KR20000068069A - 화학적으로 개질된 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

폴리펩타이드 분자 중의 하나 이상의 하이드록실 그룹을 폴리알킬렌 글리콜로 개질시킨 화학적으로 개질된 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드의 제조방법, 당해 폴리펩타이드를 사용하는 치료방법, 당해 폴리펩타이드의 용도, 당해 폴리펩타이드를 함유하는 약제 및 당해 폴리펩타이드를 함유하는 치료용 조성물.

Description

화학적으로 개질된 폴리펩타이드{Chemically modified polypeptides}
폴리펩타이드의 분자 중의 하나 이상의 아미노 그룹, 카복시 그룹, 머캅토 그룹 또는 구아니디노 그룹을 폴리알킬렌 글리콜로 개질시킨 화학적으로 개질된 폴리펩타이드(W0 제95/023165호) 및 폴리펩타이드의 분자 중의 시스테인 잔기의 유리 티올 그룹의 개질에 관해 공지되어 있지만(EP 제0 668 353호), 폴리펩타이드의 분자 중의 아미노 그룹, 카복시 그룹, 머캅토 그룹 또는 구아니디노 그룹을 폴리알킬렌 글리콜로 개질시키거나, 시스테인 잔기의 하나 이상의 유리 티올 그룹을 폴리알킬렌 글리콜로 개질시키는 경우에는 폴리펩타이드가 갖는 활성이 현저하게 또는 완전하게 소실되는 경우가 있다.
예를 들면, 인터루킨 15는 아미노 그룹이 폴리에틸렌 글리콜로 개질됨으로써 완전하게 활성이 소실된다[문헌 참조: J.Biol.Chem., 272, 2312(1997)].
폴리펩타이드 분자 중의 하나 이상의 하이드록실 그룹을 폴리알킬렌 글리콜로 개질시킨 화학적으로 개질된 폴리펩타이드는 공지되어 있지 않다.
(1) 폴리펩타이드의 활성 부위에 하이드록실 그룹이 관여하는 경우에 당해 하이드록실 그룹의 활성에 대한 영향을 분석하는 방법,
(2) 종래의 폴리펩타이드의 화학적 개질방법으로는 폴리펩타이드의 생물학적 활성이 현저하게 손상되는 경우에 있어서, 이를 피할 수 있는 신규한 화학적 개질방법, 및 당해 방법으로 수득되는 화학적으로 개질된 폴리펩타이드,
(3) 폴리펩타이드의 프로테아제, 동결 융해 및 변성제에 대한 내성을 향상시키는 신규한 방법이 요구되고 있다.
발명의 개시
본 발명은 폴리펩타이드 분자 중의 하나 이상의 하이드록실 그룹을 폴리알킬렌 글리콜로 개질시킨 화학적으로 개질된 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드의 제조방법, 당해 폴리펩타이드를 사용하여 환자에서 과립구 또는 혈소판을 감소시키기 위한 치료방법, 당해 폴리펩타이드의 용도, 당해 폴리펩타이드를 함유하는 약제 및 당해 폴리펩타이드를 함유하는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용할 수 있는 폴리펩타이드로서는 하이드록실 그룹을 가지며생리학적 활성 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩타이드라면 어떠한 것이든 가능하다. 예를 들면, 아스파라기나제(Asparaginase), 글루타미나제(Glutaminase), 우리카제(Uricase), 수퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase), 락토페린(Lactoferin), 스트렙토키나제(Streptokinase), 플라즈민(Plasmin), 아데노신 데아미나제(Adenosine deaminase), 인터루킨 1 내지 13(Interleukin-1 내지 13), 인터루킨 15(Interleukin-15), 인터페론-α(Interferon-α), 인터페론-β(Interferon-β), 인터페론-γ(Interferon-γ) 또는 사람 과립구 콜로니 자극 인자(이하, hG-CSF로서 약기함) 등의 활성을 갖는 폴리펩타이드 등을 들 수 있다.
hG-CSF 활성을 갖는 폴리펩타이드로서는 서열번호 1의 아미노산 서열, 당해 서열 중의 일부 아미노산 서열 또는 당해 서열의 일부 아미노산이 별도의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드[문헌 참조: Nature, 319, 415(1986), 일본 공개특허공보 제(소)63-267292호, 제(소)63-299호, WO 제87/01132호] 등을 들 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열 중의 일부 아미노산이 별도의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드(hG-CSF 유도체)의 구체적인 예가 표 1에 제시되어 있다.
N말단 아미노산의 위치(서열번호 1에 기재된 hG-CSF) 각종 hG-CSF 유도체에 치환된 아미노산
a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l)
1번째 (Thr) 3번째 (Leu) 4번째 (Gly) 5번째 (Pro)17번째 (Cys) *GluLysSerSer ValIleArgSerSer CysIleArgSerSer ThrIleArgSerSer ArgThrArgSerSer *ThrArgSerSer AsnGluArgSerSer IleThrArgSerSer SerThrArgSerSer **Arg*Ser AlaThrTyrArgSer ****Ser
* 치환되지 않은 아미노산
폴리알킬렌 글리콜로서는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체 등을 들 수 있다.
본 발명의 화학적으로 개질된 폴리펩타이드는 상기 폴리알킬렌 글리콜로 이루어진 화학 개질제를 사용하여 제조할 수 있지만, 바람직한 화학 개질제로서 화학식 I의 화합물을 예로 들 수 있다.
R1-(M)n­X­R2
상기식에서,
R1은 알킬 그룹 또는 알카노일 그룹이고,
M은 -OCH2CH2-, -OCH2CH2CH2- 또는 -(OCH2CH2)r­(OCH2CH2CH2)s­(여기서, r 및 s는 동일하거나 상이하며 가변적인 양의 정수이다)이며,
n은 가변적인 양의 정수이고,
X는 결합, O, NH 또는 S이며,
R2는 화학식
{여기서, R3는 OH, 할로겐 또는 -Xa-(Ma)na-R1a(여기서, Xa, Ma, R1a및 na는 각각 상기한 X, M, R1및 n과 동일하다)이고, Y는 할로겐 또는 -Z­(CH2)p­(O)m-W[여기서, Z는 O, S 또는 NH이고, W는 카복시 그룹 또는 이의 반응성 유도체 또는(여기서, R4는 알킬 그룹이고, Hal은 할로겐이다)이며, p는 0 내지 6의 정수이고, m은 0 또는 l이다]이다},
-(CO)m-(CH2)t­W
(여기서, t는 0 내지 6의 정수이고, m 및 W는 상기한 바와 동일하다),
(여기서, Hala, pa 및 R4a는 각각 상기한 Hal, p 및 R4와 동일하다),
(여기서, R3및 W는 상기한 바와 동일하다),
(여기서, R3, t 및 W는 상기한 바와 동일하다),
(여기서, W는 상기한 바와 동일하다),
또는
(여기서, R5는 아미노산으로부터 아미노 그룹 및 카복실 그룹을 제외한 잔기이며, W는 상기한 바와 동일하다)이다.
화학식 I의 화합물에 있어서, R1, R4등의 알킬 그룹으로는 탄소수 1 내지 18의 직쇄 또는 측쇄, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 옥틸, 이소옥틸, 데실, 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 옥타데실 등이 있으며, R1의 알카노일 그룹으로는 탄소수 1 내지 18의 직쇄 또는 측쇄, 예를 들면, 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 발레릴, 피발로일, 펜타노일, 라울로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 등이 있고, R3, Y 또는 Hal 등의 할로겐으로는 염소, 브롬, 요오드의 각 원자를 들 수 있으며, W 등의 카복시 그룹의 반응성 유도체로는 산 클로라이드, 산 브로마이드 등의 할라이드, p-니트로페닐에스테르, N-옥시숙신산이미드 등의 활성 에스테르, 탄산모노에틸에스테르, 탄산모노이소부틸에스테르 등과의 혼합 산무수물 등이 있고, R5의 아미노산으로는 예를 들면, 글리신, L-알라닌, L-발린, L-류신, L-세린, D-알라닌, D-발린, D-류신, D-세린, β-알라닌 등이 있다. n, r 또는 s의 양의 정수는 1 내지 20,000이고, 특히 n의 경우에는 50 내지 5,000, r, s의 경우에는 1 내지 5,000이 바람직하다.
폴리알킬렌 글리콜의 분자량은 500 내지 l,000,000의 범위이고, 바람직하게는 3,000 내지 l, 000,000의 범위이다.
