DE69737415T2

DE69737415T2 - Gespannte, helixformende peptide und verfahren um sie herzustellen

Info

Publication number: DE69737415T2
Application number: DE69737415T
Authority: DE
Inventors: Andrew San Francisco BRAISTED; J. Kevin Montara JUDICE; Robert S. San Francisco MCDOWELL; J. Christopher San Francisco PHELAN; Melissa A. Starovasnik; James A. Burlingame WELLS
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-11-06
Filing date: 1997-11-05
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2017-11-06
Also published as: JP2001503064A; AU5428798A; CA2270869A1; ATE355300T1; EP0938497A1; WO1998020036A1; AU745101B2; EP0938497B1; DE69737415D1; IL129772A0

Description

Die Erfindung betrifft die Konformationseinschränkung (erzwungene Konformation) von Peptiden. Insbesondere betrifft die Erfindung die Einschränkung von Peptiden auf eine α-helikale Konformation. Außerdem betrifft diese Erfindung die rationale Entwicklung und Herstellung von HIV-Vakzinen, die auf HIV-gp41-Polypeptidsequenzen basieren. Weiters betrifft diese Erfindung verbesserte Verfahren zur Diagnose von HIV-Infektionen und Immunogene, die in Diagnoseverfahren zweckdienliche Antikörper induzieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Verschiedene Verfahren zur Stabilisierung von α-helikaien Peptiden wurden bereits beschrieben. Zusatz von Trifluorethanol oder Hexafluorisopropanol wurde häufig eingesetzt, um α-Helices in wässriger Lösung zu stabilisieren. Die Dimerisierung von α-Helices an hydrophoben Grenzflächen hat ebenfalls zu einer exogenen Stabilisierung geführt. Kurze α-helikale Peptide wurden stabilisiert, indem Gruppen an den Termini eingebaut wurden, um den immanenten Helixdipol zu stabilisieren. Natürlich vorkommende Capping-Motive sowie organische Matrizen wurden eingesetzt, um α-Helices durch Endnucleation zu stabilisieren. Verschiedene Einschränkungen für nichtkovalente Seitenketten wurden in Bezug auf die α-Helix-Stabilisierung untersucht, einschließlich hydrophaber Wechselwirkungen, Salzbrücken und Metallionenchelatierung durch sowohl natürliche als auch nicht-natürliche Aminosäuren.
Schließlich wurden α-Helices durch kovalente Seitenketten-„Fesseln" stabilisiert. Chorev et al., Biochemistry 30, 5968–5974 (1991), Osapay et al., J. Am. Chem. Soc. 112, 6046–6051 (1990), Osapay et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 6966–6973 (1990), Bracken et al., J. Am. Chem. Soc. 116, 6431–6432 (1994) und Houston et al., J. Peptide Science 1, 274–282 (1995), beschrieben die Stabilisierung von α-Helices durch Seitienketten-an-Seitenketten-Lactamisierung. Ravi et al., J. Am. Chem. Soc. 105, 105–109 (1983) und Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 9391–9392 (1991), beschrieben die Einschränkung von Peptiden durch Disulfidbindungen zwischen Resten. Das natürlich vorkommende Peptid Apamin wurde als Gerüst zur Präsentation von α-helikalen Peptidsequenzen verwendet, deren Helixkonformation durch Disulfidbindungen an Gerüst-Cysteinreste eingeschränkt war.
AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome = erworbenes Immunschwächesyndrom) wird durch ein Retrovirus ausgelöst, das als HIV (Human Immunodeficiency Virus = menschliches Immunschwächevirus) bezeichnet wird. Es wurden große Anstrengungen unternommen, eine Vakzine zu entwickeln, die eine schützende Immunantwort induziert, und zwar ausgehend von der Induktion von Antikörpern oder zellulären Reaktionen. Neuere Bemühungen nutzten Untereinheitenvakzinen, worin aus Sicherheitsgründen ein HIV-Protein und kein abgeschwächtes oder abgetötetes Virus als Immunogen in der Vakzine eingesetzt wird. Untereinheitenvakzinen enthaften im Allgemeinen gp120, den Abschnitt des HIV-Hüllproteins, der sich auf der Oberfläche des Virus befindet.
Das HIV-Hüllprotein wurde umfassend beschrieben, und für die HIV-Hülle kodierenden Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen von verschiedenen HIV-Stämmen sind bekannt (G. Myers et al., Human Retroviruses and Aids. A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico, USA (1992)). Das HIV-Hüllprotein ist ein Glykoprotein mit etwa 160 kd (gp160), das in der Membrandoppelschicht in der carboxylterminalen Region verankert ist. Das N-terminale Segment, gp120, dringt in die wässrige Umgebung ein, die das Virion umgibt, und das C-terminale Segment, gp41, durchdringt die Membran. Durch einen wirtszellvermittelten Prozess wird gp160 gespalten, um gp120 und das komplette Membranprotein gp41 zu bilden. Da keine kovalente Bindung zwischen gp120 und gp41 vorhanden ist, wird manchmal freies gp120 von der Oberfläche von Virionen und infizierten Zellen freigesetzt.
gp120 war als Vakzinenkandidat für Untereinheitenvakzinen Gegenstand intensiver Untersuchungen, da es das Virusprotein ist, das am leichtesten für einen Immunangriff zugänglich ist. Klinische Studien am gp120-MN-Stamm sind derzeit am Laufen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Konstruktion eines eingeschränkten helikalen Peptids bereit, das folgende Schritte umfasst: (1) das Synthetisieren eines Peptids, worin das Peptid eine Sequenz aus acht Aminosäureresten umfasst, worin die Sequenz aus acht Aminosäureresten einen ersten terminalen Rest und einen zweiten terminalen Rest aufweist, worin der erste terminate Rest und der zweite terminate Rest eine interne Sequenz aus sechs Aminosäureresten flankieren und worin der erste terminate Rest eine Seitenkette aufweist, die einen eine Amidbindung bildenden Substituenten enthält, und der zweite terminate Rest eine Seitenkette aufweist, die einen eine Amidbindung bildenden Substituenten enthält; (2) das Bereitstellen eines difunktionellen Linkers mit einer ersten funktionellen Gruppe, die zur Bildung einer Amidbindung mit dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des ersten terminalen Rests in der Lage ist, und einer zweiten funktionellen Gruppe, die zur Bildung einer Amidbindung mit dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des zweiten terminalen Rests in der Lage ist; und (3) das Zyklisieren des Peptids durch Umsetzen des eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des ersten terminalen Rests mit der ersten funktionellen Gruppe des difunktionellen Linkers, um eine Amidbindung zu bilden, und das Umsetzen des eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des zweiten terminalen Rests mit der zweiten funktionellen Gruppe des difunktionellen Linkers, um eine Amidbindung zu bilden, was ein eingeschränktes helikales Peptid ergibt.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Konstruktion eines eingeschränkten helikalen Peptids bereit, das folgende Schritte umfasst: (1) das Synthetisieren eines Peptids, worin das Peptid eine Sequenz aus acht Aminosäureresten umfasst, worin die Sequenz aus acht Aminosäureresten einen ersten terminalen Rest und einen zweiten terminalen Rest aufweist, worin der erste terminale Rest und der zweite terminale Rest eine interne Sequenz aus sechs Aminosäureresten flankieren, worin der erste terminale Rest eine Seitenkette aufweist, die einen eine Amidbindung bildenden Substituenten enthält, und der zweite terminate Rest eine Seitenkette aufweist, die einen eine Amidbindung bildenden Substituenten enthält, und worin der eine A midbindung bildende Seitenketten-Substituent des ersten terminalen Rests mit einer solchen ersten Schutzgruppe und der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des zweiten terminalen Rests mit einer solchen zweiten Schutzgruppe geschützt werden, sodass die erste Schutzgruppe und die zweite Schutzgruppe unterschiedlich entfernbar sind; (2) das Entfernen der ersten Schutzgruppe, sodass der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des ersten terminalen Rests entschützt wird und der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des zweiten terminalen Rests nicht entschützt wird; (3) das Bereitstellen eines difunktionellen Linkers mit einer ersten funktionellen Gruppe, die zur Bildung einer Amidbindung mit dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des ersten terminalen Rests in der Lage ist, und einer zweiten funktionellen Gruppe, die zur Bildung einer Amidbindung mit dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des zweiten terminalen Rests in der Lage ist; (4) das Umsetzen des Peptids mit dem difunktionellen Linker, um eine Amidbindung zwischen der ersten funktionellen Gruppe des difunktionellen Linkers und dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des ersten terminalen Rests zu bilden; (5) das Entfernen der zweiten Schutzgruppe, um den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des zweiten terminalen Rests zu entschützen; und (6) das Zyklisieren des Peptids durch intramolekulares Umsetzen des eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des zweiten terminalen Rests mit der zweiten funktionellen Gruppe des difunktionellen Linkers, um eine Amidbindung zu bilden und ein eingeschränktes helikales Peptid zu erhalten.
Weiters stellt die Erfindung ein Verfahren zur Konstruktion eines eingeschränkten helikalen Peptids bereit, das folgende Schritte umfasst: (a) das Synthetisieren eines Peptids, worin das Peptid eine Sequenz aus acht Aminosäureresten umfasst, worin die Sequenz aus acht Aminosäureresten einen ersten terminalen Rest und einen zweiten terminalen Rest aufweist, worin der erste terminale Rest und der zweite terminale Rest eine interne Sequenz aus sechs Aminosäureresten flankieren, worin der erste terminale Rest eine Seitenkette aufweist, die einen eine Amidbindung bildenden Substituenten enthält, und der zweite terminale Rest eine Seitenkette aufweist, die einen eine Amidbindung bildenden Substituenten enthält, worin der erste termina le Rest an einen difunktionellen Linker gebunden ist, der eine erste funktionelle Gruppe und eine zweite funktionelle Gruppe aufweist, worin die erste funktionelle Gruppe in einer Amidbindung mit dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des ersten terminalen Rests vorliegt und worin die zweite funktionelle Gruppe des difunktionellen Linkers zur Bildung einer Amidbindung mit dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des zweiten terminalen Rests in der Lage ist; und (b) das Zyklisieren des Peptids durch intramolekulares Umsetzen des eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des zweiten terminalen Rests mit der zweiten funktionellen Gruppe des difunktionellen Linkers, um eine Amidbindung zu bilden und ein eingeschränktes helikales Peptid zu erhalten.
Außerdem stellt die Erfindung ein Verfahren zur Konstruktion eines eingeschränkten helikalen Peptids bereit, das folgende Schritte umfasst: (1) das Synthetisieren eines Peptids, worin das Peptid eine Sequenz aus acht Aminosäureresten umfasst, und worin die Sequenz aus acht Aminosäureresten einen ersten terminalen Rest und einen zweiten terminalen Rest aufweist, worin der erste terminate Rest und der zweite terminale Rest unabhängig voneinander aus Asp und Glu ausgewählt sind; (2) das Bereitstellen eines Diaminlinkers mit einer ersten Aminogruppe, die zur Bildung einer Amidbindung mit der Carboxyseitenkette des ersten terminalen Rests in der Lage ist, und einer zweiten Aminogruppe, die zur Bildung einer Amidbindung mit der Carboxyseitenkette des zweiten terminalen Rests in der Lage ist; und (3) das Zyklisieren des Peptids durch Umsetzen der ersten Aminogruppe des Diaminlinkers mit der Carboxyseitenkette der ersten terminalen Rests, um eine Amidbindung zu bilden, und das Umsetzen der zweiten Aminogruppe des Diaminlinkers mit der Carboxyseitenkette des zweiten terminalen Rests, um eine Amidbindung zu bilden, was ein eingeschränktes helikales Peptid ergibt.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Konstruktion eines eingeschränkten helikalen Peptids, das folgende Schritte umfasst: (1) das Synthetisieren eines Peptids, worin das Peptid eine Sequenz aus acht Aminosäureresten umfasst, worin die Sequenz aus acht Aminosäureresten einen ersten terminalen Rest und einen zweiten terminalen Rest aufweist, worin der erste terminale Rest und der zweite terminale Rest eine interne Sequenz aus sechs Aminosäureresten flankieren, worin der erste terminale Rest und der zweite terminale Rest unabhängig voneinander aus Asp und Glu ausgewählt sind und worin die Carboxyseitenkette des ersten terminalen Rests mit einer solchen ersten Schutzgruppe und die Carboxyseitenkette des zweiten terminalen Rests mit einer solchen zweiten Schutzgruppe geschützt sind, dass die erste Schutzgruppe und die zweite Schutzgruppe unterschiedlich entfernbar sind; (2) das Entfernen der ersten Schutzgruppe, sodass die Carboxyseitenkette des ersten terminalen Rests entschützt wird und die Carboxyseitenkette des zweiten terminalen Rests nicht entschützt wird; (3) das Umsetzen des Peptids mit einem Diaminlinker, der eine erste Aminogruppe und eine zweite Aminogruppe aufweist, um eine Amidbindung zwischen der entschützten Carboxyseitenkette des ersten terminalen Rests und der ersten Aminogruppe des Diaminlinkers zu bilden; (4) das Entfernen der zweiten Schutzgruppe, um die Carboxyseitenkette des zweiten terminalen Rests zu entschützen; und (5) das Zyklisieren des Peptids durch intramolekulares Umsetzen der entschützten Carboxyseitenkette des zweiten terminalen Rests mit der zweiten Aminogruppe des Diaminlinkers, um eine Amidbindung zu bilden und ein eingeschränktes helikales Peptid zu erhalten.
Die Erfindung umfasst weiters ein Verfahren zur Konstruktion eines eingeschränkten helikalen Peptids, das folgende Schritte umfasst: (1) das Synthetisieren eines Peptids, worin das Peptid eine Sequenz aus acht Aminosäureresten umfasst, worin die Sequenz aus acht Aminosäureresten einen ersten terminalen Rest und einen zweiten terminalen Rest aufweist, worin der erste terminale Rest und der zweite terminale Rest eine interne Sequenz aus sechs Aminosäureresten flankieren, worin der erste terminale Rest und der zweite terminale Rest unabhängig voneinander aus Asp und Glu ausgewählt sind, und worin die Carboxyseitenkette des ersten terminalen Rests an einen Diaminlinker mit einer ersten Aminogruppe und einer zweiten Aminogruppe verbunden ist, sodass die Carboxyseitenkette des ersten terminalen Rests in einer Amidbindung mit der ersten Aminogruppe des Diaminlinkers vorliegt; und (2) das Zyklisieren des Peptids durch intramolekulares Umsetzen der entschützten Carboxyseitenkette des zweiten terminalen Rests mit der zweiten Aminogruppe des Diamin linkers, um eine Amidbindung zu bilden und ein eingeschränktes helikales Peptid zu erhalten.
Die Erfindung umfasst außerdem eine Verbindung, die aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist:
Verbindungen der Formel (1):
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; m und p unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass m + p kleiner als oder gleich 6 ist, und n eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (m + p)) bis (9 – (m + p)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass n größer als 1 ist;
Verbindungen der Formel (6):
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; q aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, s aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass q + s kleiner als oder gleich 7 ist, und r eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (q + s)) bis (9 – (q + s)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass r größer als 0 ist;
Verbindungen der Formel (11):
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; t aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist und v aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass t + v kleiner als oder gleich 7 ist, und u eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (t + v)) bis (9 – (t + v)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass u größer als 0 ist; und
Verbindungen der Formel (16):
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; w und y unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass w + y kleiner als oder gleich 8 ist, und x eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7-(w + y)) bis (9 – (w + y)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass x größer als oder gleich 0 ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Verbindung bereitgestellt, die ein eingeschränktes helikales Peptid enthält, das wiederum ein Peptid aus einer Sequenz von acht Aminosäureresten umfasst, worin die Sequenz von acht Aminosäureresten einen ersten terminalen Rest und eine zweiten terminalen Rest aufweist, die eine interne Sequenz aus sechs Aminosäureresten flankieren und die Seitenketten aufweisen, die aneinander gebunden sind und so eine Arretiergruppierung bilden, um ein eingeschränktes helikales Peptid zu bilden. Die interne Sequenz aus sechs Aminosäuren weist die Form gabcde, defgab oder cdefga auf und ist aus einer Gruppe von Sequenzen ausgewählt, die eine Sequenz aus sechs zusammenhängenden Aminosäuren in der HIV-1LAI-Stamm-gp41-Aminosäuresequenz 633 bis 678, in deren homologer Sequenz von einem anderen HIV-Stamm, in einer Consensus-Sequenz derer homologen Sequenzen von einer beliebigen HIV-Clade oder einer Aminosäure-Substitutionsvariante davon umfasst, worin der Aminosäure 633 oder ihrer entsprechenden Aminosäure in der homologen Sequenz, Consensus-Sequenz oder Sequenzvariante die Position a einer Grundaufstellung abcdefg für die Sequenz 633–678 zugeordnet ist (wie in 18 dargestellt). In diesen Verbindungen liegt die Arretiergruppierung oder Fessel zwischen benachbarten f-Positionen vor, wenn die interne Sequenz die Form gabcde aufweist, zwischen benachbarten c-Positionen, wenn die interne Sequenz die Form defgab aufweist, oder zwischen benachbarten b-Positionen, wenn die interne Sequenz die Form cdefga aufweist. Besonders bevorzugt befindet sich die Arretierung zwischen benachbarten f-Positionen. 18 zeigt die Anordnung der Grundaufstellung abcdefg mit den Aminosäuren in der 633-678-Region. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die interne Sequenz aus sechs Aminosäuren die Form gabcde auf. Die Verbindungen weisen vorzugsweise antifusogene oder antinfektiöse HIV-Aktivität auf.
Bevorzugte Verbindungen sind solche, die aus der aus eingeschränkten helikalen Peptiden mit allen möglichen Sequenzen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, die eine oder jede beliebige Kombination von Aminosäuresubstitutionen, die in der in 23A und 23B dargestellten Serie der eingeschränkten helikalen Peptide I bis XII angeführt sind, in Kombination mit einer oder jeder beliebigen Kombination von Aminosäuretrunkierungen, die in der in 23A und 23B dargestellten Serie der eingeschränkten helikalen Peptide I bis XII angeführt sind, aufweist. Die Peptide HIV24 und HIV31 sind besonders bevorzugte Verbindungen dieser Art.
In einer anderen Ausführungsform werden die Verbindungen der Erfindung, vorzugsweise an Träger gebunden, als Haptene eingesetzt, und zwar zur Verwendung als Immunogen zur Bildung von Antikörpern für diagnostische Zwecke oder als Vakzine zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Patienten mit einem Risiko für eine HIV-Infektion. Beispiele für solche prophylaktische Anwendungen der Peptide können die Prävention der Übertragung eines Virus von der Mutter auf das Kind und in anderen Situationen, in denen die Gefahr einer HIV-Übertragung besteht, wie beispielsweise bei Unfällen im Gesundheitsbereich, wo Mitarbeiter mit HIV-hältigen Blutprodukten in Kontakt kommen, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die eingeschränkten Peptide der Erfindung können als prophylaktische Vakzine dienen, wobei der Wirt Antikörper gegen das Peptid der Erfindung bildet, die dann zur Neutralisierung von HIV-Viren durch beispielsweise Hemmung einer weiteren HIV-Infektion dienen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Darstellung, welche die Synthese von Peptid 1b und 1c zeigt. Reagens a ist 20%igem Piperidin in DMA; Reagens b ist H₂NCH₂CH₂CH₂NHR (R=H oder BOC), BOP, DIPEA, CH₂Cl₂; Reagens c ist Pd(PPh3)4, 20%igem Piperidin in DMA, (R=BOC) TFA/CH₂Cl₂/Anisol/1,2-Ethandithiol 45:45:5:5 Vol./Vol.; Reagens d ist BOP, DIPEA, CH₂Cl₂; Reagens e ist HF/Anisol/EtSMe 20:2:1 Vol./Vol., 0°C; und Reagens f ist CH₃NH₂, BOP, CH₂Cl₂.
2 ist eine Darstellung, welche die Synthese von N-Fmoc-S-Acm-D-thiolysin (Verbindung 7) zeigt. Reagens a ist ⁿBuLi, THF, –78°C; Br(CH₂)₄Br; Reagens b ist 4-McOBnSN, KO^tBu, THF; Reagens c ist 0,25 M HCl, THF/H₂O; Reagens d ist Hg/OAc)₂, TFA, H₂S; Reagens e ist Acetamidomethanol, TFA; Reagens f ist LiOH, THF/H₂O; und Reagens g ist Fmoc-OSu, Dioxan, NaHCO₃.
3a und 3b sind graphische Darstellungen des H^N-H^α- bzw. H^N-H^N-Abschnitts des ROESY-Spektrums von Peptid 1c. Das Spektrum wurde bei 280 K, pH 5,0, 500 MHz und einer Peptidkonzentration von 1,5 mM mit einem 4,5-kHz-Spinlock-Mischimpuls mit einer Dauer von 200 ms aufgenommen. ROEs sind durch Linien verbunden, anhand derer sequentielle Zuweisungen vorgenommen wurden. Rechteckige, ovale und rautenförmige Kästchen kennzeichnen Korrelationen innerhalb von Resten, Sequenz- bzw. (I,I+3)-Korrelationen.
4 ist eine graphische Darstellung von ROE- und ³J_HN-Hα-Daten für die Peptide 1c und 1b. Für die d_NN- und d_αN-Reihe ist die Beobachtung des sequentiellen ROE durch einen Balken dargestellt, der zwei Reste verbindet, wobei die Dicke des Balkens die relative Intensität des ROE anzeigt. Die nach unten weisenden Pfeile zeigen eine ³J_HN–Hα von unter 6,0 Hz an. Die beobachteten mittleren ROEs (H^α-H^N I,I+3 und H^α-H^β I,I+3) sind durch die Linien im unteren Teil der Figur angegeben; gestrichelte Linien und Sterne kennzeichnen ROEs, die aufgrund von Degeneration der chemischen Verschiebung nicht eindeutig identifiziert werden konnten. Das Schleifenmotiv über der Primärsequenz zeigt die Region an, von der aus den NMR-Daten gefolgert wurde, dass sie die Helixstruktur aufweist; die gestrichelten Schleifen zeigen Abschnitte eines Peptids an, in denen nur ein Teil der NMR-Daten auf einen helikalen Charakter hinweist.
5 ist ein Molekülmodell, das eine Gruppe von 20 rMD-Strukturen darstellt, die mithilfe von NMR-Daten für Peptid 1c berechnet wurden. Die Strukturen wurden unter Verwendung der N-, Cα- und C-Atome der Reste Thr1 bis Gln10 überlagert. Schwere Rückgrat- und Seitenkettenatome sind durch durchgehende bzw. gestri chelte Linien dargestellt. Die Seitenketten von Arg8 und Arg9 sind an C^γ trunkiert, und alle Seitenkettenatome von Gln11 und Gln12 sind aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen.
6 ist eine graphische Darstellung, die das CD-Spektrum von Peptid 1c bei 280, 310, 330, 350 und 370 K zeigt.
7 ist eine graphische Darstellung, die das CD-Spektrum der Peptide 1 und 3 (Apamin-basierte Sequenzen) bei 280 K zeigt.
8 ist eine graphische Darstellung, die das CD-Spektrum der Peptide 2 und 4 (C-Peptid-basierte Sequenzen) bei 280 K zeigt.
9 ist eine graphische Darstellung, die das Hitzedenaturierungsprofil von Peptid 1c zeigt, das durch CD-Spektren vor, während und nach dem Erhitzen auf 87°C für 1 Tag erhalten wurden. Kreise kennzeichnen das Anfangsspektrum, das vor dem Erhitzen von einer Probe erhalten wurde; Quadrats kennzeichnen das Spektrum, das von einer Probe während einer Inkubation bei 87°C erhalten wurde; Dreiecke kennzeichnen das Spektrum, das von einer Probe nach dem Abkühlen auf 7°C mit 0,2°C/min erhalten wurde.
10 ist eine graphische Darstellung, die einen Abschnitt des TOCSY-Spektrums von Peptid 1c zeigt. Die Daten wurden bei 280 K, pH 5,0, 500 MHz und einer Peptidkonzentration von 1,5 mM mit einer Mischdauer von 90 ms gewonnen. Die durchgehenden Linien verbinden Kreuzpeaks zwischen Rückgratamid- und Seitenketten-Protonen; Zuordnungen sind über den einzelnen Linien angegeben. Gestrichelte Linien verbinden Kreuzpeaks zwischen den Seitenkettenamid-Protonen von Gln3 und Gln10 und den Methylenlinker-Resonanzen.
11 ist eine Darstellung, welche die Synthese einer arretierten Helixspezies des Peptids Asn-Met-Glu-Gln-Gln-Arg-Arg-Phe-Tyr-Glu-Ala-Leu-His zeigt, worin die Car boxyseitenketten der Glu-Reste kovalent mit einem 1,5-Pentandiamin-Linker verbunden sind.
12 zeigt Sequenzen und schematische Darstellungen der arretierten Helixpeptid-Ausführungsformen der Erfindung. Die Zylinder stellen α-Helices dar, wobei die getüpfelten Flächen der hydrophoben 4,3-Wiederholung entsprechen. Kovalente Einschränkungen, die Seitenketten bei I und I+7 verbinden, sind als dunkle Linien dargestellt.
13 ist ein Zirkulardichroismus-Spektrum der Peptide HIV24 (weiße Quadrate), HIV30 (weiße Kreise), HIV31 (schwarze Kreise) und HIV35 (schwarze Quadrate). Die Spektren wurden bei 7°C in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 aufgenommen (21).
Die 14A und 14B sind Diagramme, welche die Wirkung von inhibitarischen Peptiden in Primärinfektiositätstests unter Einsatz von PBMCs mit dem Virus JRCSF, einem NSI-Stamm (14A), und BZ167, einem SI-Stamm (14B), zeigen (22). HIV24 (schwarze Dreiecke), HIV31 (schwarze Kreise); HIV35 (schwarze Quadrate); DP178 (weiße Quadrate).
15 ist eine schematische Darstellung eines Vorschlags für einen Mechanismus zur Erzeugung des fusogenen Zustands von gp41 (oben) und die Hemmung durch eingeschränkte Peptide (unten).
Die 16A bis 16M zeigen Aminosäuresequenzen von gp41 von bekannten NIV-Virusstämmen und ihre Consensus-Seguenzen, basierend auf der statistischen Aminosäurehäufigkeit. Aminosäuren sind im herkömmlichen Einbuchstabencode anangeben. Die Stämme innerhalb der einzelnen HIV-Claden sind angegeben. Ein „-" in einer Sequenz kennzeichnet die entsprechende Position in Virussequenzen innerhalb dieser Clade. Eine groß geschriebene Aminosäure in einer Consensus-Sequenz zeigt an, dass nur diese Aminosäure an der entsprechenden Position in Virussequenzen innerhalb dieser Clade gefunden wurde. Stammbezeichnungen ohne Se quenzinformationen zeigen an, dass nicht die gesamte gp41-Sequenz bestimmt wurde.
17 ist eine Zusammenfassung von Consensus-Sequenzen von bekannten Stämmen. Die Peptidsequenz von DP178 ist hervorgehoben. Die Nomenklatur ist dieselbe wie in den 16A bis 16G.
18 ist eine schematische Darstellung von Sequenzanordnungen von Consensus-Sequenzen der Claden A, B, C, D und E, der Peptide DP178 und HIV35 sowie des Neurath-Peptids, worin die Heptaden-Grundaufstellung abcdefg, wie sie hierin gelehrt wird, bereitgestellt wird und die Positionen einiger einschränkender Arretierungen angezeigt sind. Den Aminosäuren in der Sequenz ESQNQQ von DP178 sind zum Zwecke der vorliegenden Erfindung beispielsweise die Positionen g, a, b, c, d bzw. e zugeordnet, sodass es die Form gabcde aufweist. Diese Sequenz ist die interne Sequenz aus sechs Aminosäuren, die im Peptid HIF24 vorhanden ist, das eine einfach arretierte Form der HIV35-Sequenz ist. Positionen von internen Sequenzen der Erfindung sind jene, die sich zwischen Arretierungsresten befinden, deren Positionen durch das Symbol „|" angezeigt sind und denen in diesem Beispiel jeweils die Position f zugeordnet ist. Positionen zur Platzierung von entweder einer, zwei oder drei Arretierungen in den repräsentativen gezeigten Sequenzen sind angegeben. Die Figur stellt fünf helikale Abschnitte der Form gabcde zur Arretierung dar, wenn Arretierungen an benachbarten f-Positionen erfolgen. Außerdem sind die Positionen von helikalen Abschnitten der Form gabcde dargestellt, wenn eine, zwei oder drei i-bis-i+7-Arretierungen in einer 633-678-Sequenz oder Variante davon vorhanden sind. Die zweifach arretierten Varianten sind als (II), (III), HIV31, (VI) und (VII) bezeichnet. und die einfach arretierten Varianten sind (VIII), (IX), HIV24, (XI) und (XII). Die dreifach arretierte Variante ist als (I) bezeichnet.
19 ist eine helikale Raddarstellung der repräsentativen gp42-Fusionsproteinsequenz aus dem HIV-1-LAI-Stamm, weiche das „abcdefg"-Heptaden-Leseraster und das Heptaden-Wiederholungsmuster, wie es hierin zum Zwecke der vorliegenden Erfindung zugeordnet ist (siehe 18), zeigt.
20 ist eine schematische Darstellung, welche die Verwendung der Verbindungen der Erfindung als Haptene zur Immunisierung darstellt und das gp41-Kerntrimer, seine DP178-Bindungsfurche und die 633-678-Region, die diese Gruppe bindet, Hapten a präsentiert die 4,3-Wiederholungsoberfläche aus HIV24 in einer eingeschränkten Helix. Diese Fläche würde vermutlich niemals dem Immunsystem exponiert werden, da sie wahrscheinlich nicht gebildet würde, bis sie der Trimer-„Furchenbindungsstelle" ausgesetzt wird. Ein dagegen gebildeter Antikörper wäre jedoch im Wesentlichen ein antiidiotypischer Antikörper gegen die Trimerfurchen. Wenn gp41 im Ruhezustand diesem Antikörper ausgesetzt wird, würde es den C-Terminus von gp41 dazu bringen, eine Helix in einem nichtproduktiven Zustand, d.h. an den Antikörper gebunden, zu bilden, wodurch das Protein aus dem Fusionsweg heraus maskiert wird. Von Antikörpern gegen Hapten a wird erwartet, dass sie an die angegebene Region binden und diese Region veranlassen, eine Helix in einer nichtproduktiven Orientierung zu bilden, wodurch eine letztendliche Anordnung des fusogenen helikalen Bündels verhindert wird.
21 ist eine schematische Darstellung, die einen Vorschlag für den Mechanismus einer Antikörper-Intervention in HIV-Virusinfektiosität zeigt.
22 zeigt eine Consensus-Sequenz der HIV-gp41-Sequenzen aus 17 mit allen erlaubten Aminosäuresubstitutionen jeder einzelnen angeführten Position. An der fünften Aminosäureposition (an der N-terminalen Aminosäure (linkes Ende) beginnend) sind beispielsweise die Aminosäuren E (Glutaminsäure), D (Asparaginsäure) und K (Lysin) erlaubt, ohne dass die H-Bindung gestört wird und somit ohne dass die Helizität gestört wird oder die Wechselwirkung des Peptids mit dem Kern-Superhelix-Trimer von gp41 wesentlich beeinträchtigt wird. „X" bezeichnet Positionen, die mit einer beliebigen die Helix nicht brechenden Aminosäure substituiert werden kann. Die wiederkehrende abcdefg-Heptaden-Grundzuordnung für die einzelnen Aminosäurepositionen in der Sequenz 633 bis 678 zum Zwecke der vorliegenden Erfindung ist dargestellt. „*" kennzeichnet b-, c- und f-Positionen, die, wenn sie nicht zur Arretierung der Helix genutzt werden, durch eine nicht-helixbrechende Aminosäure ersetzt werden können, ohne dass die H-Bindung, die Helizität und die Trimerfurchenbindung wesentlich beeinträchtigt werden.
23 zeigt eine Kurzschrift-Notation spezifischer Peptide in der Peptidreihe I bis XII (siehe 18), wobei jeweils Arretierungspositionen, Aminosäuresubstitions-Peptidvarianten und Trunkierungs-Peptidvarianten angegeben sind. „X" kennzeichnet eine Position, die mit einer beliebigen nicht-helixbrechenden Aminosäure substituiert werden kann, vorzugsweise jedoch mit einer Aminosäure, die in einer der in 16 dargestellten bekannten HIV-Sequenzenan dieser Position vorhanden ist. „B" kennzeichnet eine Position, die zur Überbrückung (oder Fesselung oder Arretierung) von Resten genutzt wird. Bevorzugte f-Positionen zur Arretierung sind angegeben; in weniger bevorzugten Ausführungsformen können jedoch auch die c- und einige b-Positionen zur Arretierung verwendet werden. Wie in 18 sind Positionen von internen Sequenzen, die für die Erfindung relevant sind, jene, die sich zwischen Arretierungsresten, deren Positionen durch das Symbol „|" angezeigt sind, befinden und in diesem Beispiel der f zugeordneten Position entsprechen. Positionen zur Platzierung von entweder einer, zwei oder drei Arretierungen in den repräsentativen dargestellten Sequenzen sind angezeigt. In der Figur sind fünf helikale Abschnitte der Form gabcde dargestellt, die zur Arretierung geeignet sind, wenn Arretierungen an benachbarten f-Positionen erfolgen. „." kennzeichnet Positionen, die in der letztendlichen eingeschränkten helikalen Peptidverbindung mitunter fehlen können, ohne dass die Helixeigenschaften und Furchenbindungseigenschaften des fertigen eingeschränkten helikalen Peptids wesentlich beeinträchtigt werden. Einem auf Peptid I basierenden Peptid, dessen drei Arretierungen wie angegeben platziert sind, können beispielsweise eine oder alle fünf N-terminale Aminosäuren WXXWE fehlen, die durch „." markiert sind. Außerdem ist in der Figur eine weitere Reihe von trunkierten Varianten – C-terminal trunkierten Varianten – dargestellt, da die fünf C-terminalen Reste (LWNWF), die mit „." markiert sind, fehlen können. Wenn die Arretierung zentraler in der 633-678-Sequenz platziert ist, wie in der Peptidreihe II dargestellt ist, können Peptiden in dieser Reihe zusätzliche Aminosäuren am C-terminalen Ende fehlen, wie durch die mit „." markierten Positionen angezeigt ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
A. DEFINITIONEN
Die hierin beschriebenen Aminosäuren und Aminosäurereste sind nach dem in der nachstehenden Tabelle angeführten, allgemein bekannten Ein- oder Dreibuchstabencode bezeichnet. Sofern nicht anders angegeben, liegen diese Aminosäuren oder Reste in der natürlich vorkommenden L-Stereoisomerform vor.
