JPH02167230A - ポリペプチド系抗ウィルス剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、ポリペプチドを有効成分として含有する抗ウ
ィルス剤に関するちのである。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）本発明
者らは、リボ多１（以下ｒＬＰＳＪという、）に親和性
を示す新規物質を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、カ
ブトガニ血球から新規ポリペプチドを抽出・単離すると
ともに該ポリペプチドの固相合成法による合成に成功し
、更に、該ボッペプチドがＬＰＳに強い親和性を示すこ
とを見出し、昭和６３年８月１９日付けにてＰＣＴ／Ｊ
Ｐ８８１００８２３として国際出願を行っている。

本発明者らは、更に、本ポリペプチドの薬理活性につい
て鋭意研究を重ねた結果、本ボリベブチドが抗ウィルス
作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った
。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段） 本発明は、 次式（Ｉ）　　二 Ａｒｇ　　−Ｇｌｙ ／　　　　　　　＼ Ｔｙｒ　　　　　　　　　　Ｉ　ｌ　ｅ＼　　　　　　
　／ Ｃｙｓ　　−Ｃｙｓ　　　　　　　　（１）／　　　　
　　　＼ Ｖａｌ　　　　　　　　　　Ｔｙｒ Ａｒｇ　　　　　　　　　　Ａｒｇ Ｐｈｅ　　　　　　　　　Ａｒｇ ＼　　　　　　　／ Ｈ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ　　−Ｃｙｓ−Ａｒｇ　　
−Ｘ（式中、Ｌｙｓはリジンを、Ｔｒｐはトリプトファ
ンを、Ｃｙｓはシスティンを、Ｐｈｅはフェニルアラニ
ンを、Ａｒｇはアルギニンを、Ｖａｌはバリンを、’Ｔ
ｙｒはチロシンを、　Ｇｌｙはグリシンを、１１ｅはイ
ソロイシンを表し：Ｘは水酸基又はアミノ基を表す。） で示されるポリペプチド又はその類縁体を有効成分とし
て含有することを特徴とする抗ウィルス剤に関するもの
である。

本発明に用いる化合物は、アミノ酸１７個からなるポリ
ペプチドであり、抽出・単離された状態ではＣ末端アミ
ノ酸であるアルギニンのカルボキシル基はアミド化され
ているが、加水分解により酸となっても、抗ウィルス作
用には特に影響は生じない。

本発明に用いるポリペプチドは、例えば、以下のように
してカブトガニ血球（ｎ並社旦朋ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕ
ｓ及びＴａｃｈ　　１ｅｕｓ　　ｉ　ａｓ　）から抽出
・単離することができる。

即ち、カブトガニ血球を低張抽出し、残渣として得られ
る不溶性画分を酸性条件下、例えば希塩酸、希硝酸、希
硫酸等の鉱酸の希酸：酢酸等の低級脂肪酸の存在による
強酸性条件下で抽出して、得られた抽出液を常法、例え
ばゲルろ過、クロマトグラフィー等の精製手段により精
製することにより、単離することができる。

本発明に用いるポリペプチドは、固相合成法によっても
製造することができる。

即ち、Ｎ−保護アルギニンを、場合によりカルボキシル
基と結合しつる官能基とカルボキシル基とを有するスペ
ーサーを介して、アミノ基を有する不溶性樹脂に結合さ
せた後、 次式。

Ｈ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ
−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−
Ｔｙｒ−５−ｌ１ｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒ式中の記号
は前記と同義である。） で示されるポリペプチドの１６位から１位までの保護ア
ミノ酸を固相合成法に従って順次結合し、次いで、該不
溶性樹脂及びアミノ酸の保護基を脱離させて、 次式（ＩＩ）： Ｈ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ
−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ一１ｉｅ−Ｃｙｓ−
Ｔｙｒ５−１ｉｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒ　−Ｎ　Ｈ２
Ｃ式中の記号は前記と同義である。） で示されるポリペプチドを得、その３位と１６位、及び
７位と１２位のシスティンをそれぞれのメルカプト基を
介して結合させ、ジスルフィド結合を形成させることに
より製造することができる。

前述のアミン基を有する不溶性樹脂としては、そのアミ
ノ基を介してＮ−保護アルギニンのカルボキシル基又は
場合によりこれに結合しているスペーサーのカルボキシ
ル基と結合可能であり、かつ、その後脱離可能なもので
あれば如何なるものでちよい。

かかる不溶性樹脂としては、例えば、アミノメチル樹脂
（アミノメチル−ポリ（スチレン−旦旦−ジビニルベン
ゼン）、ベンズヒドリルアミン樹脂、メチルベンズヒド
リルアミン樹脂、４−（アミノメチル）フェノキシメチ
ル樹脂等が挙げられる。ベンズヒドリルアミン樹脂、メ
チルベンズヒドリルアミン樹脂、４−（アミノメチル）
フェノキシメチル樹脂を用いれば開裂によって直接アミ
ドを与えるが、収率の点からはアミノメチル樹脂が好ま
しい。