폴리펩타이드의 분자에 다수개의 하이드록실 그룹이 존재하는 경우가 있지만, 당해 폴리펩타이드를 화학적으로 개질시키는 경우에는 이들 그룹 중의 하나 이상의 그룹이 화학적으로 개질되도록 하는 것이 양호하다.
폴리펩타이드 분자 중의 하이드록실 그룹으로는 세린 또는 트레오닌 잔기로부터의 하이드록실 그룹을 들 수 있으며, 바람직하게는 세린 잔기로부터의 하이드록실 그룹을 들 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-폴리프로필렌 글리콜 공중합체 등의 폴리알킬렌 글리콜과 같은 화학 개질제를 하이드록실 그룹을 포함하는 폴리펩타이드와 반응시킴으로써 당해 폴리펩타이드를 화학적으로 개질시킬 수 있다.
폴리펩타이드의 분자 중의 하이드록실 그룹과, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜와 같은 화학 개질제를 반응시키는 방법으로서 문헌[예를 들면, 일본 공개특허공보 제(평)1-316400호, Biotech. Lett., 14, 559-564(1992), BIO/TECHNOLOGY, 8, 343-346(1990)] 또는 이에 준한 방법을 사용할 수 있다. 즉, pH 6 내지 10으로 제조한 단백질의 수용액에 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜을 단백질당 1 내지 200몰의 양으로 첨가하여 0 내지 37℃에서 l시간 내지 3일 동안 반응시키는 방법 등을 사용할 수 있다.
폴리펩타이드의 분자 중의 하이드록실 그룹과 폴리에틸렌 글리콜-폴리프로필렌 글리콜 공중합체를 반응시키는 방법으로는 예를 들면, 일본 공개특허공보 제(소)59-59629호, 제(소)60-176586호, WO 제89/06546호, EP 제0 539 167 A2호 또는 이에 준한 방법을 사용할 수 있다. 즉, pH 6 내지 10으로 제조한 단백질의 수용액에 폴리에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체로 이루어진 화학 개질제를 단백질당 1 내지 200몰의 양으로 첨가하여 0 내지 37℃에서 1시간 내지 3일 동안 반응시키는 방법 등을 사용할 수 있다.
상기의 방법에 따라 폴리펩타이드 분자 중의 하나 이상의 하이드록실 그룹을 폴리알킬렌 글리콜로 개질시킴으로써 (1) 폴리펩타이드의 활성 부위에 하이드록실 그룹이 관여하는 경우에 하이드록실 그룹의 활성에 대한 영향을 해석하는 방법, (2) 종래의 폴리펩타이드의 화학적 개질방법으로는 당해 폴리펩타이드의 생물 활성이 현저하게 손상되는 경우에 있어서 이를 피하기 위한 신규한 화학적 개질방법 및 이러한 방법으로 수득된 화학적으로 개질된 폴리펩타이드, (3) 폴리펩타이드의 프로테아제, 동결 융해 또는 변성제에 대한 내성을 향상시키는 신규한 방법, 및 프로테아제, 동결 융해 또는 변성제에 대한 내성을 향상시킨 화학적으로 개질된 폴리펩타이드를 제공할 수 있다.
하기에서는 폴리펩타이드로서 hG-CSF 활성을 갖는 폴리펩타이드를 사용하는 것을 예시하면서 본 발명의 화학적으로 개질된 폴리펩타이드를 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 화학적으로 개질된 폴리펩타이드는 hG-CSF 또는 hG-CSF 유도체 중의 하나 이상의 하이드록실 그룹이 하기 화학식 Ia 또는 Ib의 화학 개질제에 의해 화학적으로 개질된 폴리펩타이드이다.
R1-(OCH2CH2)n­X­R2a
상기식에서,
R1, n 및 X는 상기와 동일하고,
R2a는
[여기서, R3a는 OH, 할로겐 또는 -Xb-(CH2CH2O)nb­R1b(여기서, Xb, R1b및 nb는 각각 앞서 기술한 X, R1및 n과 동일하다)이다]이다.
상기식에서,
R1, M, R3, Z, n 및 p는 상기한 바와 동일하고,
Wa는 카복시 그룹 또는 이의 반응성 유도체이다.
화학적으로 개질된 hG-CSF 및 이의 유도체에는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜-폴리프로필렌 글리콜 공중합체가 1분자 이상 결합한다. 따라서, 본 발명의 화학적으로 개질된 hG-CSF 및 이의 유도체는 혼합물로서 사용되거나 1분자 이상의 결합체를 분리하여 사용될 수 있다.
본 발명의 화학적으로 개질된 hG-CSF 및 이의 유도체의 분리에는 통상적인 장쇄 폴리펩타이드 등을 분리하는데 사용되는 이온교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, 유안 분획 등의 방법을 준용할 수 있다.
화학적 개질의 정도는 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS- PAGE)법을 사용하여, 화학적으로 개질된 hG-CSF의 이동도의 변화를 관찰함으로써 확인할 수 있다.
본 발명에서 폴리펩타이드 함량의 측정은 하기에 기재하는 실험방법으로 측정할 수 있다.
실험방법 l
로리의 방법[문헌 참조: Lowry, O.H., et. al : J. Biol. Chem. 193. 265(1951)]으로 폴리펩타이드 함량을 측정한다.
실험방법 2
렘리의 방법[문헌 참조: U.K. Laemmli:Nature, 227, 680(1970)]으로 SDS-PAGE를 수행하여 겔 위에 분리된 폴리펩타이드를 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 다음, 크로마토 스캐너(CS-930, 제조원; 시마쓰세이사쿠쇼)로 측정함으로써 폴리펩타이드 함량을 구한다.
본 발명의 화학적으로 개질된 폴리펩타이드는 그대로 또는 각종 약제 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 활성성분으로서 화학적으로 개질된 폴리펩타이드의 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체와 균일하게 혼합하여 제조할 수 있다. 이들 약제학적 조성물은 주사 투여에 적합한 단위 투여 형태인 것이 바람직하다.
주사제는 화학적으로 개질된 폴리펩타이드와 증류수, 염수 용액, 글루코스 용액, 또는 염수와 글루코스 용액의 혼합물로 이루어진 담체를 사용하여 액제로서 제조할 수 있다. 이때 통상적인 방법에 따라 적당한 제조법을 사용함으로써 용액, 현탁제 또는 분산제로서 제조할 수도 있다. 또한, 당해 액제를 동결 건조하여 동결 건조제로서 제조할 수 있다. 동결 건조 조건은 특별히 한정하지는 않지만, 통상적으로는 -50℃ 이하에서 1 내지 5시간 동안 동결하고, 선반 온도 -20℃ 내지 0℃, 진공도 50 내지 150mTorr에서 24 내지 48시간 동안 건조한 다음, 선반 온도 10 내지 30℃, 진공도 50 내지 l00mTorr에서 16 내지 24시간 동안 건조하여 동결 건조품을 수득한다.
또한, 화학적으로 개질된 폴리펩타이드 제제는 통상적인 각종 약제 담체, 부형제, 희석제, 안정화제 또는 흡착 방지제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 화학적으로 개질된 폴리펩타이드의 경우, 예를 들면, 화학적으로 개질된 hG-CSF 또는 화학적으로 개질된 hG-CSF 유도체를 함유하는 호중구 및 혈소판 증식촉진제의 투여량 및 투여회수는 투여형태, 환자의 연령, 체중, 대상 질환 및 환자의 병상을 종합해서 결정하며, 통상적으로 성인 1인당 15㎍ 내지 1.5㎎, 바람직하게는 25 내지 500㎍의 화학적으로 개질된 hG-CSF 또는 화학적으로 개질된 hG-CSF 유도체 함유 제제를 1주일 동안 1 내지 7회 투여한다.
본 발명의 화학적으로 개질된 폴리펩타이드 제제의 투여방법으로는 정맥 주사 또는 피하 주사 등을 들 수 있으며, 또한, 좌제, 점비약으로서의 투여방법도 사용할 수 있다.
하기에는 본 발명의 화학적으로 개질된 폴리펩타이드의 약리활성에 관해 시험예로 설명한다.
