Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），３．８１（ｓ，２Ｈ），４．３５（ｍ，４Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｄｄ，１Ｈ），７．５５（ｄｄ，１Ｈ），７．８７（ｍ，１Ｈ），８．３６（ｄ，１Ｈ），８．４１（ｄ，１Ｈ），８．４２（ｄ，１Ｈ），８．７４（ｄｄ，１Ｈ）。
ビピリジルアラニン：３−（２，２’−ビピリジン−５−イル）−２−アミノプロパン酸。２−（２，２’−ビピリジン−５−イルメチル）−２−アセトアミドマロン酸ジエチル（２．５ｇ，６．５ｍｍｏｌ）を１２Ｍ ＨＣｌ中で６時間加熱還流した。反応混合物を減圧濃縮し、生成物（２．３ｇ，９９％）をＨＣｌ塩形態の白色固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３．５９（ｍ，２Ｈ），４．５８（ｔ，１Ｈ），８．１１（ｍ，１Ｈ），８．４０（ｄｄ，１Ｈ），８．６７（ｄ，１Ｈ），８．７０（ｍ，１Ｈ），８．８３（ｄ，１Ｈ），８．９９（ｄｄ，１Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１３Ｈ１３Ｎ３Ｏ２（Ｍ＋１）の計算値２４３．１，実測値２４３．１。
ファージ定量
２種類の方法を使用してファージ力価を測定した（１６）。感染性ファージが該当集団である選択等の用途では、Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞の感染によりファージを定量した。具体的には、小容量のファージを１．７５μｇ／ｍＬトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で消化し、Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞に感染させるために使用した。次に希釈液を選択プレートに撒くことにより感染細胞量を測定した（ｐＳＥＸ系ファージミドにはアンピシリンプレートを使用した）。ファージ粒子全体が該当集団であるＥＬＩＳＡ等の用途では、ファージをＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、２％脱脂乳ＰＢＳ溶液でブロックし、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０２５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で数回洗浄し、２％脱脂乳ＰＢＳＴ溶液中で抗Ｍ１３ポリクローナル抗体（ＮＥＢ）と結合させ、ＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で検出した。既知量のハイパーファージをプレートに吸着させて同様に処理した標準曲線とこのサンプルを比較した。複数のサンプルを比較した場合には、全部に同一力価シグナルを与えるようにサンプルを標準化した。
ｇｐ１２０結合性ファージの選択
０．５μｇの可溶性ＡＤＡ ｇｐ１２０をＰＢＳ１００μＬに溶かし、１２時間３７℃にてＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）マイクロタイタープレートウェルの表面にコーティングした。２％脱脂乳（Ｂｉｏｒａｄ）ＰＢＳ溶液で２時間ブロックし、ＰＢＳＴ ２００μＬで３回洗浄後、濃縮したファージライブラリーを２％脱脂乳ＰＢＳＴ溶液１００μＬに加え、３７℃で４時間インキュベートした。ＰＢＳＴとＰＢＳで洗浄後、トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）１．７５μｇ／ｍＬで１２分間ファージを溶出させた。溶出したファージを使用し、クロラムフェノコール３０μｇ／ｍＬとテトラサイクリン３０μｇ／ｍＬを添加した２ＹＴ中でＳＹ−Ｘ−大腸菌の０．４ Ｏ．Ｄ．培養液２０ｍＬに感染させた。１時間３７℃で感染させた後、細胞の小アリコートをプレートに撒き、溶出したファージ数を測定した。細胞の残余を遠心し、クロラムフェノコール３０μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン３０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、及びグルコース１％を添加した２ＹＴ ２５ｍＬに再懸濁した。一晩増殖後、濃度が増加したライブラリーを使用し、次回にファージを産生させた。
ＥＬＩＳＡによるｇｐ１２０結合親和性の測定
サンプル１個当たり０．３３μｇの可溶性ＡＤＡ ｇｐ１２０をＰＢＳ １００μＬに溶かし、ＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）マイクロタイタープレートウェルの表面に１２時間３７℃でコーティングした。２％脱脂乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＰＢＳ溶液２００μＬで２時間ブロック後、上記手順に従って予め精製及び定量したＦａｂ蛋白質を２％脱脂乳ＰＢＳＴ溶液１００μＬに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄後、抗ヒトκ軽鎖抗体（Ｓｉｇｍａ）を２％脱脂乳ＰＢＳＴ溶液１１０μＬに加え、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで８回洗浄後、ＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ）を使用してＥＬＩＳＡシグナルを測定した。
ドープライブラリーを使用したＧｐ１２０結合選択
一般的なｇｐ１２０結合選択手順を使用した（上記参照）。具体的には、この選択では以下の洗浄プロトコルを使用した。
１回目：１回当たりＰＢＳＴ ２００μＬで１０回洗浄；１回当たり〜１分間
２回目：１回当たりＰＢＳＴ ２００μＬで１２回洗浄；１回当たり〜１分間
３回目：１回当たりＰＢＳＴ ２００μＬで１４回洗浄；１回当たり〜１分間
４回目：１回当たりＰＢＳＴ ２００μＬで１５Ｘ回洗浄；１回当たり〜１分間
この選択の全回のファージ添加量と溶出量を下表に示す。溶出前の最終洗浄液中に存在するファージの量を測定した場合にはこの量も示す。
この選択で少なくとも１個のＴＡＧを含むファージの百分率と４１２ｄ２ＴＡＧをドープしたクローンを含むファージの百分率を下表に示す。
ナイーブ生殖細胞系列ライブラリーを使用したｇｐ１２０結合選択
一般的なｇｐ１２０結合選択手順を使用した（上記参照）。具体的には、この選択では以下の洗浄プロトコルを使用した。
１回目：１回当たりＰＢＳＴ ２００μＬで２回洗浄；１回当たり〜１分間
２回目：１回当たりＰＢＳＴ ２００μＬで１０回とＰＢＳ ２００μＬで１回洗浄；１回当たり〜１分間
３回目：１回当たりＰＢＳＴ ２００μＬで１０回とＰＢＳ ２００μＬで１回洗浄；１回当たり〜１分間
４回目：１回当たりＰＢＳＴ ２００μＬで１０回とＰＢＳ ２００μＬで１回洗浄；１回当たり〜１分間
この選択の全回のファージ添加量と溶出量を下表に示す。なお、１回目のストリンジェンシーは低いので、ファージ溶出量が多い。こうして、ライブラリーに各クローンのコピーが非常に少数しか存在しない場合に機能的クローンの無原則な減少が生じないようにする。
遊離ｓｃＦｖ蛋白質の発現
ファージと融合せずに遊離蛋白質としてｓｃＦｖを発現させるために、標準方法を使用してｇＩＩＩペリプラズムシグナル配列とＣ−末端６Ｘヒスチジンタグを含むｐＢＡＤ発現ベクターにｓｃＦｖ６６ＣＣ８、４１２ｄ−２ＳＹ及び４１２ｄ−Ｙのコーディング領域を挿入した。こうして、ｐＢＡＤ−６６ＣＣ８、ｐＢＡＤ−４１２ｄ−２ＳＹ、及びｐＢＡＤ−４１２ｄ−Ｙを得た。
４１２ｄ−ＹをｓｃＦｖとして発現させるために、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを添加した２ＹＴで光学密度が０．６に達するまでｐＢＡＤ−４１２ｄ−Ｙを導入したＴｏｐ１０Ｆ’細胞を３７℃、２５０ｒｐｍにて増殖させ、この時点で０．１％Ｌ−アラビノースによりｓｃＦｖ産生を誘導した。次に培養液を２５０ｒｐｍ、室温で３０時間振盪後、可溶性ｓｃＦｖは産生されなかったので、細胞をペレット化し、８Ｍ尿素に溶解させた。蛋白質リフォールディングキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してリフォールディングし、可溶性ｓｃＦｖを得た。
