CN117700497A - 抗病毒肽氰病毒素n的化学合成、其类似物以及应用 - Google Patents
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Abstract
一种肽，其含有、或组成为SEQ ID No.2‑SEQ ID No.114的任意一个序列或更多个序列；与CVN相比，本发明杀病毒肽具有许多突变体，这有助于对这种新型抗病毒肽的结构‑功能关系的研究，由于其在对抗各种病毒感染方面的许多潜在用途，这些杀病毒肽在医疗和制药领域能够提供更实际的用途，例如更好的杀病毒的活性和/或更小的毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及抗病毒蛋白或其药物可接受的盐，以及他们的配合物，包含它的组合物，以及使用和获得它们的方法，尤其涉及如抗病毒治疗和预防的临床应用。
背景技术
获得性免疫缺陷综合症(艾滋病，AIDS)是一种致命的疾病，在过去二十年中报告的病例数量急剧增加。引起艾滋病的病毒于1983年被首次发现。它有几个名字和多种缩写。它是已知的第三种嗜T淋巴病毒(HTLV-III)，它有能力在免疫系统的细胞内复制，造成严重的细胞破坏。艾滋病病毒是一种逆转录病毒，即一种在复制过程中使用逆转录酶的病毒。这种特殊的逆转录病毒也被称为淋巴结病相关病毒(LAV)、艾滋病相关病毒(ARV)，目前也被称为人类免疫缺陷病毒(HIV)，首字母缩写HIV在这里是用来一般指人类免疫缺陷病毒。
HIV对CD4+辅助/诱导剂T细胞(CD4+helper/inducer T-cell)产生深刻的细胞病变作用，从而严重损害免疫系统；艾滋病毒感染还会导致神经系统恶化，并最终导致受感染者死亡。全世界有数千万人感染了艾滋病毒，如果缺乏有效的治疗，其中大多数人注定要死亡。在较长的潜伏期内，即从最初感染到因艾滋病而出现症状或死亡的一段时间内，受感染者通过性接触、在静脉注射期间通过交叉使用受污染的针头、滥用药物、输血的血液或血液制品、或母亲将艾滋病毒转移给胎儿或新生儿的方式进一步传播感染，因此，不仅迫切需要有效的治疗药物来抑制已经感染者的艾滋病毒疾病的进展，而且还需要预防艾滋病毒感染从感染者传播到非感染者的方法。事实上，世界卫生组织(WHO)已将寻找有效的抗艾滋病毒预防病毒剂列为紧急的国际优先事项，以帮助遏制艾滋病的进一步扩大流行。
氰病毒素N(CVN)是一种培养蓝藻(Nostoc ellipsosporumwith)的组成部分，具有强大的抗HIV活性，是一种独特的环肽，有101个氨基酸，长11kDa。一级氨基酸结构与任何已知的蛋白质具有<20％的同源性，因此提供了一个独特的三维结构和序列。
CVN的晶体结构显示了一个结构域交换二聚体。它主要是一种具有内部双伪对称性的β-片状蛋白(β-sheet protein)。这两个序列重复(残基1-50和51-101)共享32％的序列同一性，但没有形成单独的结构域，因为整体折叠依赖于它们之间的大量接触。相反，两个对称相关的结构域是由两个重复序列之间的链交换形成的。氰病毒素N的序列结构如下：LGKFSQTCYN SAIQGSVLTS TCERTNGGYN TSSIDLNSVI ENVDGSLKWQ PSNFIETCRN TQLAGSSELAAECKTRAQQF VSTKINLDDH IANIDGTLKYE(SEQ ID NO:1)。
CVN对所有免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-1的M-和T型毒株、HIV-2、SIV(猿类)、FIV(猫))以及其他包膜病毒：包括流感病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒6和麻疹病毒，具有强活性。
因此，强大的抗病毒活性、无毒副作用、耐物理化变性以及对耐药性的超高遗传屏障，表明CVN及其类似物是一种很有前途的抗HIV分子，可用作局部杀微生物剂。具有生物活性的CVN能有效地、不可逆地使多种HIV-1初级毒株失活，包括参与艾滋病毒性传播的嗜CVN型病毒；CVN还能阻止艾滋病毒感染的细胞间传播。由于CVN直接杀灭病毒，因此CVN及其类似物的使用可能导致一种全新的抗HIV(人类免疫缺陷病毒)药物。
CVN对各种理化降解(physicochemical degradation)均表现出高度的抗性，用变性剂、洗涤剂、有机溶剂、多次冻融循环和热处理对其抗病毒活性没有影响。因此，CVN及其功能类似物可能被证明是一种很好的候选药物，用于各种治疗和预防用途。
CVN及其一些突变体已经通过重组产生，这需要先进的分子生物学和昂贵的发酵设施。目前，即使经过全面的文献研究，也还没有实用和直接的化学合成CVN的报道。
发明内容
本发明提供一种抗病毒肽、尤其是氰病毒素N的化学合成、其类似物以及应用。
本申请第一个方面提供一种肽，其含有、或组成为SEQ ID No.2-SEQ ID No.21的任意一个序列或更多个序列(即大于一个序列)。