시험예 1
화학적으로 개질된 hG-CSF 및 화학적으로 개질된 hG-CSF 유도체의 마우스 백혈병 세포 NFS 60에 대한 증식 촉진작용
하기의 참고예 1, 실시예 5, 14, 17 및 20에서 수득되는 G-CSF 유도체, 화학적으로 개질된 hG-CSF 유도체 및 화학적으로 개질된 G-CSF의 마우스 백혈병 세포 NFS 60[문헌 참조: K. Holmes 등, Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 82, 6687(1985)]에 대한 증식 촉진활성을 아사노 등의 방법[문헌 참조: 야쿠리와 치료 19, 2767(1991)]에 따라 측정한다. 각 화합물을 표 2a 또는 표 2b에 기재된 농도로 세포에 작용시킬 경우의 결과가 표 2a과 표 2b에 제시되어 있다.
화합물 농도(ng/㎖) NFS60 세포 증식촉진활성(%)*1
참고예 1의 hG-CSF 유도체실시예 5의 Mono체 1실시예 5의 Mono체 2실시예 5의 Di체실시예 5의 Tri체 1실시예 5의 Tri체 2 12.512.512.512.512.512.5 1001001001007293
hG-CSF실시예 14의 Mono체 1실시예 14의 Mono체 2실시예 14의 Di체 5555 100868181
*1: 참고예 1에서 수득된 hG-CSF 유도체(12.5ng/㎖) 및 hG-CSF(5ng/㎖)의 활성을 100으로 하였을 때의 상대치(%)를 나타냄
화합물 농도(ng/㎖) NFS60 세포 증식촉진활성(%)*1
참고예 1의 hG-CSF 유도체실시예 17의 Tri체 1실시예 17의 Tri체 2실시예 17의 Di체실시예 20의 Tri체 1실시예 20의 Tri체 2실시예 20의 Di체 25252525252525 100928099657398
*1: 참고예 1에서 수득된 hG-CSF 유도체(25ng/㎖)의 활성을 100으로 하였을 때의 상대치(%)를 나타냄
시험예 2
방사선을 전신 조사시킨 마우스에서의 혈소판 감소에 대한 회복 촉진효과
수컷 BALB/c 마우스(6주령)를 1그룹당 4마리씩 사용하여 이들 마우스에게 137Cs 방사선 공급원(RI-433, 제조원; 도시바)을 마우스 한마리당 3Gy를 전신 방사선 조사(이하, Rx라고 약기함)시킨 다음, 특정 병원균이 존재하지 않는(SPF) 사육 환경 시설의 클린 랙 내에서 사육한다. 음료수 및 사료는 자유롭게 섭취하도록 한다. 무처리 대조군으로서 방사선을 조사하지 않은 마우스를 동일한 조건으로 사육한다. 하기의 실시예 4에서 수득된 화학적으로 개질된 hG-CSF 유도체를 각각 생리식염수 용액에 용해시키고 화학적으로 개질된 hG-CSF 유도체 용액을 Rx의 다음날에 l회, 마우스 1마리당 1회 5㎍/0.2㎖를 피하투여한다.
경시적으로 마우스 안저 정맥에서 채혈하여 자동 혈구 계수기(CC-180 A, 제조원; 도아이요우덴시)로 혈소판의 수를 측정한다. 결과가 표 3에 제시되어 있다.
3Gy를 전신에 방사선 조사시킨 마우스에서는 혈소판 수가 현저하게 감소되는 것으로 나타나며, Rx의 8 내지 9일째에서 최저치로 되었다가 그후 서서히 혈소판 수가 증가하지만 시험기간 중에 방사선 처리 전과 동일한 혈소판 수까지 회복되지는 않는다. 그러나, 화학적으로 개질된 hG-CSF 유도체를 투여한 마우스에서는 혈소판 수의 감소가 억제되며, 8 내지 9일째 이후에 혈소판 수가 현저하게 증가되는 것으로 확인되고, l1 내지 12일째에는 방사선 처리 전과 동일한 혈소판 수에까지 완전히 회복된다. Rx의 다음날과 5일째에 투여한 그룹에서도 동일한 효과가 확인된다.
화학적으로 개질된hG-CSF 유도체 평균 혈소판 수(%)*1
방사선 조사 068101112 일후
투여시 100 58.9 26.6 35.1 38.3 45.1
실시예 4의 Di체 투여 100 55.1 30.5 62.7 98.5 103.6
*1: 방사선 전신 조사시키지 않은 경우의 평균 혈소판의 값을 100으로 하였을 때의 상대치(%)를 나타냄
시험예 3
마우스에서의 백혈구 증가작용
니혼챨즈리버로부터 구입한 후 예비 사육시킨 SPF/VAF 마우스(계통명 BALB/cAnNCrj, 수컷, 8주 나이, l그룹 4마리)를 대상으로 하여 정상 마우스에서의 백혈구 증가활성을 확인한다.
실시예 5에서 수득된 Di체(0.34㎎/㎖)를 생리식염수를 사용하여 100 및 l0㎍/㎖로 희석시키고 l0㎕/g(마우스 체중)의 비율로 1회 피하 투여한다. 따라서, 투여량은 1 및 0.1㎎/kg으로 된다. 대조 그룹에는 생리식염수를 1회 피하 투여한다. 투여 전 및 투여 다음날부터 경시적으로 채혈을 실시하고 자동 혈구 계수장치(Sysmex F 800)를 사용하여 말초 혈구수를 측정한다.
그 결과, 투여한지 2일 후에 양쪽 투여군에서 백혈구 수가 대조 그룹의 2.4 내지 2.6배로 증가하는 것으로 나타났다. 0.1㎎/kg 투여군에서는 이의 약효가 이후 감소하다가 투여 4일 후에 대조 그룹과 동일한 정도의 수로 회복되지만, l㎎/kg 투여군에서는 투여 2일 후에도 백혈구 수가 증가되는 경향이 있음이 확인되었고 투여 4일 후에는 대조 그룹의 3.5배의 수를 나타내었다. 그후, 투여 7일째에는 대조 그룹과 동일한 정도의 수로 회복된다.
하기에 실시예 및 참고예를 기재한다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
실시예 1
폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액의 제조
참고예 1에서 제조한 hG-CSF 유도체를 인산 완충액(pH 7.5)을 사용하여 4.6 ㎎/㎖로 되도록 제조하고, 상기 제조액 l2㎖에 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 프로피온산의 N-하이드록시숙신이미드에스테르(M­SPA­20,000, 제조원; Shearwater Polymer)를 205.5㎎ 가하여 4℃에서 밤새 교반함으로써 폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액(1)을 제조한다.
실시예 2
폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액의 제조
참고예 1에서 제조한 hG-CSF 유도체를 인산 완충액(pH 7.5)을 사용하여 4.6 ㎎/㎖로 되도록 제조하고, 상기 제조액 12㎖에 카복시메틸모노메톡시폴리에틸렌 글리콜의 N-하이드록시숙신이미드에스테르(M­SCM­20,000, 제조원; Shearwater Polymer)를 469.8㎎ 가하여 4℃에서 밤새 교반함으로써 폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액(2)을 제조한다.
실시예 3
폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액의 제조
참고예 1에서 제조한 hG-CSF 유도체를 인산 완충액(pH 7.5)을 사용하여 4.6 ㎎/㎖로 되도록 제조하고, 상기 제조액 6.6㎖에 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 프로피온산의 N-하이드록시숙신이미드에스테르(M­SSPA­20,000, 제조원; Shearwater PoIymer)를 96.9㎎ 가하여 4℃에서 밤새 교반함으로써 폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액(3)을 제조한다.
실시예 4
폴리에틸렌 글리콜 개질된 성분의 단리
실시예 2에서 제조한 폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액(2)(단백질량 55㎎)을 l50mM 식염-함유 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 5배 희석한 다음, 상기 완충액으로 평형화한 세파크릴 S-400 칼럼(제조원: 파마시아)에 통과시켜 당해 통과액을 분획시킨다. 당해 조작에 따라 2분자의 폴리에틸렌 글리콜이 개질된 성분(Di체)을 주로 함유하는 분획과 1분자의 폴리에틸렌 글리콜이 개질된 성분(Mono체)을 주로 함유하는 조분획을 수득한다.
이들 분획을 각각 TSK 겔 G 4000 SWxL(7.8mm I.D. x 300mm, 제조원; 도소)에 통과시켜 Di체 및 Mono체를 함유하는 분획을 분취한다. 또한, 각각의 분획을 SP-5 PW(21.5mm 1.D. x l50mm, 제조원; 도소)를 사용하여 하기 조건으로 정제하여 Di체의 주요 성분 l종류(0.39㎎/㎖ x 3.0㎖)와 Mono체의 주요 성분 1종류(0.55㎎/㎖ x 3.0㎖)를 각각 수득한다.