４１２ｄ−２ＳＹをｓｃＦｖとして発現させるために、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、クロラムフェノコール３０μｇ／ｍＬ、及びスルホチロシン１０ｍＭを添加した２ＹＴ（Ｂａｃｈｅｍ）で、非天然アミノ酸による発現に適した最適化プラスミドであり、この場合にはスルホチロシン特異的シンテターゼと対応する直交ｔＲＮＡを含むｐＳＵＰＡＲ６−Ｌ３−３ＳＹ（Ｃｅｌｌｉｔｔｉ，Ｓ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｌａｇｐａｃａｎ，Ｌ．，Ｈａｏ，Ｘ．，Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，Ｈｕ，Ｈ．，Ｂｒｉｔｔａｉｎ，Ｓ．，Ｂｒｉｎｋｅｒ，Ａ．，Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｊ．，Ｂｕｒｓｕｌａｙａ，Ｂ．，Ｓｐｒａｇｇｏｎ，Ｇ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．，Ｒｙｕ，Ｙ．，Ｕｎｏ，Ｔ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．，Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ，Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００８）１３０，９２６８−９２８１）と共にｐＢＡＤ−４１２ｄ−ＳＹを導入したＴｏｐ１０Ｆ’細胞を３７℃、２５０ｒｐｍにて増殖させた。光学密度が０．６に達したら、シンテターゼとｓｃＦｖの両方の産生を０．２％Ｌ−アラビノースで誘導した。次に培養液を２５０ｒｐｍで室温にて３０時間振盪後、細胞をペレット化し、８Ｍ尿素に溶解させた。蛋白質リフォールディングキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してリフォールディングし、可溶性ｓｃＦｖを得た。
６６ＣＣ８−ＳＹをｓｃＦｖとして発現させるために、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、クロラムフェノコール３０μｇ／ｍＬ、及びスルホチロシン１０ｍＭを添加した２ＹＴ（Ｂａｃｈｅｍ）で、ｐＳＵＰＡＲ６−Ｌ３−３ＳＹと共にｐＢＡＤ−６６ＣＣ８を導入したＴｏｐ１０Ｆ’細胞を３７℃、２５０ｒｐｍにて増殖させた。光学密度が０．６に達したら、シンテターゼとｓｃＦｖの両方の産生を０．２％Ｌ−アラビノースで誘導した。次に培養液を２５０ｒｐｍで室温にて３０時間振盪後、細胞をペレット化し、８Ｍ尿素に溶解させた。可溶性蛋白質が回収されなかったので、リフォールディングは失敗した。
６６ＣＣ８−ＹをｓｃＦｖとして発現させるために、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、クロラムフェノコール３０μｇ／ｍＬを添加した２ＹＴで、ｐＴＡＧに応答してチロシンをコードするプラスミドであるｐＣＤＦ−ＪＹＲＳと共にｐＢＡＤ−６６ＣＣ８を導入したＴｏｐ１０Ｆ’細胞を３７℃、２５０ｒｐｍにて増殖させた。光学密度が０．６に達したら、シンテターゼとｓｃＦｖの両方の産生を０．２％Ｌ−アラビノースで誘導した。次に培養液を２５０ｒｐｍで室温にて３０時間振盪後、細胞をペレット化し、８Ｍ尿素に溶解させた。可溶性蛋白質が回収されなかったので、リフォールディングは失敗した。
抗６ＸＨｉｓ抗体（Ｓｉｇｍａ）と標準６Ｘ−ヒスチジンタグを付加した既知濃度の蛋白質を使用してウェスタンブロット分析により蛋白質収率を測定した。
遊離Ｆａｂ蛋白質の発現及び精製
ファージに提示されたｓｃＦｖをＦａｂフォーマットに変換するために、標準方法を使用して（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎで合成した）ヒト重鎖及び軽鎖定常領域を含むｐＢＣ発現ベクターにｓｃＦｖ６６ＣＣ１４、６６ＣＣ８、４１２ｄ−２ＳＹ及び４１２ｄ−Ｙの軽鎖及び重鎖可変領域を別々に挿入した。こうして、ｌａｃプロモーター下で２シストロン性構築物からＦａｂ発現用のをｐＢＣ−６６ＣＣ１４Ｆａｂ、ｐＢＣ−６６ＣＣ８Ｆａｂ、ｐＢＣ−４１２ｄ−２ＳＹＦａｂ及びｐＢＣ−４１２ｄ−ＹＦａｂを得た。
６６ＣＣ１４と４１２ｄ−ＹをＦａｂとして発現させるために、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを添加した２ＹＴでｐＢＣ−６６ＣＣ１４Ｆａｂ又はｐＢＣ−４１２ｄ−ＹＦａｂを導入したＴｏｐ１０Ｆ’細胞を光学密度が０．６に達するまで３７℃、２５０ｒｐｍにて増殖させ、この時点で１ｍＭ ＩＰＴＧでＦａｂ産生を誘導した。次に培養液を２５０ｒｐｍで室温にて３０時間振盪後、細胞をペレット化し、培養液の１／２０容量のペリプラズム溶解用緩衝液（２０％スクロース，３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍｇ／ｍＬリゾチーム，ｐＨ７．４）で３回溶解させた。プロテインＧ樹脂で精製するためにペリプラズム溶解液を採取した。
４１２ｄ−２ＳＹと６６ＣＣ８−ＳＹをＦａｂとして発現させるために、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、クロラムフェノコール３０μｇ／ｍＬ、及びスルホチロシン１０ｍＭを添加した２ＹＴ（Ｂａｃｈｅｍ）でｐＳＵＰＡＲ６−Ｌ３−３ＳＹと共にｐＢＣ−４１２ｄ−ＳＹＦａｂ又はｐＢＣ−６６ＣＣ８−ＳＹＦａｂを導入したＴｏｐ１０Ｆ’細胞を３７℃、２５０ｒｐｍにて増殖させた。光学密度が０．３に達したら、０．２％Ｌ−アラビノースでシンテターゼ産生を誘導した。光学密度が０．６に達したら、１ｍＭ ＩＰＴＧでＦａｂ産生を誘導した。次に培養液を２５０ｒｐｍで室温にて３０時間振盪後、細胞をペレット化し、培養液の１／２０容量のペリプラズム溶解用緩衝液で３回溶解させた。プロテインＧ樹脂で精製するためにペリプラズム溶解液を採取した。
６６ＣＣ８−ＹをＦａｂとして発現させるために、アンピシリン１００μｇ／ｍＬとクロラムフェノコール３０μｇ／ｍＬを添加した２ＹＴでｐＣＤＦ−ＪＹＲＳと共にｐＢＣ−６６ＣＣ８Ｆａｂを導入したＴｏｐ１０Ｆ’細胞を３７℃、２５０ｒｐｍにて増殖させた。光学密度が０．３に達したら、０．２％Ｌ−アラビノースでシンテターゼ産生を誘導した。光学密度が０．６に達したら、１ｍＭ ＩＰＴＧでＦａｂ産生を誘導した。次に培養液を２５０ｒｐｍで室温にて３０時間振盪後、細胞をペレット化し、培養液の１／２０容量のペリプラズム溶解用緩衝液で３回溶解させた。プロテインＧ樹脂で精製するためにペリプラズム溶解液を採取した。
プロテインＧを使用してペリプラズム溶解液を精製するために、プロテインＧ樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）１ｍＬを１ｍＬポリプロピレンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に充填した。結合用緩衝液（５０ｍＭ ＭＥＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．５）５ｍＬでカラムの平衡化後、ペリプラズム溶解液をカラムにロードし、重力流により樹脂に通過させた。次にカラムを結合用緩衝液１５ｍＬで洗浄後、溶出用緩衝液（１００ｍＭグリシン，ｐＨ２．８）５ｍＬで溶出させ、すぐにｐＨ７．４まで中和した。溶出したＦａｂを次にＰＢＳで透析し、その後の使用に備えて濃縮した。
λ＝２８０のＵＶ吸光度によりＦａｂ収率を測定した。
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１８．Ｃｈｏｅ Ｈ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＲ５ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０．Ｃｅｌｌ １１４（２）：１６１−１７０．
１９．Ｈｕａｎｇ ＣＣ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＲ５ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ａｎｄ ｏｆ ａ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｓｕｌｆａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ ａｎｄ ＣＤ４．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１７（５８４６）：１９３０−１９３４．
２０．Ｈｕａｎｇ ＣＣ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｉｏｎ ａｎｄ ＶＨ−ｇｅｎｅ ｕｓａｇｅ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｔｈｅ ＨＩＶ ｔｙｐｅ １ ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｇｐ１２０．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（９）：２７０６−２７１１．