前述の場合により存在するカルボキシル基と結合しうる
官能基とカルボキシル基とを有するスペーサーとしては
、例えばアルギニンのカルボキシル基をｐ−カルボキシ
メチルベンジルエステルに変換しつるものが挙げられる
が特に制限はない。

かかるスペーサーと保護アルギニンとが結合した４−（
ｔ−ブトキシカルボニル−旦−トシル−Ｌ−アルギニル
オキシメチル）フェニル酢酸はＪ、Ｐ、　Ｔａｍら（５
ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（１９７９）　ｐ、９５５−９５７
）の方法により調製することができる。

保護アミノ酸とは、官能基を公知の方法により保護基で
保護したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が市販さ
れている０本発明のポリペプチドを合成する場合には、
以下に示す保護基のいずれかを選択するのが好ましい、
まず、アミノ酸のα−アミノ基の保護基はＢｏｃ（ｔ−
ブチルオキシカルボニル）又はＦｍｏｃ（９−フルオレ
ニルメチルオキシカルボニル）である、　Ａｒｇのグア
ニジノ基の保護基は、Ｔｏｓ　（トシル）、ＮＯ，（ニ
トロ）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−）−リメ
チルベンゼンスルホニル）である、　Ｃｙｓのメルカプ
ト基の保護基としてはＢｚｌ　（ベンジル）、Ｍ−Ｂｚ
ｌ　（４−メトキシベンジル）、　４−ＭｅＢｚｌ　（
４−メチルベンジル）、Ａｃｍ　（アセトアミドメチル
）、Ｔｒｔ（トリチル）　、　Ｎｐｙｓ　（３−ニトロ
ピリジンスルフェニル）　、　ｔ−Ｂｕ　（ｔ−ブチル
）、ｔ−ＢｕＳ　（ｔ　−ブチルメルカプト）が挙げら
れるが、４−ＭｅＢｚｌ。

Ａｃｍ、　Ｎｐ’／ｓが好ましい、　Ｔｙｒの水酸基の
保護基は、Ｂｚｌ、　　Ｃ１ｚ−Ｂｚｌ　（２、６−ジ
クロロベンジル）　、　ｔ−Ｂｕであるか、あるいは保
護しなくてもよい、　Ｌｙｓのε−アミン基の保護基は
、２（ベンジルオキシカルボニル）、Ｃ１・Ｚ（２−ク
ロロベンジルオキシカルボニル）　、　Ｂｏｃ　、　Ｎ
ｐｙｓである。各保護基は、ペプチドの合成条件に応じ
適切なちのを選択する必要がある。

保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例えば、　ＤＣ
Ｇ　（ジシクロへキシルカルボジイミド）法、活性エス
テル法、混合あるいは対称酸無水物法、カルボニルジイ
ミダゾール法、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール）法、ジフェニルホスホリルアジド法等
に従って行なうことができるが、ＤＣＣ法、ＤＣＣ−Ｈ
ＯＢｔ法、対称酸無水物法が好ましい、これらの縮合反
応は、通常、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド等
の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行なわれる。α−
アミノ基の保護基の脱離試薬としては、トリフルオロ酢
酸／ジクロロメタン、　ＨＣＩ／ジオキサン、ピペリジ
ン／ジメチルホルムアミド等が用いられ、該保護基の種
類により適宜選択する。また、合成の各段階における縮
合反応の進行の程度はＥ、カイザーらの方法［Ａｎａｌ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　３４．５９５（１９７０）］
にンヒドリン反応法）によって検査される。

以上のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ペ
プチド樹脂を得ることができる。

不溶性樹脂としてアミノメチル樹脂を用いた場合には、
例えば適当な溶媒中においてアンモニアで処理すること
により該樹脂を脱離させることができる６次いで、フッ
化水素で処理することにより、前記式（ＩＩ）で示され
る、全ての保護基が脱離したポリペプチドが得られる。

不溶性樹脂としてベンズヒドリルアミン樹脂、メチルベ
ンズヒトノルアミン樹脂、４−（アミノメチル）フェノ
キシメチル樹脂を用いた場合には、フッ化水素で処理す
ることにより、該樹脂及び保護基を同時に脱離させるこ
とができる。

次いで、好ましくは、２−メルカプトエタノール等で還
元することによりシスティンのメルカプト基が還元型と
なっていることを確実ならしめた後、酸化処理すること
により目的とする環状ポリペプチド（Ｉ）をアミドとし
て得ることができる。

この際の酸化処理は、公知の方法を用いることができ、
通常、大気中の酸素やフェリシアン酸塩（例えば、フェ
リシアン化カリウム）のような酸化剤を用いる。

かくして得られたポリペプチドは、ポリペプチドの常套
的手段、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフィ
ー（ゲルろ過、イオン交換、分配、吸着、逆相）、電気
泳動、向流分配等により単離精製することができるが、
逆相高速液体クロマトグラフィーによる方法が最も効果
的である。