SP-5 PW 정제조건
칼럼: SP-5 PW(21.5mm I.D. x l50mm)(제조원; 도소)
검출: 280nm
A액: 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)
B액: 0.5M 식염-함유 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)
용출: A액으로부터 B액으로 직선 농도 구배 용출
실시예 5
폴리에틸렌 글리콜 개질된 성분의 단리
실시예 1에서 제조한 폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액(1)(단백질량 55㎎)을 150mM 식염-함유 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 5배 희석한 다음, 상기 완충액으로 평형화한 세파크릴 S-400 칼럼(제조원; 파마시아)에 통과시켜 통과액를 분획시킨다. 당해 조작에 따라 3분자의 폴리에틸렌 글리콜이 개질된 성분(Tri체)를 함유하는 조분획, 2분자의 폴리에틸렌 글리콜이 개질된 성분(Di체)를 함유하는 조분획 및 1분자의 폴리에틸렌 글리콜이 개질된 성분(Mono체)을 함유하는 조분획을 수득한다.
이들 분획을 각각 TSK 겔 G 4000 SWxL(7.8mm I.D. x 300mm, 제조원; 도소)에 통과시켜 Tri체, Di체 및 Mono체를 함유하는 분획을 분취한다. 또한, 이들 분획을 각각 실시예 4와 동일한 순서로 양이온 교환 칼럼, SP-5 PW(제조원; 도소)로 정제하여 Tri체의 주요 성분 2종류(Tri체 1 : 1.4㎎/㎖ x 0.5㎖, Tri체 2 : 1.0㎎/㎖ x 0.8㎖), Di체의 주요 성분 1종류(0.34㎎/㎖ x 3.0㎖) 및 Mono체의 주요 성분 2종류(Mono체 1 : 0.48㎎ x 0.4㎖, Mono체 2 : 1.58㎎/㎖ x 0.5m1)을 각각 단리한다.
하기의 실시예에 기재된 바와 같이, Mono체 1은 N말단으로부터 66번째에 있는 Ser의 하이드록실 그룹이 1분자의 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 것이고, Mono체 2는 N말단 Met가 1분자의 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 것이다.
실시예 6
폴리에틸렌 글리콜 개질된 성분의 단리
실시예 3에서 제조한 폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액(3)(단백질량 30㎎)을 150mM 식염-함유 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 5배 희석한 다음, 상기 완충액으로 평형화한 세파크릴 S-400 칼럼(제조원; 파마시아)에 통과시켜 당해 통과액을 분획시킨다. 당해 조작에 따라 2분자의 폴리에틸렌 글리콜이 개질된 성분(Di체)을 함유하는 조분획을 수득한다.
당해 분획을 각각 TSK 겔 G 4000 SWxL(7.8mm I.D. x 300mm, 제조원; 도소)에 통과시켜 Di체를 함유하는 분획을 분취한다. 당해 분취 분획을 실시예 4와 동일한 순서로 양이온 교환칼럼, SP-5 PW 칼럼(제조원; 도소)으로 정제하여 Di체의 주요 성분 l종류(0.43㎎/㎖ x 3.0㎖)를 단리한다.
실시예 7
hG-CSF 유도체의 펩타이드 매핑
참고예 1에서 제조한 hG-CSF 유도체를 인산 완충액(pH 7.5)을 사용하여 2m g/㎖로 되도록 제조하고, 상기 제조액 1.0㎖를 "단백질·펩타이드의 고속액체 크로마토그래피(II) 화학증간 ll7(문헌 참조: 가가쿠도진, 153 내지 160, 1990년)"에 기재된 조건에 따라 V8 프로테아제(제조원; 세이가가쿠고교)로 처리한 다음, 50㎕를 HPLC에 주입하여 하기 조건하에서 HPLC로 분석한다.
HPLC 분석조건
칼럼: 단백질 ＆ 펩타이드 C18[PROTEIN ＆ PEPTIDE C l8(4.6mm I.D. x 250mm, VYDAC)]
A액: 0.1% 트리플루오로아세트산
B액: 0.1% 트리플루오로아세트산-함유 90% 아세트니트릴
용출: A액 내지 B액의 직선 농도 구배 용출
검출: 215nm
유량: 0.5㎖/min
V8 프로테아제로 소화된 hG-CSF 유도체의 분석 패턴에서는 9개의 피크가 관측된다. 각 피크를 분취하여 분자량 분석을 실시한 결과, 각 피크는 표 4와 같이 나타난다.
V8 프로테아제에 의한 hG-CSF 유도체의 펩타이드 매핑
피크 번호 펩타이드 단편 분자량 분석치 (계산치)*(Na 부가)
123456789 94 - 9820 - 3334 - 46163 - 174-1 - 19124 - 162105 - 12347 - 9399 - 123 524.5*(502)1512.8 (1514)1648.8 (1649)1438.9 (1440)2241.7 (2241)4028.0 (4029)2263.8*(2240)5060.5 (5060)2836.9 (2836)
실시예 8
펩타이드 매핑에 의한 폴리에틸렌 글리콜 결합 위치의 추정
실시예 5에서 수득한 Mono체 1, Mono체 2, Di체, Tri체 1 및 Tri체 2를 실시예 7의 hG-CSF 유도체의 펩타이드 매핑과 동일한 조작을 사용하여 프로테아제로 소화시킨다.
그 결과, 실시예 5에서 수득된 Mono체 1, Di체, Tri체 1 및 Tri체 2에서는 특정 피크가 소실되거나 현저하게 감소되는 것으로 확인된다(표 5).
정제시킨 폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 성분의 펩타이드 매핑(개질되지 않은 hG-CSF 유도체의 비율)
성분 소실되거나 현저하게 감소된 피크 번호
실시예 5의 Mono체 1실시예 5의 Mono체 2실시예 5의 Di체실시예 5의 Tri체 1실시예 5의 Tri체 2 855, 83, 5, 83, 5, 8
폴리에틸렌 글리콜이 결합된 펩타이드 단편은 HPLC의 피크가 실시예 7의 h G-CSF 유도체의 분석 패턴과 비교하여 변하는 것으로 예상된다. 표 4의 결과로부터, 폴리에틸렌 글리콜의 결합 위치는 실시예 5에 기재된 Mono체 2, Di체, Tri체 1 및 Tri체 2에서는 적어도 hG-CSF 유도체의 -1 내지 19잔기(피크5)에 상응하는 펩타이드 잔기(N 말단 아미노 그룹을 함유함)인 것으로 추정된다.
Mono체 2에 관해 시마쓰사에서 제조한 프로테인 서열 PPSQ-l0을 사용하여 N말단 서열을 측정한 결과, 서열이 확인되지 않았기 때문에 Mono체 2는 N말단 Met 잔기가 1분자의 에틸렌 글리콜로 개질된 것으로 보인다.
Tri체 1 및 Tri체 2에 있어서, 적어도 hG-CSF 유도체의 34 내지 46 잔기(피크3)에 상응하는 펩타이드 잔기(Lys의 아미노 그룹을 함유함)에도 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 것으로 추정된다.
또한, Mono체 1, Di체, Tri체 1 및 Tri체 2는 모두 피크 8이 소실되거나 또는 현저하게 감소되므로, 47 내지 93잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(리진 등의 유리 아미노 그룹을 함유하지 않음)에도 폴리에틸렌 글리콜이 결합되어 있는 것으로 추정된다.
실시예 9
펩타이드 매핑에 의한 폴리에틸렌 글리콜 결합 위치의 추정
실시예 6에서 수득한 Di체의 분획을 실시예 7에 기재한 hG-CSF 유도체의 펩타이드 매핑과 동일한 조작을 사용하여 프로테아제로 소화시킨다.
실시예 7의 hG-CSF 유도체의 분석 패턴과 비교하여, 실시예 6에서 수득한 Di 체에서는 표 6에 나타낸 바와 같이 특정 피크가 소실되거나 현저하게 감소되는 것으로 확인된다.
정제시킨 폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 성분의 펩타이드 매핑(개질되지 않은 hG-CSF 유도체의 비율)
성분 소실되거나 현저하게 감소된 피크 번호
실시예 5의 Di체 5, 8
폴리에틸렌 글리콜이 결합된 펩타이드 단편은 HPLC의 피크가 실시예 7의 h G-CSF 유도체의 분석 패턴과 비교하여 변하는 것으로 예상된다. 표 5의 결과로부터, 실시예 8과 동일하게 폴리에틸렌 글리콜의 결합 위치는 실시예 6에 기재된 Di체에서는 hG-CSF 유도체의 -l 내지 19잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(N말단 아미노 그룹을 함유함) 및 hG-CSF 유도체의 47 내지 93잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(리진 등의 유리 아미노 그룹을 함유하지 않음)인 것으로 추정된다.