Im Allgemeinen basieren, sofern nicht anders angegeben, die zur Bezeichnung von Aminosäuren und dafür eingesetzten Schutzgruppen verwendeten Abkürzungen auf den Empfehlungen der IUPAC-IUB Commision of Biochemical Nomenclature (Biochemistry 11, 1726–1732 (1972)).
Die Bezeichnung -(CH₂)_n- wird hierin zur Bezeichnung eines unverzweigten Alkylsubstituenten mit einer Länge von n Kohlenstoffen verwendet, worin -(CH₂)₀- als chemische Bindung definiert ist, d.h. angibt, dass kein Alkylsubstituent vorhanden ist, -(C₂)₁- als Methylsubstituent definiert ist, -(CH₂)₂- als Ethylsubstituent definiert ist usw.
Die Bezeichnung „C₁-C₆-Alkyl" steht hierin für einen gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoffsubstituenten mit der angegebenen Anzahl an Kohlenstoffatomen. C₁-C₆-Alkyl umfasst zyklische und geradlinige Kohlenwasserstoffe, unverzweigte und verzweigte Kohlenwasserstoffe, substituierte und unsubstituierte Kohlenwasserstoffe sowie primäre, sekundäre und tertiäre Kohlenwasserstoffsubstituenten. Repräsentative Beispiele für diese Alkylsubstituenten umfassen Methyl, Fluorenylmethyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isabutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl, 2-Methylbutyl, 2,2-Dimethylpropyl, n-Hexyl, 2-Methylpentyl, 2,2-Dimethylbutyl, Cyclohexyl und dergleichen. Die Bezeichnungen „Niederalkyl", „einfaches Alkyl" und „C₁-C₆-Alkyl" sind Synonyme und austauschbar.
Die Bezeichnungen „Peptid", „Polypeptid" und „Protein" sind hierin Synonyme und beziehen sich auf jegliche proteinartige Verbindung, die eine Aminosäuresequenz aus zwei oder mehr Aminosäureresten umfasst.
Ein „eine Amidbindung bildender Substituent in einer Aminosäure-Seitenkette", ein „eine Amidbindung bildender Seitenketten-Substituent" und grammatikalische Varianten davon sind hierin definiert als solche, die Folgendes umfassen: (1) einen beliebigen Carboxysubstituenten in der Seitenkette („R"-Gruppe) einer Aminosäure, worin der Carboxysubstituent zur Bildung einer Amidbindung mit einer Aminogruppe in einem anderen Molekül in der Lage ist, d.h. der Carboxysubstituent reagiert mit einer Aminogruppe in einem anderen Molekül, um eine Amidbindung zu bilden; und (2) einen beliebigen Aminosubstituenten in der Seitenkette („R"-Gruppe") einer Aminosäure, worin der Aminosubstituent zur Bildung einer Amidbindung mit einer Carboxygruppe in einem anderen Molekül in der Lage ist, d.h. der Aminosubstituent reagiert mit einer Carboxygruppe in einem anderen Molekül, um eine Amidbindung zu bilden.
„Unterschiedlich entfernbare" Schutzgruppen sind hierin als jedes beliebige Paar von Schutzgruppen definiert, die in der Lage sind, einen ersten eine Amidbindung bildenden Substituenten und einen zweiten eine Amidbindung bildenden Substituenten zu schützen, worin der erste eine Amidbindung bildende Substituent, der mit einem Element des Paars geschützt ist, unter Bedingungen entschützt werden kann, unter denen der zweite eine Amidbindung bildende Substituent, der mit dem anderen Element des Paars geschützt ist, nicht entschützt wird. Unterschiedlich entfernbare Schutzgruppen werden hierin auch als „orthogonale" Schutzgruppen bezeichnet, und der durch solche Schutzgruppen verliehene, unterschiedlich entfernbare Schutz wird hierin als „orthogonaler" Schutz bezeichnet.
Der Begriff „Epitop" bezeichnet hierin die Strukturkomponente eines Moleküls, die für spezifische Wechselwirkungen mit entsprechenden Antikörper- (Immunglobulin-) Molekülen verantwortlich ist, die durch das gleiche oder ein verwandtes Antigen hervorgerufen werden. Allgemeiner gesehen bezeichnet der Begriff ein Peptid mit den gleichen oder ähnlichen Immunreaktionseigenschaften, beispielsweise spezifische Antikörperbindungsaffinität, wie das antigene Protein oder Peptid, das zur Erzeugung des Antikörpers eingesetzt wird. Somit ist ein Epitop, das von einer spezifischen Peptidsequenz gebildet wird, im Allgemeinen jedes beliebige Peptid, das mit gegen die spezifischen Sequenz gerichteten Antikörpern reaktiv ist.
Der Begriff „Antigen" bezeichnet hierin ein Molekül, das zur Induktion der Produktion von Antikörpern dient. Alternativ dazu dient der Begriff zur Bezeichnung eines Moleküls, das mit einem spezifischen Antikörper reaktiv ist.
Die Bezeichnung „Immunogen" beschreibt hierin eine Einheit, die Antikörperproduktion in einem Wirtstier induziert. In manchen Fällen sind das Antigen und das Immunogen die gleiche Einheit, während in anderen Fällen die beiden Einheiten unterschiedlich sind.
Der Begriff „Untereinheitenvakzine" wird hierin, wie auf dem Gebiet der Erfindung, zur Bezeichnung einer Virusvakzine verwendet, die kein Virus, aber ein oder mehrere Virusproteine oder Fragmente von Virusproteinen enthält. Die Bezeichnung „mehrwertig" bedeutet hierin, dass die Vakzine ein oder mehrere eingeschränkte helikale Peptide mit einer auf gp41 basierenden Sequenz aus zumindest zwei HIV-Isolaten mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen enthält.
Die Bezeichnung „Breakthrough-Isalat" oder „Breakthrough-Virus" wird hierin, wie auch auf dem Gebiet der Erfindung, für ein Virus verwendet, das aus einer Vakzine isoliert ist.
B. ALLGEMEINE VERFAHREN
Allgemein stellt die Erfindung ein Verfahren zur Entfernung von Elementen einer α-hefikalen Sekundärstruktur aus dem Gefüge eines Proteins bereit, ohne dass die wohldefinierte Struktur innerhalb der α-Helix des Proteins verloren geht. In einem Aspekt dient das Verfahren zur künstlichen Rekonstruktion und Charakterisierung der Bindungsdeterminanten, die innerhalb einer α-helikalen Bindungsdomäne eines Proteins von Interesse vorhanden sind. Der Entwurf von Molekülen, die an einem Proteinbindungsabschnitt zur kompetitiven Bindung in der Lage sind, erfordert die Fähigkeit, die übergeordnete Struktur des natürlichen Liganden nachzuahmen. Wenn die Struktur des Liganden an der Stelle des Proteinbindungsabschnitts mit einem kurzen Peptid nachgeahmt werden kann, dann kann das Peptid dazu verwendet werden, um zu bestimmen, ob es mäglich ist, kleine Moleküle zu entwerfen, die kompetitiv an den Prateinbindungsabschnitt binden. Die Fähigkeit eines kurzen Peptids, mit dem natürlichen Liganden um die Bindung an den Proteinbindungsabschnitt zu konkurrieren, würde darauf hinweisen, dass die Struktur des Liganden am Kontaktpunkt mit dem Proteinbindungsabschnitt so aussieht, dass das kurze Peptid als Modell zum Entwurf von kleinen Molekülen verwendet werden könne, die mit dem natürlichen Liganden um die Bindung an den Proteinbindungsabschnitt konkurrieren.
In einem anderen Aspekt werden die Verfahren der Erfindung dazu verwendet, die Konformationsstruktur eines Proteins oder Peptids zu stabilisieren. Die vorliegenden Verfahren können eingesetzt werden, um eine (oder mehrere) α-helikale Determinanten von Interesse in einem Protein oder Peptid an ihrer Position zu fixieren, sodass das Protein (oder Peptid) in Umgebungen oder unter Bedingungen, welche die α-helikale Sekundärstruktur einer nichteingeschränkten Protein- oder Peptidspezies destabilisieren oder verschlechtern würden, eine α-helikale Konformation beibehält.
Die Verfahren der Erfindung sind auch zur Replikation einer Proteinfunktion ohne intaktes Protein oder intakte funktionelle Domäne zweckdienlich. Die Replikation der Bindungsaktivität eines Proteins durch ein eingeschränktes helikales Peptid der Erfindung würde die Anwendung von Affinitätsreinigungsverfahren für den Liganden des Proteins ermöglichen, ohne dass ein intaktes Protein oder große Fragmente davon bereitgestellt werden müssten. Somit könnte ein eingeschränktes helikales Peptid, dass die Bindungsaktivität eines bestimmten Proteins aufweist, die Verwendung des Proteins in der Affinitätsreinigung verhindernde Liefer- oder Kostenprobleme lösen. In einem weiteren Beispiel könnte ein eingeschränktes helikales Peptid, das die Konformationsstruktur an der Stelle von Interesse in einem bestimmten Protein aufweist, zur Isolierung eines Konformationsepitops vom Rest des Proteins zur Bildung von Antikörpern gegen das einzelne Epitop von Interesse ohne Störung von den anderen antigenen Stellen, die im intakten Protein vorhanden sind, verwendet werden.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Verbindungen der Erfindung, die eingeschränkte helikale Peptide mit internen Aminosäuresequenzen aus der HIV-Isolat-LAI-gp41-Aminosäuresequenz 633–678 und Homologen davon aufweisen, als Haptene, Vakzinen und in der Diagnostik.
In einem weiteren Aspekt können die Verfahren und Peptide der Erfindung zur Schaffung von kombinatorischen Bibliotheken von eingeschränkten helikalen Peptiden verwendet werden, die für chemische Selektionssysteme geeignet sind.
I. Arretiere Helixpeptide und Anwendungsmöglichkeiten
Die Erfindung stellt arretierte Helixpeptide der Formel (1) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; m und p unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass m + p kleiner als oder gleich 6 ist, und n eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (m + p)) bis (9 – (m + p)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass n größer als 1 ist;
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (2) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäurese quenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (3) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (4) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (5) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (6) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; q aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, und s aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass q + s kleiner als oder gleich 7 ist; und r eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (q + s)) bis (9 – (q + s)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass r größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (7) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (8) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromalekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (9) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (10) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (11) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; t aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, und v aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass t + v kleiner als oder gleich 7 ist; und u eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (t + v)) bis (9 – (t + v)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass u größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (12) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (13) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (14) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (15) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (16) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; w und y unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass w + y kleiner als oder gleich 8 ist, und x eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (w + y)) bis (9 – (w + y)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass x größer als oder gleich 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (17) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromalekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (18) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (19) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (20) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist; und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (1), Formel (2), Formel (3), Formel (4), Formel (5), Formel (6), Formel (7), Formel (8), Formel (9), Formel (10), Formel (11), Formel (12), Formel (13), Formel (14), Formel (15), Formel (16), Formel (17), Formel (18), Formel (19) und Formel (20) bereit, worin X, Y und Z gemeinsam bis zu oder etwa 35 Aminosäuren enthalten (d.h. arretierte Helixpeptide der Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19) und (20), die jeweils insgesamt nicht mehr als oder etwa 35 Aminosäurereste enthalten).
Außerdem werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1), Formel (2), Formel (3), Formel (4), Formel (5), Formel (6), Formel (7), Formel (8), Formel (9), Formel (10), Formel (11), Formel (12), Formel (13), Formel (14), Formel (15), Formel (16), Formel (17), Formel (18), Formel (19) und Formel (24) bereitgestellt, worin X und/oder Y bis zu oder etwa 30 Aminosäurereste enthält/enthalten.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1), Formel (2), Formel (3), Formel (4), Formel (5), Formel (6), Formel (7), Formel (8), Formel (9), Formel (10), Formel (11), Formel (12), Formel (13), Formel (14), Formel (15), Formel (16), Formel (17), Formel (18), Formel (19) und Formel (20) bereitgestellt, worin X und/oder Y bis zu oder etwa 25 Aminosäurereste enthält/enthalten.
Außerdem werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1), Formel (2), Formel (3), Formel (4), Formel (5), Formel (6), Formel (7), Formel (8), Formel (9), Formel (10), Formel (11), Formel (12), Formel (13), Formel (14), Formel (15), Formel (16); Formel (17), Formel (18), Formel (19) und Formel (20) bereitgestellt, worin X und/oder Y bis zu oder etwa 20 Aminosäurereste enthält/enthalten.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1), Formel (2), Formel (3), Formel (4), Formel (5), Formel (6), Formel (7), Formel (8), Formel (9), Formel (10), Formel (11), Formel (12), Formel (13), Formel (14), Formel (15), Formel (16), Formel (17), Formel (18), Formel (19) und Formel (20) bereitgestellt, worin X und/oder Y bis zu oder etwa 15 Aminosäurereste enthält/enthalten.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1), Formel (2), Formel (3), Formel (4), Formel (5), Formel (6), Formel (7), Formel (8), Formel (9), Formel (10), Formel (11), Formel (12), Formel (13), Formel (14), Formel (15), Formel (16), Formel (17), Formel (18), Formel (19) und Formel (20) bereitgestellt, worin X und/oder Y bis zu oder etwa 10 Aminosäurereste enthält/enthalten.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1), Formel (2), Formel (3), Formel (4), Formel (5), Formel (6), Formel (7), Formel (8), Formel (9), Formel (10), Formel (11), Formel (12), Formel (13), Formel (14), Formel (15), Formel (16), Formel (17), Formel (18), Formel (19) und Formel (20) bereitgestellt, worin X und/oder Y bis zu oder etwa 5 Aminosäurereste enthält enthalten.
Auch innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung liegen arretierte Helixpeptide der Formel (1), Formel (2), Formel (3), Formel (4), Formel (5), Formel (6), Formel (7), Formel (8), Formel (9), Formel (10), Formel (11), Formel (12), Formel (13), Formel (14), Formel (15), Formel (16), Formel (17), Formel (18), Formel (19) und Formel (20), worin X und/oder Y bis zu oder etwa 3 Aminosäurereste enthält/enthalten.
Die Erfindung stellt auch arretierte Helixpeptide der Formel (1a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, m und p unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass m + p kleiner als oder gleich 6 ist, und n eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (m + p)) bis (9 – (m + p)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass n größer als 1 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (3a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (4a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (5a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlassen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (6a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, q aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, s aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass q + s kleiner als oder gleich 7 ist, und r eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (q + s)) bis (9 – (q + s)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass r größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (7a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (8a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (9a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (10a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (11a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, t aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist und v aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass t + v kleiner als oder gleich 7 ist, und u eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (t + v)) bis (9 – (t + v)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass u größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Forme (12a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminasäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (13a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (14a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (16a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, w und y unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass w + y kleiner als oder gleich 8 ist, und x eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (w + y)) bis (9 – (w + y)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass x größer als oder gleich 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (17a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (18a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (19a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (20a) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (1 a), Formel (2a), Formel (3a), Formel (4a), Formel (5a), Formel (6a), Formel (7a), Formel (8a), Formel (9a), Formel (10a), Formel (11a), Formel (12a), Formel (13a), Formel (14a), Formel (15a), Formel (16a), Formel (17a), Formel (18a), Formel (19a) und Formel (20a) bereit, worin X, Y und Z gemeinsam bis zu oder etwa 12 Aminosäuren enthalten (d.h. arretierte Helixpeptide der Formeln (1a), (2a), (3a), (4a), (5a), (6a), (7a), (8a), (9a), (10a), (11a), (12a), (13a), (14a), (15a), (16a), (17a), (18a), (19a) und (20a), die jeweils insgesamt nicht mehr als oder etwa 12 Aminosäurereste enthalten).
Außerdem werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1a), Formel (2a), Formel (3a), Formel (4a), Formel (5a), Formel (6a), Formel (7a), Formel (8a), Formel (9a), Formel (10a), Formel (11a), Formel (12a), Formel (13a), Formel (14a), Formel (15a), Formel (16a), Formel (17a), Formel (18a), Formel (19a) und Formel (20a) bereitgestellt, worin X und/oder Y bis zu oder etwa 30 Aminosäurereste enthält/enthalten.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1a), Formel (2a), Formel (3a), Formel (4a), Formel (5a), Formel (6a), Formel (7a), Formel (8a), Formel (9a), Formel (10a), Formel (11a), Formel (12a), Formel (13a), Formel (14a), Formel (15a), Formel (16a), Formel (17a), Formel (18a), Formel (19a) und Formel (20a) bereitgestellt, worin X und/oder Y bis zu oder etwa 25 Aminosäurereste enthält/enthalten.
Außerdem werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1a), Formel (2a), Formel (3a), Formel (4a), Formel (5a), Formel (6a), Formel (7a), Formel (8a), Formel (9a), Formel (10a), Formel (11a), Formel (12a), Formel (13a), Formel (14a), Formel (15a), Formel (16a), Formel (17a), Formel (18a), Formel (19a) und Formel (20a) bereitgestellt, worin X und/oder Y bis zu oder etwa 20 Aminosäurereste enthält/enthalten.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1a), Formel (2a), Formel (3a), Formel (4a), Formel (5a), Formel (8a), Formel (7a), Formel (8a), Formel (9a), Formel (10a), Formel (11a), Formel (12a), Formel (13a), Formel (14a), Formel (15a), Formel (16a), Formel (17a), Formel (18a), Formel (19a) und Formel (20a) bereitgestellt, worin X und/oder Y bis zu oder etwa 15 Aminosäurereste enthält/enthalten.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1a), Formel (2a), Formel (3a), Formel (4a), Formel (5a), Formel (6a), Formel (7a), Formel (8a), Formel (9a), Formel (10a), Formel (11a), Formel (12a), Formel (13a), Formel (14a), Formel (15a), Formel (16a), Formel (17a), Formel (18a), Formel (19a) und Formel (20a) bereitgestellt, worin X und/oder Y bis zu oder etwa 10 Aminosäurereste enthält/enthalten.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1a), Formel (2a), Formel (3a), Formel (4a), Formel (5a), Formel (6a), Formel (7a), Formel (8a), Formel (9a), Formel (10a), Formel (11a), Formel (12a), Formel (13a), Formel (14a), Formel (15a), Formel (16a), Formel (17a), Formel (18a), Formel (19a) und Formel (20a) bereitgestellt, worin X und/oder Y bis zu oder etwa 5 Aminosäurereste enthält/enthalten.
Auch innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung liegen arretierte Helixpeptide der Formel (1a), Formel (2a), Formel (3a), Formel (4a), Formel (5a), Formel (6a), Formel (7a), Formel (8a), Formel (9a), Formel (10a), Formel (11a), Formel (12a), Formel (13a), Formel (14a), Formel (15a), Formel (16a), Formel (17a), Formel (18a), Formel (19a) und Formel (20a), worin X und/oder Y bis zu oder etwa 3 Aminosäurereste enthält/enthalten.
Die Erfindung stellt auch arretierte Helixpeptide der Formel (1b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, m und p unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass m + p kleiner als oder gleich 6 ist, und n eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (m + p)) bis (9 – (m + p)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass n größer als 1 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (2b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (3b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (4b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (5b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (6b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, q aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, s aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass q + s kleiner als aller gleich 7 ist, und r eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (q + s)) bis (9 – (q + s)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass r größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (7b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Amionsäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (8b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (9b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (10b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (11b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, t aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist und v aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass t + v kleiner als oder gleich 7 ist, und u eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (t + v)) bis (9 – (t + v)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass u größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (12b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (13b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (14b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminasäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (15b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (16b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, w und y unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass w + y kleiner als oder gleich 8 ist, und x eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (w + y)) bis (9 – (w + y)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass x größer als oder gleich 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (17b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (18b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (19b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (20b) bereit:
worin Y Hydroxyl oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
Außerdem werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1b), Formel (2b), Formel (3b), Formel (4b), Formel (5b), Formel (6b), Formel (7b), Formel (8b), Formel (9b), Formel (10b), Formel (11b), Formel (12b), Formel (13b), Formel (14b), Formel (15b), Formel (16b), Formel (17b), Formel (18b), Formel (19b) und Formel (20b) bereitgestellt, worin Y bis zu oder etwa 30 Aminosäurereste enthält.
Außerdem werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1b), Formel (2b), Formel (3b), Formel (4b), Formel (5b), Formel (6b), Formel (7b), Formel (8b), Formel (9b), Formel (10b), Formel (11b), Formel (12b), Formel (13b), Formel (14b), Formel (15b), Formel (16b), Formel (17b), Formel (18b), Formel (19b) und Formel (20b) bereitgestellt, worin Y bis zu oder etwa 25 Aminosäurereste enthält.
Außerdem werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1b), Formel (2b), Formel (3b), Formel (4b), Formel (5b), Formel (6b), Formel (7b), Formel (8b), Formel (9b), Formel (10b), Formel (11b), Formel (12b), Formel (13b), Formel (14b), Formel (15b), Formel (16b), Formel (17b), Formel (18b), Formel (19b) und Formel (20b) bereitgestellt, worin Y bis zu oder etwa 20 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1b), Formel (2b), Formel (3b), Formel (4b), Formel (5b), Formel (6b), Formel (7b), Formel (8b), Formel (9b), Formel (10b), Formel (11b), Formel (12b), Formel (13b), Formel (14b), Formel (15b), Formel (16b), Formel (17b), Formel (18b), Formel (19b) und Formel (20b) bereitgestellt, worin Y bis zu oder etwa 15 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1b), Formel (2b), Formel (3b), Formel (4b), Formel (5b), Formel (6b), Formel (7b), Formel (8b), Formel (9b), Formel (10b), Formel (11b), Formel (12b), Formel (13b), Formel (14b), Formel (15b), Formel (16b), Formel (17b), Formel (18b), Formel (19b) und Formel (20b) bereitgestellt, worin Y bis zu oder etwa 10 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1b), Formel (2b), Formel (3b), Formel (4b), Formel (5b), Formel (6b), Formel (7b), Formel (8b), Formel (9b), Formel (10b), Formel (11b), Formel (12b), Formel (13b), Formel (14b), Formel (15b), Formel (16b), Formel (17b), Formel (18b), Formel (19b) und Formel (20b) bereitgestellt, worin Y bis zu oder etwa 5 Aminosäurereste enthält.
Auch innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung liegen arretierte Helixpeptide der Formel (1b), Formel (2b), Formel (3b), Formel (4b), Formel (5b), Formel (6b), Formel (7b), Formel (8b), Formel (9b), Formel (10b), Formel (11b), Formel (12b), Formel (13b), Formel (14b), Formel (15b), Formel (16b), Formel (17b), Formel (18b), Formel (19b) und Formel (20b), worin Y bis zu oder etwa 3 Aminosäurereste enthält.
Die Erfindung stellt auch arretierte Helixpeptide der Formel (1c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, m und p unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass m + p kleiner als oder gleich 6 ist, und n eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (m + p)) bis (9 – (m + p)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass n größer als 1 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (2c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (3c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (4c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (5c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (6c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, q aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, s aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass q + s kleiner als oder gleich 7 ist, und r eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (q + s)) bis (9 – (q + s)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass r größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (7c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (8c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (9c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäureseqenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (10c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (11c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, t aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist und v aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass t + v kleiner als oder gleich 7 ist, und u eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (t + v)) bis (9 – (t + v)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass u größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (12c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (13c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (14c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausfürhrungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (15c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (16c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminasäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, w und y unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass w + y kleiner als oder gleich 8 ist, und x eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (w + y)) bis (9 – (w + y)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass x größer als oder gleich 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (17c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (18c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretiere Helixpeptide der Formel (19c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (20c) bereit:
worin X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
Außerdem werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1c), Formel (2c), Formel (3c), Formel (4c), Formel (5c), Formel (6c), Formel (7c), Formel (8c), Formel (9c), Formel (10c), Formel (11c), Formel (12c), Formel (13c), Formel (14c), Formel (15c), Formel (16c), Formel (17c), Formel (18c), Formel (19c) und Formel (20c) bereitgestellt, worin X bis zu oder etwa 30 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1c), Formel (2c), Formel (3c), Formel (4c), Formel (5c), Formel (6c), Formel (7c), Formel (8c), Formel (9c), Formel (10c), Formel (11c), Formel (12c), Formel (13c), Formel (14c), Formel (15c), Formel (16c), Formel (17c), Formel (18c), Formel (19c) und Formel (20c) bereitgestellt, worin X bis zu oder etwa 25 Aminosäurereste enthält.
Außerdem werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1c), Formel (2c), Formel (3c), Formel (4c), Formel (5c), Formel (6c), Formel (7c), Formel (8c), Formel (9c), Formel (10c), Formel (11c), Formel (12c), Formel (13c), Formel (14c), Formel (15c), Formel (16c), Formel (17c), Formel (18c), Formel (19c) und Formel (20c) bereitgestellt, worin X bis zu oder etwa 20 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1c), Formel (2c), Formel (3c), Formel (4c), Formel (5c), Formel (6c), Formel (7c), Formel (8c), Formel (9c), Formel (10c), Formel (11c), Formel (12c), Formel (13c), Formel (14c), Formel (15c), Formel (16c), Formel (17c), Formel (18c), Formel (19c) und Formel (20c) bereitgestellt, worin X bis zu oder etwa 15 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1c), Formel (2c), Formel (3c), Formel (4c), Formel (5c), Formel (6c), Formel (7c), Formel (8c), Formel (9c), Formel (10c), Formel (11c), Formel (12c), Formel (13c), Formel (14c), Formel (15c), Formel (16c), Formel (17c), Formel (18c), Formel (19c) und Formel (20c) bereitgestellt, worin X bis zu oder etwa 10 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1c), Formel (2c), Formel (3c), Formel (4c), Formel (5c), Formel (6c), Formel (7c), Formel (8c), Formel (9c), Formel (10c), Formel (11c), Formel (12c), Formel (13c), Formel (14c), Formel (15c), Formel (16c), Formel (17c), Formel (18c), Formel (19c) und Formel (20c) bereitgestellt, worin X bis zu oder etwa 5 Aminosäurereste enthält.
Auch innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung liegen arretierte Helixpeptide der Formel (1c), Formel (2c), Formel (3c), Formel (4c), Formel (5c), Formel (6c), Formel (7c), Formel (8c), Formel (9c), Formel (10c), Formel (11c), Formel (12c), Formel (13c), Formel (14c), Formel (15c), Formel (16c), Formel (17c), Formel (18c), Formel (19c) und Formel (20c), worin X bis zu oder etwa 3 Aminosäurereste enthält.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung auch arretierte Helixpeptide der Formel (1d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, m und p unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass m + p kleiner als oder gleich 6 ist, und n eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (m + p)) bis (9 – (m + p)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass n größer als 1 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (2d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (3d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (4d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (5d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (6d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, q aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, s aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass q + s kleiner als oder gleich 7 ist, und r eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (q + s)) bis (9 – (q + s)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass r größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (7d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminasäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (8d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (9d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (10d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (11d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, t aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist und v aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass t + v kleiner als oder gleich 7 ist, und u eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (t + v)) bis (9 – (t + v)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass u größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (12d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (13d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (14d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (15d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (16d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, w und y unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass w + y kleiner als oder gleich 8 ist, und x eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (w + y)) bis (9 – (w + y)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass x größer als oder gleich 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (17d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminasäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (18d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (19d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (20d) bereit:
worin Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
Die Erfindung stellt auch arretierte Helixpeptide der Formel (1e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, m und p unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass m + p kleiner als oder gleich 6 ist, und n eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (m + p)) bis (9 – (m + p)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass n größer als 1 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (2e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (3e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (4e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (5e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (6e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, q aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, s aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass q + s kleiner als oder gleich 7 ist, und r eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (q + s)) bis (9 – (q + s)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass r größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (7e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (8e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (9e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (10e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (11e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eins beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, t aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist und v aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass t + v kleiner als oder gleich 7 ist, und u eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (t + v)) bis (9 – (t + v)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass u größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (12e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (13e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (14e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (15e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (16e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, w und y unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass w + y kleiner als oder gleich 8 ist, und x eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (w + y)) bis (9 – (w + y)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass x größer als oder gleich 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (17e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (18e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs A minosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen- eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Form (19e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (20e) bereit:
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs A minasäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
Außerdem werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1e), Formel (2e), Formel (3e), Formel (4e), Formel (5e), Formel (6e), Formel (7e), Formel (8e), Formel (9e), Formel (10e), Formel (11e), Formel (12e), Formel (13e), Formel (14e), Formel (15e), Formel (16e), Formel (17e), Formel (18e), Formel (19e) und Formel (20e) bereitgestellt, worin Y bis zu oder etwa 30 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1e), Formel (2e), Formel (3e), Formel (4e), Formel (5e), Formel (6e), Formel (7e), Formel (8e), Formel (9e), Formel (10e), Formel (11e), Formel (12e), Formel (13e), Formel (14e), Formel (15e), Formel (16e), Formel (17e), Formel (18e), Formel (19e) und Formel (20e) bereitgestellt, worin Y bis zu oder etwa 25 Aminosäurereste enthält.
Außerdem werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1e), Formel (2e), Formel (3e), Formel (4e), Formel (5e), Formel (6e), Formel (7e), Formel (8e), Formel (9e), Formel (10e), Formel (11e), Formel (12e), Formel (13e), Formel (14e), Formel (15e), Formel (16e), Formel (17e), Formel (18e), Formel (19e) und Formel (20e) bereitgestellt, worin Y bis zu oder etwa 20 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1e), Formel (2e), Formel (3e), Formel (4e), Formel (5e), Formel (6e), Formel (7e), Formel (8e), Formel (9e), Formel (10e), Formel (11e), Formel (12e), Formel (13e), Formel (14e), Formel (15e), Formel (16e), Formel (17e), Formel (18e), Formel (19e) und Formel (20e) bereitgestellt, worin Y bis zu oder etwa 15 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1e), Formel (2e), Formel (3e), Formel (4e), Formel (5e), Formel (6e), Formel (7e), Formel (8e), Formel (9e), Formel (10e), Formel (11e), Formel (12e), Formel (13e), Formel (14e), Formel (15e), Formel (16e), Formel (17e), Formel (18e), Formel (19e) und Formel (20e) bereitgestellt, worin Y bis zu oder etwa 10 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1e), Formel (2e), Formel (3e), Formel (4e), Formel (5e), Formel (6e), Formel (7e), Formel (8e), Formel (9e), Formel (10e), Formel (11e), Formel (12e), Formel (13e), Formel (14e), Formel (15e), Formel (16e), Formel (17e), Formel (18e), Formel (19e) und Formel (20e) bereitgestellt, worin Y bis zu oder etwa 5 Aminosäurereste enthält.
Auch innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung liegen arretierte Helixpeptide der Formel (1e), Formel (2e), Formel (3e), Formel (4e), Formel (5e), Formel (6e), Formel (7e), Formel (8e), Formel (9e), Formel (10e), Formel (11e), Formel (12e), Formel (13e), Formel (14e), Formel (15e), Formel (16e), Formel (17e), Formel (18e), Formel (19e) und Formel (20e), worin Y bis zu oder etwa 3 Aminosäurereste enthält.
Die Erfindung stellt auch arretierte Helixpeptide der Formel (1f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, m und p unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass m + p kleiner als oder gleich 6 ist, und n eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (m + p)) bis (9 – (m + p)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass n größer als 1 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (2f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (3f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (4f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, 2 eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (5f) beriet:
worin S Hydroxyl oder ein Makramolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (6f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, q aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, s aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass q + s kleiner als oder gleich 7 ist, und r eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (q + s)) bis (9 – (q + s)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass r größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (7f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (8f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, beste hend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (9f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (10f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (11f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, t aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist und v aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass t + v kleiner als oder gleich 7 ist, und u eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (t + v)) bis (9 – (t + v)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass u größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (12f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (13f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (14f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (15f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (16f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, w und y unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass w + y kleiner als oder gleich 8 ist, und x eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (w + y)) bis (9 – (w + y)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass x größer als oder gleich 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (17f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (18f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (19f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (20f) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
Außerdem werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1f), Formel (2f), Formel (3f), Formel (4f), Formel (5f), Formel (6f), Formel (7f), Formel (8f), Formel (9f), Formel (10f), Formel (11f), Formel (12f), Formel (13f), Formel (14f), Formel (15f), Formel (16f), Formel (17f), Formel (18f), Formel (19f) und Formel (20f) bereitgestellt, worin X bis zu oder etwa 30 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1f), Formel (2f), Formel (3f), Formel (4f), Formel (5f), Formel (6f), Formel (7f), Formel (8f), Formel (9f), Formel (10f), Formel (11f), Formel (12f), Formel (13f), Formel (14f), Formel (15f), Formel (16f), Formel (17f), Formel (18f), Formel (19f) und Formel (20f) bereitgestellt, worin X bis zu oder etwa 25 Aminosäurereste enthält.