２１．Ｙｏｏ ＴＨ，Ｌｉｎｋ ＡＪ，＆ Ｔｉｒｒｅｌｌ ＤＡ（２００７）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４（３５）：１３８８７−１３８９０．
２２．Ｌｏｖｅ ＫＲ，Ｓｗｏｂｏｄａ ＪＧ，Ｎｏｒｅｎ ＣＪ，＆ Ｗａｌｋｅｒ Ｓ（２００６）Ｅｎａｂｌｉｎｇ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ａ ｆａｃｉｌｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ ｅｎｚｙｍｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ７（５）：７５３−７５６．
２３．Ｎｉｊｋａｍｐ ＨＪ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｏｇｅｎｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ ＣｌｏＤＦ１３．Ｐｌａｓｍｉｄ １６（２）：１３５−１６０．
２４．Ｒｙｕ Ｙ ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ（２００６）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ３（４）：２６３−２６５．
図面の説明
図７。非天然アミノ酸のファージミドディスプレイ。（ａ）スルホチロシンの構造。（ｂ）パラアセチルフェニルアラニンの構造。（ｃ）ビピリジルアラニンの構造。（ｄ）４−ボロノフェニルアラニンの構造。（ｅ）最適化条件（方法の項参照）下のファージ収率であり、＋ＵＡＡは最適化濃度（方法の項参照）で培地に添加した対応する非天然アミノ酸（ＵＡＡ）の存在下で産生されたファージに対応し、−ＵＡＡは対応する非天然アミノ酸の不在下で産生されたファージに対応する。３回ずつ力価を測定し、誤差棒は＋標準偏差に対応する。（ｆ）非天然アミノ酸の存在下でｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＧを使用して産生された全長ファージからのｐＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合体の検出。サンプル１個当たりファージ粒子〜１０８個（沈降したファージ培養液〜２００μＬに対応し、〜１０μＬまで濃縮）を変性ＰＡＧＥゲル上に還元条件下で泳動させた後、抗ｐＩＩＩ抗体によるウェスタンブロットのために膜に転写した。同様に産生させ、非天然アミノ酸の不在下でｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＧから作製した同一容量のファージを泳動させ、ｐＩＩＩについてウェスタンブロットした処、バンドは検出されなかった。ハイパーファージはｓｃＦｖが提示されないファージに対応する。対照は標準アミノ酸のみの存在下のｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＴＡＴに由来するｐＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合体を提示するファージに対応し、５１ｋＤバンドは６２ｋＤバンド（ｐＩＩＩ−ｓｃＦｖ融合体）の非特異的蛋白分解の結果である。
図８。ケト−Ｘ−大腸菌、ＳＹ−Ｘ−大腸菌、Ｂｐｙ−Ｘ−大腸菌、又はボロ−Ｘ−大腸菌（ｎ＝１００）でｐＳＥＸ−ＧｅｒｍＮＮＫライブラリーからファージ発現後にＴＡＧコドンを含むファージクローンの百分率。予想値は１７．３％であり、偏差は２０種類の標準アミノ酸のみを含有する配列に有利なバイアスに相当する。最適化条件下でファージを産生させた。
図９。初期ファージライブラリーと３回目のライブラリーからのファージ収率に比較した培養液１ｍＬ当たりの４１２ｄ−２ＳＹのファージ収率。ＳＹ−Ｘ−大腸菌を使用して全ファージを産生させた。４１２ｄ−２ＳＹでは、３個の別個のファージ調製物からの力価を平均し、誤差棒は＋標準偏差を表す。
図１０。スルホチロシンをチロシンで置換した４１２ｄ−Ｙと比較したドープ４１２ｄライブラリーから選択した４１２ｄ−２ＳＹとのｇｐ１２０結合のファージＥＬＩＳＡ。サンプル毎に０．３３μｇのｇｐ１２０をＭａｘｉｓｏｒｐプレートにコーティングし、２％脱脂乳でブロックし、夫々のファージと結合させた。抗Ｍ１３抗体でファージを検出した。特異的ｇｐ１２０結合を立証するためにＢＳＡ結合を対照として使用した。モックとはファージを添加せずに発生されたシグナルを意味する。
図１１。（ａ）各回後のファージ溶出量により判断したｇｐ１２０結合の増加。各クローンのコピーが少数しか存在しない場合に潜在的ヒットの無原則な減少を最小限にするために、１回目の選択は後続回よりも著しく低いストリンジェンシーで実施した（方法の項参照）。（ｂ）シーケンシングにより判定した各回後のスルホチロシン含有クローンの百分率の増加（ｎ＝１５〜３０）。
図１２。初期ファージライブラリーと３回目のライブラリーからのファージ収率に比較した培養液１ｍＬ当たりの６６ＣＣ８−ＳＹのファージ収率。全ファージをＳＹ−Ｘ−大腸菌で産生させた。全ファージをＳＹ−Ｘ−大腸菌で産生させた。６６ＣＣ８−ＳＹでは、３個の別個のファージ調製物からの力価を平均し、誤差棒は＋標準偏差を表す。６６ＣＣ８−ＳＹでは、非天然アミノ酸を培地に添加しない場合には、ファージ収率は〜５×１０６であった。
図１３。６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ及び６６ＣＣ１４とのｇｐ１２０結合のファージＥＬＩＳＡ。サンプル毎に０．３μｇのｇｐ１２０をマイクロタイタープレートウェルにコーティングし、２％脱脂乳でブロックし、夫々のファージと結合させた。抗Ｍ１３抗体でファージを検出した。特異的ｇｐ１２０結合を立証するためにＢＳＡ結合を対照として使用した。（ａ）２種類のファージ濃度で実施した代表的なｇｐ１２０結合実験のＥＬＩＳＡ。（ｂ）２個の別個のファージ調製物で実施した４回の別個の実験に相当する平均ＥＬＩＳＡシグナル。各実験は全サンプルで同一量のファージを利用した。同一実験内の４１２ｄ−２ＳＹの結合に正規化したシグナルから平均を計算した。誤差棒は＋標準偏差を表す。なお、個々のＥＬＩＳＡ実験は異なるファージ濃度を使用し、異なるインキュベーション、洗浄、発色及び検出時間に相当するので、この統合グラフは変動を誇張している。
図１４ａは抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰ抗体を使用し、金属増感型ＤＡＢキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させたプロテインＧ精製Ｆａｂのウェスタンブロット分析を示す。サンプルを変性ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）上に泳動させた。６６ＣＣ８−ＳＹ及び４１２ｄ−ＳＹでは、硫酸化抗体発現がスルホチロシンの存在に依存することを立証するために、スルホチロシンの不在下の発現に対応するレーンも示す。図１４ｂ〜ｆは夫々Ｆａｂ６６ＣＣ１４、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８−Ｙ、４１２ｄ−ＳＹ及び４１２ｄ−ＹのＬＣＭＳ（ＥＳＩ陽性）スペクトルを示す。図１４ｇは精製Ｆａｂ４１２ｄ−２ＳＹ、４１２ｄ−Ｙ、６６ＣＣ８−ＳＹ、６６ＣＣ８及び６６ＣＣ１４とｇｐ１２０の結合を測定したＥＬＩＳＡの結果を示す。
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用する全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で本明細書に援用し、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で本明細書に援用すると個々に記載しているものとみなす。
米国特許第７，０９４，５７１号 国際公開番号ＷＯ２００２／０８６０７５
Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９８５）"Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｈａｇｅ：ｎｏｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｄｉｓｐｌａｙ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ．"Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１３１５−７ Ｓｅｒｇｅｅｖａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）"Ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｄｒｕｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ．"Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８：１６２２−５４ Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９８３）"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｂｅｓ．"Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：１１９４−８ Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）"Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．"Ｎａｔｕｒｅ．３４０：２４５−２４６ Ａｒｍｏｕｒ，Ｃ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）"Ｆｒｏｍ ｄｒｕｇ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｔａｒｇｅｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．"Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：２０−２４ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）"Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．"Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２６１：２４７−２６２ Ｗｏｌｋｏｗｉｃｚ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）"Ａ ｒａｎｄｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ＣＣＲ５ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｍｅｏｔｏｐｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｖｉａ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．"Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：１５１９５−１５２０１ Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，Ｖ．Ａ．（１９９７）"Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ．"Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：３９１−４１０ Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．（２００１）"Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｍ１３ ｆｏｒ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ．"Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１８：５７−６３ Ｒｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｍａｌａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９）"Ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｆｉｎｄｉｎｇ ａ ｎｅｅｄｌｅ ｉｎ ａ ｖａｓｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈａｙｓｔａｃｋ．"Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：８７−９３ Ｗｉｌｌａｔｓ，Ｗ．Ｇ．Ｔ．（２００２）"Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ｐｒａｃｔｉｃａｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．"Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５０：８３７−８５４

Claims (73)

  1. １種以上の該当機能についてポリペプチド変異体のライブラリーをスクリーニングする方法であって、
    発現される変異体の平均比が１０：１以下となるように、ポリペプチド変異体の少なくとも１個に少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有するライブラリーの複数のポリペプチド変異体の発現を正規化する段階と；
    観測される該当機能の差異が変異体の活性の差異と相関するように、複数の変異体から該当機能を示す変異体を選択する段階を含む前記方法。
  2. 複数のポリペプチド変異体が各々少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有する請求項１に記載の方法。
  3. 発現される変異体の比が５：１以下である請求項１に記載の方法。
  4. 発現される変異体の比が１：１である請求項１に記載の方法。
  5. 変異体の発現を正規化すると、選択の感度が改善される請求項１に記載の方法。
  6. 該当機能を示す変異体を選択する段階が、発現される変異体の比が１：１０以下であるときに検出可能な該当機能の差異を選択する段階を含む請求項１に記載の方法。
  7. 該当機能を示す変異体を選択する段階が、発現される変異体の比が１：５以下であるときに検出可能な該当機能の差異を選択する段階を含む請求項１に記載の方法。
  8. ポリペプチド変異体のライブラリーをスクリーニングする段階が、抗体フラグメント変異体、α１アンチトリプシン変異体、アンジオスタチン変異体、抗血友病因子変異体、アポリポ蛋白質変異体、アポ蛋白質変異体、心房性ナトリウム利尿因子変異体、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド変異体、心房性ペプチド変異体、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン変異体、Ｔ３９７６５変異体、ＮＡＰ−２変異体、ＥＮＡ−７８変異体、Ｇｒｏ−ａ変異体、Ｇｒｏ−ｂ変異体、Ｇｒｏ−ｃ変異体、ＩＰ−１０変異体、ＧＣＰ−２変異体、ＮＡＰ−４変異体、ＳＤＦ−１変異体、ＰＦ４変異体、ＭＩＧ変異体、カルシトニン変異体、ｃキットリガンド変異体、サイトカイン変異体、ＣＣケモカイン変異体、単球化学誘引蛋白質−１変異体、単球化学誘引蛋白質−２変異体、単球化学誘引蛋白質−３変異体、単球炎症性蛋白質−１α変異体、単球炎症性蛋白質−１β変異体、ＲＡＮＴＥＳ変異体、Ｉ３０９変異体、Ｒ８３９１５変異体、Ｒ９１７３３変異体、ＨＣＣ１変異体、Ｔ５８８４７変異体、Ｄ３１０６５変異体、Ｔ６４２６２変異体、ＣＤ４０変異体、ＣＤ４０リガンド変異体、Ｃキットリガンド変異体、コラーゲン変異体、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）変異体、補体因子５ａ変異体、補体阻害剤変異体、補体受容体１変異体、サイトカイン変異体、上皮好中球活性化ペプチド−７８変異体、ＧＲＯα変異体、ＭＧＳＡ変異体、ＧＲＯβ変異体、ＧＲＯγ変異体、ＭＩＰ１−α変異体、ＭＩＰ１−β変異体、ＭＣＰ−１変異体、表皮増殖因子（ＥＧＦ）変異体、上皮好中球活性化ペプチド変異体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）変異体、表皮剥離毒素変異体、ＩＸ因子変異体、ＶＩＩ因子変異体、ＶＩＩＩ因子変異体、Ｘ因子変異体、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）変異体、フィブリノーゲン変異体、フィブロネクチン変異体、Ｇ−ＣＳＦ変異体、ＧＭ−ＣＳＦ変異体、グルコセレブロシダーゼ変異体、ゴナドトロピン変異体、増殖因子変異体、増殖因子受容体変異体、ヘッジホッグ蛋白質変異体、ヘモグロビン変異体