このようにして得られる前記式ＣＩ）で示されるポリペ
プチドは、水痘性口内炎ウィルスｆＶｅｓｉｃｕｌａｒ
　Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）、インフルエン
ザウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（ｈｕｍａｎｉｍｍ
ｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ：　ＨＩ　Ｖ
）等の種々のウィルスに対し、不活化作用を示し、抗ウ
ィルス剤として広く適用することができる。

（発明の実施例） 以下、調製例及び実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、これらは本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。

調製例Ｉ Ａ、ポリペプチドの抽出・精製 カブトガニ（ｎ化社ハ朋ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）血球
約５０ｇに２０ｍＭ）リス塩酸／　５０　ｍ　Ｍ塩化ナ
トリウム／ｐＨ８，０緩衝液１５０ｍ１を加え、高速ホ
モゲナイザ−（ヒスコトロン■：日本精密工業（（２）
製）で３分間ホモゲナイズした後、遠心（８０００ｒ　
ｐｍ、　３０分間、４℃）にまり上清と沈澱物に分画し
た。沈澱画分について、前記操作を２回繰り返し、血球
内の可溶性成分を充分に抽出した後、不溶性画分（沈澱
物）を得た。

不溶性画分に２０ｍＭ塩酸１５０ｍ１を加え、高速ボモ
ゲナイザーで３分間ホモゲナイズし、遠心後、塩酸抽出
液の上清を得た。この操作を計３回繰り返し、全量的４
００ｍ１の抽出液を得た。この上清画分を凍結乾燥によ
り濃縮乾固した。

濃縮乾固した塩酸抽出物は２０ｍＭ塩酸で再溶解した後
、セファデックスＧ−５０（３，０Ｘ９０、Ｏｃｍ）カ
ラム（２０ｍＭ塩酸で予め平衡化）に添加してゲルろ過
を行った。ＬＰＳ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１１１　Ｂ：４
株由来のちのを使用）によるＣ因子（カブトガニ血液磨
固セ１リンプロテアーゼ前駆体：本発明者らが名付けた
ＬＰＳ感受性因子、　　Ｎａｋａｍｕｒａ、　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

１５４、５１１（１９８６１）の活性化を阻害する溶出
画分を集め、プールした画分のｐＨを水酸化ナトリウム
水溶液で６．０に合わせた。

サンプルを予め２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平
衡化したＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムにかけ、
溶出を０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ６，０）のグラジェントで行った。Ｃ因子
活性化阻害画分を集め、ＬＰＳ結合物質の最終精製標品
（本発明に用いるポリペプチド）とした、収量は、血球
約５０ｇから約３０ｍｇであった。

Ｂ、純度検定 （１）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法ＬＰＳ
結合ポリペプチドを還元剤（β−メルカプトエタノール
）の不存在下又は存在下に、８Ｍ尿素を含む１２％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（Ｗｅｂｅｒ−Ｏｓｂｏｒ
ｎ系）を行い、クーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏ
ｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）　Ｒ−
２５０で染色したところ、共に分子盟約２０００の単一
バンドを示した。結果を第１図に示す。第１図において
、左側のバンドは、還元剤の不存在下におけるバンドを
、中央のバンドは、還元剤の存在下におけるバンドを、
右側のバンドは、標準蛋白質（ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ　Ｍ
ａｒｋｅｒ　ＩＩｌ、　Ｆｌｕｋａ　ＡＧ　（スイス）
］によるミオグロビン（１６，９ｋＤａ）、ミオグロビ
ンＩ＋Ｈ（１４，４ｋＤａ）、　ミオグロビンＩ　　（
８，２ｋＤａ）、　ミオグロビンＩＩ（６，２ｋＤａ）
、　　ミオグロビンＩＩＩ（２，５ｋＤａ）のバンドを
示す。

（２）逆相高速液体クロマトグラフィー本発明に用いる
ポリペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィ＝（カラ
ムはＣｏｓｍｏｓｉｌ　５Ｃ＋ａＰ、ペプチドの溶出は
Ｏ，Ｌ％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルＯ〜９８％
のグラジェント系を使用）で分析したところ、単一ピー
クを示した。

Ｃ、アミノ酸組成値 サンプルを１１０’Ｃで２４．４８．７２時間５．７Ｍ
塩酸で加水分解した後、日立８３５自動アミノ酸分析計
で分析した。半シスチンについては、サンプルを過ギ酸
酸化後、１１０℃で２４時間５．７Ｍ塩酸で加水分解し
、またトリプトファンについては、サンプルを３Ｍメル
カブトエタンスルホン酸で１１０’ｃで２４時間加水分
解した後、それぞれアミノ酸分析計で分析した。ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で得た分子量から、
このペプチドは１７個のアミノ酸から構成される単純塩
基性ポリペプチドであることが判明した。アミノ酸分析
の結果を表１に示す。