Außerdem werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1f), Formel (2f), Formel (3f), Formel (4f), Formel (5f), Formel (6f), Formel (7f), Formel (8f), Formel (9f), Formel (10f), Formel (11f), Formel (12f), Formel (13f), Formel (14f), Formel (15f), Formel (16f), Formel (17f), Formel (18f), Formel (19f) und Formel (20f) bereitgestellt, worin X bis zu oder etwa 20 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1f), Formel (2f), Formel (3f), Formel (4f), Formel (5f), Formel (6f), Formel (7f), Formel (8f), Formel (9f), Formel (10f), Formel (11f), Formel (12f), Formel (13f), Formel (14f), Formel (15f), Formel (16f), Formel (17f), Formel (18f), Formel (19f) und Formel (20f) bereitgestellt, worin X bis zu oder etwa 15 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1f), Formel (2f), Formel (3f), Formel (4f), Formel (5f), Formel (6f), Formel (7f), Formel (8f), Formel (9f), Formel (10f), Formel (11f), Formel (12f), Formel (13f), Formel (14f), Formel (15f), Formel (16f), Formel (17f), Formel (18f), Formel (19f) und Formel (20f) bereitgestellt, worin X bis zu oder etwa 10 Aminosäurereste enthält.
Weiters werden hierin arretierte Helixpeptide der Formel (1f), Formel (2f), Formel (3f), Formel (4f), Formel (5f), Formel (6f), Formel (7f), Formel (8f), Formel (9f), Formel (10f), Formel (11f), Formel (12f), Formel (13f), Formel (14f), Formel (15f), Formel (16f), Formel (17f), Formel (18f), Formel (19f) und Formel (20f) bereitgestellt, worin X bis zu oder etwa 5 Aminosäurereste enthält.
Auch innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung liegen arretierte Helixpeptide der Formel (1f), Formel (2f), Formel (3f), Formel (4f), Formel (5f), Formel (6f), Formel (7f), Formel (8f), Formel (9f), Formel (10f), Formel (11f), Formel (12f), Formel (13f), Formel (14f), Formel (15f), Formel (16f), Formel (17f), Formel (18f), Formel (19f) und Formel (20f), worin X bis zu oder etwa 3 Aminosäurereste enthält.
Die Erfindung stellt auch arretierte Helixpeptide der Formel (1g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, m und p unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass m + p kleiner als oder gleich 6 ist, und n eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (m + p)) bis (9 – (m + p)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass n größer als 1 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (2g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (3g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (4g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (5g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (6g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, q aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, s aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass q + s kleiner als oder gleich 7 ist, und r eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (q + s)) bis (9 – (q + s)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass r größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (7g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (8g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (9g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (10g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (11g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, t aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist und v aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass t + v kleiner als oder gleich 7 ist, und u eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (t + v)) bis (9 – (t + v)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass u größer als 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (12g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (13g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (14g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (15g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (16g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, w und y unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass w + y kleiner als oder gleich 8 ist, und x eine beliebige ganze Zahl im Be reich von (7 – (w + y)) bis (9 – (w + y)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass x größer als oder gleich 0 ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (17g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (18g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 4 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (19g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 5 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung arretierte Helixpeptide der Formel (20g) bereit:
worin S Hydroxyl oder ein Makromolekül ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, und n eine beliebige ganze Zahl von 3 bis 5, Grenzen eingeschlossen, ist.
Für arretierte Helixpeptide der Formel (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (1e), (2e), (3e), (4e), (5e), (6e), (7e), (8e), (9e), (10e), (11e), (12e), (13e), (14e), (15e), (16e), (17e), (18e), (19e), (20e), (1f), (2f), (3f), (4f), (5f), (6f), (7f), (8f), (9f), (10f), (11f), (12f), (13f), (14f), (15f), (16f), (17f), (18f), (19f), (20f), (1g), (2g), (3g), (4g), (5g), (6g), (7g), (8g), (9g), (10g), (11g), (12g), (13g), (14g), (15g), (16g), (17g), (18g), (19g) oder (20g), die an ein Makromolekül gebunden sind, kommt gemäß der Erfindung jedes beliebige Makromolekül in Betracht, das als Anker für den C-Terminus des arretierten Helixpeptids dienen kann. Typischerweise dient das Makromolekül als fester Träger. Der feste Träger ist im Allgemeinen eine inerte Matrix, wie z.B. ein polymeres Gel, das ein(e) dreidimensionale(s) Struktur, Gitter oder Netzwerk eines Materials aufweist. Nahezu jedes beliebige Makromolekül, synthetisch oder natürlich, kann ein Gel in einer geeigneten Flüssigkeit bilden, wenn es auf geeignete Weise mit einem difunktionellen Reagens vernetzt ist. In einer Ausführungsform ist das ausgewählte Makromolekül zur Verwendung für die Affinitätschromatographie geeignet. Die meisten chromatographischen Matrices, die für die Affinitätschromatographie verwendet werden, sind Xerogele. Solche Gele schrumpfen beim Trocknen zu einem kompakten Feststoff, der nur die Gelmatrix umfasst. Wenn das getrocknete Xerogel in der Flüssigkeit resuspendiert wird, nimmt die Gelmatrix Flüssigkeit auf, quillt und kehrt wieder in den Gelzustand zurück. Zur Verwendung hierin geeignete Xerogele umfassen Polymergele, wie z.B. Cellulose, vernetzte Dextrane (z.B. Sepharose), Agarose, vernetzte Agarose, Polyacrylamid-Gele und Polyacrylamid-Agarose-Gele.
Die hierin bereitgestellten arretierten Helixpeptide können nach den in den nachstehenden Abschnitten II und III beschriebenen Verfahren der Erfindung konstruiert werden.
In einer Ausführungsform sind die Peptide der Erfindung so entworfen, dass sie die Bindungsdeterminanten aus α-helikalen Bindungsdomänen von bekannten Proteinen isolieren. Solche Peptide sind für eine Reihe von Anwendungen geeignet, einschließlich der Bestimmung, ob eine Bindungsdeterminante in einer α-helikalen Bindungsdomäne eines bekannten Proteins als Strukturmodell für den Entwurf von Peptidmimetika oder kleinen Molekülen geeignet ist, die zur Nachahmung oder Wirkung gegen die Bindungsaktivität des intakten Proteins in der Lage sind. Bei der Verwendung der Peptide der Erfindung Für diesen Zweck wählt der Anwender selbst ein Bindungsprotein mit einer helikalen Domäne aus, die mit einem Liganden wechselwirkt, und identifiziert dann eine Kandidatenbindungsdeterminante, die sich innerhalb einer Sequenz aus sechs (oder mehr) zusammenhängenden Aminosäuren in der helikalen Bindungsdomäne befindet. Die Kandidatenbindungsdomäne kann unter Verwendung von Alanin-Scanning-Mutagenese identifiziert werden, um zu bestimmen, ob die Kandidatensequenz einen oder mehrere Aminosäurereste enthält, die für die Ligandenbindung entscheidend sind. Als Nächstes wird ein eingeschränktes Peptid, das die Kandidatensequenz enthält, entworfen, indem zwei Reste in der Kandidatensequenz (bezeichnet als I und I+7), die durch eine dazwischenliegende Sequenz aus sechs Aminosäuren getrennt sind und nicht mit einem Liganden wechselwirken (wie durch die Alanin-Scanning-Mutagenese im vorherigen Schritt bestimmt wurde) zur Substitution mit Aminosäureresten einer Seitenkette, die einen eine Amidbindung bildenden Substituenten enthält, ausgewählt werden. Das Peptid wird synthetisiert, und die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der fremden I- und I+7-Reste werden genutzt, um das Peptid gemäß den im nachstehenden Abschnitt II beschriebenen Verfahren der Erfindung in α-helikaler Konformation festzumachen. Schließlich wird die Bindungsaktivität des arretierten Helixpeptids mit dem Liganden getestet, beispielsweise in einem Bindungskompetitionstest mit dem intakten Bindungsprotein, und die Ergebnisse des Tests können verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein peptidmimetischer oder kleinmolekularer Antagonist unter Verwendung der Bindungsdeterminante als Strukturmodell entwickelt werden könnte.
In einer weiteren Ausführungsform werden die arretierten Helixpeptide der Erfindung eingesetzt, um intakte Bindungsproteine oder Proteinbindungsdomänen bei der Affinitätsreinigung eines Liganden zu ersetzen. Beispielsweise wird Protein A im Allgemeinen zur affinitätschromatographischen Reinigung von IyG-Molekülen eingesetzt. Wie im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben wird, kann eine arretierte Helixspezies des Peptids Phe-Asn-Met-(1)-Gln-Gln-Arg-Arg-Phe-Tyr-(2)-Ala-Leu-His (worin die Aminosäurereste an den Positionen (1) und (2) in der entsprechenden Z-Domänensequenz beide durch Glutaminsäurereste ersetzt sind), die einer Bindungsdeterminante in Helix 1 der Z-Domäne entspricht, zur Bindung von IgG verwendet werden. Demgemäß stellt die Erfindung eingeschränkte Helixspezies bereit, die Bindungsdeterminanten in Helix 1 der Z-Domäne in Protein A enthalten, einschließlich Molekülen der obigen Formel (4), worin Z Gln-Gln-Arg-Arg-Phe-Tyr ist. In einer Ausführungsform ist die eingeschränkte Helixspezies ein Molekül der Formel (4), worin Z Gln-Gln-Arg-Arg-Phe-Tyr ist, X Phe-Asn-Met ist und Y Ala-Leu-His ist. Die IgG-Bindungsmoleküle der Erfindung werden am besten unter Einsatz der im nachstehenden Abschnitt II beschriebenen Festphasen-Peptidsyntheseverfahren synthetisiert, sodass die Moleküle an Harzkügelchen verankert sind, die für Säulen- oder Chargenaffinitätschromatographie geeignet sind.
In einer weiteren Ausführungsform sind die arretierten Helixpeptide der Erfindung so aufgebaut, dass sie Epitope in Proteinen nachahmen, und werden verwendet, um polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen solche Epitope zu bilden. Da die Peptide häufig zu klein sind, um eine Immunantwort zu erzeugen, können die Peptide unter Verwendung eines difunktionellen oder derivatisierenden Mittels, beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N=C=NR, worin R und R¹ unterschiedliche Alkylgruppen sind, an Träger konjugiert werden, die bekanntermaßen in der zu immunisierenden Spezies immunogen sind, beispielsweise Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglabulin oder Sojabohnentrypsininhibitor.
Die arretierten Helixpeptide der Erfindung sind vor allem zur Isolierung von synthetischen Antikörperklonen mit ausgewählter Bindungsaktivität aus kombinatorischen Phagendisplay-Bibliotheken nützlich. Das arretierte Helixpeptid bringt dahingehend einen deutlichen Vorteil gegenüber dem intakten Protein oder der Proteindomäne mit sich, dass die Verwendung des arretierten Helixpeptids die Isolierung von Bindungsaktivitäten für das jeweilige Konformationsepitop von Interesse ermöglicht. Ohne die arretierten Helixpeptide der Erfindung würde das Konformationsepitop wahrscheinlich eine strukturelle Unterstützung von anderen Regionen des Proteins oder der Proteindomäne erfordern, deren Gegenwart im Liganden zur gleichzeitigen Isolierung von unerwünschten Klonen führen würde. Außerdem würde die Synthese von arretierten Helixpeptiden, die an polymeren Harzen verankert sind, wie in den nachste henden Abschnitten II und III beschrieben wird, Material bereitstellen, das leicht zum Panning von Phagendisplay-Bibliotheken in Säulen gepackt werden kann.
In einem weiteren Aspekt werden die arretierten Helixpeptide der Erfindung verwendet, um konformationsstabile Varianten von Peptiden oder Proteinen bereitzustellen, die in nichteingeschränkter Form unter Bedingungen von Interesse eine „wackelige" oder instabile α-helikale Sekundärstruktur an einer oder mehreren Stellen aufweisen. Vor allem können die Verfahren der Erfindung Probleme einiger Antigene lösen, die mit der instabilität von Konformationsepitopen zusammenhängen. Manchmal ist ein Konformationsepitop aufgrund eines oder mehrerer „wackeliger" oder instabiler α-helikaler Sekundärstrukturelemente im Epitop nicht in der Lage, die gewünschte antigene Determinante zu präsentieren. Die Einschränkung solcher „wackeliger" α-helikaler Strukturen gemäß den Verfahren der Erfindung würde das Konformationsepitop stabilisieren und eine Präsentation der gewünschten antigenen Determinante ermöglichen. Diese Anwendung der vorliegenden Verfahren und Peptide ist beispielsweise bei der Vakzinenentwicklung und Bildung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern aus Wirtstieren oder Isolierung von Antikörperklonen aus Phagendisplay-Bibliotheken besonders nützlich.
In einer Ausführungsform der Erfindung, in der die arretierten Helixpeptide der Erfindung verwendet werden, um konformationsstabile Varianten von Peptiden oder Proteinen bereitzustellen, die in nichteingeschränkter Form unter Bedingungen von Interesse eine „wackelige" oder instabile α-helikale Sekundärstruktur an einer oder mehreren Stellen aufweisen, wird eine Verbindung bereitgestellt, die ein eingeschränktes helikales Peptid enthält, das als Immunogen, als Vakzine und zur Diagnose des HIV (Human Immunodeficiency Virus) zweckdienlich ist. AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) wird durch ein Retrovirus ausgelöst, das als HIV (Human Immunodeficiency Virus) bezeichnet wird. Es wurden große Anstrengungen unternommen, eine Vakzine zu entwickeln, die eine schützende Immunantwort induziert, und zwar ausgehend von der Induktion von Antikörpern oder zellulären Reaktionen. Neuere Bemühungen nutzten Untereinheitenvakzinen, worin aus Sicherheitsgründen ein HIV-Protein und kein abgeschwächtes oder abgetötetes Virus als Immunogen in der Vakzine eingesetzt wird.
Die Human-Immunschwäche-Virus-1-(HIV-1-) Hüllglykoproteine gp120 und gp41 vermitteln einen viralen Tropismus für und nachfolgenden Eintritt in Zielzellen (Freed et al., The Journal of Biological Chemistry 270, 23883-23886 (1995)). Die Rolle von gp120 besteht darin, Zielzellen durch Wechselwirkungen mit CD4 und einem von mehreren Corezeptoren zu binden (D'Souza et al., Nature Medicine 2, 1293–1300 (1996)), wonach gp41 die Fusion von Virus- und Zellmembranen fördert. Der Mechanismus, durch den gp41 eine Membranfusion vermittelt, war vor kurzem Gegenstand intensiver Untersuchungen. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass der Prozess die Bildung eines Superhelix-Trimers umfassen kann, das wahrscheinlich den Übergang vom Ruhe- in einen fusogenen Zustand antreibt, wie am Modell von Influenza-Hämagglutinin gezeigt wurde (Wilson et al., Nature 289, 366–373 (1981); Carr et al., Cell 63, 823–832 (1993); Bullough et al., Nature 371, 37–43 (1994)).
Es wurde herausgefunden, dass zwei von HIV-1-gp41 stammende lineare Peptide Virusfusionen hemmen. Das erste davon, DP107, stellt eine Abschnitt von gp41 nahe dem N-terminalen Fusionspeptid dar, und es wurde gezeigt, dass es in Lösung helikal ist und auf eine Weise oligomerisiert, die mit der Superhelixbildung übereinstimmt (Gallaher et al., AIDS Res. Hum. Retraviruses 5, 431–440 (1989); Weissenhorn et al., Nature 387, 426–430 (1997)). Ein wirksameres Peptid, DP178, stammt aus der C-terminalen Region der gp41-Ektodomäne (Wild et al., PNAS 91, 9770–9774 (1994); Jiang et al., Nature 365, 113 (1993)). Obwohl von dieser Region von gp41 vorausgesagt wurde, dass sie α-helikal sein würde (Gallaher et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 5, 431–440 (1989)), fehlt DP178 selbst in Lösung eine erkennbare Struktur (Wild et al, PNAS 91, 9770–9774 (1994)). Versuche, den Wirkmechanismus von DP178 zu untersuchen, wurden dadurch erschwert, dass seine bioaktive Konformation nicht vollkommen geklärt ist. Vor kurzem haben kristallographische Untersuchungen (Chan et al., Cell 89, 263–273 (1997); Weissenhorn et al., Nature 387, 426–430 (1997)) und Lösungsuntersuchungen (Lawless et al., Biochemistry 35, 13697–13708 (1996); Lu et al., Nature Structural Biology 2, 1075–1082 (1995); Rabenstein et al., Biochemistry 35, 13922, 13918 (1996)) gezeigt, dass losgelöste Segmente von HIV-1-gp41, die mit DP107 und DP178 überlappen, sich in einem dicht gepackten helikalen Bündel verbinden. Das C-terminale Segment, das DP178 entspricht, bildet eine verlängerte Helix, die sich antiparallel eng an eine von einem N-terminalen (DP107) Superhelix-Trimer gebildete Furche angelagert. Obwohl diese Daten eine mögliche Kapformation für DP178 vorschlagen, stellen sie keine schlüssigen Informationen über den Mechanismus der Peptidhemmung während Virusfusionsvorgängen bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt eingeschränkte helikale Formen von DP178 und homologen Sequenzen und Varianten bereit, welche die Einschränkungen auf dem Gebiet der Erfindung in Bezug auf DP178 überwinden und eine effizientere Nutzung von DP178-artigen Sequenzen ermöglichen. Demgemäß wird in einer Ausführungsform der Erfindung ein eingeschränktes helikales Peptid bereitgestellt, bei dem zumindest die interne Aminosäuresequenz (und vorzugsweise auch benachbarte Aminosäuresequenzen) aus der C-terminalen Region der HIV-1-LAI-Isolat-Transmembranprotein-gp41-Ektodomänenaminosäuren 633 bis 678 ausgewählt sind, die mit der Sequenz überlappen, die dem Peptid DP178 entspricht (Aminosäurereste 643 bis 673). Diese Region ist eine 46 Aminosäuren umfassende Sequenz (vom Amino- zum Carboxyterminus gelesen): NH2-WMEWEREIDNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH.
Peptide in einer α-helikalen Superhelixkonformation wechselwirken miteinander auf charakteristische Weise, die durch die Primärsequenz der einzelnen Peptide bestimmt wird. Die Tertiärstruktur einer α-Helix sieht so aus, dass 7 Aminosäurereste in der Primärsequenz etwa 2 Umkehrschleifen der α-Helix entsprechen. Demgemäß kann eine primäre Aminosäuresequenz, die eine α-helikale Konformation ergibt, in Einheiten aus jeweils 7 Resten unterteilt werden, die Heptaden genannt werden (und die Form abcdefg aufweisen). Die Kernpolypeptide bestehen aus eine Reihe von hintereinander angeordneten Heptaden. Wenn die Sequenz einer Heptade in einem bestimmen Kernpeptid wiederholt wird, kann die Heptad als „Heptaden-Repeat" (Heptaden-Wiederholung) oder einfach als „Repeat" bezeichnet werden.
Es werden Verbindungen als Ausführungsformen der Erfindung bereitgestellt, die ein eingeschränktes helikales Peptid enthalten, das aus einem Peptid besteht, das eine Sequenz aus acht Aminosäureresten umfasst, worin die Sequenz aus acht Aminosäureresten einen ersten terminalen Rest und einen zweiten terminalen Rest aufweist, worin der erste terminale Rest und der zweite terminale Rest eine interne Sequenz aus sechs Aminosäureresten flankieren, worin der erste und der zweite terminale Rest Seitenketten aufweisen, die miteinander verbunden sind und eine arretierte Gruppierung bilden, um das Peptid auf eine helikale Form einzuschränken. Die interne Sequenz aus sechs Aminosäuren weist die Form abcde, defgab oder cdefga auf und umfasst eine Sequenz aus sechs zusammenhängenden Aminosäuren, die in der HIV-1LAI-Stamm-Transmembranprotein-gp41-Aminosäuresequenz 633 bis 678, in deren homologer Sequenz von einem anderen HIV-Stamm, in einer Consensus-Sequenz derer homologen Sequenzen aus einer beliebigen HIV-Clade oder einer Aminosäure-Substitutionsvariante davon gefunden wurde. Gemäß der Erfindung ist jeder der Aminosäuren in den oben genannten Sequenzen eine Position a, b, c, d, e, f oder g zugeordnet. Die Zuordnungen basieren auf der Zuordnung der Aminosäure 633 der HIV-LAI-gp41-633-678-Sequenz zu Position a einer Heptaden-Grundaufstellung abcdefg. Nachfolgende Aminosäuren in der Sequenz sind demgemäß ihren Positionen zugeordnet. 18 zeigt die Heptaden-Positionszuordnung der einzelnen Aminosäuren in der Sequenz. Die Zuordnung kann leicht auf Homologe und Consensus-Sequenzen übertragen werden, indem ihre Aminosäuren mit der entsprechenden Aminosäure in der repräsentativen HIV-LAI-Sequenz abgeglichen werden. Der Aminosäure 633 oder ihrer entsprechenden Aminosäure in einem Homolog oder einer Consensus-Sequenz ist die Position a zugeordnet, mit der das Muster der zugeordneten Grundaufstellung abcdef beginnt.
In diesen in den 16–18 gezeigten repräsentativen Verbindungen und Sequenzen befindet sich die Arretiergruppierung oder „Fessel" zwischen benachbarten f-Positionen, wenn die interne Sequenz die Form gabcde aufweist, zwischen benachbarten c-Positionen, wenn die interne Sequenz die Form defgab aufweist, oder zwischen benachbarten b-Positionen, wenn die interne Sequenz die Form cdefga aufweist. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die Arretierung zwischen benachbarten f-Positionen, in welchem Fall die Aminosäuren an der f-Position durch Aminosäuren ersetzt sind, die zur Bereitstellung einer Helix-Arretiergruppierung geeignet sind. 18 zeigt den Abgleich der abcdefg-Grundzuordnung mit den für die Erfindung relevanten Sequenzen. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die interne Sequenz aus sechs Aminosäuren die Form gabcde auf. Diese „interne Sequenz" aus sechs Aminosäuren aus gp41 kann in jeglichen hierin dargelegten Verbindungen, Formeln und Syntheseverfahren für die Gruppierung „Z" substituiert werden.
Obwohl die interne Aminosäuresequenz vorzugsweise von einer Sequenz aus sechs zusammenhängenden Aminosäuren in der HIV-1LAI-Stamm-gp41-Aminosäuresequenz 633 bis 678, in deren homologer Sequenz von einem anderen HIV-Stamm oder in einer Consensus-Sequenz derer homologen Sequenzen aus einer beliebigen HIV-Clade stammt, kann sie eine Aminosäure-Substitutionsvariante davon sein. Die Sequenzen der Erfindung umfassen auch Analoge der HIV-gp41-Sequenz 633–678 und Trunkierungen, die unter anderem Peptide umfassen können, welche die Sequenz 633–678 umfassen, die eine oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen und/oder -Deletionen enthält. Die Analoge der Sequenz zeigen, wenn sie in eingeschränkten Peptiden der Erfindung enthalten sind, antivirale Aktivität und können weiters auch zusätzliche vorteilhafte Eigenschaften haben, wie z.B. erhöhte Bioverfügbarkeit und/oder Stabilität, oder können Antikörper mit verbesserter HIV-Stamm-Erkennung hervorrufen.
HIV-1- und HIV-2-Hüllproteine sind zwar strukturell unterschiedlich, es existiert jedoch eine auffällige Aminosäurekonservierung innerhalb der gp41-633-678 entsprechenden Regionen von HIV-1 und HIV-2. Aminosäuresubstitutionen können konservativ oder nichtkonservativ sein. Konservative Aminosäuresubstitutionen bestehen im Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren der 633-678-Peptidsequenz durch Aminosäuren ähnlicher Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobieeigenschaften, wie z.B. eine Aminosäuresubstitution von Glutaminsäure (E) zu Asparaginsäure (D). Nichtkonservative Substitutionen bestehen im Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren der 633-678-Peptidsequenz durch Aminosäuren unähnlicher Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobieeigenschaften, wie z.B. eine Substitution von Glutaminsäure (E) zu Valin (V).
Deletionen der 633-678-Region oder deren Homologer liegen ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung. Derartige Deletionen bestehen in der Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren, wobei die Längenuntergrenze der resultierenden Peptidsequenz für eine Verwendung als interne Sequenz eines eingeschränkten helikalen Peptids 6 Aminosäuren beträgt. Vorzugsweise bleiben bei der Deletion ausreichend viele Aminosäuren zurück, um zumindest zwei Arretierungen, wie hierin beschrieben, vorsehen zu können. Beispiele für solche Deletionen sind das HIV35-Peptid und dessen eingeschränkte Helixverbindungen der Erfindung, die eine Arretierung (z.B. HIV-24) bzw. zwei Arretierungen (z.B. HIV-31) aufweisen. Insbesondere sind die Deletionen terminale Trunkierungen, führen jedoch in allen Fällen zu Peptiden, die bei Einschränkung entlang der f-b-c-Helixfläche weiterhin von den hierin verwendeten Superhelix-Suchalgorithmen erkannt werden, oder aber, die die a-d-Helixflächenorientierung und räumliche Ausrichtung des Ausgangsmoleküls beibehalten, oder aber, die antifusogene oder antivirale Aktivität aufweisen können.
Am meisten bevorzugte Verbindungen sind jene, die bei Einsatz als Immunogene Antikörper hervorrufen, die HIV-virale fusogene Aktivität oder Infektiosität neutralisienen.
Die Peptide der Erfindung können weiters homologe Sequenzen der Sequenz 633–678 des HIV-LAI-Stamms umfassen, die in eingeschränkter helikalen Form antivirale Aktivität aufweisen. Besonders bevorzugt bilden die eingeschränkten Peptide, wenn sie als Haptene verwendet werden, Antikörper, die vitale Fusionsereignisse blockieren, was zu einer Hemmung der Virusinfektiosität führt. Solche Homologe sind Peptide, deren Aminosäuresequenzen aus den Aminosäuresequenzen der Peptidregionen anderer (d.h. keiner HIV-1LAI-) Viren bestehen, die der gp41-Peptidregion 633–678 entsprechen. Solche Viren können andere HIV-1-Isolate und HIV-2-Isolate umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Homologe, die von der entsprechenden gp41-Peptidregion von anderen (d.h. Nicht-HIV-1LAI-) HIV-1-Isolaten stammen, kön nen die in 16A bis 16G dargestellten oder andere bekannte entsprechende Sequenzen umfassen. Besonders bevorzugt sind jene, die von HIV-1SF2, HIV-1RF und HIV-1MN, GNE6, GNE8 und vom Thai-Stamm-Isolat A244 stammen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Aminosäuren an den Positionen a und d der internen Sequenz aus sechs Aminosäuren im helikalen Peptid nicht aminosäuresubstituiert, sondern sind die Aminosäuren in den bekannten Isolaten oder Consensus-Sequenzen (siehe die 16A–16G und 17).
Auch sind Ausführungsformen, bei denen die Aminosäuren an den Positionen g und e der internen Sequenz aus sechs Aminosäuren im helikalen Peptid nicht aminosäuresubstituiert sind am meisten bevorzugt. Eine Aminosäure an einer der Positionen a, d, g oder e der internen Sequenz aus sechs Aminosäuren kann in bevorzugten Ausführungsformen im helikalen Peptid konservativ substituiert sein. Die Positionen a und d, und weniger direkt die Positionen g und e, sind vermutlich jene, die auf der Fläche der eingeschränkten Helix liegen, die mit dem gp41-Kerntrimer wechselwirkt (siehe 19). Da vermutet wird, dass die Positionen f, b und c nicht direkt an der Bindung beteiligt sind, sondern eher dazu dienen, die Helixstruktur zu ermöglichen, sind bevorzugte Variationen an den Positionen b und c der internen Sequenz aus sechs Aminosäuren im helikalen Peptid nicht aminosäuresubstituiert, wenn sie nicht die arretierenden (fesselnden) Reste sind. Weniger bevorzugt sind Verbindungen, worin eine Aminosäure an einer der Positionen b, c oder f der internen Sequenz aus sechs Aminosäuren konservativ substituiert ist oder eine beliebige nichthelixbrechenden Aminosäure ist, welche die Arretierungsgruppierung nicht beeinträchtigt. Bevorzugte Chimären aus internen Sequenzen sind solche, worin eine Aminosäure an einer der Positionen a, d, g oder e der internen Sequenz aus sechs Aminosäuren im helikalen Peptid durch eine Aminosäure an der entsprechenden Position eines anderen HIV-Virusstamms substituiert ist.
Bevorzugte Verbindungen der Erfindung können Sequenzen aus HIV-1-Clade-Consensus-Sequenzen umfassen:
Die Aminosäuren in diesen Sequenzen sind durch einen Einbuchstabencode dargestellt, worin ein Kleinbuchstabe für die angegebene Aminosäure oder eine Substitution durch eine Aminosäure an der entsprechenden Position in einer Sequenz innerhalb der gleichen Clade steht, und worin ein ? eine beliebige Aminosäure an der entsprechenden Position in einer Sequenz innerhalb derselben Clade ist. Am meisten bevorzugt sind Homologe oder Consensus-Sequenzen aus den 16A–16G. Die internen Sequenzen finden sich vorzugsweise in Virussequenzen in der aus den Claden A, B, C, D, E, F, G und F/B bestehenden Gruppe von HIV-1-Claden.
Verbindungen der Erfindung können den ersten und den zweiten terminalen Rest mit einer Seitenkette aufweisen, die einen eine Amidbindung bildenden Substituenten enthält, die unter Bildung einer Amidbindung miteinander verbunden sind, um ein eingeschränktes helikales Peptid zu bilden. Der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des ersten terminalen Rests und der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des zweiten terminalen Rests sind unabhängig voreinander aus der aus einem Aminosubstituenten und einem Carboxysubstituenten bestehenden Gruppe ausgewählt. Der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des ersten terminalen Rests ist ein Carboxysubstituent, der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des zweiten terminalen Rests ist ein Carboxysubstituent, und der difunktionelle Linker ist ein Diamin, worin die erste und die zweite funktionelle Gruppe Aminogruppen sind. In einer bevorzugten Form sind der erste terminate Rest und der zweite terminale Rest unabhängig voneinander aus der aus Asp und Glu bestehenden Gruppe ausgewählt, noch bevorzugter sind der erste terminale Rest und der zweite terminale Rest beide Glu. Die ersten terminalen Reste können eine D-Thio-Lysin-Seitenkette aufweisen, und der zweite terminale Rest ein L-Thio-Lysin, die unter Bildung einer disulfidgebundenen Arretiergruppierung miteinander verbunden sind, um ein eingeschränktes helikales Peptid zu bilden.
In einer anderen Ausführungsform ist das eingeschränkte Peptid ein Hapten, das an ein Träger-Makromolekül gebunden ist, vorzugsweise kovalent an das eingeschränkte helikale Peptid gebunden ist, wie hierin erläutert wird. Das Makromolekül kann an der Arretiergruppierung oder an Aminosäuren an den Positionen f, b oder c des eingeschränkten helikalen Peptids an das helikale Peptid gebunden sein und kann ein beliebiger Träger sein, der die a-d-Fläche des eingeschränkten helikalen Peptids nicht stört. Ein bevorzugter Träger für immunogene Zwecke ist Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, oder auch andere hierin erläuterte Träger.
In anderen Ausführungsformen enthalten die Verbindungen mehr als ein eingeschränktes helikales Peptid. Die internen Sequenzen eines ersten und eines zweiten eingeschränkten helikalen Peptids in diesen Ausführungsformen sind vorzugsweise unterschiedlich. Die internen Sequenzen eines ersten und zweiten eingeschränkten helikalen Peptids stammen von der gleichen HIV-gp41-Sequenz oder einer Consensus-Sequenz der gleichen HIV-Clade oder von einer Aminosäure-Substitutionsvariante davon. Die internen Sequenzen des ersten und zweiten eingeschränkten helikalen Peptids sind aus jenen ausgewählt, die in der HIV-gp41-Sequenz oder einer Consensus-Sequenz der gleichen HIV-Clade oder einer Aminosäure-Substitutionsvariante davon durch zumindest zwei helikale Umkehrschleifen (oder sechs Reste) getrennt sind. Die Verbindungen können weiters ein drittes eingeschränktes helikales Peptid umfassen. Wiederum sind die internen Sequenzen des ersten, des zweiten und des dritten eingeschränkten helikalen Peptids vorzugsweise unterschiedlich. In einem Beispiel sind die drei Sequenzen als separate eingeschränkte helikale Segmente in einer Superhelix des Polypeptid-Rückgrats einer 633-678-Sequenz vorhanden, wie sie in 18 dargestellt ist.
In anderen Ausführungsformen enthalten die Verbindungen der Erfindung 1 bis 38, 1 bis 35 oder, noch bevorzugter, 1 bis 19 Aminosäuren, die einen oder beide der terminalen Reste des helikalen Peptids flankieren. Die flankierenden Aminosäuren sind vorzugsweise die flankierenden Aminosäuren für die interne Sequenz, wie sie in einer Sequenz aus einer HIV-gp41-Sequenz zu finden sind.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Verbindungen weiters eine Blockiergruppe, die an einen oder an beide der terminalen Reste des helikalen Peptids gebunden ist, um proteolytischen Abbau zu verhindern. Die Blockiergruppe kann eine D-Aminosäure oder eine Nichtamidbindung zwischen benachbarten flankierenden Aminosäuren enthalten.