실시예 10
펩타이드 매핑에 의한 폴리에틸렌 글리콜 결합 위치의 추정
실시예 4와 동일한 조작으로 수득된 Di체를 실시예 7 및 실시예 8과 동일한 조작으로 펩타이드 매핑에 의해 폴리에틸렌 글리콜의 결합 위치를 조사한다. 실시예 4에 기재된 Di체에서도 hG-CSF 유도체의 -1 내지 l9잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(N말단 아미노 그룹을 함유함) 및 hG-CSF 유도체의 47 내지 93잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(리진 등의 유리 아미노 그룹을 함유하지 않음)에 폴리에틸렌 글리콜이 결합되어 있는 것으로 추정된다.
실시예 1l
폴리에틸렌 글리콜 개질된 펩타이드의 정제
실시예 4, 실시예 5, 실시예 6의 Di체, 실시예 5의 Tri체 1 및 Tri체 2, 실시예 5의 Mono체 1, 실시예 14의 Mono체 1 및 Di체, 실시예 17의 Di체, Tri체 l 및 Tri체 2 또는 실시예 20의 Di체, Tri체 1 및 Tri체 2로부터 확인된 폴리에틸렌 글리콜 결합 위치인 hG-CSF 유도체 또는 hG-CSF의 유리 아미노 그룹을 함유하지 않는 47 내지 93잔기에 상응하는 펩타이드 잔기에서 폴리에틸렌 글리콜 결합 아미노산 잔기를 조사하기 위해, 하기의 조작에 의해 Di체 성분으로부터 폴리에틸렌 글리콜 결합 펩타이드의 단편을 단리한다.
즉, 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 제조한 폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액으로부터 실시예 5와 동일한 순서로 양이온 교환 크로마토, SP-5PW의 Di체 주성분의 분획 30㎖(단백질 농도 2.2㎎/㎖)를 수득한다. 그후, 서모리신(제조원; 시그마)을 소화시킨다. 겔여과 칼럼(세파크릴 S-300, 제조원; 파마시아)을 사용하여 효소 반응액을 분획하고 목적하는 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 펩타이드 분획(약 30㎎)을 수득한다.
당해 펩타이드 분획의 질량 분석(MALDI-TOFMS) 결과는 22155.89(M+H)이고, 아미노산 분석의 결과는 Ser 2.7(3), Pro l.0(1), Leu l.0(1), Cys 0.9(1)이다.
분자량 분석 및 아미노산 분석 결과로부터, 상기한 조작으로 단리된 샘플은 hG-CSF 유도체의 6l잔기째로부터 66잔기째의 펩타이드[LeuSerSerCysProSer(류실-세릴-세릴-S­아미드메틸시스테이닐-프롤릴-세린)잔기]에 폴리에틸렌 글리콜이 결합되어 있는 것으로 추정된다.
실시예 12
1H-NMR에 의한 폴리에틸렌 글리콜 결합 위치의 결정
펩타이드 고상 합성법(PSSM8, 시마쓰)에 의해 hG-CSF 유도체의 61 내지 66잔기에 상응하는 펩타이드 LeuSerSerCysProSer(류실-세릴-세릴-시스테이닐-프롤릴-세린)를 합성하고, "단백질·펩타이드의 고속액체 크로마토그래피(Ⅱ) 화학증간117(문헌 참조: 가가쿠도진, 153 내지 160, 1990년)"에 기재된 조건에 따라 아미드메틸화하고 역상 HPLC을 사용하여 아미드메틸화 펩타이드(류실-세릴-세릴-S-아미드메틸시스테이 닐-프롤릴-세린)를 정제한다. 이러한 아미드메틸화 펩타이드 0.6㎎을 중수소 치환된 디메틸설폭사이드(d6-DMSO)에 용해시켜1H-NMR 분석(500MHz)을 수행한다. 동일하게, 실시예 ll에서 수득된 폴리에틸렌 글리콜 결합 펩타이드 20㎎을 사용하여1H-NMR 분석을 수행한다. 각각의 분석으로 관측된 양성자(폴리에틸렌 글리콜로부터의 양성자는 제외)의 케미칼 쉬프트(chemical shift)가 표 7 및 표 8에 제시되어 있다. 이 결과로부터, 합성하여 수득한 아미드메틸화 펩타이드 중의 3개의 Ser의 γOH 그룹에서 유도된 모든 양성자가 확인된다. 한편, 실시예 11에서 수득된 폴리에틸렌 글리콜 결합 펩타이드에서, 폴리에틸렌 글리콜로부터의 양성자의 시그널에 더하여 hG-CSF 유도체의 66잔기째의 Ser의 γOH 그룹에서 유도된 양성자가 관측되지 않는 Ser 잔기의 β양성자가 약 0.6ppm 저자장에 쉬프트하는 Ser 잔기의 아미드 프로톤이 다른 아미드 프로톤과 비교하여 브로드한 시그널을 제공하는 현상이 확인된다. 상기한 점으로부터 폴리에틸렌 글리콜의 결합 위치가 hG-CSF 유도체의 66잔기째의 Ser임이 확인된다.
합성하여 수득된 아미드메틸화 펩타이드의 NMR 분석에 의한 케미칼 쉬프트(ppm)
잔기 NH CαH0 CβH 기타
Leu61Ser62Ser63Cys64Pro65Ser66 8.068.668.668.038.068.197.977.988.40 3.864.474.494.324.324.684.604.424.804.234.24 1.52, 1.573.57, 3.643.633.583.572.63, 2.962.63, 2.901.91, 2.021.98, 2.203.60, 3.703.80, 3.72 γ H1.67, βCH30.92γ OH5.13γ OH5.04γ OH4.85γ OH4.80CH23.12, NH27.05, 7.42CH23.12, NH27.10, 7.45γ H1.86, δ H3.61γ H1.83, δ H3.45, 3.40γ OH4.94γ OH4.90
이탤릭체는 Cis-Pro를 나타냄
폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체에서 단리시킨 폴리에틸렌 글리콜 개질된 펩타이드의 NMR 분석에 의한 케미칼 쉬프트(ppm, 폴리에틸렌 글리콜 부분 제외)
잔기 NH CαH0 CβH 기타
Leu61Ser62Ser63Cys64Pro65Ser66 8.518.908.038.068.188.087.887.66 3.663.734.434.374.304.214.684.624.334.604.284.21 1.44, 1.561.47, 1.603.57, 3.643.643.603.58, 3.632.68, 3.032.67, 2.901.87, 2.022.12, 2.044.17, 4.324.16, 4.46 γ H1.70, βCH30.90γ H1.67, βCH30.90γ OH5.17γ OH4.85CH23.12, NH27.02, 7.43CH23.12, NH27.02, 7.62γ H1.86, δ H3.67γ H1.72,1.83 δ H3.40, 3.52
이탤릭체는 Cis-Pro를 나타냄
실시예 13
폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 반응액의 제조
인산 완충액으로 제조한 4.0㎎/㎖의 hG-CSF 용액(pH 7.5) 4.0㎖에 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜프로피온산의 N-하이드록시숙신이미드에스테르 (M­SPA­20,000, 제조원; Shearwater Polymer) 83㎎을 가하여 4℃에서 밤새 교반한다.
실시예 14
폴리에틸렌 글리콜 개질된 성분의 단리
실시예 13의 폴리에틸렌 글리콜 개질된 반응액(단백질량 16㎎)을 150mM 식염-함유 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 5배 희석한 다음, 상기 완충액으로 평형화한 세파크릴 S 1400 칼럼(제조원; 파마시아)으로 분획시킨다. 2분자의 폴리에틸렌 글리콜이 개질된 성분(Di체)을 주로 함유하는 분획 및 1분자의 폴리에틸렌 글리콜이 개질된 성분(Mono체)을 주로 함유하는 조분획을 수득한다. 이들 분획을 각각 TSK 겔 G 400 0 SWxL(7.8mm I.D. x 300mm, 제조원; 도소)에 충전하여 Di체 및 Mono체를 포함하는 분획을 분취한다. 또한, 각각의 분획을 SP-5PW(21.5mm I.D. x l50mm, 제조원; 도소)로 정제하여 Di체의 주요 성분 l 종류(0.6l㎎/㎖ x 0.6㎖)와 Mono체의 주요 성분 2종류(Mono체 1 : 0.46㎎/㎖ x l.0㎖, Mono체 2 : 0.6l㎎/㎖ x 0.7㎖)를 각각 단리한다.