表　　１ Ｄ、アミノ酸配列の決定とＣ末端アルギニンアミドの同
定 アミノ酸配列は、インタクトな標品約２３μｇを用い、
アミン末端よりベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ１８９０Ｄ
シークエンサーを用いて、１５残基（半シスチンを除く
）まで同定できた。また、還元アルキル化したサンプル
（本発明に用いるポリペプチドをＭ、　Ａ、　　Ｈｅｒ
ｍｏｄｓｏｎ、　　ｅｔ　ａｌ。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ。

１２、３１４６（１９７３１（７）方法によりＳ−ピリ
ジルエチル化したもの）約３６μｇを用い、１６残基（
半シスチンを含めて）まで同定できた。残る１７７番目
アミノ酸残基（Ｃ末端残基）はアミノ酸分析値よりアル
ギニンであると推定できた。しかし、Ｃ末端アルギニン
は、インタクトな標品、ピリジルエチル化した標品を用
い、カルボキシペプチダーゼ（以下ｒｃＰａｓｅＪとい
う）Ｙ及びＢで消化しても全く検出できなかった。そこ
で、−旦、サンプルを３０ｍＭ塩酸で１１０℃で１０時
間緩和な条件で加水分解した後、再度（、Ｐａ５ｅＢで
処理した。その結果、本発明のポリペプチド１モル当り
アルギニン約０．５モルの遊離が認められ、Ｃ末端アル
ギニンのカルボキシル基は、アミド化されている可能性
が強いものと判断した。このアミド化合物の理論分子量
（計算値ＭＷ＝２２６４）と質量分析による実測値とが
完全に一致したことにより、Ｃ末端アルギニンのカルボ
キシル基はアミド化されていることが確認された。

Ｅ、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合の同定本発明に用いる
ポリペプチド内に４個の半シスチンが同定されたが、こ
れらは全てジスルフィド結合していることが、還元剤（
ジチオスライトール）の存在下又は不存在下におけるＳ
−ピリジルエチル化の比較実験より明らかになった。そ
こで、ジスルフィド結合の位置を同定するため、インタ
クトな標品をジスルフィド結合の交換反応が起こらない
条件下（酸性条件下、ｐＨ６，５）でトリプシン消化を
行い、消化物を前述の逆相高速液体クロマトグラフィー
（カラムはＣｏｓｍｏｓｉ１５Ｃ，、Ｐ　、ペプチドの
溶出は０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル系を
使用）にて分゛離した。

得られたペプチドのアミノ酸組成を調べたところ、アミ
ン末端から３番目と１６番目、７番目と１２番目がジス
ルフィド結合していることが判明した。

Ｆ、ポリペプチドのＬＰＳ結合活性 本発明に用いるポリペプチドは、０．１μｇ／Ｄｌｌの
Ｌ　Ｐ　Ｓ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１１１　Ｂ：４株由
来の６のを使用）によるＣ因子の活性化（「Ｃ因子」と
表す）を０．０５ｕＭ　（０，１２ｕｇ／ｍｌ）で５０
％、ｌ　ＢＭ　（２，３ＬＬｇ／ｍｌ）で完全に阻害し
た。また、本発明に用いるポリペプチドは、１％アガロ
ースゲルを用いた二重拡散テストにおいて、ＬＰＳと高
分子複合体を形成し、沈降線を形成することが観察され
た。

ＬＰＳによるＣ因子の活性化に対する本発明に用いるポ
リペプチドの阻害効果についての試験結果を第２図及び
第３図に示す、第２図及び第３図は、それぞれ塩化ナト
リウム不存在下及び存在下（１Ｍ）における結果を示す
。対照として、本発明者らにより始めて明らかになった
ＬＰＳと電気的に結合する性質を示す高分子量塩基性物
質、ポリリジンを用いた６第２図及び第３図において、
（○）印及び（・）印は、それぞれ本発明に用いるポリ
ペプチド及びポリリジンの結果を表す。

これらの結果より、本発明に用いるポリペプチドは、Ｌ
ＰＳと単なる電気的な結合ではなく、塩濃度に影響を受
けない強い親和性を有することが判る。

Ｇ、吸光度の測定 本発明に用いるポリペプチド９９．２μｇ／ｍｌ水溶液
の紫外部吸収スペクトルを第４図に示す。

２７６ｎｍに吸収ピークをもつ。２８０ｎｍにおける吸
光度は０．３８４２であるので、１％水溶液の２８０ｎ
ｍにおける吸光度は、３８．７と算出される。

調製例２ Ａ、アミノメチル樹脂へのアルギニンの導入（１）４−
　（ブロモメチル）フェニル酢酸フェナシルエステルの
合成 室温下、アセトニトリル７５ｍ１中にα−ブロモアセト
フェノン３．　９８　ｇ　（２Ｏｍｍｏｌ）及びフッ化
カリウム３．４９ｇ　（６０ｍｍｏｌ）を態濁させ、撹
拌下、４−（ブロモメチル）フェニル酢酸４、５８ｇ　
（２０ｍｍｏｌ）を６等分し３０分間隔で添加し、２時
間撹拌を継続した。反応終了後、不溶物をろ別し、ろ液
から溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルに再溶解し、飽和
炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、蒸留水、クエン酸、
蒸留水で各１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。酢
酸エチルを留去し、石油エーテルから結晶化し、５．５
ｇの目的物（融点８４〜８５℃）を得た。これを再結晶
して融点８５〜８６℃の結晶５．２ｇ（収率７５％）を
得た。