Besonders bevorzugte Verbindungen umfassen jene, in denen sich eine einfache Arretierung innerhalb der Sequenz YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELD (Seq.-ID Nr. 2) oder einer homologen Sequenz davon, innerhalb der Sequenz EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE (Seq.-ID Nr. 107) oder einer homologen Sequenz davon, innerhalb der Sequenz YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNF (Seq.-ID Nr. 108) oder einer homologen Sequenz davon befinden, um ein eingeschränktes helikales Peptid zu erhalten. Mehr als eine Einschränkung, vorzugsweise zwei, können in diesen Sequenzen vorhanden sein, wie die in 18 gezeigten Beispiele zeigen. In 18 sind Positionen von helikalen Abschnitten der Form gabcde dargestellt, wenn eine, zwei oder drei i-bis-i+7-Arretierungen in einer 633-678-Sequenz oder Variante davon vorhanden sind. Die zweifach arretierten Varianten (II), (III) und HIV31 und die einfach arretierten Varianten HIV24, (IX) und (XI) sind bevorzugte Verbindungen, welche die Arretierpositionen zeigen. Weniger bevorzugt sind die dreifach arretierte Variante, die zweifach arretierten Varianten (VI) und (VII) und die einfach arretierten Varianten VIII und XII. Besonders bevorzugt sind die trunkierten Varianten HIV24 und HIV31 und ihre Homologe aus anderen HIV-Stämmen oder Consensus-Sequenzen oder Substitutionsvarianten davon. Noch weniger bevorzugt sind i-bis-i+4+Arretierungen, um ein „wackeliges" helikales Segment einzuschränken.
In einer bevorzugten Ausführungsform gibt es zumindest zwei eingeschränkte helikale Peptide in der Verbindung, die beispielsweise als unterschiedliche und unabhängige Haptene an KHL oder ein synthetisches TASP- oder Lysin-Netzwerk gebunden sind oder als zwei oder mehr arretierte helikale Segmente innerhalb einer längeren Polypeptidsequenz, vorzugsweise einer, die eine Neigung zur Bildung einer verlängerten oder superhelikalen Struktur aufweist. Die internen Sequenzen des ersten und des zweiten eingeschränkten helikalen Peptids sind vorzugsweise unterschiedlich, beispielsweise mehrere Haptene auf einem einzelnen Hapten-Träger oder zwei oder mehr arretierte helikale Segmente innerhalb einer längeren Superhelix-Polypeptidsequenz. In letzterem Fall stammen die internen Sequenzen des ersten und des zweiten eingeschränkten helikalen Peptids vorzugsweise von der gleichen IHV-gp41-Sequenz, einer Consensus-Sequenz der gleichen HIV-Clade oder der gleichen Aminosäure-Substitutionsvariante davon. Die beiden helikalen Peptide sind über eine trennende Aminosäuresequenz miteinander verbunden, die 5 bis 7, 12 bis 14 oder 19 bis 21 nichthelixbrechende, natürliche oder nichtnatürliche Aminosäuren umfassen können, und worin vorzugsweise die internen Sequenzen des ersten und des zweiten eingeschränkten helikalen Peptids von der gleichen HIV-gp41-Sequenz, einer Consensus-Sequenz der gleichen HIV-Clade oder der gleichen Aminosäure-Substitutionsvariante davon stammen. Die Trennsequenz kann eine zusammenhängende Aminosäuresequenz sein, die aus einer dazwischenliegenden Sequenz, die sich zwischen den beiden internen Sequenzen in der gleichen HIV-gp41-Sequenz befindet, einer Consensus-Sequenz der gleichen HIV-Clade oder der gleichen Aminosäure-Substitutionsvariante davon ausgewählt ist und jene beiden Aminosäuren ausschließt, die den helikalen Peptid-Arretierpositionen entsprechen, die direkt die dazwischenliegende Sequenz flankieren. Ein Beispiel ist HIV31, worin die beiden eingeschränkten Segmente (internen Aminosäuresequenzen) in der Ausgangssequenz (HIV35) durch eine Sequenz aus acht Aminosäuren getrennt sind, wobei die Aminosäuren an benachbarten f-Positionen, die zur Arretierung verwendet werden, nicht als Teil der dazwischenliegenden Sequenz betrachtet werden, sodass die dazwischenliegende Sequenz eine Sequenz aus sechs Aminosäuren ist, die als Trennsequenz aus sechs Aminosäuren in das endgültige Peptid synthetisiert wird. Die Trennsequenz ist besonders bevorzugt 6, 13 oder 20 Aminosäuren lang, um eine Anordnung von a-d-Flächen zwischen eingeschränkten helikalen Peptiden aufrechtzuerhalten.
Die Aminosäuren in der Trennsequenz behalten die abcdefg-Zuordnungspositionen der dazwischenliegenden Sequenz bei, worin vorzugsweise die Aminosäuren an den Positionen a und d in der Trennsequenz identisch mit den ihnen entsprechenden Aminosäuren in der dazwischenliegenden Sequenz sind. Außerdem sind in bevorzugten Ausführungsformen die Aminosäuren an den Trennsequenzpositionen g und e ebenfalls identisch mit den ihnen entsprechenden Aminosäuren in der dazwischenliegenden Sequenz. Weniger bevorzugt ist eine Aminosäure an einer der Positionen a, d, g oder e in der Trennsequenz konservativ substituiert (mit einer anderen Sequenz als in der Clade an dieser Position dargestellt). Am meisten bevorzugt behalten die Aminosäuren in der Trennsequenz die abcdefg-Zuordnungspositionen der dazwischenliegenden Sequenz bei, und eine Aminosäure an einer der Positionen a, d, g oder e ist in der Trennsequenz durch eine entsprechende Aminosäure aus ihrer homologen Sequenz von einem anderen HIV-Stamm, aus einer Consensus-Sequenz ihrer homologen Sequenzen einer beliebigen anderen HIV-Clade oder aus einer Aminosäure-Substitutionsvariante davon substituiert. Die Aminosäuren an den Positionen b, c oder f in der Trennsequenz können beliebige nichthelixbrechende Aminosäuren sein, wobei die Präferenzen in 22 und 23A und B angeführt sind. Chimären können gebildet werden, worin eine Aminosäure an einer der Positionen a, d, g oder e der internen Sequenz aus sechs Aminosäuren im helikalen Peptid durch eine Aminosäure an der entsprechenden Position eines anderen HIV-Virusstamms substituiert ist. Auf ähnliche Weise können Substitutionen der gleichen Art in flankierenden oder trennenden Sequenzen vorgenommen werden. Bevorzugt sind Verbindungen, worin die interne Aminosäuresequenz aus einer der Peptidsequenzen aus 23A und 23B stammt. Noch bevorzugter ist die Verbindung der Erfindung aus der aus eingeschränkten helikalen Peptiden mit jeder möglichen Sequenz bestehenden Gruppe ausgewählt, welche eine oder jede beliebige Kombination von Aminosäuresubstitutionen aufweist, die in der in den 23A und 23B dargestellten Serie der helikalen Peptide I bis XII angeführt sind. In anderen Ausführungsformen ist die Verbindung aus der aus eingeschränkten helikalen Peptiden mit jeder möglichen Se quenz bestehenden Gruppe ausgewählt, welche eine oder jede beliebige Kombination von Aminosäuretrunkierungen, die in der in den 23A und 23B dargestellten Serie der helikalen Peptide I bis XII angeführt sind, aufweist. In weiteren Ausführungsformen ist die Verbindung aus der aus Aminosäuresubstitutionen mit jeder möglichen Sequenz bestehenden Gruppe ausgewählt, welche eine oder jede beliebige Kombination von Aminosäuresubstitutionen, die in der in den 23A und 23B dargestellten Serie der helikalen Peptide I bis XII angeführt sind, in Kombination mit einer oder jeder beliebigen Kombination von Aminosäuretrunkierungen, die in der in den 23A und 23B dargestellten Serie der helikalen Peptide I bis XII angeführt sind, aufweist. X in diesen Sequenzen kann jede beliebige nichthelixbrechende Aminosäure sein.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können Peptide, welche die hierin beschriebenen Sequenzen aufweisen, mit zusätzlichen chemischen Gruppen synthetisiert werden, die an ihren Amino- und/oder Carboxytermini vorhanden sind, sodass beispielsweise die Stabilität, Bioverfügbarkeit und/oder Hemmungsaktivität der Peptide gesteigert wird. Hydrophobe Gruppen, wie z.B. Carbobenzoxyl-, Dansyl- oder t-Butyloxycarbonylgruppen können beispielsweise an den Aminotermini hinzugefügt werden. Eine Acetylgruppe oder eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe kann an den Aminotermini platziert werden. Eine hydrophobe Gruppe, t-Butyloxycarbonyl- oder Amidogruppe können an den Carboxytermini hinzugefügt werden. Außerdem können die Peptide der Erfindung so synthetisiert werden, dass ihre sterische Konfiguration verändert wird. Beispielsweise kann anstelle des üblichen L-Isomers das D-Isomer eines oder mehrerer der Aminosäurereste des Peptids verwendet werden. Die Verbindungen können zumindest eine benachbarte Aminosäuren verbindende Bindung enthalten, die keine Peptidbindung und vorzugsweise nichthelixbrechend ist. Nichtpeptidbindungen zur Verwendung in flankierenden Sequenzen umfassen eine Imino-, Ester-, Hydrazin-, Semicarbazid-, Oxim- oder Azobindung. Außerdem kann zumindest einer der Aminosäurereste der Peptide der Erfindung durch einen allgemein bekannten, nicht natürlich vorkommenden Aminosäurerest substituiert sein, der vorzugsweise nichthelixbrechend ist. Besonders bevorzugt liegt die nichtnatürliche Aminosäure oder Nichtamidbindung, die benachbarte Aminosäuren verbindet, sofern vorhanden, außerhalb der internen Sequenz und ist noch bevorzugter nichthelixbrechend. Außerdem kann zumindest einer der Aminosäurereste der Peptide der Erfindung durch einen allgemein bekannten, nicht natürlich vorkommenden Aminosäurerest substituiert sein. Solche Veränderungen können zur Steigerung der Stabilität, Bioverfügbarkeit, Immunogenität und/oder Hemmungsaktivität der Peptide der Erfindung dienen.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, wird davon ausgegangen, dass die eingeschränkten helikalen Peptide ihre Aktivität durch eine Wechselwirkung der a-d-Fläche der Helix ableiten. Die starke Anti-HIV-Aktivität der Verbindungen der Erfindung rührt von der gp41-633-678-Region her, die einer vermutlichen α-Helixregion entspricht, die sich am C-terminalen Ende der gp41-Ektodomäne befindet und sich mit einer distalen Stelle auf gp41 zu assoziieren schient, deren interaktive Struktur durch das Leucin-Zipper-Motiv, eine Superhelixstruktur, die als DP-107 bezeichnet wird, beeinflusst wird. Die Assoziation dieser beiden Domänen kann eine molekulare Bindung oder „molekulare Klammer" wiederspiegeln, die eng mit dem Fusionsprozess zusammenhängt (siehe die 18 und 19). Die DP107-Region bildet einen Kerntrimerkomplex mit einer Furche, welche die a-d-Fläche der helikalen Peptide der Erfindung erkennt und bindet.
Wenn sie als Peptide synthetisiert werden, sind sowohl DP-107 als auch DP-178 starke Inhibitoren einer HIV-Infektion und fusionieren wahrscheinlich aufgrund ihrer Fähigkeit, Komplexe mit viralem gp41 zu bilden und dessen fusogenen Prozess zu beeinflussen; während eines strukturellen Übergangs des viralen Proteins von der nativen Struktur in den fusogenen Zustand können das DP-107- und das DP-178-Peptid beispielsweise Zugang zu ihren jeweiligen Bindungsstellen am viralen gp41 gewinnen und zerstörenden Einfluss ausüben.
Wenn mehr als ein eingeschränktes helikales Peptid vorhanden ist, als Teil einer Superhelix oder eines verlängerten Helix-Polypeptid-Rückgrats, dann befinden sich die Positionen a und d eines ersten eingeschränkten helikalen Peptids folglich in der gleichen Ebene wie die Positionen a und d des zweiten eingeschränkten helikalen Peptids. Mit anderen Worten sind die a-d-Flächen der beiden Helices in der gleichen Ebene angeordnet. Um diese Orientierung zu erreichen, wenn sich die Helices in einer Polypeptid-Superhelix befinden, sind das erste und zweite eingeschränkte helikale Peptid durch entweder 5 bis 7, 12 bis 14 oder 19 bis 21 natürliche oder nichtnatürliche helixbildende Aminosäuren getrennt. Vorzugsweise sind das erste und das zweite eingeschränkte helikale Peptid durch entweder 6, 13 oder 20 natürliche oder nichtnatürliche helixbildende Aminosäuren getrennt. Eine besonders bevorzugte Anordnung des ersten, zweiten und jedes weiteren eingeschränkten helikalen Peptids ist jene, die in DP107 zu finden ist, worin die a-d-Flächen in der gleichen Ebene angeordnet sind, um eine Wechselwirkung mit der Furche im Kerntrimer zu ermöglichen.
Wenn die besonders bevorzugte Fesselungschemie, wie sie hierin gelehrt wird, eingesetzt wird, sind die Verbindungen der Erfindung aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt:
Verbindungen der Formel (1):
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist,
X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist,
Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist,
Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, worin die interne Sequenz aus sechs Aminosäuren die Form gabcde, defgab oder cdefga aufweist und aus einer Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, die eine Sequenz aus sechs zusammenhängenden Aminosäuren in der HIV-1LAI-Stamm-gp41-Aminosäuresequenz 633 bis 678, in deren homologer Sequenz von einem anderen HIV-Stamm, in einer Consensus-Sequenz derer homologen Sequenzen von einer beliebigen HIV-Clade oder einer Aminosäure-Substitutionsvariante davon umfasst, worin der Aminosäure 633 oder ihrer entsprechenden Aminosäure in der homologen Sequenz, Consensus-Sequenz oder Sequenzvariante die Position a einer Grundaufstellung abcdefg zugeordnet ist;
m und p unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass m + p kleiner als oder gleich 6 ist, und
n eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (m + p)) bis (9 – (m + p)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass n größer als 1 ist;
Verbindungen der Formel (6):
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, worin die interne Sequenz aus sechs Aminosäuren die Form gabcde, defgab oder cdefga aufweist und aus einer Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, die eine Sequenz aus sechs zusammenhängenden Aminosäuren in der HIV-1LAI-Stamm-gp41-Aminosäuresequenz 633 bis 678, in deren homologer Sequenz von einem anderen HIV-Stamm, in einer Consensus-Sequenz derer homologen Sequenzen von einer beliebigen HIV-Clade oder einer Aminosäure-Substitutionsvariante davon umfasst, worin der Aminosäure 633 oder ihrer entsprechenden Aminosäure in der homologen Sequenz, Consensus-Sequenz oder Sequenzvariante die Position a einer Grundaufstellung abcdefg zugeordnet ist; q aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen ein geschlossen, ausgewählt ist, s aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass q + s kleiner als oder gleich 7 ist, und r eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (q + s)) bis (9 – (q + s)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass r größer als 0 ist;
Verbindungen der Formel (11):
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, worin die interne Sequenz aus sechs Aminosäuren die Form gabcde, defgab oder cdefga aufweist und aus einer Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, die eine Sequenz aus sechs zusammenhängenden Aminosäuren in der HIV-1LA1-Stamm-gp41-Aminosäuresequenz 633 bis 678, in deren homologer Sequenz von einem anderen HIV-Stamm, in einer Consensus-Sequenz derer homologen Sequenzen von einer beliebigen HIV-Clade oder einer Aminosäure-Substitutionsvariante davon umfasst, worin der Aminosäure 633 oder ihrer entsprechenden Aminosäure in der homologen Sequenz, Consensus-Sequenz oder Sequenzvariante die Position a einer Grundaufstellung abcdefg zugeordnet ist; t aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist und v aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass t + v kleiner als oder gleich 7 ist, und u eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (t + v)) bis (9 – (t + v)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass u größer als 0 ist; und
Verbindungen der Formel (16):
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz, bestehend aus sechs Aminosäuren ist, worin die interne Sequenz aus sechs Aminosäuren die Form gabcde, defgab oder cdefga aufweist und aus einer Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, die eine Sequenz aus sechs zusammenhängenden Aminosäuren in der HIV-1LAI-Stamm-gp41-Aminosäuresequenz 633 bis 678, in deren homologer Sequenz von einem anderen HIV-Stamm, in einer Consensus-Sequenz derer homologen Sequenzen von einer beliebigen HIV-Clade oder einer Aminosäure-Substitutionsvariante davon umfasst, worin der Aminosäure 633 oder ihrer entsprechenden Aminosäure in der homologen Sequenz, Consensus-Sequenz oder Sequenzvariante die Position a einer Grundaufstellung abcdefg zugeordnet ist; w und y unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass w + y kleiner als oder gleich 8 ist, und x eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (w + y)) bis (9 – (w + y)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass x größer als oder gleich 0 ist.
Diese Verbindungen können weiters S' enthalten, wenn S nicht vorhanden ist, und X ist eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz, worin S' ein an X gebundenes Makromolekül ist. X oder Y kann eine Blockiergruppe enthalten, die enzymatischen Abbau verhindert. Herkömmliche terminale Blockiergruppen, wie sie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, sind geeignet. X oder Y kann auch eine D- Aminosäure oder eine Nichtamidbindung zwischen benachbarten Aminosäuren enthalten, um enzymatischen Abbau zu verhindern.
Die Verbindungen können wie hierin gelehrt mit Trägern formuliert werden. Wenn das helikale Peptid als Hapten verwendet werden soll, kann der Träger ein Adjuvans sein. Typischerweise sind Zusammensetzungen der Erfindung steril. Zusammensetzungen können zumindest zwei Verbindungen der Erfindung, entweder frei oder kovalent oder ionisch aneinander gebunden enthalten. Die Peptide der Erfindung, die Virusfusionshemmwirkung aufweisen können in Kombination mit anderen therapeutischen Wirkstoffen verwendet werden, vorzugsweise in Kombination mit einem anderen antiviralen Mittel, um dessen antivirale Wirkung zu steigern. Solche antiviralen Mittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf solche, die auf eine anderes Target-Molekül wirken, das an der Virusreplikation beteiligt ist, beispielsweise reverse-Transkriptase-Inhibitoren, Virusprotease-Inhibitoren, Glykosylierungsinhibitoren; solche, die auf ein anderes Target-Molekül wirken, das an Virusübertragung beteiligt ist; solche, die auf eine andere Stelle desselben Moleküls wirken; und solche, die das Auftreten von Virusresistenz verhindern oder verringern.
Bei der Behandlung von Säugetieren, einschließlich Menschen, mit einer Virusinfektion wird eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindungen der Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Derivat in einer Dosis verabreicht, die ausreicht, um die Virusreplikation zu hemmen, entweder alleine oder in Kombination mit anderen virushemmenden Arzneimitteln. Beispielsweise kann HIV31 oder HIV24 etwa 12 Wachen lang in einer Menge von 0,1 mg/kg bis 1,0 mg/kg pro Tag als Infusion verabreicht werden. Eine bevorzugte Dosis beträgt 20 mg bis 35 mg. Dosen können in Intervallen von etwa einmal täglich bis 4-mal täglich und vorzugsweise etwa einmal alle zwei Tage bis einmal täglich verabreicht werden. Eine bevorzugte Dosis wird verabreicht, um Spitzen-Plasmakonzentrationen einer Verbindung von etwa 1 mg/ml bis 10 mg/ml zu erreichen. Dies kann durch sterile Injektion einer etwa 2,0%igen Lösung der verabreichten Bestandteile in gepufferter Salzlösung erreicht werden (jede beliebige geeignete Salzlösung, die Fachleuten auf dem Gebiet der Chemie bekannt ist, kann eingesetzt werden). Gewünschte Blutwerte können durch kontinuierliche Infusi on aufrechterhalten werden, wie anhand der durch HPLC gemessenen Plasmawerte ermittelt wird. Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die Verbindungen der Erfindung enthalten, können einem menschlichen Patienten alleine oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, worin sie mit geeigneten Trägern oder einem oder mehreren Exzipienten, wie hierin beschrieben, in Dosen zur Behandlung einer Virusinfektion, insbesondere einer HIV-Infektion, vermischt werden. Geeignete Verabreichungswege umfassen orale, rektale, transmukosale oder intestinale Verabreichung; parenterale Verabreichung, einschließlich intramuskulärer, subkutaner, intramedullärer Injektionen, sowie intrathekalen, direkten intraventrikulären, intravenösen, intraperitonealen, intranasalen oder intraokularen Injektionen; transdermale, topische, vaginale und dergleichen. Dosierungsformen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Tabletten, Pastillen, Dispersionen, Suspensionen, Zäpfchen, Lösungen, Kapseln, Cremes, Pflaster, Minipumpen und dergleichen.
Wie hierin erläutert sind die Verbindungen der Erfindung vor allem als Haptene geeignet, um einen Antikörper hervorzurufen, der an die Verbindung bindet, wobei der Antikörper spezifisch ein Epitop bindet, das eine Aminosäure an Position a, d, e oder g im helikalen Peptid umfasst. Bevorzugte Antikörper sind monoklonal. Antikörper der Erfindung erkennen nicht nur die Peptide der Erfindung, sondern erkennen vorzugsweise auch die entsprechende Sequenz, sofern im Virus vorhanden. Sie können auch nichteingeschränktes DP178 binden. Noch bevorzugter neutralisiert der Antikörper NIV-Virus-Infektiosität und/oder neutralisiert HIV-Virus-Membranfusion. Somit können die Antikörper eine gp41-Sequenz erkennen und binden.
Hierin wird ein Verfahren zur Immunisierung eines Tiers beschrieben, welches die Verabreichung einer immunogenen Menge einer Verbindung der Erfindung an das Tier umfasst.
Außerdem wird hierin ein Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines Säugetiers beschrieben, das HIV-gefährdet oder -infiziert ist, umfassend das Verabreichen einer Zusammensetzung, die eine prophylaktisch oder therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Erfindung und einen Träger umfasst.
Obwohl erwartet wird, dass Antikörper der Erfindung breite virale Aktivität aufweisen, umfasst die Zusammensetzung vorzugsweise interne 6-Aminosäure-Sequenzen von unterschiedlichen HIV-Stämmen oder HIV-Claden. Die Zusammensetzungen umfassen auch Vakzinenformulierungen. Die Formulierungen können ein oder mehrere (mehrwertige) eingeschränkte helikale Peptide von unterschiedlichen HIV-Stämmen zur Verwendung als Vakzine oder Immunogen enthalten. Die Zusammensetzung kann einem Patienten, der infektionsgefährdet ist oder eine solche Behandlung benötigt, prophylaktisch oder therapeutisch verabreicht werden, wobei die Dosierungen und Verabreichungswege und -mittel eingesetzt werden, die leicht zu bestimmen sind. Es kann jedoch auch chronische Verabreichung bevorzugt sein, und die Dosierungen können demgemäß eingestellt werden.
Die Verabreichung der Verbindungen, welche die eingeschränkten helikalen Peptide der Erfindung enthalten, als prophylaktische Vakzine (oder therapeutische Vakzine) kann die Verabreichung einer Konzentration von Peptiden an einen Wirt umfassen, die wirksam ist, um eine Immunantwort hervorzurufen, die ausreicht, um HIV zu neutralisieren, beispielsweise durch Hemmung der Fähigkeit von HIV, Zellen zu infizieren. Die genaue Konzentration hängt vom spezifischen Peptid ab, das verabreicht werden soll, kann aber unter Einsatz von Standardverfahren zum Testen der Entwicklung einer Immunantwort bestimmt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Die Peptide, die als Vakzine verwendet werden sollen, werden üblicherweise intramuskulär verabreicht. Die Peptide können mit einem geeigneten Adjuvans formuliert werden, um die immunologische Antwort zu verstärken. Solche Adjuvantien können Mineralgele, wie z.B. Aluminiumhydroxid; Tenside, wie z.B. Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanione; andere Peptide; Ölemulsionen; und möglicherweise nützliche menschliche Adjuvantien, wie z.B. BCG und Crynebacterium parvum, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Zahlreiche Verfahren sind geeignet, um die hier beschriebenen Vakzinenformulierungen einzuführen. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf orale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane und intranasale Wege.
Eine Verbindung dieser Erfindung in einem geeigneten Träger oder Exzipienten wird eingesetzt, um eine Vakzine herzustellen. Das Polypeptid kann alleine verwendet werden, wird aber vorzugsweise in einer mehrwertigen Untereinheitenvakzine verabreicht, die interne Sequenzen vom MN-Stamm enthält. Die Vakzine umfasst üblicherweise eingeschränkte Helices, die 3 bis etwa 5 unterschiedliche Stämme repräsentieren, aber 30 oder mehr unterschiedliche, auf gp41 basierende, eingeschränkte helikale Peptide können verwendet werden, um eine wirksamere Vakzine bereitzustellen. Von besonderem Interesse sind gp41-Sequenzen von Breakthrough-Isolaten von HIV-Vakzinen-Versuchen. Die Verwendung einer homologen gp41-Sequenz aus einem oder mehreren Breakthrough-Isolaten in einer Untereinheitenvakzine, üblicherweise zusammen mit einer Sequenz aus einem herkömmlicherweise vorhandenen Isolat wie der MN-Sequenz, kann Schutz gegen HIV-Stämme bereitstellen, die sich in ausreichendem Maß vom herkömmlichen Stamm (z.B. MN) unterscheiden, sodass die typische einzelne Untereinheitenvakzine keinen Schutz gegen diese Stämme verleiht.
Die Herstellung von Polypeptiden zur Verwendung in einer Vakzine ist allgemein bekannt. Die Verbindung mit dem gewünschten Reinheitsgrad und in ausreichender Konzentration, um Antikörperbildung zu induzieren, wird mit einem physiologisch annehmbaren Träger vermischt. Ein physiologisch annehmbarer Träger ist in der Dosis und Konzentration, in der er in der Vakzine eingesetzt wird, nichttoxisch für einen Rezipienten. Im Allgemeinen wird die Vakzine für eine Injektion, normalerweise intramuskuläre oder subkutane Injektion, formuliert. Geeignete Träger für die Injektion sind steriles Wasser, bevorzugt sind aber physiologische Salzlösungen, wie z.B. normale Salzlösung, oder gepufferte Salzlösungen, wie z.B. phosphatgepufferte Salzlösung oder Ringer-Laktat. Die Vakzine enthält im Allgemeinen ein Adjuvans. Nützliche Adjuvantien umfassen QS21 (Quillaja saponaria, im Handel von Cambridge Biotech, Worcester, MA, USA erhältlich), das zytotoxische T-Zellen stimuliert, und Alaun (Aluminiumhydroxid-Adjuvans). Formulierungen mit unterschiedlichen Adjuvantien, die zelluläre oder lokale Immunität erhöhen, können ebenfalls eingesetzt werden.
Weitere Exzipienten, die in der Vakzine vorhanden sein können, umfassen niedermolekulare Polypeptide (weniger als etwa 10 Reste), Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate, einschließlich Glucose und Dextrane, Chelatbildner, wie z.B. EDTA, und andere Exzipienten, die das Protein stabilisieren oder das Wachstum von Mikroorganismen hemmen.
Die Vakzine kann außerdem noch andere HIV-Proteine enthalten. Vor allem gp120 oder der extrazelluläre Abschnitt von gp41 oder HIV-1-Kernproteine, wie z.B. P24, P17 und P55, können in der Vakzine vorhanden sein. Vorzugsweise stammt jegliches gp120, das in der Vakzine vorhanden ist, von einer HIV-Isolat-Sequenz, die in einem eingeschränkten helikalen Peptid enthalten ist, das in der Vakzine vorhanden ist.
Vakzinenformulierungen umfassen im Allgemeinen insgesamt 10 bis 5.000 μg der Verbindung, noch bevorzugter etwa 100 bis 1000 μm, noch bevorzugter etwa 300 bis 600 μg, am besten in etwa 1,0 ml bis 1,5 ml des Trägers. Die Menge der Verbindung, die ein beliebiges Isolat oder eine beliebige Clade in der Vakzine repräsentiert, variiert je nach Immunogenität der Verbindung. Ein eingeschränktes helikales Peptid mit Sequenzen von einigen HIV-Stämmen kann beispielsweise weniger immunogen sein als jene vom MN-Stamm. Wenn Peptide, die zwei Stämme mit unterschiedlicher Immunogenität darstellen, in Kombination eingesetzt werden, wird eine empirische Titration der Menge der einzelnen Viren durchgeführt, um den Prozentsatz des Peptids der einzelnen Stämme in der Vakzine zu bestimmen. Für Isolate mit ähnlicher Immunogenität sind etwa gleiche Peptidmengen der einzelnen Isolate in der Vakzine vorhanden. Verfahren zur Bestimmung der relativen Menge eines immunogenen Proteins in mehrwertigen Vakzinen sind allgemein bekannt und wurden beispielsweise zur Bestimmung der relativen Anteile verschiedener Isolate in mehrwertigen Poliovakzinen eingesetzt.
Die Vakzinen werden, je nach Schema, im Allgemeinen im Monat 0, 1 und 6, 8 oder 12 verabreicht. Ein bevorzugtes Schema umfasst eine Verabreichung im Monat 0, 1, 6 und 12. Nach dem Immunisierungsvorgang können jährliche oder zweijährliche Auffrischungen verabreicht werden, Während des Immunisierungsvorgangs und danach können jedoch die Neutralisationsantikörperwerte getestet und das Schema dementsprechend angepasst werden.
Die Vakzine wird nichtinfizierten Individuen verabreicht. Außerdem kann die Vakzine seropositiven Individuen verabreicht werden, um die Immunantwort auf das Virus zu steigern.
Obwohl die hierin beschriebenen Verbindungen wie oben beschrieben als Vakzine verwendet werden können, können die Verbindungen auch alleine oder in Kombinationen mit demselben Formulierungstyp als Immunogen eingesetzt werden, um Antikörper zu induzieren, welche das/die Isolat(e) im Immunogen erkennen. Immunogene werden auf die gleiche Weise formuliert und können dieselben Exzipienten usw. enthalten. Antikörper, die durch die Immunogene induziert werden, können in der Diagnostik zur Detektion des HIV-Stamms in Patientenseren- oder Körperflüssigkeitsproben eingesetzt werden, oder um das jeweilige gp41-Molekül oder das Virus einer Affinitätsreinigung zu unterziehen. Die Verbindung finden auch in diagnostischen Tests zum Nachweis der Gegenwart von Antikörpern gegen HIV in Seren von Individuen, die vermutlich infiziert sind, Anwendung.
In einer weiteren Ausführungsform werden die arretierten Helixpeptide der Erfindung verwendet, um kombinatorische Bibliotheken von eingeschränkten Peptiden herzustellen. Kombinatorische Peptidbibliotheken sind auf einzigartige Weise dazu geeignet, eingeschränkte Peptide miteinzubeziehen. Diese Bibliotheken werden durch ein Verfahren der „geteilten Synthese" konstruiert, bei dem ein fester Träger (z.B. Kügelchen) in gleichen Mengen aliquotiert wird und an jeden Teil separat eine andere Aminosäure gebunden wird. Die Teile werden gepoolt, erneut aufgeteilt, und das Verfahren wird wiederholt. Beim „Peptid-auf-Kügelchen-Verfahren" ergibt dieses Verfahren ein Gemisch aus Kügelchen, von denen jedes mit einem Peptid mit einer einzigartigen Sequenz verbunden ist. Das Kügelchengemisch kann direkt in einer Bindungsselektion eingesetzt werden, wobei die Bindung kolorimetrisch detektiert und positive Kügelchen physikalisch zur Mikrosequenzierung aus dem Gemisch entfernt werden (Clackson und Wells, Tibtech 12, 173–184 (1994)). Um eine Bibliothek von Peptiden herzustellen, die eine Zufallssequenz aus sechs (oder mehr) Aminosäuren enthalten, die durch I- und I+7-Reste gemäß der Erfindung in einer helikalen Konfurmation arretiert sind, wird das Teilungssyntheseverfahren modifiziert, um I- und I+7-Reste in jeder Zufalls-Aminosäuresequenz an festgelegten Positionen zu platzieren, die durch sechs Reste getrennt sind, und die Peptide werden zyklisiert, indem die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der I- und I+7-Reste in den einzelnen Peptiden unter Verwendung eines der im nachstehenden Abschnitt II beschriebenen Verfahrens verbunden werden.
Kombinatorische Bibliotheken, welche die eingeschränkten Peptide der Erfindung enthalten, sind ein besonders leistungsstarkes Werkzeug zur Identifikation von hoch affinen Liganden beim Arzneimitteldesign. Angesichts der Prävalenz des α-helikalen Motivs an aktiven Stellen von Bindungsproteinen, einschließlich DNA-Bindungsproteinen, und der Abwesenheit von Aminosäuresequenz-Einschränkungen im Fesselungssystem der Erfindung erhöhen die arretierten Helixpeptide der Erfindung die Nützlichkeit von kombinatorischen Peptidbibliotheken in Screening-Verfahren auf spezifische Bindungsaktivitäten, wie beispielsweise den Verfahren des US-Patents Nr. 5.306.619, das zum Screenen auf DNA-Sequenz-spezifische Bindungsmoleküle eingesetzt wird, deutlich.
II. Verfahren zur Konstruktion von synthetischen arretierten Helixpeptiden
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Element einer α-helikalen Struktur aus seinem Umfeld in einem nativen Protein entfernt, indem ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz konstruiert wird, das die α-helikale Sekundärstruktur von Interesse im nativen Protein überspannt und das kurze Peptid in einer α-helikalen Konformation eingeschränkt wird, welche die α-helikale Sekundärstruktur von Interesse nachahmt. Die vorliegenden Erfindung ermöglicht es dem Anwender, jedes Peptid, das sechs Aminosäuren lang ist, in einer helikalen Struktur zu arretieren, indem eine Aminosäure mit einem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten am N- Terminus des Peptids platziert wird, und eine weitere Aminosäure mit einem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten am C-Terminus des Peptids platziert wird, und dann die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des N-terminalen und des C-terminalen Rests verbunden werden, um eine zyklisierte Struktur zu bilden, welche die Konformation einer α-Helix nachahmt. Die vorliegenden Erfindung ermöglichen es dem Anwender außerdem, jede Sequenz aus sechs Aminosäureresten in einem größeren Peptid in einer helikalen Konformation zu arretieren, indem zwei Reste mit eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten in die N-terminale Aminosäureposition und die C-terminale Aminosäureposition, welche die Sequenz (bestehend aus sechs Aminosäureresten) von Interesse innerhalb eines größeren Peptids flankieren, importiert werden und die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des N-terminalen und C-terminalen flankierenden Rests dann verbunden werden, um eine zyklisierte Struktur zu bilden, welche die Konformation einer α-Helix nachahmt.
Es gibt zumindest zwei allgemeine Verfahren zur Konstruktion der eingeschränkten Helixpeptide der Erfindung: (1) Synthese eines linearen Peptids, das ein Paar von Resten umfasst, welche eine Aminosäuresequenz flankieren, die sechs Reste lang ist, worin die beiden flankierenden Reste unabhängig voneinander aus der aus Aminosäuren mit eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, gefolgt von der Überbrückung der eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste mit einem difunktionellen Linker, um das Peptid zu zyklisieren; und (2) Synthese eines linearen Peptids, das ein Paar von Resten umfasst, welche eine Aminosäuresequenz flankieren, die sechs Reste lang ist, worin die beiden flankierenden Reste unabhängig voneinander aus der aus Aminosäuren mit eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und worin einer der flankierenden Reste zur Peptidkette hinzugefügt wird, welche einen difunktionellen Linker trägt, sodass eine funktionelle Gruppe des Linkers mit dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des Rests verbunden wird, gefolgt vom Verbinden der freien funktionellen Gruppe des Linkers mit dem eine Amidbindung bildenden Sei tenketten-Substituenten am anderen flankierenden Rest, um das Peptid zu zyklisieren.
Jede beliebige Aminosäure mit einer Seitenkette, die einen Substituenten aufweist, der in der Lage ist, eine Amidbindung zu bilden, kann hierin als flankierender Rest eingesetzt werden. Geeignete flankierende Aminosäurereste umfassen Aminosäuren mit Seitenketten, die eine freie Carboxylgruppe tragen, wie z.B. Aminoprapandisäure, Asp, Glu, 2-Aminohexandisäure und 2-Aminoheptandisäure, sowie Aminasäuren mit Seitenketten, die eine freie Aminogruppe tragen, wie z.B. 2,3-Diaminopropansäure (2,3-Diaminopropionsäure), 2,4-Diaminobutansäure (2,4-Diaminobuttersäure), 2,5-Diaminopentansäure und Lys.
(1) Synthese eines linearen Peptids ohne an einen difunktionellen Linker gebundene flankierende Aminosäure
a. Peptidsynthese
Die gewünschte Peptidsequenz ist so aufgebaut, dass die Sequenz aus sechs Aminosäureresten, aus der eine Helix gebildet werden soll, sich zwischen zwei flankierenden Resten erstreckt, die unabhängig voneinander aus der Aminosäureresten mit eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten bestehenden Gruppe ausgewählt ist. In einer Ausführungsform sind die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des N-terminalen und des C-terminalen flankierenden Rests unabhängig voneinander aus der aus einem Carboxysubstituenten und einem Aminosubstituenten bestehenden Gruppe ausgewählt. In einer weiteren Ausführungsform sind die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des N-terminalen und des C-terminalen flankierenden Rests beide Carboxysubstituenten. In einer weiteren Ausführungsform ist der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent eines der flankierenden Reste ein Carboxysubstituent und der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests ein Aminosubstituent. In einer weiteren Ausführungsform sind die flankierenden Reste unabhängig voneinander aus der aus Aminopropandisäure, Asp, Glu, 2- Aminohexandisäure, 2-Aminoheptandisäure, 2-Aminooctandisäure, 2-Aminononandisäure, 2,3-Diaminopropansäure, 2,4-Diaminobutansäure, 2,5-Diaminopentansäure, Lys, 2,7-Diaminoheptansäure, 2,8-Diaminooctansäure und 2,9-Diaminononansäure bestehenden Gruppe ausgewählt.
In einigen Ausführungsformen enthält das gewünschte Peptid eine zusätzliche Aminosäure oder zusätzliche Aminosäuren, die sich vom C-terminalen flankierenden Rest und/oder vom N-terminalen flankierenden Rest aus erstrecken.
Sobald die gewünschte Peptidsequenz ausgewählt ist, kann eine chemische Synthese durchgeführt werden, um das eingeschränkte helikale Peptid der Erfindung zu konstruieren. Dies kann erreicht werden, indem eines von verschiedenen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind (siehe R.F. Kelley & M.E. Winkler, in: Genetic Engineering Principles and Methods, J.K. Setlow, Hrsg., Plenum Press, N.Y., Bd. 12, S. 1–19 (1990); J.M. Steart, J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); siehe auch US-Patent Nr. 4.105.603, 3.972.859, 3.842.067; und 3.862.925) modifiziert wird, um ein gewünschtes Peptid herzustellen.
Peptide der Erfindung werden am besten unter Einsatz von Festphasen-Peptidsynthese hergestellt (J. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1964); Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5132 (1985). Eine Festphasensynthese beginnt am Carboxyterminus des geplanten Peptids, indem eine geschützte Aminosäure an einen inerten festen Träger gebunden wird. Der inerte feste Träger kann jedes beliebige Makromolekül sein, das in der Lage ist, als Anker für den C-Terminus der Ausgangsaminosäure zu dienen. Typischerweise ist der makromolekulare Träger ein vernetztes Polymerharz (z.B. ein Polyamid- oder Polystyrolharz), wie es in den 1-1 und 1-2 auf den Seiten 2 und 4 in Stewart und Young, s.o., gezeigt wird. In einer Ausführungsform wird die C-terminale Aminosäure an ein Polystyrolharz gebunden, um einen Benzylester herzustellen. Ein makromolekularer Träger wird so gewählt, dass die Peptid-Ankerbindung unter den Bedingungen stabil ist, die zum Entschützen der α-Aminogruppe der blockierten Aminosäuren während der Peptid synthese eingesetzt werden. Wenn eine basenlabile α-Schutzgruppe verwendet wird, ist es wünschenswert, eine säurelabile Verbindung zwischen dem Peptid und dem festen Träger einzusetzen. Ein säurelabiles Etherharz ist beispielsweise wirksam für eine Synthese eines basenlabilen Fmoc-Aminosäurepeptids, wie dies auf Seite 16 in Stewart und Young, s.o., beschrieben wird. Alternativ dazu können eine Peptidankerbindung und eine α-Schutzgruppe eingesetzt werden, die unterschiedlich labil gegenüber Azidolyse sind. Beispielsweise funktioniert ein Aminomethylharz, wie z.B. das Phenylacetamidomethyl- (Pam-) Harz, gut zusammen mit Boc-Aminosäurepeptidsynthese, wie sie auf Seite 11–12 in Stewart und Young, s.o., beschrieben wird.
Nachdem die Ausgangsaminosäure an einen inerten festen Träger gebunden wurde, wird die α-Aminoschutzgruppe der Ausgangsaminosäure entfernt, beispielsweise mit Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid und Neutralisierung in beispielsweise Triethylamin (TEA). Nach Entschützung der α-Aminogruppe der Ausgangsaminosäure wird die nächste α-Amino- und Seitenketten-geschützte Aminosäure der Synthese hinzugefügt. Die restlichen α-Amino-geschützten, und falls erforderlich Seitenkettengeschützten, Aminosäuren werden dann nacheinander in der gewünschten Reihenfolge durch Kondensation gebunden, um eine Zwischenverbindung zu erhalten, die an den festen Träger gebunden ist. Alternativ dazu können einige Aminosäuren aneinander gebunden werden, um ein Fragment des gewünschten Peptids zu bilden, gefolgt vom Hinzufügen des Peptidfragments zum wachsenden Festphasen-Peptidkette.
Die Kondensationsreaktion zwischen zwei Aminosäuren oder einer Aminosäure und einem Peptid oder einem Peptid und einem Peptid kann nach herkömmlichen Kondensationsverfahren, wie z.B. durch das Azidverfahren, gemischtes Säureanhydridverfahren, DCC-(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid-) oder DIC-(N,N'-Diisopropylcarbodiimid-) Verfahren, Aktivesterverfahren, p-Nitrophenylesterverfahren, BOP-(Benzotriazol-1-yloxytris[dimethylamino]phosphoniumhexafluorophosphat-) Verfahren, N-Hydroxybernsteinsäureimidoesterverfahren usw., sowie nach dem Woodward-Reagens-K-Verfahren erfolgen.
Normalerweise wird bei der chemischen Synthese von Peptiden jede reaktive Seitenkettengruppe der Aminosäuren mit geeigneten Schutzgruppen entschützt. Diese Schutzgruppen werden schlussendlich entfernt, nachdem die gewünschte Polypeptidkette zusammengesetzt wurde. Auch üblich ist ein Schutz der α-Aminogruppe an der Aminosäure oder einem Fragment, während das Gesamte an der Carboxygruppe reagiert, gefolgt von der selektiven Entfernung der α-Aminoschutzgruppe, damit an dieser Stelle eine nachfolgende Reaktion stattfinden kann. Demgemäß wird bei der Polypeptidsynthese häufig eine Zwischenverbindung hergestellt, die alle Aminosäurereste in der gewünschten Reihenfolge in der Peptidkette enthält, wobei an einige dieser Reste Seitenketten-Schutzgruppen gebunden sind. Diese Schutzgruppen werden meist zum im Wesentlichen gleichen Zeitpunkt entfernt, um das gewünschte Produkt herzustellen, gefolgt von einer Abspaltung vom Harz. Einen Überblick über Schutzgruppen und Verfahren zu deren Verwendung bei der Peptidsynthese findet sich in Protective Groups in Organic Synthesis, 1. Aufl., T.W. Greene und P.G.M. Wuts, Wiley & Sons, New York (1991).
Beispiele für geeignete Schutzgruppen für α-Amino- und Seitenketten-Aminogruppen sind Benzyloxycarbonyl-(abgekürzt mit Z), Isonicotinyloxycarbonyl-(iNOC), o-Chlorbenzyloxycarbonyl-[Z(2Cl)], p-Nitrobenzyloxycarbonyl-[Z(NO2)], p-Methoxybenzyloxycarbonyl-[Z(OMe)], t-Butoxycarbonyl-(Boc), t-Amyloxycarbonyl-(Aoc), Isobornyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl-, 2-(4-Biphenyl)-2-propyloxycarbonyl-(Bpoc), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc), Methylsulfonylethoxycarbonyl-(Msc), Trifluoracetyl-, Phthalyl-, Formyl-, 2-Nitrophenylsulfenyl-(NPS), Diphenylthiophosphinyl-(Ppt) und Dimethylthiophosphinyl-(Mpt) Gruppen und dergleichen.
Beispiele für Schutzgruppen für die funktionelle Carboxygruppe sind Benzylester, (Obz), Cyclohexylester (Chx), 4-Nitrobenzylester (Onb), t-Butylester (Obut), 4-Pyridylmethylester (Opic) und dergleichen. Oft ist es wünschenswert, dass Aminosäuren wie Arginin, Cystein und Serin, die eine andere funktionelle Gruppe aufweisen als Amino- und Carboxygruppen, mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt werden. Die Guanidinogruppe von Arginin kann beispielsweise mit Nitro, p-Toluolsulfonyl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, p-Methoxybenzolsulfonyl, 4-Methoxy-2,6-dimethylbenzolsulfonyl (Nds), 1,3,5-Trimethylphenylsulfonyl (Mts) und dergleichen geschützt werden. Die Thiolgruppe von Cystein kann mit p-Methoxybenzyl, Trityl und dergleichen geschützt sein.
In einer Ausführungsform werden die Peptide der Erfindung mithilfe von Blockiergruppen synthetisiert, welche die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der N-terminalen und C-terminalen flankierenden Reste schützen. Die Schutzgruppe oder -gruppen für die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der N-terminalen und C-terminalen flankierenden Reste können die gleichen wie oder andere als die Schutzgruppe oder -gruppen sein, die zum Blockieren der funktionellen Seitenkettengruppen anderer Reste im Peptid eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Schutzgruppe oder -gruppen, die zum Blockieren der eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten verwendet werden, in Bezug auf die Schutzgruppen, die für die anderen funktionellen Seitenkettengruppe im Peptid eingesetzt werden, unterschiedlich entfernbar, d.h. die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten können entschützt werden, ohne dass die anderen funktionellen Seitenkettengruppen im Peptid entschützt werden, und zwar zusätzlich zur unterschiedlichen Entfernbarkeit in Bezug auf die in der Peptidsynthese eingesetzte α-Aminoschutzgruppe. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste orthogonal in Bezug aufeinander entschützt, sodass der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent eines flankierenden Rests entschützt werden kann, ohne dass der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird.
Geeignete Schutzgruppen zur Verwendung beim orthogonalen Schützen der eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste in Bezug auf andere funktionelle Gruppe und/oder in Bezug aufeinander umfassen Paare von unterschiedlich entfernbaren Carboxyschutzgruppen, wie beispielsweise reduktionslabilen Schutzgruppen, z.B. Allyl- oder Benzylestern, gepaart mit einer basenlabilen Carboxyschutzgruppen, z.B. Fluorenylmethylestern, Methyl oder anderen primä ren Alkylestern. Fluorenylmethyl-, Methyl- oder andere primäre Alkylgruppen oder andere basenlabile Carboxyschutzgruppen können aus ihren entsprechenden Estern entfernt werden, um eine freie Carboxylgruppe zu erhalten (ohne dass Allyl- oder Benzylester oder anderen reduktionslabile Ester entschützt werden), und zwar durch Verseifung der Ester mit einer geeigneten Base, wie z.B. Piperidin und Natriumhydroxid, in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. Dimethylacetamid oder Methanol und Wasser, für einen Zeitraum von 10 bis 120 Minuten, vorzugsweise 20 Minuten, bei 0 bis 50°C. Der Allyl- oder Benzyl- oder andere reduktionslabile Ester kann, falls gewünscht, entfernt werden, und zwar durch Reduktion in Gegenwart eines geeigneten Übergangsmetallkatalysators, wie z.B. Pd(PPh₃)₄, Pd(PPh₃)₂Cl₂, Pd(OAc)₂ oder Pd/C, mit einer Wasserstoffquelle, z.B. H₂-Gas, in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. Dimethylacetamid, Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidinon oder Methanol, für einen Zeitraum von 10 bis 500 Minuten, vorzugsweise 100 Minuten, bei 0 bis 50°C. Der Einfachheit und Bequemlichkeit halber sind alle Carboxyschutzgruppen, die durch Pd-katalysierte Verfahren entfernbar sind, welche zur Reduktion des geschützten Carboxysubstituenten führen, in der Bezeichnung „reduktionslabile Schutzgruppen" enthalten, wie sie hierin verwendet wird, auch wenn Pdkatalysierte Entschützungsverfahren eventuell nicht zur Reduktion der betreffenden Schutzgruppe führen.
In Ausführungsformen, bei denen Pd-Katalyse die Bildung von Zwischenprodukten von mit reduktionslabilen Schutzgruppen derivatisiertem Pd, wie z.B. von Pd-Allyl-Derivaten, umfasst, kann der Pd-Katalysator durch Umsetzung mit einem geeigneten Nucleophil, wie z.B. Piperidin oder Tributylzinnhydrid, wiederhergestellt werden. Wenn solche reduktionslabile Gruppen verwendet werden, um in Kombination mit basenlabilen Schutzgruppen einen orthogonalen Schutz bereitzustellen, wird vorzugsweise entweder (1) ein Syntheseschema verwendet, das eine Entfernung der basenlabilen Schutzgruppen vor der Entfernung der reduktionslabilen Schutzgruppen erfordert, oder (2) der Pd-Katalysator mit einem Nucleophil wiederhergestellt, das die basenlabilen Schutzgruppen nicht entschützt.
Alternativ dazu können die Carboxy-Substituenten der flankierenden Reste in Bezug auf andere funktionelle Gruppen und/oder in Bezug aufeinander unter Einsatz einer säurelabilen Schutzgruppe, wie beispielsweise eines tertiären Alkylesters, z.B. t-Butylester, in Kombination mit einer reduktionslabilen Schutzgruppe, beispielsweise dem oben beschriebenen Allyl- oder Benzylester, orthogonal geschützt werden. Die tertiäre Alkyl- oder andere säurelabile Estergruppe kann durch Azidolyse, beispielsweise mit Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, entfernt werden, und der Allyl- oder Benzyl- oder andere reduktionslabile Ester kann durch Reduktion in Gegenwart eines Übergangsmetallkatalysators, wie oben beschrieben, entfernt werden.
In einer anderen Ausführungsform können die Carboxy-Substituenten der flankierenden Reste in Bezug auf andere funktionelle Gruppen und/oder in Bezug aufeinander unter Einsatz einer fluoridionenlabilen Schutzgruppe, beispielsweise 2-(Trimethylsilyl)ethyl- und Silylester, in Kombination mit einer reduktionslabilen Schutzgruppe, wie z.B. dem oben beschriebenen Allyl- oder Benzylester, oder in Kombination mit einer basenlabilen Schutzgruppe, wie z.B. dem oben beschriebenen Fluorenylmethyl-, Methyl- oder anderen primären Alkylester, orthogonal entschützt werden, ohne dass die reduktionslabilen oder basenlabilen Ester entschützt werden. Die 2-(Trimethylsilyl)ethyl-, Silyl- oder andere fluoridlabile Estergruppe kann durch Umsetzung mit einer geeigneten Fluoridionenquelle, wie z.B. Tetrabutylammoniumfluorid, in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels, wie z.B. Dimethylacetamid (DMA), Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF) oder Acetonitril, entfernt werden.
Geeignete Schutzgruppen zur Verwendung beim orthogonalen Schützen der eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste in Sezug auf andere funktionelle Gruppen und/oder in Bezug aufeinander umfasst auch Paare unterschiedlich entfernbarer Aminoschutzgruppen, wie z.B. eine Allyloxycarbonyl- oder andere reduktionslabile Aminoschutzgruppe, die mit einer t-Butoxycarbonyl-(Boc-) oder anderen säurelabilen Aminoschutzgruppe gepaart ist, und eine reduktionslabile Schutzgruppe, die mit einer Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc-) oder anderen basenlabilen Aminoschutzgruppe gepaart ist. Eine Allyloxycarbonyl-(oder mit einer anderen reduktionslabilen Blockiergruppe) geschützte Aminogruppe kann durch Reduktion unter Einsatz eines Übergangsmetallkatalysators entschützt werden, wie in den oben beschriebenen Verfahren zur Entfernung von reduktionslabilen Carboxyschutzgruppen erläutert wird, ohne dass eine Boc- oder Fmoc-geschützte Aminogruppe entschützt wird. Gleichermaßen kann eine säurelabile Aminoschutzgruppe und eine basenlabile Aminoschutzgruppe durch Azidolyse bzw. basische Verseifung entfernt werden, ohne dass eine reduktionslabile Aminoschutzgruppe entfernt wird. Der Einfachheit und Bequemlichkeit halber sind alle Aminoschutzgruppen, die durch Pd-katalysierte Verfahren entfernbar sind, die zur Reduktion der geschützten Aminosubstituenten führen, in der Bezeichnung „reduktionslabile Schutzgruppen", wie er hierin verwendet wird, eingeschlossen, auch wenn solche Pd-katalysierte Entschützungsverfahren eventuell nicht zur Reduktion der betreffenden Schutzgruppe führen.
In einer anderen Ausführungsform können die Aminosubstituenten der flankierenden Reste in Bezug auf andere funktionelle Gruppen und/oder in Bezug aufeinander unter Einsatz einer fluoridlabilen Schutzgruppe, wie z.B. 2-Trimethylsilylethylcarbamat (Teoc), in Kombination mit einer reduktionslabilen Schutzgruppe, wie z.B. Allyfoxylcarbonyl, oder in Kombination mit einer basenlabilen Schutzgruppe, wie z.B. Fluorenylmethoxycarbonyl, wie oben beschrieben orthogonal geschützt werden. Die Teoc- oder andere fluoridlabile Gruppe kann durch Umsetzung mit einer geeigneten Fluoridionenquelle, wie z.B. Tetrabutylammoniumfluorid, wie in den oben beschriebenen Verfahren zur Entfernung von fluoridlabilen Carboxyschutzgruppen entfernt werden, ohne dass eine Allyloxycarboyl- oder Fluorenylmethoxycarbonyl-geschützte Aminogruppe entschützt wird. Gleichmaßen kann eine reduktionslabile Aminoschutzgruppe und eine basenlabile Aminoschutzgruppe durch Reduktion bzw. basische Verseifung entfernt werden, ohne dass eine fluoridlabile Aminoschutzgruppe entfernt wird.
In Ausführungsformen, bei denen ein Carboxysubstituent als eine Amidbindung bildender Seitenketten-Substituent eines flankierenden Rests eingesetzt wird und ein Aminosubstituent als eine Amidbindung bildender Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests eingesetzt wird, können der Carboxysubstituent und der Aminosubstituent in Bezug aufeinander orthogonal geschützt werden, indem eine reduktionslabile Schutzgruppe eingesetzt wird, um einen Substituenten zu blockieren, z.B. Allylester oder Allyloxycarbonyl, und eine fluoridlabile, säurelabile oder basenlabile Schutzgruppe, um einen anderen Substituenten zu blockieren, z.B. Silylester, t-Butylester, Fluorenylmethylester, Teoc, Boc oder Fmoc.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine reduktionslabile Schutzgruppe verwendet, um den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten eines flankierenden Rests zu blockieren, und der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests wird so gewählt, dass er orthogonalen Schutz in Bezug auf sowohl die reduktionslabile Schutzgruppe als auch die α-Aminoschutzgruppe, die in der Peptidsynthese eingesetzt werden, bereitstellt. In einer Ausführungsform unter Anwendung von Fmoc-Chemie zur Peptidsynthese wird orthogonaler Schutz der eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten beispielsweise durch eine reduktionslabile Schutzgruppe und eine säurelabile Schutzgruppe bereitgestellt. Gleichmaßen wird in einer Ausführungsform unter Anwendung von Boc-Chemie zur Peptidsynthese orthogonaler Schutz der eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten durch eine reduktionslabile Schutzgruppe und eine basenlabile Schutzgruppe bereitgestellt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste in Bezug aufeinander, in Bezug auf eine α-Aminoschutzgruppe, die bei der Peptidsynthese eingesetzt wird, und in Bezug auf die Schutzgruppe, die zur Blockierung anderer funktioneller Seitenkettengruppen irr der Peptidkette orthogonal geschützt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste in Bezug aufeinander und in Bezug auf die α-Aminoschutzgruppe, die bei der Peptidsynthese eingesetzt wird, orthogonal geschützt, aber nur einer der eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten wird in Bezug auf die Schutzgruppen, die zur Blockierung ande rer funktioneller Seitenkettengruppen in der Peptidkette eingesetzt werden, orthogonal geschützt. In dieser Ausführungsform wird der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent mit vollem orthogonalem Schutz vorzugsweise als Target für die anfängliche Bindung des Peptids an den difunktionellen Linker verwendet. Da der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent mit vollem orthogonalem Schutz entschützt werden kann, ohne dass andere funktionelle Gruppen entschützt werden, ist die Bindungsreaktion spezifisch für den gewünschten, eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten und verringert die Produktion von unerwünschten Derivaten von Peptid/difunktionellem Linker. Obwohl eine Zyklisierung die Entschützung des eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des anderen flankierenden Rests erfordert und eine gleichzeitige Entschützung anderer funktioneller Seitenkettengruppen verursachen kann, ist die Wahrscheinlichkeit geringer, dass unerwünschte Derivate entstehen, da die Peptidketten an einem festen Träger verankert sind und die Linker-Länge regioselektiv eine Bindungsreaktion zwischen der ungebundenen funktionellen Gruppe des Linkers und dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der anderen flanierenden Rests bevorzugt. Wenn nach der Zyklisierung weitere Peptidkettensynthese gewünscht wird, kann jede beliebige funktionelle Seitenkettengruppe anderer Aminosäurereste, die durch die Zyklisierungsreaktionen entschützt worden waren, erneut geschützt werden, bevor die Kettensynthese wiederaufgenommen wird.
Viele der oben beschriebenen blockierten Aminosäuren können im Handel erworben werden, wie beispielsweise von Novabiochem (San Diego, CA, USA), Bachem CA (Torrence, CA, USA) oder Peninsula Labs (Belmont, CA, USA).
Außerdem können die Verfahren der Erfindung auch zusammen mit Flüssigphasen-Peptidsynthese umgesetzt werden, beispielsweise mit den in Principles of Peptide Synthesis, 2. Aufl., M. Bodansky, Springer-Verlag (1993) oder in The Practice of Peptide Synthesis, 2. Aufl., M. Bodansky und A. Bodansky, Springer Verlag (1994) beschriebenen Flüssigphasen-Peptidsyntheseverfahren. Es versteht sich, dass Flüssigphasen-Peptidsyntheseverfahren leicht so modifiziert werden können, dass die gewünschten flankierenden Reste, mit oder ohne orthogonal geschützte, eine Amid bindung bildende Seitenketten-Substituenten, in die Peptidkette von Interesse eingebaut werden, wobei ähnliche Verfahren eingesetzt werden wie bei den hierin beschriebenen Festphasen-Peptidsyntheseverfahren. Außerdem versteht sich, dass alle Verweise auf Peptidsynthese hierin, sofern nicht anders angegeben, sowohl Festphasen- als auch Flüssigphasen-(oder Lösungsphasen-) Peptidsyntheseverfahren umfassen.
b. Peptidzyklisierung
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz vervollständigt wurde, wird das lineare Peptid zyklisiert, um das Peptid auf eine helikale Konformation einzuschränken. Jedes beliebige Verfahren zur Verbrückung der eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste mit einem difunktionellen Linker ist zur Herstellung der eingeschränkten helikalen Peptide der Erfindung geeignet.
(i) Selektion eines difunktionellen Linkers
Typischerweise ist der zur Verwendung hierin geeignete difunktionelle Linker in der Lage, zwei funktionelle Gruppen, die in einem Abstand von etwa 5 Å bis etwa 30 Å, vorzugsweise etwa 8 Å bis etwa 14 Å, noch bevorzugter etwa 10 Å, voneinander getrennt sind, so zu präsentieren, dass der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent eines der flankierenden Reste eine Amidbindung mit einer der funktionellen Gruppen des Linkers bilden kann und der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests eine Amidbindung mit der verbleibenden funktionellen Gruppe des Linkers bilden kann. Es versteht sich, dass die Art des Molekülgerüsts, das zur Präsentation der gewünschten funktionellen Gruppen in der passenden räumlichen Beziehung verwendet wird, für die Umsetzung der Erfindung nicht entscheidend ist. Obwohl unverzweigte und verzweigte Alkylgerüste zur Verwendung hierin geeignet sind, ist die Erfindung nicht darauf beschränkt. Beispielsweise können Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder andere aliphatische Kohlenwasserstoffspezies, mit oder ohne Heteroatome, und Monophenyl-, Biphenyl-, Naphthyl- und andere aromatische Kohlenwasserstoffspezies, mit oder ohne Hetero atome, die mit den gewünschten funktionellen Gruppen in der passenden räumlichen Beziehung substituiert sind (z.B. para- oder meta-Substitutionen in Ringstrukturen, wie z.B. Monophenyl, Biphenyl, Naphthyl und dergleichen), verwendet werden, um die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste zu verbinden.
Die im funktionellen Linker eingesetzten funktionellen Gruppen werden so gewählt, dass sie in der Lage sind, Amidbindungen mit den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste zu bilden, die im zu zyklisierenden Peptid verwendet werden. In Ausführungsformen, worin der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent jedes flankierenden Rests ein Carboxysubstituent ist, wird das Peptid am besten mit einem Diaminlinker zyklisiert. In einem Beispiel werden die flankierenden Reste und der Diaminlinker gemäß nachstehender Tabelle 1 ausgewählt. Es versteht sich, dass die flankierenden Reste und Linkermoleküle, die in der nachstehenden Tabelle 1 angeführt sind, nicht nur das jeweilige Molekül darstellen, das dem chemischen Namen gemäß IUPAC entspricht, sondern auch Varianten des Moleküls, die weitere Substituenten oder modifizierte Substituenten enthalten, welche die Funktion der Amino- und/oder Carboxygruppen im Molekül nicht verhindern und/oder wesentlich verändern, wobei diese Funktion zur Verwendung des Moleküls in den Verfahren der Erfindung notwendig ist. Demgemäß versteht sich, dass jedes nachstehend angeführte Molekül auch Molekülvarianten umfasst, die Alkenyl-, Alkinyl- und andere ungesättigte Bindungen, Heteroatome, Cycloalkylsubstituenten, aromatische Substituenten oder andere Substituenten im Kohlenstoff-Rückgrat des Moleküls enthalten, und/oder Varianten, welche die obigen oder andere Substituenten oder Gruppen anstelle von Wasserstoffatomen auf dem Kohlenstoff-Rückgrat des Moleküls enthalten.
Tabelle 1
In Ausführungsformen, in denen der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent jedes flankierenden Rests ein Aminosubstituent ist, wird das Peptid am besten mit einem Dicarbonsäurelinker zyklisiert. In einem Beispiel werden die flankierenden Reste und der Dicarbonsäurelinker gemäß nachstehender Tabelle 2 ausgewählt. Es versteht sich, dass die flankierenden Reste und Linkermoleküle, die in der nachstehenden Tabelle 2 angeführt sind, nicht nur das jeweilige Molekül darstellen, das dem chemischen Namen gemäß IUPAC entspricht, sondern auch Varianten des Moleküls, die weitere Substituenten oder modifizierte Substituenten enthalten, welche die Funktion der Amino- und/oder Carboxygruppen im Molekül nicht verhindern und/oder wesentlich verändern, wobei diese Funktion zur Verwendung des Moleküls in den Verfahren der Erfindung notwendig ist. Demgemäß versteht sich, dass jedes nachstehend angeführte Molekül auch Molekülvarianten umfasst, die Alkenyl-, Alkinyl- und andere ungesättigte Bindungen, Heteroatome, Cycloalkylsubstituenten, aromatische Substituenten oder andere Substituenten im Kohlenstoff-Rückgrat des Moleküls enthalten, und/oder Varianten, welche die obigen oder andere Substituen ten oder Gruppen anstelle von Wasserstoffatomen auf dem Kohlenstoff-Rückgrat des Moleküls enthalten.
Tabelle 2
In Ausführungsformen, bei denen ein Aminosubstituent als eine Amidbindung bildender Seitenketten-Substituent des einen fankierenden Rests und ein Carboxysubstituent als eine Amidbindung bildender Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests eingesetzt wird, wird das Peptid am besten mit einem aminosubstituierten Carbonsäure-(Aminocarbonsäure-) Linker zyklisiert. In einem Beispiel werden die flankierenden Reste und der Aminocarbonsäure-Linker gemäß nachstehender Tabelle 3 ausgewählt. Es versteht sich, dass die flankierenden Reste und Linkermoleküle, die in der nachstehenden Tabelle 3 angeführt sind, nicht nur das jeweilige Molekül darstellen, das dem chemischen Namen gemäß IUPAC entspricht, sondern auch Varianten des Moleküls, die weitere Substituenten oder modifizierte Substituenten enthalten, welche die Funktion der Amino- und/oder Carboxygruppen im Molekül nicht verhindern und/oder wesentlich verändern, wobei diese Funktion zur Verwendung des Moleküls in den Verfahren der Erfindung notwendig ist. Demgemäß versteht sich, dass jedes nachstehend angeführte Molekül auch Molekülvarianten um fasst, die Alkenyl-, Alkinyl- und andere ungesättigte Bindungen, Heteroatome, Cycloalkylsubstituenten, aromatische Substituenten oder andere Substituenten im Kohlenstoff-Rückgrat des Moleküls enthalten, und/oder Varianten, welche die obigen oder andere Substituenten oder Gruppen anstelle von Wasserstoffatomen auf dem Kohlenstoff-Rückgrat des Moleküls enthalten.