실시예 15
펩타이드 매핑에 의한 폴리에틸렌 글리콜 결합 위치의 추정
실시예 14에서 수득된 Mono체 1, Mono체 2 및 Di체의 분획을 실시예 7에 기재된 hG-CSF 유도체의 펩타이드 매핑과 같은 조작을 사용하여 프로테아제로 소화시킨다.
그 결과, 실시예 8에서 확인된 바와 같이, hG-CSF의 분석 패턴과 비교하면, 특정 피크의 소실 또는 현저한 감소가 확인된다.
실시예 8과 같이, 폴리에틸렌 글리콜의 결합 위치는 하기와 같은 것이 추정된다.
Mono체 1: 서열번호 1의 아미노산 서열의 47 내지 93잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(리진 등의 유리 아미노 그룹을 함유하지 않음) 내에 위치하며 실시예 12에 기재한 방법에 준하여 N말단으로부터 66번째에 있는 Ser의 하이드록실 그룹이 l분자의 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 것으로 확인된다.
Mono체 2: 서열번호 1의 아미노산 서열의 -1 내지 19잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(N말단 아미노 그룹을 함유함) 내에 위치하며 실시예 7에 기재한 방법에 준하여 N 말단 Met가 1분자의 폴리에틸렌 글리콜로 개질된 것으로 확인된다.
Di체: 서열번호 1의 아미노산 서열의 -1 내지 19잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(N말단 아미노 그룹을 함유함) 및 47 내지 93 잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(리진 등의 유리 아미노 그룹을 함유하지 않음).
실시예 16
폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액의 제조
참고예 l에서 제조한 hG-CSF 유도체를 인산 완충액(pH 7.2)을 사용하여 0.9 ㎎/㎖로 되도록 제조하여 제조액 600㎖를 수득한다. 당해 제조액에 빙냉하에서 참고예 2와 동일한 방법으로 수득된 2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-6-(3-카복시프로필아미노)-s-트리아진의 N­하이드록시숙신이미드에스테르 8.7g을 첨가하여 4℃에서 48시간 동안 교반함으로써 폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액(4)을 제조한다.
실시예 17
폴리에틸렌 글리콜 개질된 성분의 단리
실시예 16과 동일한 방법으로 제조한 폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액(4)(단백질량 40㎎)을 150mM 식염-함유 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 평형화한 세파크릴 S1300 칼럼(제조원; 파마시아)에 통과시켜 통과액을 분획시킨다. 당해 조작에 의해 3분자의 폴리에틸렌 글리콜이 개질된 성분(Tri체)을 함유하는 조분획 및 2분자의 폴리에틸렌 글리콜이 개질된 성분(Di체)을 함유하는 조분획을 수득한다.
이들 분획을 각각 실시예 4와 같은 순서로 양이온 교환 칼럼, SP-5PW(제조운; 도소)로 정제하여 Tri체의 주요 성분 2종류(Tri체 1: 0.49㎎/㎖ x l.3㎖, Tri체 2: 0.57㎎/㎖ x l.5㎖) 및 Di체의 주요 성분 1종류(1.94㎎/㎖ x l.2㎖)를 각각 단리한다.
실시예 18
펩타이드 매핑에 의한 폴리에틸렌 글리콜 결합 위치의 추정
실시예 17에서 수득한 Di체, Tri체 1 및 Tri체 2를 실시예 7 및 실시예 8과 동일한 조작으로 펩타이드 매핑에 의해 폴리에틸렌 글리콜의 결합 위치를 조사한다. 실시예 l7에 기재된 Di체, Tri체 1 및 Tri체 2에서도 hG-CSF 유도체의 -1 내지 19 잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(N말단 아미노 그룹을 함유함) 및 hG-CSF 유도체의 47 내지 93 잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(리진 등의 유리 아미노 그룹을 함유하지 않음)에 폴리에틸렌 글리콜이 결합되는 것으로 추정된다. 또한, Tri체 1 및 Tri체 2에서는 적어도 hG-CSF 유도체의 34 내지 46 잔기(피크 3)에 상응하는 펩타이드 잔기(Lys의 아미노 그룹을 함유함)에도 폴리에틸렌 글리콜이 결합되는 것으로 추정된다.
실시예 19
폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액의 제조
참고예 1에서 제조한 hG-CSF 유도체를 인산 완충액(pH 7.3)을 사용하여 0.9 ㎎/㎖로 되도록 제조하여 제조액 560㎖를 수득한다. 당해 제조액에 빙냉하에서 참고예 4와 같은 방법으로 수득된 2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-6-(-카복시프로필아미노)-s-트리아진의 N-하이드록시숙신이미드에스테르 22.4g을 첨가하여 4℃에서 48시간 동안 교반함으로서 폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액(5)을 제조한다.
실시예 20
폴리에틸렌 글리콜 개질된 성분의 단리
실시예 l9와 동일한 방법으로 제조하는 폴리에틸렌 글리콜 개질된 hG-CSF 유도체 반응액(5)(단백질량 15㎎)을 150mM 식염-함유 20mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 평형화한 세파크릴 S-400 칼럼(제조원; 파마시아)에 통과시켜 통과액을 분획한다. 당해 조작에 의해 3분자의 폴리에틸렌 글리콜이 개질된 성분(Tri체)을 포함하는 조분획 및 2분자의 폴리에틸렌 글리콜이 개질된 성분(Di체)를 함유하는 조분획을 수득한다.
이들 분획을 각각 실시예 4와 같은 순서로 양이온 교환 칼럼, SP-5PW(제조원; 도소)로 정제하고 Tri체의 주요 성분 2종류(Tri체 1: 3.53㎎/m1 x 0.4m1, Tri체 2: 0.26㎎/㎖ x 2.l㎖) 및 Di체의 주요 성분 1종류(0.84㎎/㎖ x l.2㎖)를 각각 단리한다.
실시예 21
펩타이드 매핑에 의한 폴리에틸렌 글리콜 결합 위치의 추정
실시예 20에서 수득된 Di체, Tri체 1 및 Tri체 2를 실시예 7 및 실시예 8과 동일한 조작으로 펩타이드 매핑에 의해 폴리에틸렌 글리콜의 결합 위치를 조사한다. 실시예 20의 Di체, Tri체 1 및 Tri체 2에서도 hG-CSF 유도체의 -1 내지 l9잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(N말단 아미노 그룹을 함유함) 및 hG-CSF 유도체의 47 내지 93잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(리진 등의 유리 아미노 그룹을 함유하지 않음)에 폴리에틸렌 글리콜이 결합되는 것으로 추정된다. 또한, Tri체 1 및 Tri체 2에서는 적어도 hG-CSF 유도체의 34 내지 46 잔기에 상응하는 펩타이드 잔기(Lys의 아미노 그룹을 함유함)에도 폴리에틸렌 글리콜이 결합되는 것으로 추정된다.
실시예 22
화학적으로 개질된 폴리펩타이드의 프로테아제 내성
실시예 14에서 수득된 Mono체 성분 2종류를 각각 0.5㎖씩 10mM 인산 완충액(pH 5.0)으로 평형화한 겔여과 칼럼[세파텍스 G-25(NAP­5, 제조원; 아마샴·파마시아)]에 통과시키고 각각에 대해 통과액을 1.0㎖씩 회수한다.
이들 회수 용액에 l0mM 인산 완충액(pH 5.0)을 가하고 단백질 농도를 0.2 ㎎/㎖로 되도록 희석시킨다.
이들 희석액 2㎖에 0.2㎎/㎖ 서모라이신을 가하여(효소/기질 비=l/50) 30℃에서 반응시킨다.
당해 반응액으로부터 경시적으로 100㎕씩 채취하고 채취한 용액에 아세트산 2㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨다.
이들 반응을 정지시킨 후의 용액 50㎕를 사용하여 하기 조건으로 HPLC로 해석한다.