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）変異体、ヒルジン変異体、ヒト血清アルブミン変異体、ＩＣＡＭ−１変異体、ＩＣＡＭ−１受容体変異体、ＬＦＡ−１変異体、ＬＦＡ−１受容体変異体、インスリン変異体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）変異体、ＩＧＦ−Ｉ変異体、ＩＧＦ−ＩＩ変異体、インターフェロン変異体、ＩＦＮ−α変異体、ＩＦＮ−β変異体、ＩＦＮ−γ変異体、インターロイキン変異体、ＩＬ−１変異体、ＩＬ−２変異体、ＩＬ−３変異体、ＩＬ−４変異体、ＩＬ−５変異体、ＩＬ−６変異体、ＩＬ−７変異体、ＩＬ−８変異体、ＩＬ−９変異体、ＩＬ−１０変異体、ＩＬ−１１変異体、ＩＬ−１２変異体、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）変異体、ラクトフェリン変異体、白血病阻害因子変異体、ルシフェラーゼ変異体、ニュールチュリン変異体、好中球阻害因子（ＮＩＦ）変異体、オンコスタチンＭ変異体、骨形成蛋白質変異体、腫瘍遺伝子産物変異体、副甲状腺ホルモン変異体、ＰＤ−ＥＣＳＦ変異体、ＰＤＧＦ変異体、ペプチドホルモン変異体、ヒト成長ホルモン変異体、プレイオトロピン変異体、プロテインＡ変異体、プロテインＧ変異体、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣの変異体、リラキシン変異体、レニン変異体、ＳＣＦ／ｃキット変異体、可溶性補体受容体Ｉ変異体、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１変異体、可溶性インターロイキン受容体変異体、可溶性ＴＮＦ受容体変異体、ソマトメジン変異体、ソマトスタチン変異体、ソマトトロピン変異体、ストレプトキナーゼ変異体、スーパー抗原変異体、ブドウ球菌エンテロトキシン変異体、ＳＥＡ変異体、ＳＥＢ変異体、ＳＥＣ１変異体、ＳＥＣ２変異体、ＳＥＣ３変異体、ＳＥＤ変異体、ＳＥＥ変異体、ステロイドホルモン受容体変異体、スーパーオキシドジスムターゼ変異体、毒素性ショック症候群毒素変異体、チモシンα１変異体、組織プラスミノーゲンアクチベーター変異体、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）変異体、ＴＧＦ−α変異体、ＴＧＦ−β変異体、腫瘍壊死因子変異体、腫瘍壊死因子α変異体、腫瘍壊死因子β変異体、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）変異体、ＶＬＡ−４蛋白質変異体、ＶＣＡＭ−１蛋白質変異体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）変異体、ウロキナーゼ変異体、Ｍｏｓ変異体、Ｒａｓ変異体、Ｒａｆ変異体、Ｍｅｔ変異体、ｐ５３変異体、Ｔａｔ変異体、Ｆｏｓ変異体、Ｍｙｃ変異体、Ｊｕｎ変異体、Ｍｙｂ変異体、Ｒｅｌ変異体、エストロゲン受容体変異体、プロゲステロン受容体変異体、テストステロン受容体変異体、アルドステロン受容体変異体、ＬＤＬ受容体変異体、炎症性分子の変異体、シグナル伝達分子の変異体、転写アクチベーターの変異体、転写サプレッサーの変異体、ヒアルリン変異体、ＣＤ４４変異体、及びコルチコステロン変異体のライブラリーをスクリーニングする段階を含む請求項１に記載の方法。
  9. 複数の発現されるポリペプチド変異体を含む組換えポリペプチド発現ライブラリーであって、変異体の少なくとも１個が少なくとも１個の非天然アミノ酸残基を含み、複数の変異体の各々が１０：１以下のモル比でライブラリーに存在する前記組換えポリペプチド発現ライブラリー。
  10. 変異体の少なくとも２個が少なくとも１個の非天然アミノ酸残基を含む請求項９に記載の組換えポリペプチド発現ライブラリー。
  11. 変異体の少なくとも３個が少なくとも１個の非天然アミノ酸残基を含む請求項１に記載の組換えポリペプチド発現ライブラリー。
  12. 変異体の４個以上が少なくとも１個の非天然アミノ酸残基を含む請求項１に記載の組換えポリペプチド発現ライブラリー。
  13. 変異体の少なくとも１個が少なくとも２個の異なる非天然アミノ酸残基を含む請求項１に記載の組換えポリペプチド発現ライブラリー。
  14. 変異体の少なくとも１個が３個以上の異なる非天然アミノ酸残基を含む請求項１に記載の組換えポリペプチド発現ライブラリー。
  15. 複数の変異体の各々が５：１以下のモル比でライブラリーに存在する請求項９に記載の組換えポリペプチド発現ライブラリー。
  16. 複数の変異体の各々が１：１のモル比でライブラリーに存在する請求項９に記載の組換えポリペプチド発現ライブラリー。
  17. 発現されるポリペプチド変異体が抗体フラグメント変異体、α１アンチトリプシン変異体、アンジオスタチン変異体、抗血友病因子変異体、アポリポ蛋白質変異体、アポ蛋白質変異体、心房性ナトリウム利尿因子変異体、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド変異体、心房性ペプチド変異体、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン変異体、Ｔ３９７６５変異体、ＮＡＰ−２変異体、ＥＮＡ−７８変異体、Ｇｒｏ−ａ変異体、Ｇｒｏ−ｂ変異体、Ｇｒｏ−ｃ変異体、ＩＰ−１０変異体、ＧＣＰ−２変異体、ＮＡＰ−４変異体、ＳＤＦ−１変異体、ＰＦ４変異体、ＭＩＧ変異体、カルシトニン変異体、ｃキットリガンド変異体、サイトカイン変異体、ＣＣケモカイン変異体、単球化学誘引蛋白質−１変異体、単球化学誘引蛋白質−２変異体、単球化学誘引蛋白質−３変異体、単球炎症性蛋白質−１α変異体、単球炎症性蛋白質−１β変異体、ＲＡＮＴＥＳ変異体、Ｉ３０９変異体、Ｒ８３９１５変異体、Ｒ９１７３３変異体、ＨＣＣ１変異体、Ｔ５８８４７変異体、Ｄ３１０６５変異体、Ｔ６４２６２変異体、ＣＤ４０変異体、ＣＤ４０リガンド変異体、Ｃキットリガンド変異体、コラーゲン変異体、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）変異体、補体因子５ａ変異体、補体阻害剤変異体、補体受容体１変異体、サイトカイン変異体、上皮好中球活性化ペプチド−７８変異体、ＧＲＯα変異体、ＭＧＳＡ変異体、ＧＲＯβ変異体、ＧＲＯγ変異体、ＭＩＰ１−α変異体、ＭＩＰ１−β変異体、ＭＣＰ−１変異体、表皮増殖因子（ＥＧＦ）変異体、上皮好中球活性化ペプチド変異体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）変異体、表皮剥離毒素変異体、ＩＸ因子変異体、ＶＩＩ因子変異体、ＶＩＩＩ因子変異体、Ｘ因子変異体、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）変異体、フィブリノーゲン変異体、フィブロネクチン変異体、Ｇ−ＣＳＦ変異体、ＧＭ−ＣＳＦ変異体、グルコセレブロシダーゼ変異体、ゴナドトロピン変異体、増殖因子変異体、増殖因子受容体変異体、ヘッジホッグ蛋白質変異体、ヘモグロビン変異体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）変異体、ヒルジン変異体、ヒト血清アルブミン変異体、ＩＣＡＭ−１変異体、ＩＣＡＭ−１受容体変異体、ＬＦＡ−１変異体、ＬＦＡ−１受容体変異体、インスリン変異体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）変異体、ＩＧＦ−Ｉ変異体、ＩＧＦ−ＩＩ変異体、インターフェロン変異体、ＩＦＮ−α変異体、ＩＦＮ−β変異体、ＩＦＮ−γ変異体、インターロイキン変異体、ＩＬ−１変異体、ＩＬ−２変異体、ＩＬ−３変異体、ＩＬ−４変異体、ＩＬ−５変異体、ＩＬ−６変異体、ＩＬ−７変異体、ＩＬ−８変異体、ＩＬ−９変異体、ＩＬ−１０変異体、ＩＬ−１１変異体、ＩＬ−１２変異体、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）変異体、ラクトフェリン変異体、白血病阻害因子変異体、ルシフェラーゼ変異体、ニュールチュリン変異体、好中球阻害因子（ＮＩＦ）変異体、オンコスタチンＭ変異体、骨形成蛋白質変異体、腫瘍遺伝子産物変異体、副甲状腺ホルモン変異体、ＰＤ−ＥＣＳＦ変異体、ＰＤＧＦ変異体、ペプチドホルモン変異体、ヒト成長ホルモン変異体、プレイオトロピン変異体、プロテインＡ変異体、プロテインＧ変異体、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣの変異体、リラキシン変異体、レニン変異体、ＳＣＦ／ｃキット変異体、可溶性補体受容体Ｉ変異体、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１変異体、可溶性インターロイキン受容体変異体、可溶性ＴＮＦ受容体変異体、ソマトメジン変異体、ソマトスタチン変異体、ソマトトロピン変異体、ストレプトキナーゼ変異体、スーパー抗原変異体、ブドウ球菌エンテロトキシン変異体、ＳＥＡ変異体、ＳＥＢ変異体、ＳＥＣ１変異体、ＳＥＣ２変異体、ＳＥＣ３変異体、ＳＥＤ変異体、ＳＥＥ変異体、ステロイドホルモン受容体変異体、スーパーオキシドジスムターゼ変異体、毒素性ショック症候群毒素変異体、チモシンα１変異体、組織プラスミノーゲンアクチベーター変異体、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）変異体、ＴＧＦ−α変異体、ＴＧＦ−β変異体、腫瘍壊死因子変異体、腫瘍壊死因子α変異体、腫瘍壊死因子β変異体、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）変異体、ＶＬＡ−４蛋白質変異体、ＶＣＡＭ−１蛋白質変異体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）変異体、ウロキナーゼ変異体、Ｍｏｓ変異体、Ｒａｓ変異体、Ｒａｆ変異体、Ｍｅｔ変異体、ｐ５３変異体、Ｔａｔ変異体、Ｆｏｓ変異体、Ｍｙｃ変異体、Ｊｕｎ変異体、Ｍｙｂ変異体、Ｒｅｌ変異体、エストロゲン受容体変異体、プロゲステロン受容体変異体、テストステロン受容体変異体、アルドステロン受容体変異体、ＬＤＬ受容体変異体、炎症性分子の変異体、シグナル伝達分子の変異体、転写アクチベーターの変異体、転写サプレッサーの変異体、ヒアルリン変異体、ＣＤ４４変異体、及びコルチコステロン変異体を含む請求項９に記載の組換えポリペプチド発現ライブラリー。
  18. ポリペプチド変異体の少なくとも１個の非天然アミノ酸がＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸（例えば糖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；酸化還元活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；スルホチロシン、４−ボロノフェニルアラニン、又はプロリン以外の環状アミノ酸を含む請求項９に記載の組換えポリペプチド発現ライブラリー。
  19. 組換えポリペプチド発現ライブラリーが複数のＭ１３由来ファージを含み、各ファージが組換えポリペプチド変異体をその外面に提示する請求項９に記載の組換えポリペプチド発現ライブラリー。
  20. 発現されるポリペプチド変異体が抗体フラグメント変異体を含む請求項１９に記載のファージディスプレイライブラリー。
  21. 組換えポリペプチド発現ライブラリーが複数のＭ１３由来ファージを含み、各ファージが２個以上の組換えポリペプチド変異体をその外面に提示し、２個以上の組換えポリペプチド変異体が同一である請求項９に記載の組換えポリペプチド発現ライブラリー。
  22. 複数の組換え核酸発現構築物を含む核酸発現ライブラリーであって、構築物のポリペプチド産物が１０：１以下の比でライブラリーに存在するように前記発現構築物が発現され、少なくとも１個の非天然アミノ酸残基がポリペプチド産物の少なくとも１個に組込まれるように発現構築物の少なくとも１個のコーディング領域が少なくとも１個のセレクターコドンを含む前記核酸発現ライブラリー。
  23. 構築物のポリペプチド産物が５：１以下の比でライブラリーに存在するように発現構築物が発現される請求項２２に記載の核酸発現ライブラリー。
  24. 構築物のポリペプチド産物が１：１の比でライブラリーに存在するように発現構築物が発現される請求項２２に記載の核酸発現ライブラリー。
  25. 構築物により発現されるポリペプチド産物が抗体フラグメント変異体、α１アンチトリプシン変異体、アンジオスタチン変異体、抗血友病因子変異体、アポリポ蛋白質変異体、アポ蛋白質変異体、心房性ナトリウム利尿因子変異体、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド変異体、心房性ペプチド変異体、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン変異体、Ｔ３９７６５変異体、ＮＡＰ−２変異体、ＥＮＡ−７８変異体、Ｇｒｏ−ａ変異体、Ｇｒｏ−ｂ変異体、Ｇｒｏ−ｃ変異体、ＩＰ−１０変異体、ＧＣＰ−２変異体、ＮＡＰ−４変異体、ＳＤＦ−１変異体、ＰＦ４変異体、ＭＩＧ変異体、カルシトニン変異体、ｃキットリガンド変異体、サイトカイン変異体、ＣＣケモカイン変異体、単球化学誘引蛋白質−１変異体、単球化学誘引蛋白質−２変異体、単球化学誘引蛋白質−３変異体、単球炎症性蛋白質−１α変異体、単球炎症性蛋白質−１β変異体、ＲＡＮＴＥＳ変異体、Ｉ３０９変異体、Ｒ８３９１５変異体、Ｒ９１７３３変異体、ＨＣＣ１変異体、Ｔ５８８４７変異体、Ｄ３１０６５変異体、Ｔ６４２６２変異体、ＣＤ４０変異体、ＣＤ４０リガンド変異体、Ｃキットリガンド変異体、コラーゲン変異体、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）変異体、補体因子５ａ変異体、補体阻害剤変異体、補体受容体１変異体、サイトカイン変異体、上皮好中球活性化ペプチド−７８変異体、ＧＲＯα変異体、ＭＧＳＡ変異体、ＧＲＯβ変異体、ＧＲＯγ変異体、ＭＩＰ１−α変異体、ＭＩＰ１−β変異体、ＭＣＰ−１変異体、表皮増殖因子（ＥＧＦ）変異体、上皮好中球活性化ペプチド変異体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）変異体、表皮剥離毒素変異体、ＩＸ因子変異体、ＶＩＩ因子変異体、ＶＩＩＩ因子変異体、Ｘ因子変異体、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）変異体、フィブリノーゲン変異体、フィブロネクチン変異体、Ｇ−ＣＳＦ変異体、ＧＭ−ＣＳＦ変異体、グルコセレブロシダーゼ変異体、ゴナドトロピン変異体、増殖因子変異体、増殖因子受容体変異体、ヘッジホッグ蛋白質変異体、ヘモグロビン変異体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）変異体、ヒルジン変異体、ヒト血清アルブミン変異体、ＩＣＡＭ−１変異体、ＩＣＡＭ−１受容体変異体、ＬＦＡ−１変異体、ＬＦＡ−１受容体変異体、インスリン変異体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）変異体、ＩＧＦ−Ｉ変異体、ＩＧＦ−ＩＩ変異体、インターフェロン変異体、ＩＦＮ−α変異体、ＩＦＮ−β変異体、ＩＦＮ−γ変異体、インターロイキン変異体、ＩＬ−１変異体、ＩＬ−２変異体、ＩＬ−３変異体、ＩＬ−４変異体、ＩＬ−５変異体、ＩＬ−６変異体、ＩＬ−７変異体、ＩＬ−８変異体、ＩＬ−９変異体、ＩＬ−１０変異体、ＩＬ−１１変異体、ＩＬ−１２変異体、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）変異体、ラクトフェリン変異体、白血病阻害因子変異体、ルシフェラーゼ変異体、ニュールチュリン変異体、好中球阻害因子（ＮＩＦ）変異体、オンコスタチンＭ変異体、骨形成蛋白質変異体、腫瘍遺伝子産物変異体、副甲状腺ホルモン変異体、ＰＤ−ＥＣＳＦ変異体、ＰＤＧＦ変異体、ペプチドホルモン変異体、ヒト成長ホルモン変異体、プレイオトロピン変異体、プロテインＡ変異体、プロテインＧ変異体、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣの変異体、リラキシン変異体、レニン変異体、ＳＣＦ／ｃキット変異体、可溶性補体受容体Ｉ変異体、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１変異体、可溶性インターロイキン受容体変異体、可溶性ＴＮＦ受容体変異体、ソマトメジン変異体、ソマトスタチン変異体、ソマトトロピン変異体、ストレプトキナーゼ変異体、スーパー抗原変異体、ブドウ球菌エンテロトキシン変異体、ＳＥＡ変異体、ＳＥＢ変異体、ＳＥＣ１変異体、ＳＥＣ２変異体、ＳＥＣ３変異体、ＳＥＤ変異体、ＳＥＥ変異体、ステロイドホルモン受容体変異体、スーパーオキシドジスムターゼ変異体、毒素性ショック症候群毒素変異体、チモシンα１変異体、組織プラスミノーゲンアクチベーター変異体、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）変異体、ＴＧＦ−α変異体、ＴＧＦ−β変異体、腫瘍壊死因子変異体、腫瘍壊死因子α変異体、腫瘍壊死因子β変異体、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）変異体、ＶＬＡ−４蛋白質変異体、ＶＣＡＭ−１蛋白質変異体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）変異体、ウロキナーゼ変異体、Ｍｏｓ変異体、Ｒａｓ変異体、Ｒａｆ変異体、Ｍｅｔ変異体、ｐ５３変異体、Ｔａｔ変異体、Ｆｏｓ変異体、Ｍｙｃ変異体、Ｊｕｎ変異体、Ｍｙｂ変異体、Ｒｅｌ変異体、エストロゲン受容体変異体、プロゲステロン受容体変異体、テストステロン受容体変異体、アルドステロン受容体変異体、ＬＤＬ受容体変異体、炎症性分子の変異体、シグナル伝達分子の変異体、転写アクチベーターの変異体、転写サプレッサーの変異体、ヒアルリン変異体、ＣＤ４４変異体、及びコルチコステロン変異体を含む請求項２２に記載の核酸発現ライブラリー。