本申请第二个方面是提供一种所述肽的制药学上可接受的盐。优选地，所述盐可以是羧酸盐或无机酸盐，如醋酸盐、盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐等。
本申请第三个方面是提供一种药物组合物，其含有所述的肽、或所述肽的制药学上可接受的盐，或者还可以含有一种或更多种制药学上可接受的辅料或稀释剂。
在一种优选实施例中，所述药物组合物可以接受的剂型是：口服、经鼻、含片、舌下、肺、体表、阴道、直肠、眼部、经皮或肠外给药中的任意一种或更多种。
一种治疗病毒感染的方法，或者，一种所述药物组合物在准备治疗病毒感染药物中的应用，所述药物组合物含有所述的肽、或所述肽的制药学上可接受的盐。
一种合成所述肽的方法，包括：C端为羧酸的第一个肽片段与第二个肽片段通过树脂上形成二硫键连接构成肽，第一片段和第二片段均固相形成二硫键。
一种合成所述肽的方法，包括：C端为羧酸的第一个肽片段与第二个肽片段通过树脂上形成二硫键连接构成带有P51 G突变的肽，第一片段和第二片段均固相形成二硫键。
一种合成所述肽的方法，包括：C端为硫酯的第一个肽片段与C端为半胱氨酸的第二个肽片段通过自然化学连接形成肽，然后肽进行折叠，优选为自然氧化还原条件下进行折叠。
一种合成所述肽的方法，包括：N端为Fmoc的三个肽片段通过两步缩合获得肽，第一个肽片段C端为羧酸，第三个片段C端为氨基，缩合后，所述肽进行折叠，，优选为自然氧化还原条件下进行折叠。
与CVN相比，本发明杀病毒肽具有许多突变体，这有助于对这种新型抗病毒肽的结构-功能关系的研究，由于其在对抗各种病毒感染方面的许多潜在用途，这些杀病毒肽在医疗和制药领域能够提供更实际的用途，例如更好的杀病毒的活性和/或更小的毒副作用。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下的例子并不以任何方式限制本发明。本申请的所有肽可以通过固相合成方法或溶液相合成，或两者与固相上的肽链组装和环化或溶液中的其他修饰相结合。以下列出了几本关于肽合成化学的主要参考书：John Jones，The ChemicalSynthesis ofPeptides；克拉伦登出版社，牛津，1994年；Steven A Kates，Fernando Alberticio(Eds.)，Solid-Phase Synthesis,A Practical Guide.；MarcelDekker公司，纽约，2000年；WengC.Chan、Peter D.White(Eds.)，FmocSolid Phase Peptide Synthesis,A PracticalApproach；牛津大学出版社，纽约，2000年。
C端酰胺，如肽酰胺，通常使用Rink Amide树脂制备；C端酸，如肽酸，使用三丁基氯树脂或Wang树脂制备。尤其是，组装的肽链仍然附着在树脂载体上时，可以在固相上形成二硫键；也可以通过本领域已知的各种方法在溶液中形成二硫键。具有完全或部分保护侧链的肽片段的溶解缩合/连接，在适当的偶联剂和催化剂存在下，在与完全或部分保护侧链的肽片段的溶液中进行。那些用于天然化学连接的肽硫酯片段是根据已知的技术制备(如：Dey B,Lerner DL,Lusso P,Boyd MR,Elder JH,Berger EA.2000.J.Virol.74:4562–4569。Lagenaur LA,Sanders-Beer BE,Brichacek B,Pal R,Liu X,Liu Y,Yu R,Venzon D,LeePP,Hamer DH.2011.Mucosal Immunol.4:648–657)。
实施例1：两片段合成方法(two-fragment process)，通过树脂上形成二硫键(on-resin disulfide bond formation)
第一个片段，含有45个氨基酸残基(固相形成二硫键)：LGKFSQTCYNSAIQGSVLTSTCERTNGGYN TSSIDLNSVI ENVDG-acid
第二个片段，含有56个氨基酸残基(固相形成二硫键)：SLKWQPSNFIETCRNTQLAGSSELA AECKTRAQQF VSTKINLDDHIANIDGTLKYE
合成肽为LGKFSQTCYN SAIQGSVLTS TCERTNGGYN TSSIDLNSVIENVDGSLKWQPSNFIETCRN TQLAGSSELA AECKTRAQQF VSTKINLDDHIANIDGTLKYE-amide
实施例2：两片段合成方法(two-fragment process)，通过树脂上形成二硫键(on-resin disulfide bond formation)，带有P51G突变
第一个片段，含有51个氨基酸残基(固相形成二硫键)：LGKFSQTCYNSAIQGSVLTSTCERTNGGYN TSSIDLNSVI ENVDGSLKWQG–acid
第二个片段，含有50个氨基酸残基(固相形成二硫键)：SNFIETCRNTQLAGSSELAAECKTRAQQF VSTKINLDDH IANIDGTLKYE
合成肽为Ac-LGKFSQTCYN SAIQGSVLTS TCERTNGGYN TSSIDLNSVIENVDGSLKWQPSNFIETCRN TQLAGSSELA AECKTRAQQF VSTKINLDDHIANIDGTLKYE-amide