HPLC 분석조건
칼럼: TSK 겔 C4000SWXL(7.8mm I.D. x 300mm)(제조원; 도소)
검출: 280nm
이동상: 150mM NaCl/20mM 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)
유속: 0.8m1/min
Mono체 1 및 2는 유지 시간 12분 동안 용출된다. 이들 Mono체가 서모라이신에 의해 분해되면 12분 위치에 출현하는 검출 피크가 감소되기 때문에 이들 Mono체가 어느 정도 서모라이신에 의해 분해되었는지를 확인할 수 있다.
표 9에는 l2분 위치에 출현하는 검출 피크의 감소율로부터 산출한 Mono체 잔존율의 경시적인 변화가 제시되어 있다.
서모라이신에 대한 안정성
반응시간(hr) 실시예 14의 Mono체 1 실시예 14의 Mono체 2
1523 1009589 1007268
표 9로부터 폴리에틸렌 글리콜을 N말단에 개질한 Mono체 2보다 Ser에 개질한 Mono체 1이 서모라이신에 대해 내성인 것으로 나타났다.
실시예 23
화학적으로 개질된 폴리펩타이드의 동결 융해에 대한 안정성
실시예 5에서 수득한 Mono체 성분 2종류 각각 1㎖를 5mM 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5) 또는 5mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0)으로 평형화한 2종류의 겔여과 칼럼[세파텍스 G 125(NAP­10, 제조원; 아마샴·파마시아)]에 통과시키고 각각에 대해 통과액을 1.5㎖씩 회수한다.
이들 회수 용액의 단백질 농도를 300㎍/㎖로 조정한다.
이들 조정 용액을 500㎕씩 분취하여 -30℃에서 동결한 다음, 실온의 수욕에서 융해시킨다.
이러한 동결 융해처리를 4회 반복한 다음, 실시예 22에 기재된 겔여과 HPLC 조건을 사용하고 각각의 개질된 폴리펩타이드의 잔량(회수율)을 측정한다.
결과가 표 10에 제시되어 있다.
폴리에틸렌 글리콜 개질물 4회 동결융해한 후의 회수율(%)
pH 4.5 pH 5.0
실시예 5의 Mono체 1실시예 5의 Mono체 2 10091.3 10185.5
표 10으로부터, 폴리에틸렌 글리콜을 N말단에 개질한 Mono체 2보다 Ser에 개질한 Mono체 1이 동결 융해에 대한 안정성이 우수함을 알 수 있다.
실시예 24
화학적으로 개질된 폴리펩타이드의 시험관내 활성
실시예 14에서 수득된 Mono체 성분 2종류에 대해 마우스 백혈병 세포 NFS 60[문헌 참조: K. Holmes 등, Proc. Nad. Acad. Sci. USA. 82, 6687(1985)]에 대한 증식 촉진활성을 아사노 등의 방법[문헌 참조; 야쿠리와 치료 19, 2767(1991)]에 따라 하기의 단계 희석법에 따라 측정한다.
96개의 기공을 가진 플레이트에 G-CSF(-) 배지에서 세정한 세포액을 각 50㎕씩 가한다.
실시예 14에서 수득된 Mono체 1을 25ng/㎖가 되도록 제조하여. 제1 웰에 50㎕를 가하여 충분히 혼합함으로써 12.5ng/㎖의 용액을 제조한다.
제1 웰로부터 50㎕를 추출하여 제2 웰에 가하여 충분히 혼합함으로써 6.25ng/㎖의 용액을 제조한다. 이러한 조작을 반복하여 11단계의 2배 희석계열을 제조한다.
상기와 동일한 방법으로, 실시예 14에서 수득된 Mono체 2(25ng/㎖) 및 참고예 1의 hG-CSF 유도체를 함유하는 표준 용액(5ng/㎖)을 사용하여 2배 희석계열을 제조한다. 당해 방법에 따라 Mono체 2는 12.5ng/㎖로부터의 희석 계열이 각 웰 50㎕가 제조되고, 표준 용액은 2.5ng/㎖로부터의 희석 계열이 각 웰 50㎕가 제조된다.
시료 용액 및 표준 용액에 대해 각 3회씩 NFS 60 세포의 증식활성을 측정하고, 표준 용액의 활성을 100으로 하여 각 Mono체의 상대 활성을 산출한다.
Mono체 1은 Mono체 2와 비교하여 1.06 내지 1.13배의 활성을 갖는다.
참고예 1
서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 hG-CSF의 l번째의 트레오닌을 알라닌으로 치환시키고 3번째의 류신을 트레오닌으로 치환시키며 4번째의 글리신을 티로신으로 치환시키고 5번째의 프롤린을 아르기닌으로 치환시키며 17번째의 시스틴을 세린으로 각각 치환시킨 hG-CSF 유도체(표 1, 화합물 k)를 일본 특허공보 제(평)07-096558호의 참고예 3에 기재된 방법에 따라 수득한다.
즉, 상기의 hG-CSF 유도체를 암호화하는 DNA를 함유하는 플라스미드 p CfBD 28을 보유하는 대장균 W3ll0 strA주(Escherichia coli ECfBD 28 FE RM BP­1479)를 LG 배지[박트트립톤 10g, 효모 엑스 5g, 염화나트륨 5g, 글루코스 1g을 물 1ℓ에 용해시키고 NaOH로 pH를 7.0으로 조절함]에서 37℃로 18시간 동안 배양하고, 이러한 배양액 5㎖를 25㎍/㎖의 트립토판과 50㎍/㎖의 암피시린를 함유하는 MCC 배지(Na2HPO40.6%, KHzPO40.3%, 염화나트륨 0.5%, 카자미노산 0.5%, MgSO41mM, 비타민 B 14㎍/㎖, pH 7.2) 100㎖에 접종하여 30℃에서 4 내지 8시간 동안 배양한 다음, 트립토판의 유도 물질인 3β-인돌아크릴산(3β-indoleacrylic acid, 이하 IAA라고 약칭함)을 10㎍/㎖ 가하고, 이어서 2 내지 12시간 동안 배양을 계속한다. 배양액을 8,000rpm에서 l0분 동안 원심하여 집균시키고, 30mM 염화나트륨, 30mM 트리스·염산 완충액(pH 7.5)으로 세정한다. 세정한 균체를 상기 완충액 30㎖에서 현탁하고 0℃에서 l0분 동안 초음파 파쇄(제조원: BRANSON SONIC POWER COMPANY, SONIFIER CELL DISRUPTOR 200, OUTPUT CONTROL2)한다. 초음파 파쇄물을 9,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 균체 잔사를 수득한다.
당해 균체 잔사로부터 마스톤 등의 방법[문헌 참조: F.A.O. Marston 등: 바이오·테크놀로지(BIO/TECHNOLOGY), 2, 800(1984)]에 준하여 hG-CSF 유도체를 추출·정제·가용화·재생시킨다.
참고예 2
2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-6-(3-카복시프로필아미노)-s-트리아진의 N­하이드록시숙신이미드에스테르의 제조
γ-아미노부티르산 4l2㎎(4.0mmo1)을 0.1M 붕산 완충액(pH l0) 300㎖에 용해시키고 빙냉하 2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-6-클로로-s-트리아진 20g(2m mol)(제조원; 세이가가쿠고교)을 가하여 4℃에서 밤새 교반하고 실온에서 6시간 교반하여 반응시킨다.
당해 반응액에 1N 염산을 첨가하고 반응액을 pH l로 조정한 다음, 2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-6-(3-카복시프로필아미노)-s-트리아진을 클로로포름으로 추출한다. 클로로포름상을 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과하여 분리한 다음, 용매를 감압 제거하여 당해 카복실산 유도체를 수득한다.
카복실산 유도체를 무수 아세톤으로 재결정화시켜 카복실산 유도체의 결정 15.8g(1.6mmol)을 수득한다.
당해 결정 l0g(1.0mmol)과 N-하이드록시숙신이미드 230㎎을 무수 염화메틸렌 l00㎖에 용해하고 빙냉 상태의 아르곤류하에서 N,N-디사이클로헥실카보디이미드 (DCC) 413㎎을 가하여 30분 동안 교반한다. 교반시킨 후, 실온으로 되돌린 다음, 1.5시간 동안 교반하고 불용물(N,N'-디사이클로헥실우레아(DCU))을 여과 분별하여 여액을 40㎖까지 감압 농축한다.
당해 농축액을 무수 디에틸에테르 600㎖에 적가하여 침전물을 생성시킨다.
침전물을 무수 디에틸에테르로 세정한 다음, 감압하에 용매를 제거하고 2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜-6-(3-카복시프로필아미노)-s-트리아진의 N-하이드록시숙신이미드에스테르 7.7g(0.77mmol)을 수득한다(수율 77%).