  26. 発現構築物の少なくとも１個のコーディング領域のセレクターコドンが終止コドン、４塩基コドン、レアコドン又は非コーディングコドンを含む請求項２２に記載の核酸発現ライブラリー。
  27. 組換え核酸発現構築物により発現されるポリペプチド産物の少なくとも１個に組込まれる少なくとも１個のアミノ酸残基がＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸（例えば糖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；酸化還元活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；スルホチロシン、４−ボロノフェニルアラニン、又はプロリン以外の環状アミノ酸を含む請求項２２に記載の核酸発現ライブラリー。
  28. 複数のポリペプチド変異体を含む発現産物のライブラリーであって、複数の変異体の各々が少なくとも１個の非天然アミノ酸を含み、変異体が１０：１以下の比で存在する。
  29. ポリペプチド変異体が５：１以下の比で存在する請求項２８に記載のライブラリー。
  30. ポリペプチド変異体が１：１の比で存在する請求項２８に記載のライブラリー。
  31. ポリペプチド変異体が抗体フラグメント変異体、α１アンチトリプシン変異体、アンジオスタチン変異体、抗血友病因子変異体、アポリポ蛋白質変異体、アポ蛋白質変異体、心房性ナトリウム利尿因子変異体、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド変異体、心房性ペプチド変異体、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン変異体、Ｔ３９７６５変異体、ＮＡＰ−２変異体、ＥＮＡ−７８変異体、Ｇｒｏ−ａ変異体、Ｇｒｏ−ｂ変異体、Ｇｒｏ−ｃ変異体、ＩＰ−１０変異体、ＧＣＰ−２変異体、ＮＡＰ−４変異体、ＳＤＦ−１変異体、ＰＦ４変異体、ＭＩＧ変異体、カルシトニン変異体、ｃキットリガンド変異体、サイトカイン変異体、ＣＣケモカイン変異体、単球化学誘引蛋白質−１変異体、単球化学誘引蛋白質−２変異体、単球化学誘引蛋白質−３変異体、単球炎症性蛋白質−１α変異体、単球炎症性蛋白質−１β変異体、ＲＡＮＴＥＳ変異体、Ｉ３０９変異体、Ｒ８３９１５変異体、Ｒ９１７３３変異体、ＨＣＣ１変異体、Ｔ５８８４７変異体、Ｄ３１０６５変異体、Ｔ６４２６２変異体、ＣＤ４０変異体、ＣＤ４０リガンド変異体、Ｃキットリガンド変異体、コラーゲン変異体、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）変異体、補体因子５ａ変異体、補体阻害剤変異体、補体受容体１変異体、サイトカイン変異体、上皮好中球活性化ペプチド−７８変異体、ＧＲＯα変異体、ＭＧＳＡ変異体、ＧＲＯβ変異体、ＧＲＯγ変異体、ＭＩＰ１−α変異体、ＭＩＰ１−β変異体、ＭＣＰ−１変異体、表皮増殖因子（ＥＧＦ）変異体、上皮好中球活性化ペプチド変異体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）変異体、表皮剥離毒素変異体、ＩＸ因子変異体、ＶＩＩ因子変異体、ＶＩＩＩ因子変異体、Ｘ因子変異体、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）変異体、フィブリノーゲン変異体、フィブロネクチン変異体、Ｇ−ＣＳＦ変異体、ＧＭ−ＣＳＦ変異体、グルコセレブロシダーゼ変異体、ゴナドトロピン変異体、増殖因子変異体、増殖因子受容体変異体、ヘッジホッグ蛋白質変異体、ヘモグロビン変異体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）変異体、ヒルジン変異体、ヒト血清アルブミン変異体、ＩＣＡＭ−１変異体、ＩＣＡＭ−１受容体変異体、ＬＦＡ−１変異体、ＬＦＡ−１受容体変異体、インスリン変異体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）変異体、ＩＧＦ−Ｉ変異体、ＩＧＦ−ＩＩ変異体、インターフェロン変異体、ＩＦＮ−α変異体、ＩＦＮ−β変異体、ＩＦＮ−γ変異体、インターロイキン変異体、ＩＬ−１変異体、ＩＬ−２変異体、ＩＬ−３変異体、ＩＬ−４変異体、ＩＬ−５変異体、ＩＬ−６変異体、ＩＬ−７変異体、ＩＬ−８変異体、ＩＬ−９変異体、ＩＬ−１０変異体、ＩＬ−１１変異体、ＩＬ−１２変異体、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）変異体、ラクトフェリン変異体、白血病阻害因子変異体、ルシフェラーゼ変異体、ニュールチュリン変異体、好中球阻害因子（ＮＩＦ）変異体、オンコスタチンＭ変異体、骨形成蛋白質変異体、腫瘍遺伝子産物変異体、副甲状腺ホルモン変異体、ＰＤ−ＥＣＳＦ変異体、ＰＤＧＦ変異体、ペプチドホルモン変異体、ヒト成長ホルモン変異体、プレイオトロピン変異体、プロテインＡ変異体、プロテインＧ変異体、発熱外毒素Ａ、Ｂ又はＣの変異体、リラキシン変異体、レニン変異体、ＳＣＦ／ｃキット変異体、可溶性補体受容体Ｉ変異体、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１変異体、可溶性インターロイキン受容体変異体、可溶性ＴＮＦ受容体変異体、ソマトメジン変異体、ソマトスタチン変異体、ソマトトロピン変異体、ストレプトキナーゼ変異体、スーパー抗原変異体、ブドウ球菌エンテロトキシン変異体、ＳＥＡ変異体、ＳＥＢ変異体、ＳＥＣ１変異体、ＳＥＣ２変異体、ＳＥＣ３変異体、ＳＥＤ変異体、ＳＥＥ変異体、ステロイドホルモン受容体変異体、スーパーオキシドジスムターゼ変異体、毒素性ショック症候群毒素変異体、チモシンα１変異体、組織プラスミノーゲンアクチベーター変異体、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）変異体、ＴＧＦ−α変異体、ＴＧＦ−β変異体、腫瘍壊死因子変異体、腫瘍壊死因子α変異体、腫瘍壊死因子β変異体、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）変異体、ＶＬＡ−４蛋白質変異体、ＶＣＡＭ−１蛋白質変異体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）変異体、ウロキナーゼ変異体、Ｍｏｓ変異体、Ｒａｓ変異体、Ｒａｆ変異体、Ｍｅｔ変異体、ｐ５３変異体、Ｔａｔ変異体、Ｆｏｓ変異体、Ｍｙｃ変異体、Ｊｕｎ変異体、Ｍｙｂ変異体、Ｒｅｌ変異体、エストロゲン受容体変異体、プロゲステロン受容体変異体、テストステロン受容体変異体、アルドステロン受容体変異体、ＬＤＬ受容体変異体、炎症性分子の変異体、シグナル伝達分子の変異体、転写アクチベーターの変異体、転写サプレッサーの変異体、ヒアルリン変異体、ＣＤ４４変異体、及びコルチコステロン変異体を含む請求項２８に記載のライブラリー。
  32. 非天然アミノ酸がＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸（例えば糖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；酸化還元活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；スルホチロシン、４−ボロノフェニルアラニン、又はプロリン以外の環状アミノ酸を含む請求項２８に記載のポリペプチド変異体。
  33. パッケージング部位を含むか又はコードし、ベクター核酸のサブ配列によりコードされ、少なくとも１個の第１のセレクターコドンを含む標的ポリペプチドをコードするベクター核酸と；
    ベクター核酸又はそのコピーもしくは転写産物でシステムにパッケージングされ、第１のセレクターコドンと同一の少なくとも１個の第２のセレクターコドンを含むパッケージング又は特異性ポリペプチドをコードする相補核酸と；
    非天然アミノ酸を負荷され、セレクターコドンを認識することにより、ベクターパッケージングシステムによるパッケージング又は特異性ポリペプチドと標的ポリペプチドの翻訳を可能にする直交ｔＲＮＡ
    を含むベクターパッケージングシステム。
  34. ベクター核酸のサブ配列によりコードされる標的ポリペプチドが融合蛋白質である請求項３３に記載のベクターパッケージングシステム。
  35. 融合蛋白質がリボソーム合成抗体フラグメント又はその誘導体を含む請求項３３に記載のベクターパッケージングシステム。
  36. 抗体フラグメントが相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む請求項３５に記載のベクターパッケージングシステム。