（２）４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ
−アルギニルオキシメチル）フェニル酢酸の合成 ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−１−シルーＬ−アルギニ
ン４．７１　ｇ　（１１ｍｍｏｌ）　、　４−　（ブロ
モメチル）フェニル酢酸フェナシルエステル３．４７　
ｇ　（１Ｏｍｍｏｌ）　、フッ化カリウム１．２８ｇ（
２２ｍｍｏｌ）　、水０　、　８ｍｌ　（４４＋ｏｎ＋
ｏｌ）　、アセトニトリル５０＋ｎｌ及びジメチルホル
ムアミドｌｏｍｌの混合物を室温下２４時間激しく撹拌
した。生成する不溶物を自然ろ過し、ろ液をエバボレー
トにより１５〜２０ｍ１まで濃縮した。酢酸エチル８０
ｍ１を添加した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２
回、蒸留水で１回、飽和クエン酸水溶液で２回、蒸留水
で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去
し、残渣を石油エーテルで処理して、半固形状の４−（
ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ−アルギニル
オキシメチル）フェニル酢酸フェナシルエステルを得た
。

これを酢酸１０５ｍ１に溶解し、水１９ｍ１及び亜１９
１３．１ｇを加え、室温下５．５時間激しく撹拌した。

亜鉛をハイフロス−パーセル及び酢酸エチルを用いてろ
別し、ろ液に酢酸エチル４００ｍ１及び水３００ｍ１を
加え、酢酸エチル層を分離し、１０回水洗し、硫酸ナト
リウムで乾燥後、溶媒を留去し、残渣を石油エーテル中
で摩細し、４−（ｔ−ブトキシカルボニル−旦−トシル
−Ｌ−アルギニルオキシメチル）フェニル酢酸４．７７
ｇを得た。本物質は薄層クロマトグラフィーによりｌス
ポットのほぼ純品として得られた。

（３）４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ
−アルギニルオキシメチル）フェニルアセトアミドメチ
ル樹脂の合成 ４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−１−シルーＬ−ア
ルギニルオキシメチル）フェニル酢酸５７７ｍｇ　（Ｌ
、Ｏｍｍｏｌ）、アミノメチル樹脂（株式会社ペプチド
研究所販売、１％架橋）２、ｏｏｇ及びＤＣＣ２０６ｍ
ｇ　（１，Ｏｍｍｏｌ）をジクロロメタン中で常法によ
りカップリングさせ、樹１指１ｇ当り０．２８４ｍｍｏ
ｌのカップリングが確認された。

８．１６位システィンの導入 ４−（ｔ−ブトキシカルボニル−旦−トシル−Ｌ−アル
ギニルオキシメチル）フェニルアセトアミドメチル樹脂
１．０ｇ　（０，２８４ｍｍｏｌＡｒｇ　（Ｔｏｓ）　
／ｇ　ｔｉ４脂）をジクロロメタン２５ｍ１で４回、各
１分洗浄し、ろ過した。この樹脂に３０％トリプルオロ
酢酸溶液（溶媒ニジクロロメタン）２５ｍｌを添加し、
３０分撹拌し、Ｂｏｃ基を脱離させた。得られた樹脂を
下記の溶媒各２５ｍ１で順次処理し、各々の処理後にろ
過した。

ジクロロメタン　（１回、１分） ジオキサン　　　（１回、１分） ジクロロメタン　（１回、１分） ジオキサン　　　（１回、１分） ジクロロメタン　（２回、各２分） １０％トリエチルアミン（ジクロロメタン溶液）　　（
１回、２分）、（１回、５分）ジクロロメタン　（４回
、各１分） 次いで、前記樹脂をジクロロメタン２５ｍ１゜及び総ア
ルギニン量に対して３．５当量の保護アミノ酸、即ち、
Ｂｏｃ−Ｃｙｓｆ４−ＭｅＢｚｌ）　３１０　ｍｇ（０
，９９４ｍｍｏｌ）とともに１分撹拌した。

ＤＣＣ２０５ｍｇ（０，９９４ｍｍｏｌ）のジクロロメ
タン溶液２５ｍ１を加え、２時間撹拌した。得られた樹
脂を下記の溶媒釜２５ｍ１で順次処理し、各々の処理後
にろ過した。