Tabelle 3
(ii) Zyklisierungsverfahren
Sobald die flankierenden Reste und der difunktionelle Linker ausgewählt wurden und die Peptidkette, welche die flankierenden Reste überspannt, auf einer festen Phase synthetisiert wurde, kann der difunktionelle Linker verwendet werden, um das festphasengebundene Peptid durch ein beliebiges geeignetes Verfahren zu zyklisieren. Es versteht sich, dass die Erfindung Verfahren zur Zyklisierung eines Peptids umfasst, nachdem die endgültige Peptidkette vollständig synthetisiert wurde, sowie Verfahren zur Zyklisierung des Peptids zu jedem beliebigen Zeitpunkt während der Peptidsynthese, an dem die Peptidkette die flankierenden Reste enthält, die durch den difunktionellen Linker zu vernetzen sind. Verfahren zur Zyklisierung des Peptids umfassen (1) die Entschützung der eine Amidbindung bildenden Seitenketten- Substituenten der flankierenden Reste und die Umsetzung des Festphasenpeptids mit dem difunktionellen Linker, um gleichzeitig Amidbindungen zwischen den beiden funktionellen Gruppen des Linkers und den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten beider flankierender Reste zu bilden; (2) das Entschützen des eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten von nur einem der flankierenden Reste (ohne dass der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird), das Umsetzen des difunktionellen Linkers mit dem Festphasenpeptid, um eine Amidbindung zwischen einer funktionellen Gruppe auf dem Linker und dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des entschützten flankierenden Rests zu bilden, und dann das intramolekulare Umsetzen der freien funktionellen Gruppe auf dem Linker und des eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des anderen flankierenden Rests, wodurch das Peptid zyklisiert wird; und (3) das Entschützen der eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten beider flankierender Reste, wodurch ein einfach geschützter difunktionellen Linker erhalten wird, worin nur eine der beiden eine Amidbindung bildenden funktionellen Gruppen des Linkers in der Lage ist, mit einem entsprechenden, eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten in einem flankierenden Rest zu reagieren, das Umsetzen des einfach geschützten, difunktionellen Linkers mit dem Festphasenpeptid, um eine Amidbindung zwischen der freien funktionellen Gruppe auf dem Linker und dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten eines der entschützten flankierenden Rests zu bilden, das Entschützen der blockierten funktionellen Gruppe auf dem Linker und dann das intramolekulare Umsetzen der freien funktionellen Gruppe auf dem Linker und des eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des anderen flankierenden Rests, wodurch das Peptid zyklisiert wird. Die orthogonalen Entschützungsreaktionen, nichtorthogonalen Entschützungsreaktionen und Amidbindung-Bildungs-reaktionen können wie im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschrieben durchgeführt werden.
Bei der Umsetzung der Verfahren der Erfindung, die im Allgemeinen wie oben als Verfahren (2) und (3) beschrieben sind, ist es wünschenswert, Syntheseschemata einzusetzen, welche die Vorteile eines orthogonalen Schutzes und einer orthogona len Entschützung von funktionellen Gruppen nutzen, um die Bildung von unerwünschten Derivaten zu vermeiden. Für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ist aus den folgenden repräsentativen Syntheseschemata ersichtlich, dass die Schutzgruppen für die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste, das eingesetzte Peptidsyntheseverfahren und die Abfolge der Peptidzyklisierungsreaktionen so gewählt werden können, dass jede dieser Komponenten des Syntheseschemas die Spezifität der Reaktionen erhöht und die Ausbeute des gewünschten Produkts verbessert.
(iii) Zyklisierung unter Einsatz von Diaminlinkern
In einem Beispiel, bei dem Carboxysubstituenten für die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten beider flankierender Reste, ein Diaminlinker zur Zyklisierung und Fmoc-Chemie zur Peptidsynthese verwendet werden, werden die Carboxysubstituenten orthogonal in Bezug aufeinander und in Bezug auf die Fmoc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette geschützt, indem eine Allylgruppe zum Schutz des Carboxysubstituenten des einen flankierenden Rests und ein t-Butylester zum Schutz des Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests eingesetzt werden. In diesem Beispiel kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) eine Reduktion zur Entschützung des Allyl-geschützten Carboxysubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der t-Butylestergeschützte Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder einfach geschützter (z.B. mit Allyloxycarbonyl oder Boc einfach geschützter) Diaminlinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen einer der Aminogruppen des Linkers und dem entschützten Carboxysubstituenten zu bilden; (3) Azidolyse zur Entschützung des t-Butylester-geschützten Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Boc-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Boc einfach geschützter Diaminlinker als Linker verwendet wird; (4) eine Reduktion zur Entschützung der Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Allyloxycarbonyl einfach geschützter Diaminlinker als Linker verwendet wird; und (5) der freie Carboxysubstituent des anderen flankieren den Rests mit der freien Aminogruppe des Linkers intramolekular umgesetzt wird, um eine Amidbindung zu bilden, die das Peptid zyklisiert.
Alternativ dazu kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) Azidolyse zur Entschützung des t-Butyiester-geschützten Carboxysubstituenten des einen flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der Allyl-geschützte Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder einfach geschützter (z.B. mit Allyloxycarbonyl oder Boc einfach geschützter) Diaminlinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen einer der Aminogruppen des Linkers und dem entschützten Carboxysubstituenten zu bilden; (3) eine Reduktion zur Entschützung des Allyl-geschützten Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Allyloxycarbonyl einfach geschützter Diaminlinker als Linker verwendet wird; (4) Azidolyse zur Entschützung der Boc-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Boc einfach geschützter Diaminlinker als Linker verwendet wird; und (5) der freie Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Aminogruppe des Linkers intramolekular umgesetzt wird, um eine Amidbindung zu bilden, die das Peptid zyklisiert.
In einem Beispiel, bei dem Carboxysubstituenten für die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten beider flankierender Reste, ein Diaminlinker zur Zyklisierung und Boc-Chemie für die Peptidsynthese verwendet werden, werden die Carboxysubstituenten in Bezug aufeinander und in Bezug auf die Boc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette orthogonal geschützt, indem eine Allylgruppe zum Schutz des Carboxysubstituenten eines flankierenden Rests und ein Fluorenylmethyl-(Fm-) Ester zum Schutz des Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests eingesetzt werden. In diesem Beispiel kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) eine Reduktion zur Entschützung des Allyl-geschützten Carboxysubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der Fm-geschützte Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder einfach geschützter (z.B. mit Allyloxycarbonyl oder Fmoc ein fach geschützter) Diaminlinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen einer der Aminogruppen des Linkers und dem entschützten Carboxysubstituenten zu bilden; (3) basische Verseifung zur Entschützung des Fm-Ester-geschützten Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Fmoc-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Fmoc einfach geschützter Diaminlinker als Linker verwendet wird; (4) eine Reduktion zur Entschützung der Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Allyloxycarbonyl einfach geschützter Diaminlinker als Linker verwendet wird; und (5) der freie Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Aminogruppe des Linkers intramolekular umgesetzt wird, um eine Amidbindung zu bilden, die das Peptid zyklisiert.
Alternativ dazu kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) basische Verseifung zur Entschützung des Fm-Ester-geschützten Carboxysubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der Allyl-geschützte Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder einfach geschützter (z.B. mit Allyloxycarbonyl oder Fmoc einfach geschützter) Diaminlinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen einer der Aminogruppen des Linkers und dem entschützten Carboxysubstituenten zu bilden; (3) eine Reduktion zur Entschützung des Allyl-geschützten Carboxysubstituenien des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Allyloxycarbonyl einfach geschützter Diaminlinker als Linker verwendet wird; (4) basische Verseifung zur Entschützung der Fmoc-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Fmoc einfach geschützter Diaminlinker als Linker verwendet wird; und (5) der freie Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Aminogruppe des Linkers intramolekular umgesetzt wird, um eine Amidbindung zu bilden, die das Peptid zyklisiert.
(iv) Zyklisierung unter Einsatz von Dicarbonsäurelinkern
In einem Beispiel, bei dem Aminosubstituenten für die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten beider flankierender Reste, ein Dicarbonsäurelinker zur Zyklisierung und Fmoc-Chemie zur Peptidsynthese verwendet werden, werden die Aminosubstituenten orthogonal in Bezug aufeinander und in Bezug auf die Fmoc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette geschützt, indem eine Allyloxycarbonylgruppe zum Schutz des Aminosubstituenten des einen flankierenden Rests und eine Boc-Gruppe zum Schutz des Aminosubstituenten des anderen flankierenden Rests eingesetzt werden. In diesem Beispiel kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) eine Reduktion zur Entschützung des Allyloxycarbonylgeschützten Aminosubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der Boc-geschützte Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder einfach geschützter (z.B. mit Allyl- oder t-Butylester einfach geschützter) Dicarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen einer der Carboxygruppen des Linkers und dem entschützten Aminosubstituenten zu bilden; (3) Azidolyse zur Entschützung des Boc-geschützten Aminosubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der t-Butylester-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit t-Butylester einfach geschützter Dicarbonsäurelinker als Linker verwendet wird; (4) eine Reduktion zur Entschützung der Allyl-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Allyl einfach geschützter Dicarbonsäurelinker als Linker verwendet wird; und (5) der freie Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Carboxygruppe des Linkers intramolekular umgesetzt wird, um eine Amidbindung zu bilden, die das Peptid zyklisiert.
Alternativ dazu kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) Azidolyse zur Entschützung des Boc-geschützten Aminosubstituenten des einen flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der Allyloxycarbonyl-geschützte Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder einfach geschützter (z.B. mit Allyl- oder t-Butylester einfach geschützter) Dicarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen einer der Carboxygruppen des Linkers und dem entschützten Aminosubstituenten zu bilden; (3) eine Reduktion zur Entschützung des Allyloxycarbonyl-geschützten Aminosubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Allyl-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Allyl einfach geschützter Dicarbonsäurelinker als Linker verwendet wird; (4) Azidolyse zur Entschützung der t-Butylester-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit t-Butylester einfach geschützter Dicarbonsäurelinker als Linker verwendet wird; und (5) der freie Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Carboxygruppe des Linkers intramolekular umgesetzt wird, um eine Amidbindung zu bilden, die das Peptid zyklisiert.
In einem Beispiel, bei dem Aminosubstituenten für die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten beider flankierender Reste, ein Dicarbonsäurelinker zur Zyklisierung und Boc-Chemie für die Peptidsynthese verwendet werden, werden die Aminosubstituenten in Bezug aufeinander und in Bezug auf die Boc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette orthogonal geschützt, indem eine Allyloxycarbonylgruppe zum Schutz des Aminosubstituenten eines flankierenden Rests und eine Fmoc-Gruppe zum Schutz des Aminosubstituenten des anderen flankierenden Rests eingesetzt werden. In diesem Beispiel kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) eine Reduktion zur Entschützung des Aliyloxycarbonyl-geschützten Aminosubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der Fmoc-geschützte Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder einfach geschützter (z.B. mit Allyl- oder Fm-Ester einfach geschützter) Dicarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen einer der Carboxygruppen des Linkers und dem entschützten Aminosubstituenten zu bilden; (3) basische Verseifung zur Entschützung des Fmoc-geschützten Aminosubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Fm-Ester-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Fm-Ester einfach geschützter Dicarbonsäurelinker als Linker verwendet wird; (4) eine Reduktion zur Entschützung der Allyl-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Allyl einfach geschützter Dicarbonsäurelinker als Linker verwendet wird; und (5) der freie Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Carboxygruppe des Linkers intramolekular umgesetzt wird, um eine Amidbindung zu bilden, die das Peptid zyklisiert.
Alternativ dazu kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) basische Verseifung zur Entschützung des Fmac-geschützten Aminosubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der Allyloxycarbonyl-geschützte Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder einfach geschützter (z.B. mit Allyl- oder Fm-Ester einfach geschützter) Dicarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen einer der Carboxygruppen des Linkers und dem entschützten Aminosubstituenten zu bilden; (3) eine Reduktion zur Entschützung des Allyloxycarbonyl-geschützten Aminosubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Allyl-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Allyl einfach geschützter Dicarbonsäurelinker als Linker verwendet wird; (4) basische Verseifung zur Entschützung der Fm-Ester-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn ein mit Fmoc einfach geschützter Dicarbonsäurelinker als Linker verwendet wird; und (5) der freie Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Carboxygruppe des Linkers intramolekular umgesetzt wird, um eine Amidbindung zu bilden, die das Peptid zyklisiert.
(v) Zyklisierung unter Einsatz von Aminocarbonsäurelinkern
In einem Beispiel, bei dem ein Aminosubstituent für den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten eines flankierenden Rests, ein Garboxysubstituent für den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des anderen flankierenden Rests, ein Aminocarbonsäurelinker zur Zyklisierung und Fmoc-Chemie zur Peptidsynthese verwendet werden, werden die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste orthogonal in Bezug aufeinander und in Bezug auf die Fmoc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette geschützt, indem eine Allyloxycarbonylgruppe zum Schutz des Aminosubstituenten des einen flankierenden Rests und ein t-Butylester zum Schutz des Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests eingesetzt werden. In diesem Beispiel kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) eine Reduktion zur Entschützung des Allyloxycarbonyl-geschützten Aminosubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der t-Butylester-geschützte Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder aminoge-schützter (z.B. mit Allyloxycarbonyl aminogeschützter oder mit Boc aminogeschützter) Aminocarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der Carboxygruppe des Linkers und dem entschützten Aminosubstituenten zu bilden; (3) Azidolyse zur Entschützung des t-Butylester-geschützten Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Boc-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Boc-geschützten Aminogruppe als Linker verwendet wird; (4) eine Reduktion zur Entschützung der Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Allyloxycarbonyl-geschützte Aminogruppe als Linker verwendet wird; und (5) der freie Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Aminogruppe des Aminocarbonsäurelinkers intramolekular umgesetzt wird, um das Peptid zu zyklisieren.
Alternativ dazu kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) Azidolyse zur Entschützung des t-Butylester-geschützten Carboxysubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ahne dass der Allyloxycarbonyl-geschützte Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder carboxygeschützter (z.B. mit Allyl- oder t-Butylester carboxygeschützter) Aminocarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der Aminogruppe des Linkers und dem entschützten Carboxysubstituenten zu bilden; (3) eine Reduktion zur Entschützung des Allyloxycarbonyl-geschützten Aminosubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Allyl-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Allyl-geschützten Carboxygruppe als Linker verwendet wird; (4) Azidolyse zur Entschützung der t-Butylester-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer t-Butylester-geschützten Carboxygruppe als Linker verwendet wird; und (5) der freie Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Carboxygruppe des Linkers intramolekular umgesetzt wird, um das Peptid zu zyklisieren.
In einem anderen Beispiel, bei dem ein Aminosubstituent für den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten eines flankierenden Rests, ein Carboxysubstituent für den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des anderen flankierenden Rests, ein Aminocarbonsäurelinker zur Zyklisierung und Fmoc-Chemie für die Peptidsynthese verwendet werden, werden die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste in Bezug aufeinander und in Bezug auf die Fmoc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette orthagonal geschützt, indem eine Boc-Gruppe zum Schutz des Aminosubstituenten eines flankierenden Rests und eine Allylgruppe zum Schutz des Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests eingesetzt werden. In diesem Beispiel kann das Peptid zyklisiert werden; indem (1) Azidolyse zur Entschützung des Boc-geschützten Aminosubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der Allyl-geschützte Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder aminogeschützter (z.B. mit Allyloxycarbonyl aminogeschützter oder mit Boc aminogeschützter) Aminocarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der Carboxygruppe des Linkers und dem entschützten Aminosubstituenten zu bilden; (3) eine Reduktion zur Entschützung des Allyl-geschützten Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe als Linker verwendet wird; (4) Azidolyse zur Entschützung der Boc-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Boc-geschützten Aminogruppe als Linker verwendet wird; und (5) der freie Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Aminogruppe des Aminocarbonsäurelinkers intramolekular umgesetzt wird, um das Peptid zu zyklisieren.
Alternativ dazu kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) Azidolyse zur Entschützung des Boc-geschützten Aminosubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der Allyl-geschützte Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder aminogeschützter (z.B. mit Allyloxycarbonyl aminogeschützter oder mit Boc aminogeschützter) Aminocarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der Carboxygruppe des Linkers und dem entschützten Aminosubstituenten zu bilden; (3) eine Reduktion zur Entschützung des Allyl-geschützten Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe als Linker verwendet wird; (4) Azidolyse zur Entschützung der Boc-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Boc-geschützten Gruppe als Linker verwendet wird; und (5) der freie Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Aminogruppe des Aminocarbonsäurelinkers intramolekular umgesetzt wird, um das Peptid zu zyklisieren.
In einem Beispiel, bei dem ein Aminosubstituent für den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten eines flankierenden Rests, ein Carboxysubstituent für den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des anderen flankierenden Rests, ein Aminocarbonsäurelinker zur Zyklisierung und Boc-Chemie für die Peptidsynthese verwendet werden, werden die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste in Bezug aufeinander und in Bezug auf die Boc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette orthogonal geschützt, indem eine Allyloxycarbonylgruppe zum Schutz des Aminosubstituenten eines flankierenden Rests und ein Fm-Ester zum Schutz des Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests eingesetzt werden. In diesem Beispiel kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) eine Reduktion zur Entschützung des Allyloxycarbonyl-geschützten Aminosubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der Fm-Ester-geschützte Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder aminogeschützter (z.B. mit Allyloxycarbonyl aminogeschützter oder mit Boc aminogeschützter) Aminocarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der Carboxygruppe des Linkers und dem entschützten Aminosubstituenten zu bilden; (3) basische Verseifung zur Entschützung des Fm-Ester-geschützten Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Fmoc-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Fmoc-geschützten Aminogruppe als Linker verwendet wird; (4) eine Reduktion zur Entschützung der Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Allyfoxycarbonyl-geschützten Aminogruppe als Linker verwendet wird; und (5) der freie Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Aminogruppe des Aminocarbonsäurelinkers intramolekular umgesetzt wird, um das Peptid zu zyklisieren.
Alternativ dazu kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) basische Verseifung zur Entschützung des Fm-Ester-geschützten Carboxysubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der Allyloxycarbonyl-geschützte Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder carboxygeschützter (z.B. mit Allyl- oder Fm-Ester carboxygeschützter) Aminocarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der Aminogruppe des Linkers und dem entschützten Carboxysubstituenten zu bilden; (3) eine Reduktion zur Entschützung des Allyl-geschützten Aminosubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Allyl-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Allyl-geschützten Carboxygruppe als Linker verwendet wird; (4) basische Verseifung zur Entschützung der Fm-Ester-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Fm-Ester-geschützten Carboxygruppe als Linker verwendet wird; und (5) der freie Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Carboxygruppe des Aminocarbonsäurelinkers intramolekular umgesetzt wird, um das Peptid zu zyklisieren.
In einem weiteren Beispiel, bei dem ein Aminosubstituent für den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten eines flankierenden Rests, ein Carboxysubstituent für den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des anderen flankierenden Rests, ein Aminocarbonsäurelinker zur Zyklisierung und Boc-Chemie für die Peptidsynthese verwendet werden, werden die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste in Bezug aufeinander und in Bezug auf die Boc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette orthogonal geschützt, indem eine Fmoc-Gruppe zum Schutz des Aminosubstituenten eines flankierenden Rests und eine Allylgruppe zum Schutz des Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests eingesetzt werden. In diesem Beispiel kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) basische Verseifung zur Entschützung des Fmoc-geschützten Aminosubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der Allyl-geschützte Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder aminogeschützter (z.B. mit Allyloxycarbonyl aminogeschützter oder mit Fmoc aminogeschützter) Aminocarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der Carboxygruppe des Linkers und dem entschützten Aminosubstituenten zu bilden; (3) eine Reduktion zur Entschützung des Allyl-geschützten Carboxysubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe als Linker verwendet wird; (4) basische Verseifung zur Entschützung der Fmoc-geschützten Aminogruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Fmoc-geschützten Aminogruppe als Linker verwendet wird; und (5) der freie Carboxysubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Aminogruppe des Aminocarbonsäurelinkers intramolekular umgesetzt wird, um das Peptid zu zyklisieren.
Alternativ dazu kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) eine Reduktion zur Entschützung des Allyl-geschützten Carboxysubstituenten eines flankierenden Rests eingesetzt wird (ohne dass der Fmoc-geschützte Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests entschützt wird); (2) ein ungeschützter oder carboxygeschützter (z.B. mit Allyl- oder Fm-Ester carboxygeschützter) Aminocarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der Aminogruppe des Linkers und dem entschützten Carboxysubstituenten zu bilden; (3) basische Verseifung zur Entschützung des Fmoc-geschützten Aminosubstituenten des anderen flankierenden Rests und zur Entschützung der Fm-Ester-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Fm- Ester-geschützten Carboxygruppe als Linker verwendet wird; (4) eine Reduktion zur Entschützung der Allyl-geschützten Carboxygruppe des Linkers eingesetzt wird, wenn eine Aminocarbonsäure mit einer Allyl-geschützten Carboxygruppe als Linker verwendet wird; und (5) der freie Aminosubstituent des anderen flankierenden Rests mit der freien Carboxygruppe des Aminocarbonsäurelinkers intramolekular umgesetzt wird, um das Peptid zu zyklisieren.
In einem weiteren Beispiel, bei dem ein Aminosubstituent für den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten eines flankierenden Rests, ein Carboxysubstituent für den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des anderen flankierenden Rests, ein Aminocarbonsäurelinker zur Zyklisierung und Fmoc-Chemie für die Peptidsynthese verwendet werden, wird für Regioselektivität des Zyklisierungsvorgangs gesorgt, indem die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste in Bezug auf die Fmoc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette orthogonal geschützt werden, nicht aber in Bezug aufeinander, und indem eine der funktionellen Gruppen des Aminocarbonsäurelinkers in Bezug auf die Fmoc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette orthogonal geschützt wird.
In einem Beispiel der oben genannten Ausführungsform, bei dem ein Allyoxycarbonyl-geschützter Aminosubstituent als eine Amidbindung bildender Seitenketten-Substituent eines flankierenden Rests, ein Allyl-geschützter Carboxysubstituent als eine Amidbindung bildender Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests, ein einfach geschützter Aminocarbonsäurelinker und Fmoc-Chemie für die Peptidsynthese verwendet werden, kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) eine Reduktion zur orthogonalen Entschützung der eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste eingesetzt wird (ohne dass die Fmoc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette entschützt wird); (2) ein carboxygeschützter (z.B. mit Allyl- oder t-Butylester carboxygeschützter) oder aminogeschützter (z.B. mit Allyloxycarbonyl oder Boc aminogeschützter) Aminocarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbin dung zwischen der ungeschützten funktionellen Gruppe des Linkers und dem entsprechenden, eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten auf einem der flankierenden Reste zu bilden; (3) eine Reduktion oder Azidolyse, je nach Fall, zur Entschützung der geschützten funktionellen Gruppe des Linkers eingesetzt wird; und (4) der freie, eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests mit der freien funktionellen Gruppe des Linkers umgesetzt wird, um das Peptid zu zyklisieren.
In einem Beispiel der oben genannten Ausführungsform, bei dem ein Boc-geschützter Aminosubstituent als eine Amidbindung bildender Seitenketten-Substituent eines flankierenden Rests, ein t-Butylester-geschützter Carboxysubstituent als eine Amidbindung bildender Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests, ein einfach geschützter Aminocarbonsäurelinker und Fmoc-Chemie für die Peptidsynthese verwendet werden, kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) Azidolyse zur orthogonalen Entschützung der eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste eingesetzt wird (ohne dass die Fmoc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette entschützt wird); (2) ein carboxygeschützter (z.B. mit Allyl- oder t-Butylester carboxygeschützter) oder aminogeschützter (z.B. mit Allyloxycarbonyl oder Boc aminogeschützter) Aminocarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der ungeschützten funktionellen Gruppe des Linkers und dem entsprechenden, eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten auf einem der flankierenden Reste zu bilden; (3) eine Reduktion oder Azidolyse, je nach Fall, zur Entschützung der geschützten funktionellen Gruppe des Linkers eingesetzt wird; und (4) der freie, eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests mit der freien funktionellen Gruppe des Linkers umgesetzt wird, um das Peptid zu zyklisieren.
In einer weiteren Ausführungsform, bei der ein Aminosubstituent für den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten eines flankierenden Rests, ein Carboxysubstituent für den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des anderen flankierenden Rests, ein Aminocarbonsäurelinker zur Zyklisierung und Boc- Chemie für die Peptidsynthese verwendet werden, wird für Regioselektivität des Zyklisierungsvorgangs gesorgt, indem die eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste in Bezug auf die Boc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette orthogonal geschützt werden, nicht aber in Bezug aufeinander, und indem eine der funktionellen Gruppen des Aminocarbonsäurelinkers in Bezug auf die Boc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette orthogonal geschützt wird.
In einem Beispiel für die oben genannte Ausführungsform, bei dem ein Allyloxycarbonyl-geschützter Aminosubstituent als eine Amidbindung bildender Seitenketten-Substituent eines flankierenden Rests, ein Allyl-geschützter Carboxysubstituent als eine Amidbindung bildender Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests, ein Aminocarbonsäurelinker und Boc-Chemie für die Peptidsynthese verwendet werden, kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) eine Reduktion zur orthogonalen Entschützung der eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste eingesetzt wird (ohne dass die Boc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette entschützt wird); (2) ein carboxygeschützter (z.B. mit Allyl- oder Fm-Ester carboxygeschützter) oder aminogeschützter (z.B. mit Allyloxycarbonyl oder Fmoc aminogeschützter) Aminocarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der ungeschützten funktionellen Gruppe des Linkers und dem entsprechenden, eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten auf einem der flankierenden Reste zu bilden; (3) eine Reduktion oder basische Verseifung, je nach Fall, zur Entschützung der geschützten funktionellen Gruppe des Linkers eingesetzt wird; und (4) der freie, eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests mit der freien funktionellen Gruppe des Linkers umgesetzt wird, um das Peptid zu zyklisieren.
In einem Beispiel für die oben genannte Ausführungsform, bei dem ein Fmoc-geschützter Aminosubstituent als eine Amidbindung bildender Seitenketten-Substituent eines flankierenden Rests, ein Fm-Ester-geschützter Carboxysubstituent als eine Amidbindung bildender Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests, ein Aminocarbonsäurelinker und Boc-Chermie für die Peptidsynthese verwendet werden, kann das Peptid zyklisiert werden, indem (1) basische Verseifung zur orthogonalen Entschützung der eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten der flankierenden Reste eingesetzt wird (ohne dass die Boc-geschützte α-Aminogruppe des N-terminalen Rests in der Peptidkette entschützt wird); (2) ein carboxygeschützter (z.B. mit Allyl- oder Fm-Ester carboxygeschützter) oder aminogeschützter (z.B. mit Allyloxycarbonyl oder Fmoc aminogeschützter) Aminocarbonsäurelinker mit dem Festphasenpeptid umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der ungeschützten funktionellen Gruppe des Linkers und dem entsprechenden, eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten auf einem der flankierenden Reste zu bilden; (3) eine Reduktion oder basische Verseifung, je nach Fall, zur Entschützung der geschützten funktionellen Gruppe des Linkers eingesetzt wird; und (4) der freie, eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des anderen flankierenden Rests mit der freien funktionellen Gruppe des Linkers umgesetzt wird, um das Peptid zu zyklisieren.
Nach der Zyklisierung wird das eingeschränkte Helixpeptid gegebenenfalls vom festen Träger abgespalten, gewonnen und gereinigt. Das Peptid kann mithilfe eines Reagens vom festen Träger abgetrennt werden, das in der Lage ist, die Bindung zwischen Peptid und fester Phase aufzubrechen und gegebenenfalls blockierte funktionelle Seitenketten-Gruppen auf dem Peptid zu entschützen. In einer Ausführungsform wird das Peptid durch Azidolyse mit flüssigem Fluorwasserstoff (Flusssäure, HF) vorn festen Träger abgespalten, das auch jegliche verbleibende Seitenketten-Schutzgruppen enlernt. Um eine Alkylierung der Reste im Peptid (beispielsweise eine Alkylierung von Methionin-, Cystein- und Tyrosinresten) zu verhindern, enthält das Azidolyse-Reaktionsgemisch vorzugsweise Thiokresol- und Kresol als Fänger. Nach der HF-Abspaltung wird das Harz mit Ether gewaschen, und das freie Peptid wird aus dem Harz extrahiert, gefolgt von Waschvorgängen mit Essigsäurelösungen. Die vereinigten Waschlösungen werden gefriergetrocknet, und der Rückstand wird gereinigt.
c. Flüssigphasenzyklisierung
Alternativ dazu kann das Peptid vor dem Zyklisierungsschritt vom festen Träger abgespalten werden. In einer Ausführungsform wird, nachdem der difunktionelle Linker an den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des ersten flankierenden Rests im Peptid gebunden wurde, das Peptid vom festen Träger abgespalten. Das Peptid wird gewonnen, an dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des zweiten flankierenden Rests entblockiert (falls erforderlich) und dann in niedrigen Konzentrationen in einem Reaktionsgemisch zyklisiert, um intramolekulare Amidbindungsbildung zu maximieren. Typischerweise kann unter Bedingungen, unter denen die Konzentration des Peptids eine intramolekulare Konzentration an freien Carboxy- und Aminogruppen bereitstellt, die höher ist als die intermolekulare Konzentration an freien Carboxy- und Aminogruppen im Reaktionsgemisch, der höchste Grad an intramolekularer Amidbindungsbildung erreicht werden. In einer Ausführungsform wird eine Peptidkonzentration von 1 nM bis 1 M, vorzugsweise 1 μM bis 1 mM, noch bevorzugter 1 μM bis 100 μM, eingesetzt, um die Zyklisierung zu maximieren. Die Zyklisierung von freiem Peptid kann mithilfe jeder beliebigen Aminosäure-Kupplungsreaktionen durchgeführt werden, die zur Helikalisierung eines an einen festen Träger gebundenen Peptids wie oben beschrieben eingesetzt wird.
d. Syntheseschemata
In einer Ausführungsform wird jede der eingeschränkten Helixverbindungen der Formeln (1), (1a), (1b), (1c), (1d), (1e), (1f) und (1g) hergestellt, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die jeweilige in der obigen Tabelle 1 angeführte Kombination aus flankierenden Resten und Diaminlinker verwendet wird, welche die Werte für n, m und p bereitstellt, welche die Verbindung von Interesse charakterisieren, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iii) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird. Beispielsweise können alle Verbindungen der Formeln (1), (1a), (1b), (1c), (1d), (1e), (1f) und (1g), die durch m = 0, p = 0 und n = 7, 8 oder 9 charakterisiert sind, hergestellt werden, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Diaminlinker verwendet werden, die in Tabelle 1 unter Nr. 1 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iii) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird. In einem weiteren Beispiel können alle Verbindungen der Formeln (1), (1 a), (1b), (1c), (1d), (1e), (1f) und (1g), die durch m = 0, p = 6 und n = 2 oder 3 charakterisiert sind, hergestellt werden, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Diaminlinker verwendet werden, die in Tabelle 1 unter Nr. 7 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iii) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird. In einem weiteren Beispiel können alle Verbindungen der Formeln (1), (1 a), (1b), (1c), (1 d), (1e), (1f) und (1g), die durch m = 3, p = 3 und n = 2 oder 3 charakterisiert sind, hergestellt werden, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Diaminlinker verwendet werden, die in Tabelle 1 unter Nr. 16 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iii) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird jede der eingeschränkten Helixverbindungen der Formeln (2), (2a), (2b), (2c), (2d), (2e), (2f), (2g), (3), (3a), (3b), (3c), (3d), (3e), (3f) und (3g) hergestellt, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Diaminlinker verwendet werden, die in Tabelle 1 unter Nr. 9 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iii) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird jede der eingeschränkten Helixverbindungen der Formeln (4), (4a), (4b), (4c), (4d), (4e), (4f) und (4g) hergestellt, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Diaminlinker verwendet werden, die in Tabelle 1 unter Nr. 13 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iii) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird jede der eingeschränkten Helixverbindungen der Formeln (5), (5a), (5b), (5c), (5d), (5e), (5f) und (5g) hergestellt, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Diaminlinker verwendet werden, die in Tabelle 1 unter Nr. 8 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iii) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird jede der eingeschränkten Helixverbindungen der Formeln (6), (6a), (6b), (6c), (6d), (6e), (6f), (Tg), (11), (11a), (11b), (11c), (11d), (11e), (11f) und (11g) hergestellt, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die jeweilige in der obigen Tabelle 3 angeführte Kombination aus flankierenden Resten und Aminocarbonsäurelinker verwendet wird, welche die Werte für q, r und s bereitstellt, welche die Verbindung von Interesse charakterisieren, oder die Werte für t, u und v, welche die Verbindung von Interesse charakterisieren, je nach Fall, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (v) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird. Beispielsweise können alle Verbindungen der Formeln (6), (6a), (6b), (6c), (6d), (6e), (6f), (6g), (11), (11a), (11b), (11c), (11d), (11e), (11f) und (11g), die durch q = 1, s = 0 und r = 6, 7 oder 8 charakterisiert sind oder durch t = 0, v = 1 und u = 6, 7 oder 8 charakterisiert sind, je nach Fall, hergestellt werden, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Aminocarbonsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 3 unter Nr. 1 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (v) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einem weiteren Beispiel können alle Verbindungen der Formeln (6), (6a), (6b), (6c), (6d), (6e), (6f), (6g), (11), (11a), (11b), (11c), (11d), (11e), (11f) und (11g), die durch q = 1, s = 6 und r = 1 oder 2 charakterisiert sind oder durch t = 6, v = 1 und u = 1 oder 2 charakterisiert sind, je nach Fall, hergestellt werden, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Aminocarbonsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 3 unter Nr. 28 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (v) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einem weiteren Beispiel können alle Verbindungen der Formeln (6), (6a), (6b), (6c), (6d), (6e), (6f), (6g), (11), (11a), (11b), (11c), (11d), (11e), (11f) und (11g), die durch q = 7, s = 0 und r = 1 oder 2 charakterisiert sind oder durch t = 0, v = 1 und u = 1 oder 2 charakterisiert sind, je nach Fall, hergestellt werden, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Aminocarbonsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 3 unter Nr. 7 angeführf sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (v) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einem weiteren Beispiel können alle Verbindungen der Formeln (6), (6a), (6b), (6c), (6d), (6e), (6f), (6g), (11), (11a), (11b), (11c), (11d), (11e), (11f) und (11g), die durch q = 3, s = 4 und r = 1 oder 2 charakterisiert sind oder durch t = 4, v = 3 und u = 1 oder 2 charakterisiert sind, je nach Fall, hergestellt werden, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Aminocarbonsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 3 unter Nr. 25 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (v) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird jede der eingeschränkten Helixverbindungen der Formeln (7), (7a), (7b), (7c), (7d), (7e), (7f), (7g), (13), (13a), (13b), (13c), (13d), (13e), (13f) und (13g) hergestellt, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Aminocarbonsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 3 unter Nr. 14 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (v) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird jede der eingeschränkten Helixverbindungen der Formeln (8), (8a), (8b), (8c), (8d), (8e), (8f), (8g), (12), (12a), (12b), (12c), (12d), (12e), (12f) und (12g) hergestellt, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Aminocarbonsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 3 unter Nr. 9 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (v) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird jede der eingeschränkten Helixverbindungen der Formeln (9), (9a), (9b), (9c), (9d), (9e), (9f), (9g), (15), (15a), (15b), (15c), (15d), (15e), (15f) und (15g) hergestellt, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Aminocarbonsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 3 unter Nr. 15 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (v) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird jede der eingeschränkten Hefixverbindungen der Formeln (10), (10a), (10b), (10c), (10d), (10e), (10f), (10g), (14), (14a), (14b), (14c), (14d), (14e), (14f) und (14g) hergestellt, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Aminocarbonsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 3 unter Nr. 8 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (v) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einer Ausführungsform wird jede der eingeschränkten Helixverbindungen der Formeln (16), (16a), (16b), (16c), (16d), (16e), (16f) und (16g) hergestellt, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die jeweilige in der obigen Tabelle 2 angeführte Kombination aus flankierenden Resten und Dicarbonsäurelinker verwendet wird, welche die Werfe für w, x und y bereitstellt, welche die Verbindung von Interesse charakterisieren, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iv) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird. Beispielsweise können alle Verbindungen der Formeln (16), (16a), (16b), (16c), (16d), (16e), (16f) und (16g), die durch w = 1, y = 1 und x = 5, 6 oder 7 charakterisiert sind, hergestellt werden, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Dicar bunsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 2 unter Nr. 1 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iv) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird. In einem weiteren Beispiel können alle Verbindungen der Formeln (16), (16a), (16b), (16c), (16d), (16e), (16f) und (16g), die durch w = 1, y = 7 und x = 0 oder 1charakterisiert sind oder durch w = 7, y = 1 und x = 0 oder 1 charakterisiert sind, hergestellt werden, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Dicarbonsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 2 unter Nr. 7 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iv) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird. In einem weiteren Beispiel können alle Verbindungen der Formeln (16), (16a), (16b), (16c), (16d), (16e), (16f) und (16g), die durch w = 4, y = 4 und x = 0 oder 1charakterisiert sind, hergestellt werden, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Dicarbonsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 2 unter Nr. 16 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iv) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird jede der eingeschränkten Helixverbindungen der Formeln (17), (17a), (17b), (17c), (17d), (17e), (17f), (17g), (18), (18a), (18b), (18c), (18d), (18e), (18f) und (18g) hergestellt, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Dicarbonsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 2 unter Nr. 2 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iv) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird jede der eingeschränkten Helixverbindungen der Formeln (19), (19a), (19b), (19c), (19d), (19e), (19f) und (19g) hergestellt, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Dicarbonsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 2 unter Nr. 1 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iv) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird jede der eingeschränkten Helixverbindungen der Formeln (20), (20a), (20b), (20c), (20d), (20e), (20f) und (20g) hergestellt, indem (in der Peptidsynthese, wie sie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben ist) die flankierenden Reste und ein beliebiger Dicarbonsäurelinker verwendet werden, die in Tabelle 2 unter Nr. 8 angeführt sind, und das resultierende Peptid gemäß den im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(b)(ii) oder (iv) beschriebenen Verfahren zyklisiert wird.
(2) Synthese eines linearen Peptids mit an einen difunktionellen Linker gebundener flankierender Aminosäure
Das Peptid ist so aufgebaut, dass die Sequenz, die helikalisiert werden soll, eine sechs Aminosäuren lange Aminosäuresequenz umfasst, die sich zwischen flankierenden Resten erstreckt, wie in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschrieben. Das Peptid kann durch Modifikation der in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschriebenen Festphasen-Syntheseverfahren konstruiert werden, worin einer der flankierenden Reste vor der Hinzufügung zur Peptidkette an einen difunktionellen Linker gebunden wird. Dies erlaubt es dem Linker, als Teil einer Standardaminosäure in das Peptid inkorporiert zu werden.
Der flankierende Rest kann mithilfe jedes beliebigen geeigneten Mittels an den difunktionellen Linker gebunden werden. Typischerweise wird der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des flankierenden Rests verwendet, um eine Amidbindung mit einer der funktionellen Gruppen auf dem Linker zu bilden. In einer Ausführungsform, die zum Einsatz gemeinsam mit Fmoc-Chemie bestimmt ist, wird der Linker-derivatisierte flankierende Rest erzeugt, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Fmoc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem t-Butylester-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Carboxygruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Carboxygruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der t-Butylester-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Aminosäureresis wird dann durch Azidolyse entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer weiteren Ausführungsform zur Verwendung gemeinsam mit Fmoc-Chemie wird der Linker-derivatisierte flankierende Rest erzeugt, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Fmoc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem Allyl-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Carboxygruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Carboxygruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der Allyl-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Aminosäurerests wird dann durch Reduktion entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer Ausführungsform, die zum Einsatz gemeinsam mit Boc-Chemie bestimmt ist, wird der Linker-derivatisierte flankierende Rest erzeugt, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Boc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem Fm-Ester-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Carboxygruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Carboxygruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der Fm-Ester-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Aminosäurerests wird dann durch basische Verseifung entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer weiteren Ausführungsform zur Verwendung gemeinsam mit Boc-Chemie wird der Linker-derivatisierte flankierende Rest erzeugt, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Boc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem Allyl-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Carboxygruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Carboxygruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der Allyl-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Aminosäurerests wird dann durch Reduktion entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer Ausführungsform, die zum Einsatz gemeinsam mit Fmoc-Chemie bestimmt ist, wird der Linker-derivatisierte flankierende Rest erzeugt, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Fmoc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem t-Butylester-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Aminogruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Aminogruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der t-Butylester-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Aminosäurerests wird dann durch Azidolyse entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer weiteren Ausführungsform zur Verwendung gemeinsam mit Fmoc-Chemie wird der Linker-derivatisierte flankierende Rest erzeugt, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Fmoc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem Allyl-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Amino säure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Aminogruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Aminogruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der Allyl-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Aminosäurerests wird dann durch Reduktion entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer Ausführungsform, die zum Einsatz gemeinsam mit Boc-Chemie bestimmt ist, wird der Linker-derivatisierte flankierende Rest erzeugt, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Boc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem Fm-Ester-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Aminogruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Aminogruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der Fm-Ester-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Aminosäurerests wird dann durch basische Verseifung entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer weiteren Ausführungsform zur Verwendung gemeinsam mit Boc-Chemie wird der Linker-derivatisierte flankierende Rest erzeugt, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Boc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem Allyl-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Aminogruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Aminogruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der Allyl-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Amino säurerests wird dann durch Reduktion entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
Es ist wünschenswert, eine der funktionellen Gruppen auf dem difunktionellen Linker zu schützen, entweder bevor der Linker an den flankierenden Rest gebunden wird, der dazu ausgewählt wurde, den Linker zu tragen, oder nach der Anbindung, aber vor Hinzufügung des linkergebundenen flankierenden Rests zur Peptidkette. Dies verbessert die Ausbeute durch Vermeidung unerwünschter Reaktionen der freien funktionellen Gruppe auf dem an einen flankierenden Rest gebundenen Linker während der Peptidsynthese. Die freie funktionelle Gruppe auf dem Linker kann mit einer der in Abschnitt (B)(II)(1)(a) oben beschriebenen Amino- oder Carboxy-Schutzgruppen blockiert werden. In einer Ausführungsform sind die freie funktionelle Gruppe auf dem Linker und die α-Aminogruppen orthogonal geschützt, sodass die α-Aminogruppen bei der Peptidsynthese entschützt werden können, ohne dass die freie funktionelle Gruppe auf dem Linker entschützt wird. Es versteht sich, dass jedes der oben genannten Verfahren zur Bindung von difunktionellen Linkern an flankierende Reste leicht modifiziert werden kann, um einen bestimmten flankierenden Rest mit einem ausgewählten orthogonal einfach geschützten difunktionellen Linker zu derivatisieren.
In einer Ausführungsform, die zur Verwendung mit Fmoc-Chemie bestimmt ist, wird ein mit einem orthogonal einfach geschützten difunktionellen Linker derivatisierter flankierender Rest geschaffen, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Fmoc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem t-Butylester-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Carboxygruppe und mit entweder einer Allyl-geschützten Carboxygruppe oder einer Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Carboxygruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensati onsverfahren eingesetzt wird. Der t-Butylester-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Aminosäurerests wird dann durch Azidolyse entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer weiteren Ausführungsform zur Verwendung gemeinsam mit Fmoc-Chemie wird ein mit einem orthogonal einfach geschützten difunktionellen Linker derivatisierter flankierender Rest geschaffen, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Fmoc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem Allyl-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Carboxygruppe und mit entweder einer Boc-geschützten Aminogruppe oder einer t-Butylester-geschützten Carboxygruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Carboxygruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der Allyl-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Aminosäurerests wird dann durch Reduktion entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer Ausführungsform, die zum Einsatz gemeinsam mit Boc-Chemie bestimmt ist, wird ein mit einem orthogonal einfach geschützten difunktionellen Linker derivatisierter flankierender Rest geschaffen, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Boc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem Fm-Ester-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Carboxygruppe und mit entweder einer Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe oder einer Allyl-geschützten Carboxygruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Carboxygruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der Fm-Ester-geschützte α-Carboxysubstituent des derivati sierten Aminosäurerests wird dann durch basische Verseifung entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer weiteren Ausführungsform, die zum Einsatz gemeinsam mit Boc-Chemie bestimmt ist, wird ein mit einem orthogonal einfach geschützten difunktionellen Linker derivatisierter flankierender Rest geschalten, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Boc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem Allyl-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Carboxygruppe und mit entweder einer Fmoc-geschützten Aminogruppe oder einer Fm-Ester-geschützten Carboxygruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Carboxygruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Aminosubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der Allyl-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Aminosäurerests wird dann durch Reduktion entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer Ausführungsform, die zur Verwendung mit Fmoc-Chemie bestimmt ist, wird ein mit einem orthogonal einfach geschützten difunktionellen Linker derivatisierter flankierender Rest geschaffen, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Fmoc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem t-Butylester-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Aminogruppe und mit entweder einer Allyloxycarbonyl-geschützten Aminogruppe oder einer Allyl-geschützten Carboxygruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Aminogruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der t-Butylester-geschützte α-Carboxysubstituent des de rivatisierten Aminosäurerests wird dann durch Azidolyse entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer weiteren Ausführungsform zur Verwendung gemeinsam mit Fmoc-Chemie wird ein mit einem orthogonal einfach geschützten difunktionellen Linker derivatisierter flankierender Rest geschaffen, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Fmoc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem Allyl-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Aminogruppe und mit entweder einer Boc-geschützten Aminogruppe oder einer t-Butylester-geschützten Carboxygruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Aminogruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der Allyl-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Aminosäurerests wird dann durch Reduktion entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer Ausführungsform, die zum Einsatz gemeinsam mit Boc-Chemie bestimmt ist, wird ein mit einem orthogonal einfach geschützten difunktionellen Linker derivatisierter flankierender Rest geschaffen, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Boc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem Fm-Ester-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Aminogruppe und mit entweder einer Allyloxycarbonylgeschützten Aminogruppe oder einer Allyl-geschützten Carboxygruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Aminogruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der Fm-Ester-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Aminosäurerests wird dann durch basische Verseifung entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einer weiteren Ausführungsform, die zum Einsatz gemeinsam mit Boc-Chemie bestimmt ist, wird ein mit einem orthogonal einfach geschützten difunktionellen Linker derivatisierter flankierender Rest geschaffen, indem ein im Handel erhältlicher Aminosäurerest mit einem Boc-geschützten α-Aminosubstituenten, einem Allyl-geschützten α-Carboxysubstituenten und einem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten bezogen wird und dann die α-Substituent-geschützte Aminosäure mit einem difunktionellen Linker mit einer freien Aminogruppe und mit entweder einer Fmoc-geschützten Aminogruppe oder einer Fm-Ester-geschützten Carboxygruppe umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen der freien Aminogruppe des Linkers und dem ungeschützten Seitenketten-Carboxysubstituenten der Aminosäure zu bilden, wobei eines der im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahren eingesetzt wird. Der Allyl-geschützte α-Carboxysubstituent des derivatisierten Aminosäurerests wird dann durch Reduktion entfernt, um einen Einbau der derivatisierten Aminosäure in die Peptidkette zu ermöglichen.
In einem weiteren Aspekt können die oben genannten Ausführungsformen, bei denen ein mit einem difunktionellen Linker derivatisierter flankierender Rest eingesetzt wird, modifiziert werden, indem der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des nichtderivatisierten (nicht schon vorher an einen difunktionellen Linker gebundenen) flankierenden Rests in Bezug auf die α-Amino-Schutzchemie, die bei der Peptidsynthese eingesetzt wird, und in Bezug auf einen oder alle der eine Amidbindung bildenden Substituenten, die in den Seitenketten anderer Aminosäurereste im Peptid vorkommen, orthogonal geschützt wird. In diesem Aspekt kann der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des nichtderivatisierten flankierenden Rests selektiv entblockiert werden, was ein Peptid ergibt, das durch eine Kondensationsreaktion zyklisiert werden kann, die spezifisch und gezielt zwischen dem entschützten, eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des nichtderivatisierten flankierenden Rests und der freien funktionellen Gruppe des di funktionellen Linkers erfolgt. Geeignete Verfahren für einen orthogonalen Schutz von eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten sind oben in Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschrieben.
Nach vollständiger Festphasen-Peptidsynthese kann das Peptid durch eine Kupplungsreaktion zwischen der freien funktionellen Gruppe des difunktionellen Linkers und dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des nichtderivatisierten flankierenden Rests wie in Abschnitt (B)(II)(1)(b) oben beschrieben zyklisiert werden. Jegliche Blockiergruppen, die den eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des nichtderivatisierten flankierenden Rests und/oder die freie funktionelle Gruppe des difunktionellen Linkers schützen, werden entfernt, und die entschützten Gruppen werden unter Einsatz eines im obigen Abschnitt (B)(II)(1)(a) beschriebenen Kondensationsverfahrens unter Ausbildung einer Amidbindung verbunden. Gegebenenfalls wird das resultierende zyklisierte (eingeschränkt-helikale) Peptid vom festen Träger abgespalten, gewonnen und gereinigt.
Alternativ dazu kann das Peptid vor dem Zyklisierungsschritt vom festen Träger abgespalten werden. In einer Ausführungsform wird das Peptid nach der Synthese der linearen Peptidkette vom festen Träger abgespalten. Das Peptid wird gewonnen, am eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des nichtderivatisierten flankierenden Rests und/oder der freien funktionellen Gruppe des difunktionellen Linkers entblockiert und dann in niedrigen Konzentrationen in einem Reaktionsgemisch zyklisiert, um die intramolekulare Amidbindungsbildung zu maximieren. Typischerweise kann unter Bedingungen, unter denen die Konzentration des Peptids eine intramolekulare Konzentration an freien, eine Amidbindung bildenden Substituenten oder Gruppen bereitstellt, die höher ist als die intermolekulare Konzentration an freien, eine Amidbindung bildenden Substituenten oder Gruppen im Reaktionsgemisch, der höchste Grad an intramolekularer Amidbindungsbildung erreicht werden. In einer Ausführungsform wird eine Peptidkonzentration von 1 nM bis 1 M, vorzugsweise 1 μM bis 1 mM, noch bevorzugter 1 μM bis 100 μM, eingesetzt, um die Zyklisierung zu maximieren. Die Zyklisierung eines freien Peptids kann mithilfe jeder beliebigen Kon densationsreaktion durchgeführt werden, die zur Helikalisierung eines Festphasenpeptids wie oben beschrieben eingesetzt wird.
III. Verfahren zur Konstruktion von halbsynthetischen arretierten Helixproteinen
Außerdem werden hierin halbsynthetische Proteine bereitgestellt, die arretierte Helixpeptide umfassen, die an eine oder mehrere größere, rekombinant synthetisierte Proteinmoleküle gebunden oder darin eingebaut sind. Die halbsynthetischen arretierten Helixpeptide der Erfindung können durch ein beliebiges herkömmliches Verfahren hergestellt werden, einschließlich einer Ligation der arretierten Helixpeptide, die wie im obigen Abschnitt (B)(II) beschrieben synthetisiert wurden, an eine oder mehrere rekombinant synthetisierte Proteinsequenzen. Proteinligasen, wie z.B. die „Subtiligasen", können beispielsweise zur Verknüpfung der arretierten Helixpeptide, die wie hierin beschrieben hergestellt wurden, zu größeren, rekombinant synthetisierten Proteinfragmenten eingesetzt werden.
In einer Ausführungsform werden die Verfahren der Erfindung modifiziert, um ein arretiertes Helixpeptid herzustellen, das als „erstes Ligationssubstrat" in den Subtiligase-katalysierten Peptidligationsverfahren dient, die in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US91/05480 (WO 92/02615, veröffentlicht am 20. Februar 1992) beschrieben sind, oder als „Donorester", „Donorpeptid" bzw. „P_n...P₄-P₃-P₂-P₁-glc-F-Amidester" in den Subtiligase-katalysierten Peptidligationsverfahren, die von Abrahmsen et al., Biochem. 30, 4151–4159 (1991), Jackson et al., Science 266, 243–247 (1994) und Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12544–12548 (1994) beschrieben werden. Das arretierte Helixpeptid kann so synthetisiert werden, dass der C-terminale Aminosäurerest des zyklisierten Peptids in einer Esterbindung mit der 2-Hydroxylgruppe einer 2-Hydroxycarbonsäure, wie z.B. Glykolsäure oder Milchsäure, vorliegt, um eine Abgangsgruppe zu bilden, die von der jeweiligen Subtiligase von Interesse bevorzugt wird, d.h. sodass der 2-Hydroxycarbonsäureester, der in 2B der WO 92/02615 als X-Rest des „ersten Ligationssubstrats" dargestellt ist, dem ersten Rest ähnelt, der sich im normalen Peptidsubstrat von Subtilisin auf der N- terminalen Seite der hydrolysierbaren Amidbindung befindet, dargestellt als Rest P₁' des „Hydrolysesubstrats" in 2B.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Abgangsgruppe einen 2-Hydroxycarbonsäure- und einen anderen Aminosäurerest, der in 2B von WO 92/02615 als R₂''-Rest des ersten Ligationssubstrats dargestellt ist, worin die Carboxygruppe des 2-Hydroxycarbonsäurerests in einer Amidbindung mit der α-Aminogruppe des weiteren Aminosäurerests vorliegt. In solchen Ausführungsformen. kann der Aminosäurerest in der Abgangsgruppe so gewählt werden, dass er dem zweiten Rest ähnelt, der sich auf der N-terminalen Seite der hydrolysierbaren Amidbindung im normalen Peptidsubstrat von Subtilisin befindet, dargestellt als P₂' des „Hydrolysesubstrats" in 2 der WO 92/02615. in einer bevorzugten Ausführungsform ist die Abgangsgruppe eine Glykolat-Phenylalanyl-(glc-F-) Gruppierung, wie z.B. die in Beispiel 2 der WO 920/02615 beschriebene Glykolat-Phenylalanyl-Amid-(glc-F-NN₂-) Gruppierung.
In einem Aspekt wird die glc-F-Abgangsgruppe an ihre richtige Position im C-Terminus des arretierten Helixpeptids gebracht, indem ein Boc- oder Fmoc-α-Amino-geschütztes Phenylalanin erhalten wird, das α-Amino-geschützte Phenylalanin mit einer α-Carboxyester- oder Amidbindung an Festphasenharz gebunden wird, die geschützte α-Aminogruppe entschützt wird, ein Glykolsäurerest in Form eines t-Butylethers hinzugefügt wird, um eine Amidbindung zwischen der Carboxygruppe der Glykolsäure und der freien α-Aminogruppe des Festphasenphenylalanins zu bilden, die t-Butylethergruppe mit Säure aus dem Glykolsäurerest entfernt wird und eine Esterbindung zwischen dem freien Hydroxyl des Glykolsäurerests und dem α-Carboxyl des nächsten Aminosäurerests in der C-terminalen Sequenz gebildet wird, die für das arretierte Helixpeptid gewünscht wird. Nachfolgende Aminosäuren können hinzugefügt werden, und das resultierende Peptid kann gemäß einem der oben beschriebenen Verfahren helikalisiert werden, wobei herkömmliche Boc- oder Fmoc-Chemie für die Peptidsynthese eingesetzt werden. In einer Ausführungsform wird eine glc-F-NH₂-Abgangsgrupe im Wesentlichen wie in Beispiel 2 der WO 92/02615 beschrieben oder wie von Jackson et al., Science 266, 243–247 (1994), beschrieben in die gewünschte Peptidkette eingebaut.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das „Donorpeptid" eine flexible Linkersequenz zwischen dem C-terminalen Rest der Sequenz des arretierten Helixpeptids und der Abgangsgruppensequenz, wie z.B. einen Di- oder Triglycinlinker, um die Flexibilität und Zugänglichkeit der Abgangsgruppe des Donorpeptids für Subtiligase zu fördern.
Nachdem das Donorpeptid (mit der Helix-Arretierfesssel an seiner Position) erhalten wurde, kann eine Subtiligase verwendet werden, um ein Peptid- oder Proteinfragment (hergestellt durch Rekombinations- oder andere Syntheseverfahren), das in 2C der WO 92/02615 als „zweites Ligationssubstrat", in 2 auf Seite 244 von Jackson et al., Science 266, 243–247 (1994) als „Akzeptorpeptid" und im Syntheseschema auf Seite 12545 von Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12544–12548 (1994) als „Nucleophil" bezeichnet wird, an den C-Terminus des Donorpeptids zu ligieren, indem die Abgangsgruppe gemäß einem der oberen Subtiligasekatalysierten Peptidligationsverfahren verdrängt wird. In Ausführungsformen, in denen Akzeptorpeptide oder -proteine aufgrund der Proteinstruktur höherer Ordnung einen relativ gut zugänglichen N-Terminus aufweisen, kann die Ligationseffizienz verbessert werden, indem der Aufbau des Akzeptorpeptids verändert wird, um eine flexible Linkersequenz, wie z.B. eine Di- oder Triglycinsequenz, am N-Terminus einzubauen, um die Flexibilität und Zugänglichkeit des Akzeptorpeptid-N-Terminus in der Peptidligationsreaktion zu fördern. Alternativ dazu kann die Zugänglichkeit des Akzeptorpeptid-N-Terminus und/oder des Donorpeptid-C-Terminus für Subtiligase verbessert werden, indem die Ligationsreaktion unter Denaturierungsbedingungen durchgeführt wird, was unerwünschte Strukturkonformationen, die von den Peptidsubstraten eingenommen werden könnten, eliminiert. In solchen Ausführungsformen wird vorzugsweise eine denaturierungsstabile Subtiligase eingesetzt, wie z.B. die von Chang et al., s.o., beschriebene „Stabiligase" (die in 4 M Guanidin-hydrochlorid nahezu 50 % der katalytischen Aktivität beibehalten kann).
Es versteht sich, dass weitere Peptide mit einer geeigneten Abgangsgruppe am C-Terminus synthetisiert und anschließend an den N-Terminus des halbsynthetischen Peptids ligiert werden können, das die arretierte Helixgruppierung enthält, indem die obigen Verfahren wiederholt werden, bis ein komplettes Peptid mit dem gewünschten N-Terminus erhalten wird.
Für den Fall, dass das fertige, halbsynthetische arretierte Helixprotein als Folge der eingesetzten Syntheseverfahren in denaturierter, fehlgefalteter oder ansonsten inaktiver Form erhalten wird, kann die inaktive Spezies durch Renaturierungsverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, zur nativen oder aktiven Konformation rückgefaltet werden. Typische Renaturierungsverfahren nutzen ein Chaotrop, wie z.B. Harnstoff bei einem hohen pH oder Guanidin-hydrochlorid, um inaktives Material aufzufalten, gefolgt von einer Verdünnung des Denaturierungsmittels, damit eine Rückfaltung stattfinden kann, während die Bildung von zufälligen Disulfidbindungen vor der Einnahme der biologisch aktiven Konformation durch nichtkovalente intramolekulare Wechselwirkungen verhindert wird (siehe US-Patente Nr. 4.512.922; 4.518.256; 4.511.502; und 4.511.503). Inverse Mizellen oder Ionenaustauschchromatograpie werden verwendet, um die Rückfaltung von denaturierten Proteinen zu unterstützen, indem ein einzelnes Proteinmolekül in Mizellen eingeschlossen wird oder Proteine auf einem Harz isoliert werden und dann das Denaturierungsmittel entfernt wird (Hagen et al., Biotechnol. Bioeng. 35, 966–975 (1990); Creighton in Protein Structure Folding and Design, S. 249–251, D.L. Oxender, Hrsg., Alan R. Liss, Inc., New York (1985)). Außerdem kann eine kanformationsspezifische Rückfaltung mit Liganden und Antikörpern gegen die native Struktur des Proteins durchgeführt werden (Cleland und Wang in Biotechnelogy, S. 528–555, H.-J. Rehm und G. Reed, Hrsg., VCH, New York). Da die Wahrscheinlichkeit höher ist, mit dem Protein in seiner nativen Konformation wechselzuwirken, können diese Bindungsmoleküle verwendet werden, um die Faltungsreaktionen in Richtung eines Proteins in nativem Zustand zu lenken. Die oben genannten Gewinnungsverfahren werden, mit kleineren Modifikationen, als für die Gewinnung von biologisch aktiven rekombinanten Proteinen aus Einschlusskörpern universell einsetzbar angesehen und sind ge nauso für die Gewinnung von biologisch aktiven Proteinen aus den halbsynthetischen Verfahren der Erfindung einsetzbar.
IV. Verfahren zur Konstruktion von an Makromoleküle gebundenen arretierten Helixpeptiden
In einer Ausführungsform können die eingeschränkten helikalen Peptide der Erfindung, die an einen makromolekularen festen Träger gebunden sind, erhalten werden, indem die arretierten Helixpeptide nach den im obigen Abschnitt (II) beschriebenen Festphasensyntheseverfahren konstruiert werden und das intakte Konjugat aus festem Träger und Peptid gewonnen wird. Alternativ dazu kann das zyklisierte Peptid nach der Synthese von der Festphase abgespalten und dann durch ein auf dem Gebiet der Erfindung bekanntes, geeignetes Verfahren an das Makromolekül der Wahl gebunden werden. Ein häufig zur Anbindung von Peptidliganden an Polysaccharid-Matrices, z.B. Agarose, Dextran oder Cellulose, eingesetztes Verfahren umfasst die Aktivierung des Trägers mit Halogencyan und die darauf folgende Bindung der primären aliphatischen oder aromatischen Amine des Peptids an die aktivierte Matrix. Die Inaktivierung von Polysacchariden mit Bromcyan (CNBr) bei alkalischem pH wurde von Axen et al., Nature 214, 1302 (1967) in die Affinitätschromatographie eingeführt. In einem Aspekt der Erfindung wird die Aktivierung von Polysaccharidmatrices, insbesondere Agarosematrices, nach dem Titrationsaktivierungsverfahren durchgeführt. Bei diesem Verfahren werden 20 g ausgiebig gewaschener, feuchter Agarosekuchen zu 20 ml Wasser in einem 100 ml fassenden Becherglas zugesetzt, das mit einem Thermometer für 0–100°C, einem pH-Meter und einem 25 mm langen Magnetrührstäbchen ausgestattet ist. Die Suspension wird langsam gerührt, die Temperatur wird durch Zusatz von zerstoßenem Eis auf etwa 10–15°C gesenkt, und der pH wird durch Zusatz von 1–2 Tropfen 4 N NaOH auf 10,8 ± 0,1 eingestellt. Der Aktivierungsvorgang wird durch Zusatz des CNBr initiiert, und der pH der Reaktion wird durch manuelle Titration mit der 4 N NaOH auf 10,8 ± 0,1 gehalten. Das CNBr (100 g/mg Feuchtgewicht Gel) kann als kristalliner Feststoff, zerstoßener Feststoff, wässrige Lösung oder durch Zusatz einer Aliquote einer Stammlösung zu gesetzt werden. Letztere kann hergestellt werden, indem CNBr in Acetonitril (1 g/ml) gelöst und bei –20°C in einer dicht verschlossenen Phiole gelagert wird. Die Temperatur wird dann auf 18–20°C ansteigen gelassen.
Trotz der relativen Einfachheit des Titrationsverfahrens ist gegebenenfalls zu bevorzugen, das schnellere und technisch vereinfachte Verfahren gemäß March et al., Anal. Biochem. 60, 149 (1974) einzusetzen. Der Aktivierungsvorgang wird in konzentriertem Carbonatpuffer durchgeführt. Die erforderliche Menge an gewaschenem Gel wird im gleichen Volumen von 2 M NaHCO₃-NaCO₃-Puffer (pH 10,9) in einem Becherglas suspendiert, das mit einem Thermometer und einem Magnetrührstäbchen ausgestattet ist. Die Aufschlämmung wird auf etwa 4–5°C abgekühlt, und das aktivierte Gel wird in eine Sinternutsche gefüllt und gewaschen.
Die für die oben beschriebenen Verfahren empfohlene CNBr-Konzentration reicht für mäßige Peptidsubstitutionsgrade aus. Wenn niedrigere oder höhere Aktivierungsgrade erforderlich sind, können für die Titration 50 mg und 200–300 mg CNBr/g Feuchtgewicht Gel zusammen mit 2 M und 8 M NaOH eingesetzt werden.
Es ist allgemein anerkannt, dass die CNBR-aktivierten intermediären funktionellen Gruppen von Polysaccharidgelen begrenzte Stabilität aufweisen, und deshalb sollte das Gel vorzugsweise so rasch wie möglich gewaschen werden, bevor es auf das Kupplungsreaktionsmedium übertragen wird. Am Ende des Aktivierungsschritts wird das Gel rasch durch Zusatz von zerstoßenem Eis gekühlt und in eine große Glassinternutsche gegossen, der vorher mit zerstoßenem Eis gekühlt worden war. Die Suspension wird rasch in einen Büchner-Kolben (2 Liter) filtriert, der festes Eisen(III)sulfat enthält, um nichtumgesetztes CNBr und Cyanide, wie z.B. harmloses Ferrocyanid, zu entfernen. Das Gel wird anschließend durch Abnutschen mit 1 Liter eiskaltem destilliertem Wasser und 1 Liter des Puffers, der in der Kupplungsstufe verwendet wird, typischerweise mit eiskaltem 0,1 M NaHCO₃-NaCO₃-Puffer (pH 8,5–9,5), gewaschen.
CNBr-aktivierte Sepharose 4B ist im Handel von Pharmacia erhältlich, womit der gefährliche Umgang mit CNBr umgangen wird. Das aktivierte Gel wird in Gegenwart von Dextran und Lactose gefriergetrocknet, um die Kügelchenform beizubehalten und in 15 g fassenden luftdichten Verpackungen bereitgestellt. Die erforderliche Menge an gefriergetrocknetem Pulver wird in 1 mM HCl auf einem Glasfilter gequollen und mit zumindest 200 ml der gleichen Lösung pro Gramm Pulver gewaschen. 1 g gefriergetrocknetes Material entspricht etwa 3,5 ml an endgültigem Gelvolumen. Die Peptidligand-Bindungskapazität des Gels wird wirksamer aufrechterhalten, wenn mit Lösungen mit niedrigem pH und nicht mit Lösungen mit einem pH über 7 gewaschen wird. Das Gel ist bereit, einen Peptidliganden zu binden, sobald der Waschvorgang abgeschlossen ist.
Pharmacia vertreibt auch CNBr-aktivierte Sepharose 6 MB zur Verwendung in der Zellbiologie und Immunologie zur Trennung von „funktionell homogenen Zellpopulationen". Sie wird durch Aktivierung von Sepharose-6MB-Makrokügelchen (Durchmesser 200–300 μm) mit Bromcyan hergestellt und auf gleiche Weise gehandhabt wie CNBr-aktivierte Sepharose 4B.
Das anzubindenden Peptid wird in einem dem Volumen des gepackten Gels entsprechenden Volumen des kalten Puffers gelöst, zum feuchten, gewaschenen Gel zugesetzt, und dann wird die Suspension sofort (in einer Nutsche) mit einem Glasrührstab gerührt. Der gesamte Vorgang des Waschens, Zusetzens der Peptidlösung und Vermischens dauert vorzugsweise weniger als 90 Sekunden. Die Suspension wird aus der Nutsche in ein Becherglas übergeführt, das ein Magnetrührstäbchen enthält, und vorsichtig bei 4°C gerührt. Obwohl die Reaktion im Wesentlichen nach 2 bis 3 Stunden abgeschlossen ist, wird das Gemisch 16 bis 20 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen, um das vollständige Verschwinden von reaktiven Polysaccharidgruppen sicherzustellen. Das Gel mit angebundenen Peptiden wird dann mit großen Portionen Wasser gewaschen, bis sichergestellt ist, dass kein Peptid mehr entfernt wird.