实施例3：两片段自然化学连接和折叠
第一个片段，含有57个氨基酸残基，C端为硫酯(thioester)：LGKFSQTCYNSAIQGSVLTS TCERTNGGYN TSSIDLNSVI ENVDGSLKWQ PSNFIET–thioester
第二个片段，含有44个氨基酸残基，C端为半胱氨酸：CRN TQLAGSSELAAECKTRAQQFVSTKINLDDH IANIDGTLKYE
连接过程之后，在自然氧化还原作用下进行折叠。所得产物为：LGKFSQTCYNSAIQGSVLTS TCERTNGGYN TSSIDLNSVI ENVDGSLKWQPSNFIETCRN TQLAGSSELA AECKTRAQQFVSTKINLDDHIANIDGTLKYE-amide
实施例4：三片段缩合制备方法
第一个片段含有27个氨基酸残基：Fmoc-LGKFSQTCYN SAIQGSVLTS TCERTNG-acid；
第二个片段含有38个氨基酸残基：Fmoc-GYN TSSIDLNSVIENVDGSLKWQ PSNFIETCRN TQLAG；
第三个片段含有36个氨基酸残基：SSELA AECKTRAQQF VSTKINLDDHIANIDGTLKYE-amide；
合成的肽为：Ac-LGKFSQTCYN SAIQGSVLTS TCERTNGGYNTSSIDLNSVI ENVDGSLKWQGSNFIETCRN TQLAGSSELA AECKTRAQQFVSTKINLDDH IANIDGTLKYE-amide
通过两步缩合获得完整长度的线性肽，所述线形肽然后在氧化还原反应条件下折叠为自然构型。
本申请其他肽SEQ ID No.6-21可以通过上述三种方式中的一种来获得。
上述实施例的最终产物通过反相HPLC纯化，并通过分析和质谱进一步表征。从反相HPLC中纯化的多肽通常是三氟乙酸(TFA)的盐的形式。
这种盐通常被转化为更具有药物友好性的盐形式，如醋酸或盐酸盐形式。将TFA盐中的肽转化为盐酸盐可以通过在稀盐酸溶液中在TFA盐中反复冻干来实现。对于将TFA盐中的肽转化为醋酸盐，最简单的方法是使用如下方法制备的阴离子交换树脂：
强阴离子交换树脂(氯离子形式，取代量3mmole/g，含水量50％，每克肽使用2克树脂)首先用milli Q水洗涤三次，然后用1N氢氧化钠溶液洗涤3次，5分钟/次；然后用milli Q水洗涤5次，5分钟/次。
用75％乙醇水溶液清洗强阴离子交换树脂，直到pH值达到7.4。这种树脂用10％的醋酸溶液处理3次，每次5分钟。然后用1％的醋酸溶液清洗树脂3次，每次5分钟。该树脂可以进行纯化的肽的盐转化。
将纯化的冻干肽溶解在1％醋酸溶液中并添加到上述制备的强阴离子交换树脂中。将混合物在室温下搅拌或磁性搅拌1小时。上清液分离。该强阴离子交换树脂用1％的醋酸溶液洗涤三次。将上清液和洗涤液结合，通过0.22μm的膜过滤并冻干，在醋酸盐中生成一种肽。
本申请通过上述方式可以获得具有突变的肽，从而获得具有抗病毒活性的肽，可用于替代CVN。
以上对发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明内。
Claims (9)
1.一种肽，其特征在于，所述肽含有、或组成为SEQ ID No.2-SEQ ID No.21的任意一个序列或更多个序列。
2.一种权利要求1所述肽的制药学上可接受的盐。
3.根据权利要求3所述的盐，其特征在于，所述盐选自羧酸盐或无机酸盐。
4.根据权利要求4所述的盐，其特征在于，所述盐选自醋酸盐、盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的肽、或权利要求2所述肽的制药学上可接受的盐。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物，还含有一种或更多种制药学上可接受的辅料或稀释剂。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型是：口服、经鼻、含片、舌下、肺、体表、阴道、直肠、眼部、经皮或肠外给药中的任意一种或更多种。
8.一种权利要求5所述药物组合物在准备治疗病毒感染药物中的应用。
9.一种合成权利要求1所述的肽的方法，其特征在于，选自：
C端为羧酸的第一个肽片段与第二个肽片段通过树脂上形成二硫键连接构成肽，第一片段和第二片段均固相形成二硫键；
C端为羧酸的第一个肽片段与第二个肽片段通过树脂上形成二硫键连接构成带有P51G突变的肽，第一片段和第二片段均固相形成二硫键；
C端为硫酯的第一个肽片段与C端为半胱氨酸的第二个肽片段通过自然化学连接形成肽，然后肽进行折叠，优选为自然氧化还原条件下进行折叠；
N端为Fmoc的三个肽片段通过两步缩合获得肽，第一个肽片段C端为羧酸，第三个片段C端为氨基，缩合后，所述肽进行折叠，，优选为自然氧化还原条件下进行折叠。
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