  37. ベクター核酸又は相補核酸によりコードされるセレクターコドンが終止コドン、４塩基コドン、レアコドン又は非コーディングコドンである請求項３３に記載のベクターパッケージングシステム。
  38. 相補核酸によりコードされるパッケージング又は特異性ポリペプチドがウイルスキャプシド又はエンベロープ蛋白質を含む請求項３３に記載のベクターパッケージングシステム。
  39. キャプシド蛋白質がｐＩＩＩである請求項３８に記載のベクターパッケージングシステム。
  40. システムがインビトロ翻訳系を含む請求項３３に記載のベクターパッケージングシステム。
  41. システムが細胞を含む請求項３３に記載のベクターパッケージングシステム。
  42. 細胞が哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞又は大腸菌細胞を含む請求項４１に記載のベクターパッケージングシステム。
  43. システムが直交ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を負荷することが可能な直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む請求項３３に記載のベクターパッケージングシステム。
  44. システムが非天然アミノ酸を含む請求項４３に記載のベクターパッケージングシステム。
  45. 非天然アミノ酸がビピリジルアラニン残基を含む請求項４４に記載のベクターパッケージングシステム。
  46. Ｍ１３パッケージング配列を含み、少なくとも１個の第１のセレクターコドンを含む抗体フラグメントを含む融合蛋白質をコードするファージミドと；
    ベクターファージミドのコピーでパッケージングされ、少なくとも１個の第１のセレクターコドンと同一の少なくとも１個の第２のセレクターコドンを含む突然変異体ｐＩＩＩポリペプチドをコードするプラスミドと；
    非天然アミノ酸を負荷され、セレクターコドンを認識することにより、ベクターパッケージングシステムによるｐＩＩＩポリペプチドと抗体フラグメント融合蛋白質の翻訳を可能にする直交ｔＲＮＡ
    を含む大腸菌細胞。
  47. 標的ポリペプチドをコードするパッケージングされた核酸と；
    パッケージングされた核酸によりコードされる標的ポリペプチドと；
    ベクターに宿主細胞特異性を付与し、少なくとも１個の非天然アミノ酸残基を含む特異性ポリペプチド
    を含むベクター。
  48. パッケージされた核酸がパッケージング部位を含むか又はコードする請求項４７に記載のベクター。
  49. パッケージされた核酸によりコードされる標的ポリペプチドが融合蛋白質である請求項４７に記載のベクター。
  50. コードされる標的ポリペプチドが抗体フラグメントを含む融合蛋白質である請求項４７に記載のパッケージングされた核酸。
  51. 抗体ドメインが相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む請求項５０に記載のパッケージングされた核酸。
  52. 特異性ポリペプチドがキャプシド蛋白質を含む請求項４７に記載の特異性ポリペプチド。
  53. キャプシド蛋白質がｐＩＩＩ蛋白質を含む請求項５２に記載の特異性ポリペプチド。
  54. 特異性ポリペプチドがエンベロープ蛋白質を含む請求項４７に記載の特異性ポリペプチド。
  55. ベクターがウイルスキャプシドを含む請求項４７に記載のベクター。
  56. ベクターが哺乳動物ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、昆虫ウイルス、バキュロウイルス又はバクテリオファージに由来する請求項５５に記載のベクター。
  57. バクテリオファージがＭ１３に由来する請求項５６に記載のベクター。
  58. 標的ポリペプチドがベクターの外面に提示される請求項４７に記載のベクター。
  59. 少なくとも１個のセレクターコドンを含む標的ポリペプチドをコードするパッケージングされた核酸と；
    パッケージングされた核酸によりコードされ、少なくとも１個の第１の非天然アミノ酸を含む標的ポリペプチドと；
    核酸をパッケージングするか又はベクターに宿主細胞特異性を付与し、少なくとも１個の第２の非天然アミノ酸を含むパッケージング又は特異性ポリペプチド
    を含むベクター。
  60. 少なくとも１個の第１の非天然アミノ酸と少なくとも１個の第２の非天然アミノ酸が同一である請求項５９に記載のベクター。
  61. 標的ポリペプチドがベクターの外面に提示される請求項５９に記載のベクター。
  62. 少なくとも１個のセレクターコドンを含む抗体フラグメントを含む融合蛋白質をコードするファージミドと；
    少なくとも１個の第１の非天然アミノ酸を含む抗体フラグメントを含み、組換えＭ１３ファージの外面に提示される融合蛋白質と；
    少なくとも１個の第１の非天然アミノ酸と同一の少なくとも１個の第２の非天然アミノ酸を含むｐＩＩＩポリペプチド
    を含む組換えＭ１３ファージ。
  63. 非天然アミノ酸がＯ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸（例えば糖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；酸化還元活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；スルホチロシン、４−ボロノフェニルアラニン、又はプロリン以外の環状アミノ酸を含む請求項５９に記載のベクター。
  64. ベクター核酸を発現させ、非天然アミノ酸残基を標的ポリペプチドに組込むように標的ポリペプチドを産生させる段階と；
    相補核酸を発現させ、非天然アミノ酸残基をパッケージング又は特異性ポリペプチドに組込むようにパッケージング又は特異性ポリペプチドを産生させる段階と；
    ベクター核酸又はそのコピーもしくは転写産物をパッケージング又は特異性ポリペプチドと標的ポリペプチドに結合させ、ベクター核酸をパッケージングする段階
    を含むベクター核酸のパッケージング方法。
  65. 発現させるベクター核酸がパッケージング部位を含むか又はコードし、前記ベクター核酸が更に標的ポリペプチドをコードし、標的ポリペプチドが少なくとも１個のセレクターコドンを含む請求項６４に記載の方法。
  66. 発現させる相補核酸がパッケージング又は特異性ポリペプチドをコードする相補核酸を含み、パッケージング又は特異性ポリペプチドが少なくとも１個のセレクターコドンを含む請求項６４に記載の方法。
  67. ベクター核酸又は相補核酸を細胞に形質転換、形質導入、共役、安定的トランスフェクション又は一過性にランスフェクションする段階を含む方法により、発現させるベクター核酸又は相補核酸を提供する請求項６４に記載の方法。
  68. ベクター核酸を発現させて標的ポリペプチドを産生させる段階又は相補核酸を発現させてパッケージング又は特異性ポリペプチドを産生させる段階が、標的ポリペプチド又はパッケージングもしくは特異性ポリペプチドをコードするＲＮＡの合成を誘導する段階を含む請求項６４に記載の方法。
  69. ベクター核酸又はそのコピーもしくは転写産物をパッケージング又は特異性ポリペプチドと標的ポリペプチドに結合させる段階が、ベクター核酸を導入した大腸菌株を培養する段階と、ベクター核酸を発現させて標的ポリペプチドを産生させる段階と、相補核酸を提供する段階と、相補核酸を発現させてパッケージング又は特異性ポリペプチドを産生させる段階を含む請求項６４に記載の方法。
  70. ベクター核酸をパッケージングする段階が、ベクター核酸を別のポリペプチドと結合させる段階を含み、前記別のポリペプチドがポリメラーゼ、ウイルスマトリックス蛋白質又はウイルスコア蛋白質の１種以上を含む請求項６４に記載の方法。
  71. 方法の各段階を細胞内で実施する請求項６４に記載の方法。
  72. 細胞が哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞又は大腸菌細胞を含む請求項７１に記載の方法。
  73. ベクタープラスミドを発現させ、少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有する抗体フラグメントを含む融合蛋白質を産生させる段階と；
    相補プラスミドを発現させ、少なくとも１個の第１の非天然アミノ酸と同一の少なくとも１個の第２の非天然アミノ酸を含有する突然変異体ｐＩＩＩ蛋白質を産生させる段階と；
    ベクタープラスミドのコピーを突然変異体ｐＩＩＩと融合蛋白質に結合させ、ベクタープラスミドをパッケージングする段階
    を含むベクタープラスミドのパッケージング方法。
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