ジクロロメタン　　（１回、１分） イソプロパツール　（１回、１分） ジクロロメタン　　（１回、１分） イソプロパツール　（１回、１分） ジクロロメタン　　（３回、各１分） Ｃ０１５〜１位のアミノ酸の導入 Ｂと同様にして、先に得られた樹脂に、前記式（ＩＩ　
）で示されるポリペプチドの１５位から１位までの各構
成アミノ酸に対応する保護アミノ酸を順次カップリング
した０表２に各反応段階で用いた保護アミノ酸を示す、
保護アミノ酸の使用量は全て総アルギニン量に対して３
．５当量である。

なお、Ｂｏｃ−Ａｒｇ　（ＴｏｓｌのカップリングはＤ
ＣＣ−ＨＯＢｔ；法によりＤＣＣに対しＨＯＢｔを２倍
モル使用で行った。

表２ １位アミノ酸の導入後、樹脂ペプチドをジクロロメタン
を用いてグラスフィルターに回収し、減圧乾燥して、乾
燥樹脂ペプチド１．７８１ｇを得た。

Ｄ、樹脂の脱離 Ｃで得られた乾燥樹脂ペプチドをメタノール及びジメチ
ルホルムアミド中においてアンモニア（無水）で処理す
ることにより樹脂を脱離させて、 次式； ％式％ で示される保護ポリペプチド０．７６５ｇ（０、１９６
ｍｍｏｌ）を得た。

分子量＋　　３９０４ Ｅ、保護基の脱離 りで得られた保護ポリペプチドをアニソール中において
エタンジチオールの存在下フッ化水素で処理し、次いで
塩酸で処理することにより、次式・ Ｈ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ
−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−
Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ　−Ｎ　ＨＫ
−７８Ｃ１で示されるポリペプチド塩酸塩４７０＋ｎｇ
（０，１８６ｍｍｏｌ）を得た。

分子量＋　　２５２３ Ｆ、ポリペプチドの環化 Ｅで得られたポリペプチド塩酸塩３０ｍｇを、２００倍
モル過剰の２−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，５）中において一夜室温
で放置した。次いで、１％酢酸で平衡化したセファデッ
クスＧ−１０カラムで処理してポリペプチド含有画分を
得た。水で１０倍に希釈しく○、１ｍｇ／ｍｌ　）　、
０．５ＭＮａＯＨでｐＨを８．５に調整し、室温で３０
時間放置した後、凍結乾燥した。次いで、１％酢酸で平
衡化したセファデックスＧ−１０カラムで処理して酸化
型ポリペプチド８．５１１Ｉｇを得た。

これを逆相高速液体クロマトグラフィー（カラムはＴＳ
Ｋ−ゲル　０ＤＳ−１２０Ｔ　（０，４６ｘ２５ｃｍ）
、ペプチドの溶出は０．０１Ｍギ酸−トリエチルアミン
（ｐｉ（４，５）（Ａ）−Ａ２０％含有アセトニトリル
（Ｂ）を使用）で分析したところ、調製例１で得られた
天然のポリペプチドのピークと一致し、更に両者を混合
したものは該ピークが２倍になり、両者は同一物と認め
られた。

実施例　ｌ 水痘性口内炎ウィルス及びインフルエンザウィルスに対
する抗ウィルス作用 １、材料及び方法 （１）ウィルス及び使用細胞 水痘性口内炎ウィルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　Ｓｔｏｍ
ａｔｉｔｉｓＶｉｒｕｓｌ　（Ｎｅｍ　Ｊｅｒｓｅｙ株
）（以下ｒＶＳＶＪという、）は、サル腎由来のＶｅｒ
ｏ細胞で増殖させた。インフルエンザウィルス（Ａ／Ｙ
ａｍａｇａｔａ／１２０／８６、ＨＩＮＩ）は、イヌ腎
由来のＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ　ｃａｎｉｎｅｋｉｄｎ
ｅｙ細胞で増殖させた後、培養液中のトリプシン（１０
μｇ／ｍｌ）を除去するために２回超遠心（２４，ＯＯ
Ｏｒｐｍ、９０分）して洗浄し使用した。

（２）ポリペプチドとウィルスとの反応リン酸緩衝液（
以下ｒＰＢＳＪという、）で希釈した一定濃度の調製例
１で得られたポリペプチド（以下ｒＬＢＰＪという、）
（２０！ＬＬ）とウィルス液（２０μｌ）とを混合し、
３７℃、５％Ｃ○２聯卵機にて６０分又は１２０分反応
させた後、ウィルスを定量した。対照としてＬＢＰの代
わりにＰＢＳを使用した。ＬＢＰとトリプシンとの反応
ではそれぞれ最終濃度が１２５μｇ／ｍ１．　　ｌ　Ｏ
ＬＬ　ｇ　／ｍｌとなるように調整した。