참고예 3
2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-6-(3-카복시프로필아미노)-s-트리아진의 제조
충분히 건조시킨 평균 분자량이 12000인 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(제조원; 니혼유시) l00g(8.33mmol), 산화아연(제조원; 와코쥰야쿠고교) 9.3g 및 분자체(유형 4A)(제조원; 와코쥰야쿠고교) 83.5g을 무수 벤젠에 용해하고, 아르곤 류하에서 실온에서 밤새 방치한다.
분자체를 제거하고 증류장치를 사용하여 아르곤류하에서 80℃로 증류하고, 분자체(유형 4A)를 l00g 정도 채운 속실렛 추출장치(고상용)를 사용하여 아르곤류 하에서 80℃에서 밤새 탈수 환류시킨다.
탈수 환류시켜 수득된 반응액을 냉각시킨 다음, 736㎎(4.0mmol)의 염화시아눌을 가하여 5일 동안 상기와 동일한 방법으로 탈수 환류를 실시한다. 그후, 실온으로 냉각시키고 무수 벤젠 300㎖를 가하여 3600rpm에서 10분 동안 원심분리하여 불용물을 제거한다.
수득된 상층액을 300㎖까지 감압 농축시키고 무수 디에틸에테르 3000㎖에 적가하여 침전물을 생성시킨다. 당해 침전물을 회수하여 무수 디에틸에테르로 세정한 다음, 감압하에 용매를 제거하여 무수 침전물을 수득한다.
무수 침전물 100g을 빙냉하에서 γ-아미노부티르산 1.24g(12.0mmol)을 0.lM 붕산 완충액(pH 10) 1000㎖에 용해시킨 용액에 가하여 4℃에서 밤새 교반한다. 실온에서 6시간 더 교반한 다음, 1N 염산으로 pH를 l.0에 조정하고 2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-6-(3-카복시프로필아미노)-s-트리아진을 클로로포름으로 추출한다. 당해 화합물을 함유하는 클로로포름상을 무수 황산나트륨으로 건조한 다음, 여과 분별하여 여액를 감압하에 용매 제거한다. 생성된 백색 고체를 무수 아세톤으로 재결정화시켜 2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜-6-(3-카복시프로필아미노)-s-트리아진 약 90g을 수득한다(수율 90%).
참고예 4
2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜-6-(3-카복시프로필아미노)-s-트리아진의 N-하이드록시숙신이미드에스테르의 제조
참고예 3과 동일한 방법으로 합성하여 충분히 건조시킨 2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜-6-(3-카복시프로필아미노)-s-트리아진 25g(l.0mmol)과 N-하이드록시숙신이미드 240㎎을 무수 염화메틸렌 400㎖에 용해시키고 빙냉하에 아르곤류하에서 N,N-디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 431㎎을 가하여 30분 동안 교반한다.
교반시킨 후, 실온으로 되돌리고 1.5시간 동안 교반한 다음, 불용물(N,N'-디사이클로헥실우레아(DCU))를 여과 분별하고 여액을 160㎖까지 감압 농축한다.
당해 농축액을 무수 디에틸에테르 2400m1에 적가하여 침전물을 생성시키고, 수득된 침전물을 무수 디에틸에테르로 세정한 다음, 감압하에 용매를 제거하여 2,4-비스(o-메톡시폴리에틸렌 글리콜)-6-(3-카복시프로필아미노)-s-트리아진의 N-하이드록시숙신이미드에스테르 21.4g(0.89mmol)을 수득한다(수율 89%).
서 열 표
서열번호: 1
서열 길이: 174
서열형: 아미노산
쇄의 수: 단일쇄
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 단백질
서열
본 발명은 폴리펩타이드 분자 중의 하나 이상의 하이드록실 그룹을 폴리알킬렌 글리콜로 개질시킨 화학적으로 개질된 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드의 제조방법, 당해 폴리펩타이드를 사용하여 환자에서 과립구 또는 혈소판을 감소시키기 위한 치료방법, 당해 폴리펩타이드를 함유하는 치료용 조성물 및 당해 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 폴리펩타이드 분자 중의 하나 이상의 하이드록실 그룹을 폴리알킬렌 글리콜 유도체로 개질시킨 화학적으로 개질된 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드의 제조방법, 당해 폴리펩타이드를 사용하는 치료방법, 당해 폴리펩타이드의 용도, 당해 폴리펩타이드를 함유하는 약제 및 당해 폴리펩타이드를 함유하는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

Claims (14)

  1. 폴리펩타이드 분자 중의 하나 이상의 하이드록실 그룹을 폴리알킬렌 글리콜로 개질시킨 화학적으로 개질된 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드 분자 중의 하이드록실 그룹이 세린 잔기-유도된 하이드록실 그룹인 화학적으로 개질된 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리펩타이드가 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 화학적으로 개질된 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 당해 서열에서 1개 이상의 아미노산이 소실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진, 화학적으로 개질된 폴리펩타이드.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜의 분자량이 500 내지 1,000,000인 화학적으로 개질된 폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서, 폴리알킬렌 글리콜로 이루어진 화학 개질제로 개질된 화학적으로 개질된 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, 화학 개질제가 화학식 I의 폴리알킬렌 글리콜인 화학적으로 개질된 폴리펩타이드.
    화학식 I
    R1-(M)n­X­R2
    상기식에서,
    R1은 알킬 그룹 또는 알카노일 그룹이고,
    M은 -OCH2CH2-, -OCH2CH2CH2- 또는 -(OCH2CH2)r­(OCH2CH2CH2)s­(여기서, r 및 s는 동일하거나 상이하며 가변적인 양의 정수이다)이며,
    n은 가변적인 양의 정수이고,
    X는 결합, O, NH 또는 S이며,
    R2는
    {여기서, R3는 OH, 할로겐 또는 -Xa-(Ma)na-R1a(여기서, Xa, Ma, R1a및 na는 각각 상기한 X, M, R1및 n과 동일하다)이고, Y는 할로겐 또는 -Z­(CH2)p­(O)m-W[여기서, Z는 O, S 또는 NH이고, W는 카복시 그룹 또는 이의 반응성 유도체 또는(여기서, R4는 알킬 그룹이고, Hal은 할로겐이다)이고, p는 0 내지 6의 정수이며, m은 0 또는 l이다]이다},
    -(CO)m-(CH2)t­W
    (여기서, t는 0 내지 6의 정수이고, m 및 W는 상기한 바와 동일하다),
    (여기서, Hala, pa 및 R4a는 각각 상기한 Hal, p 및 R4와 동일하다),
    (여기서, R3및 W는 상기한 바와 동일하다),
    (여기서, R3, t 및 W는 상기한 바와 동일하다),
    (여기서, W는 상기한 바와 동일하다),
    또는
    (여기서, R5는 아미노산으로부터 아미노 그룹 및 카복실 그룹을 제외한 잔기이며, W는 상기한 바와 동일하다)이다.
  8. 제6항에 있어서, 화학 개질제가 화학식 Ib의 폴리알킬렌 글리콜인 화학적으로 개질된 폴리펩타이드.
    화학식 Ib
    상기식에서,
    R1, M, R3, Z, n 및 p는 제7항에서 정의한 바와 동일하고,
    Wa는 카복시 그룹 또는 이의 반응성 유도체이다.
  9. 폴리펩타이드 분자 중의 하나 이상의 하이드록실 그룹을 폴리알킬렌 글리콜로 이루어진 화학 개질제와 반응시킴을 특징으로 하는, 화학적으로 개질된 폴리펩타이드의 제조방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 화학적으로 개질된 폴리펩타이드를 함유하는 약제.
  11. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 화학적으로 개질된 폴리펩타이드의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 과립구 또는 혈소판을 감소시키기 위한 치료방법.
  12. 과립구 또는 혈소판을 감소시키기 위한 환자의 치료에 효과적인 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 화학적으로 개질된 폴리펩타이드의 용도.
  13. 과립구 또는 혈소판을 감소시켜 환자를 치료하기 위한, 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 화학적으로 개질된 폴리펩타이드의 용도.
  14. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 화학적으로 개질된 폴리펩타이드의 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제학적으로 허용되는 투여형태로 함유하는, 과립구 또는 혈소판을 감소시키기 위한 환자 치료용 조성물.
KR1019997000988A 1997-06-06 1998-06-05 화학적으로 개질된 폴리펩타이드 KR100565022B1 (ko)

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