（３）ウィルスの定量 ＬＢＰとウィルスを反応させた後のウィルスの定量は、
混合液を最少必須培地（ｍｉｎｉｍｕｒａｅｓｓｅｎｔ
ｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）　　（以下ｒＭＥＭＪという。

）でｌＯ段階希釈した後、５０％ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌ
ｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉｖｅ　ｄｏｓｅ　（以下ｒ　Ｔ
　ＣＩ　Ｄ　ｓｏＪという、）又はプラーク形成単位（
ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）（以下ｒＰＦ
ＵＪという、）にて測定した。

まず、ＴＣＩＤ６．法では１０段階希釈したウィルス液
の０．１ｍｌずつを、予め９６穴マイクロプレートに培
養していた単層細胞の４穴に接種して、２〜３日培養し
た後、細胞変性効果（ＣＰＥ）の有無を顕微鏡下にて調
べ、Ｒｅｅｄ　＆１１Ｉｕｅｎｃｈの方法にて計算した
。ＰＦＬＪ法では直径６０ｍｍのプラスチックシャーレ
の単層培養した細胞に１０段階希釈したウィルス液を０
．１ｍｌ接種し、ウィルスを細胞に吸着させるために３
７℃、Ｃｏ　、卿卵機にて６０分静置し、０．６％寒天
を含んだＭＥＭ培地培地５奢ｌ胞に重層した後、３７°
ｃ、ｃ○２卿卵機にて培養した。プラーク数の計算はウ
ィルスの種類によってｌ〜３日培養後に行った。インフ
ルエンザウィルス定量の赤血球凝集素（Ｈｅｍａｇｇｌ
ｕｔｉｎｉｎｌ　　（以下ｒＨＡＪという、）の測定は
、ウィルス−ＬＢＰ反応液を２段階希釈し、その５０μ
ｌと０．５％ニワトリ赤血球の５０μｌを９６穴Ｕ型マ
イクロプレートに入れ、混合した後、４°Ｃ１６０分の
後、最高希釈倍数の凝集によりウィルス数を調べた。

２、結果 （１）高濃度ｖＳｖの不活化 ＶＳＶ約２Ｘ　１０’　ＰＦＵｌｏ、１ｍｌのもの１５
ｕｌとＬ　Ｂ　Ｐ　（０〜２５０　ｕ　ｇ／ｍｌ）　１
５μｌを３７℃、６０分保温後、１０−２〜１０−’ま
で段階希釈し、その０．１ｍｌをＶｅｒｏ細胞に接種し
、４田園にＴＣＩ　Ｄａ。、ＰＦＵを測定した結果を第
５図に示す。

第５図から、ＬＢＰは濃度依存的にｖＳｖを不活化する
ことがわかる。

（２）表３に本発明の抗ウィルス剤のＶＳｖ及びインフ
ルエンザウィルスに対する効果を検討した結果を示す。

表３から、ＬＢＰはＶＳｖ及びインフルエンザウィルス
を不活化することがわかる。

表３ 実施例　２ ヒト免疫不全ウィルス（Ｆ（Ｉ　Ｖ）に対する抗ウィル
ス作用 １、材料及び方法 （Ｌ）ウィルス及び使用細胞 Ｔ細胞株で継代培養されているＨＩＶ株としてＬＡＶ株
（大阪府立公衆衛生研究所）を用い、ＬＡＶ株に持続感
染しているＴＡＬＬ−１／ＬＡＶあルイはＭＯＬＴ−４
／ＬＡＶ細胞が培養液中に産生ずるウィルスを原液とし
て使用した。

尚、株化されたＴ細胞系は、成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕ
ｌｔ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ、　ＡＴＬ）の
原因ウィルスである。ＨＴＬＶ−１に持続感染している
ＭＴ−４細胞の他に、Ｔ細胞性の白血病細胞由来の細胞
株であるＴＡＬＬ−１，ＭＯＬＴ−４細胞とそれぞれの
ＨＩＶ持続感染細胞である１’　Ａ　Ｌ　Ｌ　−１／Ｈ
ＩＶ、ＭＯＬＴ−４／）ＩＩＶ及びＭＯＬＴ−４／　Ｈ
Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩを用いた。それら細胞は、１０％
の牛胎児血清（Ｆｅ２）とペニシリン（１００ｕ／ｍｌ
）とストレプトマイシン（１００Ｊ、Ｉｇ／ｍｌ）を含
むＲＰＭＩ−１６４０培養液（Ｆｌｏｗ社、英国）を用
いて５％の炭酸ガスの存在下３７℃で培養した。

（２）ＨＩＶ増殖抑制効果 本ペプチドのＨＩＶに対する増殖抑制作用を次の（イ）
原理に基づき（ロ）の方法に従い実施判定した。

（イ）原理 ヒトＴ細胞白血病の原因ウィルスであるＨＴＬＶ−１（
ＡＴＬＶ）が持続感染シテイルＴ細胞株であるＭＴ−４
細胞に、ＨＩＶを感染させると急速にＨＩＶが増殖し、
ＭＴ−４細胞は細胞障害の為に５〜６日で死滅すること
が知られている。従って、ＭＴ−４細胞の細胞障害をマ
ーカーとして薬剤の抗１（Ｉ　Ｖ効果を判定することが
出来る。

（ロ）方法 ＭＴ−４細胞にＨＩＶｆＬＡＶ株）をｏ、ｏｏｌＴ　Ｃ
Ｉ　Ｄ　ｓｏ／　ｃｅｌｌとなるように３７℃で１時間
感染させた後洗浄し、種々の濃度の薬剤（調製例２で得
られた本発明のポリペプチドをＲＰＭＩ−１６４０培養
液に無菌的に溶解準備した）を含むＲＰＭＩ−１６４０
メジウム（牛胎児血清を１０％含む）にｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏ
’　ｃｅｌｌ／　ｍｌ濃度で浮遊させた。この細胞浮遊
液を２４穴のカルチャープレートに１ｍ１／ウェル量入
れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で５日間培養した。また
ＨＩＶ非感染ＭＴ−４細胞も同様に薬剤と共に培養した
。培養後、ウィルス増殖による細胞障害効果（ＣＰＥ）
の観察を行ない、ＭＴ−４細胞の生存数をトリパンブル
ー染色法によりカウントした。

検体のＨＩＶ増殖抑制作用は下の式から算出される細胞
障害抑制率（％）を指標として評価した。

細胞障害抑制率（％） （３）巨細胞形成抑制効果 本ペプチドの巨細胞形成抑制作用を次の（イ）原理に基
づき（ロ）の方法に従い実施し、その抗ＨＩＶ作用を判
定した。

（イ）原理 ＭＯＬＴ−４細胞とＨＩＶに持続感染しているＭＯＬＴ
−４／ＨＩＶ細胞を混合すると１〜２日間で巨細胞が形
成される。この現象は、ＭＯＬＴ−４細胞表面のＣＤ４
レセプターとＭＯＬＴ−４／ＨＩＶ細胞表面に発現され
ているＨＩＶのエンベロープ蛋白であるａｐ１２０が結
合して起こるものと考えられている。この実験では薬剤
がＨＩＶとＣＤ４分子の結合（ＨＩＶのリンパ球への吸
着）を抑制する効果を見ることができる。

（ロ）方法 ＭＯＬＴ−４細胞とＨＩＶに持続感染しているＭ　ＯＬ
　Ｔ　−４／　ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩ細胞を種々ノ濃
度の薬剤（調製例２で得られた本発明のポリペプチドを
ＲＰＭＩ−１６４０培養液に無菌的に溶解準備し゛た）
を含むＲＰＭＩ−１６４０メジウム（牛胎児血清を１０
％含む）中で１＝１の割合で混合しく細胞濃度は５　Ｘ
　ｌ　Ｏ’　ｃｅｌｌ／ｍｌ）　、　２４大のカルチャ
ープレートにウェルに１ｍｌづつ入れ２４時間培養した
。培養後鏡検にて巨細胞形成の有無を観察した。

２　結果 （１）本化合物のＨＩＶ増殖抑制作用 本化合物の各濃度における細胞障害抑制率を表４に示す
。

表４ る。

［発明の効果］ 本発明によれば、新規なポリペプチド系抗ウィルス剤を
提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＬＢＰのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動の結果を示す図である。第２図及び第３図は、ＬＰ
ＳによるＣ因子の活性化に対するＬＢＰの阻害効果につ
いての試験結果を示す図である。第４図は、ＬＢＰの紫
外部吸収スペクトルである。第５図は、ＬＢＰによるｖ
ＳＶの不活化を示す図である。 表４から判るとおり、本化合物は７．５μｇ／ｍｌ〜１
５μｇ／ｍｌ濃度で８０％以上の細胞障害抑制率を示し
、ＨＩＶの増殖を強く抑制した。 （２）本化合物の巨細胞形成抑制作用 本化合物は７．５μｇ／ｍ１以上の濃度で巨細胞形成を
１００％抑制し、ＨＩＶのリンパ球への吸着（結合）を
抑制する効果を持つことが示唆され第 図 Ｃ因子活１生 （Ａ４６５１５分） Ｃ因イＬ’ｉ　ｌ′ｌ：（Ａ　４　ｏ　５　／　５分）
波長 （ｎｍ） 第 ＩＭ！

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｌｙｓはリジンを、Ｔｒｐはトリプトファンを
   、Ｃｙｓはシステインを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを
   、Ａｒｇはアルギニンを、Ｖａｌはバリンを、Ｔｙｒは
   チロシンを、Ｇｌｙはグリシンを、Ｉｌｅはイソロイシ
   ンを表し：Ｘは水酸基又はアミノ基を表す。） で示されるポリペプチドを有効成分として含有すること
   を特徴とする抗ウィルス剤。