Die Peptidmenge, die an das Polysaccharidgel gebunden wird, kann zum Teil- über die zur aktivierten Matrix zugesetzte Peptidmenge gesteuert werden. Wenn hochsubstituierte Polysaccharidgel-Derivate gewünscht werden, sollte die zugesetzte Peptidmenge 20- bis 30-mal größer sein als jene, die im Endprodukt gewünscht wird. Bei herkömmlichen Verfahren werden 100 bis 150 mg Bromcyan pro ml gepacktes Polysaccharidgel verwendet, aber viel höhere Ankupplungsausbeuten können erzielt werden, wenn diese Menge auf 250 bis 300 mg erhöht wird. Der pH, bei dem die Kupplungsreaktion durchgeführt wird, beeinflusst auch den Ankupplungsgrad, da nur die nichtprotonierte Form der Aminogruppen eines Peptids mit CNBr-aktivierten Polysacchariden reagiert. Vorzugsweise wird die N-terminale α-Aminogruppe des Peptidliganden zur Kupplung mit der aktivierten Polysaccharidmatrix verwendet. α-Aminogruppen binden sich bei einem pH von etwa 0,5 bis 10,0 optimal. Wenn die Kupplung an der/den ε-Aminogruppe(n) des ausgewählten Peptidliganden (wie z.B. die ε-Aminogruppen der Lysinylreste) gewünscht wird, sollte die Kupplungsreaktion bei einem pH-Wert von etwa 10,0 durchgeführt werden, und ein großer Peptidüberschuss sollte zugesetzt werden. Wenn eine Kupplung an den aromatischen Aminogruppen in den Histidyl- oder Tryptophanylresten des ausgewählten Peptids gewünscht wird, kann bei pH-Werten zwischen 8 und 9 eine sehr hohe Kupplungseffizienz erreicht werden.
Weitere Details der Erfindung finden sich in den nachstehenden Beispielen, die den Schutzumfang der Erfindung genauer definieren.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Experimenteller Teil
Berechnungsverfahren
Alle Berechnungen wurden mit dem DISCOVER-Programm (Biosym Technologies, San Diego, USA) unter Verwendung des AMBER-Kraftfelds aller Atome (S.J. Weiner; P.A. Kollman; D.A. Case; U.C. Singh; C. Ghio; G. Alagona; S. Profeta, Jr.; P. W. einer J. Am. Chem. Soc. 106, 765–784 (1984); S.J. Weiner; P.A. Kollman; D.T. Nguyen; D.A. Case, J. Comp. Chem. 7, 230–252 (1986)) mit einer entfernungsabhängigen Dielektrizitätskonstante (ε = 4r).
Synthese
Materialien und Verfahren
Peptide wurden unter Einsatz von herkömmlichen Festphasen-Syntheseverfahren hergestellt (R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149–2154 (1963); E. Kaiser; R.L. Colescot; C.D. Bossinger; P.I. Cook, Anal. Biochem. 34, 595–598 (1970)). Organische Chemikalien wurden von Aldrich (Milwaukee, Wis., USA) oder Fluka (Ronkonkoma, N.Y., USA) bezogen. Geschützte Aminosäuren wurden bei Bachem CC (Torrance, Calif., USA) oder Peninsula Labs (Belmont, Calif., USA) erstanden. BOP (Benzotriazol-1-yloxytris[dimethylamino]phosphoniumhexafluorophosphat) wurde von Richelieu Biotechnologies (Montreal, Kanada) bezogen. Lösungsmittel stammten von Baxter (McGaw Park, Illin., USA), Baker (Phillipsburg, N.J., USA) oder Mallinckrodt (Paris, Ky., USA). Polystyrolträger wurden von Advanced ChemTech (Louisville, Ky., USA) erworben.
Mono-t-butyloxycarbonyl-(BOC-) 1,3-Propandiamin wurde wie folgt hergestellt, 2-(tert-Butoxycarbonyloxyimino)-2-phenylaceionitril (18 g, 73 mmol) wurde über einen Zeitraum von 10 Minuten portionsweise zu einer Lösung von 1,3-Diaminopropan (12,5 g, 184 mmol) in 100 ml Tetrahydrofuran zugesetzt, die auf 0°C gekühlt war. Nach vier Stunden bei 0°C wurde die Reaktion zwei Stunden lang auf 25°C erwärmen gelassen. Dann wurden die Reaktion mit 150 ml Ethylacetat verdünnt und zweimal mit 100 ml gesättigtem wässrigem Natriumchlorid gewaschen. Die organische Phase wurde mit dreimal 100 ml 10 % wässriger Citronensäure extrahiert, und die vereinigten wässrigen Phasen wurden zweimal mit 100 ml Ethylacetat gewaschen. Die wässrige Phase wurde in einem Eisbad gekühlt, und der pH wurde mit 50%igem Natriumhydroxid auf etwa 13 eingestellt. Die basische wässrige Phase wurde dann mit dreimal 100-ml-Volumina Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde mit Kaliumcarbonat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, um Mono-tert-butyloxycarbonyl-1,3-diaminopropane zu erhalten.
Peptide wurden mittels RP-HPLC auf einer Vydac-C-18-säule gereinigt und mit Acetonitril/Wasser-Gradienten, die 0,1 Vol.-% Trifluoressigsäure (TFA) enthielten, eluiert. Dann wurden die Peptide durch Elektrospray-MS auf einem Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer PE SCIEX API III+ und durch quantitative Aminosäureanalyse auf einem automatischen Aminosäureanalysator Beckmann 6300 charakterisiert. Organische Zwischenprodukte wurden durch ¹H- und ¹³C-Magnetresonanz (NMR) auf einem Varian VXR-300S und durch hochauflösende Massenspektrometrie (MS) auf einem Tandem-Massenspektrometer JEOL JMS-HX110HF/HX110HF analysiert.
AcTNE(OFm)DLAARRE(OAllyl)QQnh-MBHA-Polystyrol (1a):
Das lineare Peptid 1 a mit der gezeigten Sequenz wurde durch herkömmliche Kupplungszyklen unter Verwendung von drei Moläquivalenten BOC-Aminosäure, 3,3 Moläquivalenten BOP und 3,3 Moläquivalenten N-Methylmorpholin in Dichlormethan (CH₂Cl₂) und Dimethylacetamid (DMA), falls für die Löslichkeit erforderlich, eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf p-MBHA-Harz (4,25 Gramm (g), 0,57 Milliäquivalente/Gramm (mÄqu./g), 2,42 Millimol (mmol)) synthetisiert. Die N-Acetyl-Kappe wurde durch 20-minütige Behandlung mit 5 Millilitern (ml) Essigsäureanhydrid in 3%igem Triethylamin (TEA) in CH₂Cl₂ bei Raumtemperatur angebunden. Das Harz wurde getrocknet und gewogen (4,41 g, schätzungsweise 0,22 mÄqu./g).
AcTNE(OFm)DLAARRE(OFm)QQnh-MBHA-Polystyrol (1f):
AcAEE(OFm)AAAKFLE(OAllyl)Allyl)-AHAnh-MBHA-Polystyrol (2a):
Die angegebenen linearen Peptide 1f und 2a wurden wie oben für 1a beschrieben synthetisiert.
AcTNQ(γ-NHCH₃)DLAARRQ(γ-NHCH₃)QQnh₂ (1b):
Das lineare harzgebundene Peptid 1f (0,60 g, 0,17 mmol) wurde mit 20%igem Piperidin in DMA 20 Minuten lang doppelt entschützt. Die freien Carbonsäuren wurden 1,5 Stunden lang mit BOP (1,57 g, 3,55 mmol) und N-Methylmorpholin (0,90 ml, 8,2 mmol) in CH₂Cl₂/DMA an Methylamin (CH₃NH₃Cl, 0,26 g, 3,85 mmol) gebunden. Das Harz wurde gewaschen und getrocknet, und die Peptid-Harz-Bindung wurde mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure (HF) (10 ml) bei 0°C eine Stunde lang mit Anisol (1 ml) und Ethylmethylsulfid (EtSMe) (0,5 ml) als Fänger gespalten. Das Harz wurde zweimal mit Ether, einmal mit Ethylacetat und dann erneut mit Ether gewaschen. Das freie Peptid wurde dann durch aufeinander folgende Waschvorgänge mit 10%iger Essigsäure, Eisessig, Acetonitril, 10%iger Essigsäure und Wasser aus dem Harz extrahiert. Die vereinigten Lösungen wurden gefriergetrocknet, und der Rückstand wurde gereinigt.
_–CH₂CH₂CH_2–
Cyclo-AcTNQ(γ-NH)DLAARRQ(γ-NH)QQnh₂ (1c):
1. Unter Verwendung von ungeschütztem Propandiamin:
Das lineare Peptid 1a auf dem Harz (0,51 g, 0,11 mmol) wurde am Fluorenylmethylester mit 20%igem Piperidin in DMA 20 Minuten lang entschützt, und das resultierende Piperidinsalz wurde durch zweimaliges Waschen mit 1%iger TFA in CH₂Cl₂ neutralisiert. Die freie Carbonsäure wurde eine Stunde lang mit BOP (0,40 g, 0,90 mmol) und Diisopropylethylamin (DIPEA) (0,17 ml, 0,98 mmol) in CH₂Cl₂ an 1,3-Propandiamin (0,12 ml, 1,44 mmol) gebunden, gefolgt vom Zusatz von DMA und dem Fortsetzen des Kuppelns für weitere 45 Minuten. Der Glutaminsäureallylester wurde mit Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (Pd(PPh₃)₄) (0,21 g, 0,18 mmol) in 20%igem Piperidin in DMA 1,5 Stunden lang entschützt, und das Piperidin wurde durch zweimaliges Waschen mit 1%iger TFA in CH₂Cl₂ entfernt. Die resultierende Aminosäure wurde mit BOP (0,32 g, 0,72 mmol) und DIPEA (0,13 ml, 0,75 mmol) in CH₂Cl₂ 3,5 Stunden lang zyklisiert. Ein Kaiser-Test ergab eine erkennbare purpurne Färbung, sodass die Zyklisierung mit BOP (0,44 g, 0,99 mmol) und DIPEA (0,19 ml, 1,09 mmol) in CH₂Cl₂ weitere drei Tage lang wiederholt wurde. Das Peptid wurde vom Harz abgespalten, wie oben beschrieben für 1b beschrieben wurde.
2. Unter Verwendung von Mono-BOC-Propandiamin:
Das lineare Peptid 1a auf dem Harz (0,57 g, 0,13 mmol) wurde am Fluorenylmethylester mit 20%igem Piperidin in DMA 0,5 Stunden lang entschützt, und das re sultierende Piperidinsalz wurde durch zweimaliges Waschen mit 1%iger TFA in CH₂Cl₂ neutralisiert. Die freie Carbonsäure wurde eine Stunde lang mit BOP (0,52 g, 1,18 mmol) und DIPEA (0,25 ml, 1,44 mmol) in CH₂Cl₂/DMA an Mono-tert-butyloxycarbonyl-1,3-propandiamin (0,23 ml, 1,32 mmol) gebunden. Der Glutaminsäureallylester wurde mit (Pd(PPh₃)₄) (0,21 g, 0,18 mmol) in 20%igem Piperidin in DMA 1,5 Stunden lang entschützt, und das Piperidin wurde durch zweimaliges Waschen mit 1%iger TFA in CH₂Cl₂ entfernt; der Kaiser-Test war an diesem Punkt negativ. Die BOC-Gruppe wurde mit TFA/CH₂Cl₂/Anisol/1,2-Ethandithiol (45:45:5:5 Vol./Vol.) entfernt; das freie Amin ergab dann einen positiven Kaiser-Test. Die resultierende Aminosäure wurde mit BOP (0,58 g, 1,31 mmol) und DIPEA (0,30 ml, 1,72 mmol) in CH₂Cl₂ zwei Stunden lang zyklisiert, wonach der Kaiser-Test nur eine schwache blau-grüne Färbung ergab. Das Peptid wurde vom Harz abgespalten, wie oben beschrieben für 1b beschrieben wurde.
AcAEQ(γ-NHCH₃)AAAKFLQ(γ-NHCH₃)AHAnh₂ (2b):
Das lineare Peptid 2a auf dem Harz (0,60 g, 0,19 mmol) wurde am Allyl- und am Fluorenylmethylester mit Pd(PPh₃)₄ (0,1 g, 0,09 mmol) in 20%igem Piperidin in DMA 30 Minuten lang entschützt, und das resultierende Piperidinsalz wurde durch Waschen mit 50%iger TFA in CH₂Cl₂ mit Anisol und 1,2-Ethandithiol neutralisiert. Die freie Carbonsäure wurden mit BOP (0,32 g, 0,72 mmol) und DIPEA (0,35 mL, 2,01 mmol) in CH₂Cl₂/DMA 1 Stunde lang an Methylamin (40 % wässrig, 0,16 ml, 1,86 mmol) gebunden. Das Peptid wurde vom Harz abgespalten, wie oben beschrieben für 1b beschrieben wurde.
1d, 1e, 2c, 2d, 2e:
1d und 1e wurden aus 1a hergestellt, und 2c–2e wurden aus 2a hergestellt, und zwar nach denselben Verfahren wie oben für 1c beschrieben, wobei ungeschütztes 1,3-Propandiamin, Kupplung mit 1,4-Butandiamin für 1d und 2d und mit 1,5-Pentandiamin für 1e und 2e eingesetzt wurden.
AcTNk(S-Acm)DLAARRK(S-Acm)QQnh₂ (3a):
AcAEk(S-Acm)AAAKFLK(S-Acm)AHAnh₂ (4a):
Die linearen Peptide 3a und 4a wurde durch herkömmliche Merrifield-Verfahren unter Einsatz von FMOC-Chemie synthetisiert (E. Atherton; R.C. Sheppard, J. Chem. Soc., Chem. Commum, 165–166(1985)). Fmoc-D-Thiolys(Acm)-OH (7,k(S-Acm)) und Fmoc-L-Thiolys(Acm)-OH (10,k(S-Acm)) wurden wie nachstehend beschrieben hergestellt.
AcTNk(S)DLAARRK(S)QQnh₂ (3b):
AcAEk(S)AAAKFLK(S)AIAnh₂ (4b):
Die zyklischen Peptide 3b und 4b wurden durch gleichzeitige Entschützung und Oxidation aus 3a bzw. 4a hergestellt. Etwa 16 mg Acm-geschütztes Peptid wurden in 1,5 ml Wasser gelöst, das 10%ige Essigsäure enthielt, und dann mit Trifluorethanol auf 50 ml Gesamtvolumen verdünnt, um eine Endkonzentration von etwa 200 Mikromol/Liter (μM) zu erhalten. Insgesamt 12 ml einer 6-Millimol/Liter-(mM) Lösung von Iod (80 Milligramm (mg), gelöst in 3 ml Essigsäure und mit Trifluorethanol auf 50 ml verdünnt) wurden in 1-ml-Portionen über einen Zeitraum von 10 Stunden zugesetzt, während der Fortschritt der Reaktion durch HPLC überwacht wurde. Als das Ausgangsmaterial verbraucht war, wurde die Reaktion mit Wasser verdünnt und gefriergetrocknet, und das rohe oxidierte Material wurde gereinigt.
(2S,5R)-2,5-Dihydro-3,6-diethoxy-2-isopropyl-5-(4-brombutyl)pyrazin (5):
n-Butyllithium (13,3 ml einer 1,6 M Lösung in Hexan, 21,3 mmol) wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten zu einer Lösung von (2S)-2,5-Dihydro-3,6-diethoxy-2-isopropylpyrazin (Schollkopf-Reagens) (4,30 g, 20,3 mmol) in Tetrahydrofuran (THF) zugesetzt. Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei –78°C gehalten, wonach 1,4-Dibrombutan (9,75 ml, 81,2 mmol) auf einmal zugesetzt wurde. Nach 2,5 Stunden bei –78°C wurde die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und mit Diethylether (100 ml) verdünnt. Die organische Phase wurde mit Wasser (100 ml) und Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen und dann über Magnesiumsulfat (MgSO₄) getrocknet. Nach Filtration und Einengung wurde der Großteil des 1,4-Dibrombutans im Hochvakuum entfernt. Das zurückbleibende Öl wurde durch Kieselgelchromatographie (2 % Ethylacetat in Hexan) gereinigt, um 5 (3,7 g, 57 %) als farblose Flüssigkeit bereitzustellen; [α]²⁵ _D – 1,13° (c = 4,5, CHCl₃); IR (Dünnfilm) 2957, 1689, 1456, 1364, 1304, 1230, 1144, 1038 cm^–1; ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4,04–4,18 (m, 4H) 3,94–4,02 (m, 1H) 3,90 (t, J = 3,9, 1H) 3,39 (t, J = 6,9, 2H) 2,21–2,32 (m, 1H) 1,68–1,92 (m, 4H) 1,33–1,47 (m, 2H) 1,274 (t, J = 7,2, 3H) 1,268 (t, J = 7,2, 3H) 1,03 (d, J = 6,9, 3H) 0,70 (d, J = 6,9, 3H); ¹³C-NMR (100,6 MHz, CDCl₃) δ 163,12, 163,05, 60,72, 60,48, 55,09, 33,60, 33,11, 32,66, 31,80, 23,22, 19,03, 16,6, 14,34, 14,31; Massenspektrum (FAB+) 347,1 (MH+).
(2S,5R)-2,5-Dihydro-3,6-diethoxy-2-isopropyl-5-(4-(4-methoxybenzyl)thiobutyl)pyrazin (6):
Kalium-tert-butoxid (11,8 ml einer 1 M Lösung in THF) wurde über einen Zeitraum von fünf Minuten bei 25°C zu einer Lösung von 4-Methoxy-α-toluolthiol (1,85 ml 90%ige Lösung, 11,8 mmol) in THF (20 ml) zugesetzt, was einen schweren, weißen Niederschlag ergab, der 25 Minuten lang gerührt wurde. Eine Lösung von 5 (3,7 g, 10,7 mmol) in THF (20 ml) wurde zugesetzt und das Rühren weitere drei Stunden fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Rotationsverdampfung eingeengt und anschließend zwischen Wasser (50 ml) und Diethylether (100 ml) verteilt, Die organische Phase wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Kieselgelchromatographie (1 %, steigend auf 2,5 % Ethylacetat in Hexan) gereinigt, um 6 (2,90 g, 91 %) als farbloses Öl bereitzustellen; [α]²⁵ _D – 3,77° (c = 3,5, CHCl₃); IR (Dünnfilm) 2957, 1689, 1510, 1238, 1038 cm^–1; ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7,21 (d, J = 8,7, 2H) 6,84 (d, J = 8,4, 2H) 4,02–4,20 (m, 4H) 3,93–3,99 (m, 1H) 3,88 (t, J = 3,3, 1H) 3,80 (s, 3H) 3,65 (s, 2H) 2,39 (t, J = 7,5, 2H) 2,20–2,32 (m, 1H) 1,64–1,82 (m, 2H) 1,50–1,62 (m, 2H) 1,22–1,38 (m, 2H) 1,27 (t, J = 7,2, 6H) 1,03 (d, J = 6,9, 3H) 0,70 (d, J = 6,9, 3H); ¹³C-NMR (100,6 MHz CDCl₃) δ 163,20, 163,00, 158,50, 130,57, 129,80, 113,80, 60,67, 60,45, 60,40, 55,24, 55,20, 35,57, 33,68, 31,74, 31,14, 29,19, 23,92, 19,05, 16,60, 14,36, 14,32; Massenspektrum (FAB+) 421,2 (MH+).
(2R)-2-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)amino-6-acetamidomethylthiohexansäure (D-thio(Acm)lysin) (7):
Wasser (30 ml) und 3 N HCl (6,5 ml) wurden zu einer Lösung von 6 (2,90 g, 9,32 mmol) in THF (50 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde 12 Stunden lang bei 25°C gerührt, und dann wurde das THF durch Rotationsverdampfung entfernt. Die Lösung wurde mit wässrigem Kaliumcarbonat (K₂CO₃) auf einen pH von 10 eingestellt und dann zweimal mit Ethylacetat (75 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und eingeengt, und der Rückstand wurde durch Kieselgelchromatographie (1:1, steigend auf 2:1 Ethylacetat/Hexan mit 0,5 % Triethylamin) gereinigt, um rohen S-Methoxybenzylthiolysinethylester (2,65 g, 91 %) als farbloses Öl zu erhalten, das direkt in der nächsten Stufe eingesetzt wurde. Dieser Ester (3,02 g, 9,71 mmol) wurde bei 0°C in einem Gemisch aus Trifluoressigsäure (50 ml) und Anisol (1 ml) gelöst, und Quecksilberacetat (3,09 g, 9,71 mmol) wurde zugesetzt, um eine klare Lösung zu erhalten. Nach 15 Minuten wurde die Trifluoressigsäure durch Rotationsverdampfung entfernt, und der Rückstand wurde zuerst mit Wasser (75 ml) verdünnt und dann mit Diethylether (75 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde 30 Minuten lang mit Schwefelwasserstoff (H₂S) (der durch die Lösung hindurchperlen gelassen wurde) behandelt, und der resultierende schwarze Niederschlag wurde durch ein Celite-Bett abfiltriert. Das Filtrat wurde durch Ratationsverdampfung eingeengt, erneut in Wasser (20 ml) gelöst und durch ein 0,45-Mikrometer-(μm-)Nylonfilter filtriert. Dann wurde die Lösung erneut eingeengt, und der resultierende Schaum wurde über Nacht im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurden anschließend in THF (20 ml) gelöst und auf 0°C abgekühlt. Eine Lösung von Lithiumhydroxid (1,22 g, 29,1 mmol) in Wasser (20 ml) wurde in zwei Portionen in einem Abstand von 15 Minuten zugesetzt. Nach zwei Stunden wurde die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, und der pH wurde mit 1 mol/Liter (M) wässriger Citronensäure auf 7,0 eingestellt. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, der Rückstand wurde in Dioxan (80 ml) gelöst, und Fmoc-H-Hydroxysuccinimid (3,3 g, 9,71 mmol) wurde zugesetzt, gefolgt von gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat (NaHCO₃) (15 ml). Nach einer Stunde wurde das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt, und der Rückstand wurde zwischen Wasser (50 ml) und Ethylacetat (50 ml) verteilt. Die wässrige Phase wurde mit 1 M wässriger Citronensäure auf einen pH von 2,5 eingestellt und dann dreimal mit Ethylacetat (jeweils 75 ml) gewaschen Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (MgSO₄) und eingeengt. Der Rückstand wurde durch Kieselgelchromatographie (zuerst mit 2:1 Ethylacetat/Hexan mit 0,5 % Essigsäure, dann mit Ethylacetat mit 0,5 % Essigsäure, dann mit 5 % Methanol in Ethylacetat mit 0,5 % Essigsäure) gereinigt, und produkthältige Fraktionen wurden aus Toluol (150 ml, dreimal) eingeengt, bevor sie in Wasser mit Acetonitril gelöst und gefriergetrocknet wurden, um 7 (3,16 g, 71 % über vier Stufen) als weißes Pulver bereitzustellen; [α]²⁵ _D – 1,8° (c = 2, EtOH); IR (Dünnfilm) 2800–3400, 1709, 1536, 1260, 759, 740 cm^–1; ¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,42 (t, J = 6,0, 1H) 7,88 (d, J = 7,3, 2H) 7,72 (d, J = 7,5, 2H) 7,58 (d, J = 8,1, 1H) 7,407 (t, J = 7,5, 2H) 7,32 (t, J = 7,5, 2H) 4,16–4,30 (m, 5H) 3,91 (m, 1H) 2,53 (t, J = 7,2, 2H) 1,82 (s, 3H) 1,33–1,76 (m, 6H); ¹³C-NMR (100,6 MHz, DMSO-d6) δ 174,00, 169,16, 156,08, 143,86, 143,80, 140,71, 127,61, 127,05, 125,28, 120,08, 65,57, 53,90, 46,68, 30,54, 30,01, 28,79, 24,91, 22,54; hochauflösendes Massenspektrum (FAB+) 457,1785^–, Err[ppm/mmu] – 2,7/–1,2.
(2R,5S)-2,5-Dihydro-3,6-dimethoxy-2-isopropyl-5-(4-bromobutan)pyrazin (8):

[α]²⁵ _D + 1,73° (c = 4,4, CNCl₃); IR (Dünnfilm) 2959, 1696, 1458, 1434, 1237, 1196, 1007 cm^–1; ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 3,98–4,47 (m, 1H) 3,95 (t, J = 3,6, 1H) 3,70 (s, 3H) 3,68 (s, 3H) 3,40 (t, J = 6,9, 2H) 2,19–2,32 (m, 1H) 1,66–1,94 (m, 4H) 1,34–1,48 (m, 2H) 1,05 (d, J = 6,9, 3H) 0,69 (d, J = 6,9, 3H); ¹³C-NMR (100,6 MHz, CDCl₃) δ 163,62, 163,60, 60,77, 55,11, 52,31, 33,54, 33,10, 32,61, 31,73, 23,26, 19,02, 16,56; Massenspektrum (FAB+) 319,1 (MH+).

(2R,5S)-2,5-Dihydro-3,6-dimethoxy-2-isopropyl-5-(4-(4-methoxybenzyl)thiobutyl)pyrazin (9):

[α]²⁵ _D + 3,96° (c = 3,63, CHCl₃); IR (Dünnfilm) 2944, 1696, 1510, 1238 cm^–1; ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7,21 (d, J = 8,7, 2H) 6,83 (d, J = 8,4, 2H) 3,97–4,25 (m, 1H) 3,93 (t, J = 3,3, 1H) 3,79 (s, 3H) 3,68 (s, 3H) 3,67 (s, 3H) 3,65 (s, 2H) 2,39 (t, J = 7,5, 2H) 2,18–2,30 (m, 1H) 1,60–1,84 (m, 2H) 1,49–1,62 (m, 2H) 1,23–1,38 (m, 2H) 1,27 (t, J = 7,2, 6H) 1,04 (d, J = 6,9, 33H) 0,68 (d, J = 6,9, 3H); ¹³C-NMR (100,6 MHz, CDCl₃) δ 163,72, 163,47, 158,48, 130,55, 129,78, 113,78, 60,68, 55,22, 55,18, 52,27, 35,58, 33,63, 31,64, 3,12, 29,13, 23,88, 19,02, 16,51; Massenspektrum (FAB+) 393,2 (MH+).

(2S)-2-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)amino-6-acetamidomethylthiohexansäure: (L-Thio(Acm)lysin) (10):

[α]²⁵ _D + 1,3° (c = 2, EtOH); IR (Dünnfilm) 2800–3400, 1709, 1536, 1260, 759, 740 cm^–1; ¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6 8,42 (t, J = 6,0, 1H) 7,88 (d, J = 7,3, 2H) 7,72 (d, J = 7,5, 2H) 7,58 (d, J = 8,1, 1H) 7,407 (t, J = 7,5, 2H) 7,32 (t, J = 7,5, 2H) 4,16–4,30 (m, 5H) 3,91 (m, 1H) 2,53 (t, J = 7,2, 2H) 1,82 (s, 3H) 1,33–1,76 (m, 6H); ¹³C-NMR (100,6 MHz, DMSO-d6) δ 174,00, 169,16, 156,08, 143,86, 143,80, 140,71, 127,61; 127,05, 125,28, 120,08, 65,57, 53,90, 46,68, 30,54, 30,01, 28,79, 24,91, 22,54; hochauflösendes Massenspektrum (FAB+) 457,1776, Err[ppm/mmu] –4,6/–2,1.

Diese Materialien wurden auf die gleiche Weise wie 5, 6 und 7, ausgehend von (2R)-2,5-Dihydro-3,6-dimethoxy-2-isopropylpyrazin (Merck) hergestellt.
NMR-Spektroskopie
Für jedes Peptid wurden 2–4 mg gereinigtes Material in 440 Mikroliter (μl) 25 mM d₃-Natriumacetat, das 5 % Deuteriumoxid (D₂O) und 0,1 Millimol/Liter (mM) Natriumazid enthielt, zugesetzt, was eine Gesamtpeptidkonzentration von 1–6 mM ergab; der pH wurde durch Zusatz von 1 M Natriumhydroxid (NaOH) auf 4,5 eingestellt. Alle Spektren wurden bei 5°C oder 10°C auf einem Bruker-AMX-500-Spektrometer aufgenommen. Zweidimensionale COSY- (W.P. Aue, E. Bartholdi und R.R. Ernst, J. Chem. Phys. 64, 2229–2246 (1976)), ROESY- (A.A. Bothner-By, R.L. Stephens, J.-M. Lee, C.D. Warnen und R.W. Jeanloz, J. Am. Chem. Soc. 106, 811–813 (1984); M.J. Rance, Magn. Reson. 74, 557–564 (1987)) und TOCSY- (L. Braunschweiler und R.R. Ernst, J. Magn. Reson. 53, 521–528 (1983); A. Bax und D.G. Davis, J. Magn. Reson. 65, 355–360 (1985)) Spektren wurden mit einer Phasendiskriminierung ω₁ aufgenommen, die mit TPPI erreicht wurde (D. Marion und K. Wuthrich, Biochem. Biophys. Res. Commun. 113, 967–974 (1983)). Die Gesamtaufnahmedauer betrug etwa 2, 4 und 12 Stunden für COSY-, TOCSY- bzw. ROESY-Spektren. Wasserunterdrückung wurde durch kohärente leistungsschwache Bestrahlung der Wasserresonanz für die 1,5 Sekunden Relaxationszeit erreicht. ROESY- und TOCSY-Spektren wurden wie von M. Akke, N.J. Skelton, J. Kordel und W.J. Chazin in Techniques in Protein Chemistry II, S. 401–408, J.J. Villafranca, Hrsg. Academic Press, Inc.: Boca Raton, Fla., USA (1991) beschrieben erhalten; außerdem wurden Phasenkorrekturen erster Ordnung durch eine Aufnahme auf sinusmodulierte Weise in ω₁ vermieden. TOCSY-Vermischung wurde mit einer sauberen DIPSI-2rc-Sequenz erreicht, die 90 Millisekunden (ms) lang angelegt wurde (J. Cavanagh und M.J. Rance, Magn. Reson 96, 670–678 (1992)). Die ROESY-Spektren wurden mit einem Spinlock-Impuls von 4,0 Kilohertz (kHz) für eine Dauer von 200 ms erhalten. Die Spektren wurde weiterbearbeitet und mithilfe des Felix-Software-Pakets (Biosym Technologies, San Diego, Calif., USA) analysiert. 3J_HN-Hα wurden durch Anpassen eines Antiphasenpaars von Lorentz-Linien in ω₂-Abschnitte von COSY-Spektren mit hoher digitaler Auflösung erhalten.
Die Amidprotonen-Austauschgeschwindigkeiten mit einem Lösungsmittel wurden für 1b und 1c gemessen, indem das Peptid aus H₂O gefriergetrocknet wurde und eine Reihe von eindimensionalen (1D-) NMR-Spektren aufgenommen wurde, gleich nachdem das Peptid in D₂O gelöst worden war. Die Austauschgeschwindigkeitskonstanten wurden bestimmt, indem eine Exponentialanpassung auf Basis dreier Parameter an die Signale des zerfallenden Amids vorgenommen wurde. Schutzfaktoren wurden als Austauschgeschwindigkeitsverhältnis im vernetzten und nichtvernetzten Peptid berechnet.
Strukturberechnung
NOESY- (A. Kumar, R.R. Ernst und K. Wuthrich, Biochem. Biophys. Res. Commun. 95, 1–6 (1980); G. Bodenhausen, H. Kogler und R.R. Ernst, J. Magn. Reson. 58, 370–388 (1984)) und ROESY-Daten wurden bei Mischdauern von 300 ms bzw. 200 ms aus Wasser (H₂O) und D₂O unter Verwendung einer Probe von 1c (etwa 8 mM) gewonnen. Die gesamte Aufnahmedauer betrug 24 Stunden pro Experiment. Aus diesen Daten wurden Distanzeinschränkungen erzeugt, indem Kreuzpeaks anhand des integrierten Peak-Volumens als stark, schwach oder sehr schwach kategorisiert wurden und eine obere Schwelte von 2,9, 3,5, 4,6 bzw. 5,6 Ångström (Å) zu den entsprechenden Interprotonabständen zugeordnet wurde. Der Diederwinkel Φ war für Reste, für die ³J_HN-Hα weniger als 6,0 Hertz (Hz) betrug, zwischen –90° und –40° eingeschränkt. Die Werte für ³J_HN-Hα wurden anhand eines COSY-Spektrums bestimmt, das in einer D₂O-Lösung mit einem 35°-Mischimpuls erhalten worden war. χ₁-Einschränkungen und stereospezifische H_β-Zuordnungen wurden auf Basis dieser Kopplungskonstanten und der Ergebnisse der anfänglichen Strukturberechnungen für vier Seitenketten erhalten (N.J. Skelton, K.C. Garcia, D.V. Goeddel, C. Quan und J.P. Burnier, Biochemistry 33, 13581–13592 (1994)).
Strukturen wurden mithilfe des Programms DGII unter Einsatz der CVFF-Kraftfeldparameter berechnet (Biosym Technologies, San Diego, Calif., USA). Eingabeeinschränkungen bestanden aus 141-Interprotonen-Abständen, 9 Φ Diedenwinkeleinschränkungen und 5 χ₁ Diederwinkeleinschränkungen. Explizite Wasserstoffbrückenbindungen wurden nicht inkludiert. Die Strukturen wurden mit einer Dreiecks- und Vierecksglättung vor der perspektivischen Einbettung aller Atome erzeugt. Die eingebetteten Strukturen wurden 10.000 Schritte lang im vierdimensionalen Raum ausgeheilt, während sie mit allen Atommassen auf 1000 eingestellt von 200 Kelvin (K) ausgehend abgekühlt wurden. Die DG-Strukturen wurden durch rMD unter Verwendung des AMBER-Kraftfelds im DISCOVER-Programm (Biosym Technologies) verfeinert. Die Strukturen wurden 3 Picosekunden (ps) lang bei 600 K ausgeheilt, 1,8 ps lang auf 0 K abgekühlt und schließlich 200 rEM-Durchgängen unterzogen. Die Ladungen auf Glu-, Asp-, Arg-, den C-terminalen und N-terminalen Resten wurden auf 0,2 e reduziert, und eine distanzabhängige dielektrische pf 1/4r wurde eingesetzt. Einschränkungen wurden als Square-Well-Potentiale mit Krafteinschränkungen von 25 Kilokalorien/Mol/Angström² (kcal·mol^–1·Å^–2) und 100 Kilokalorien/Mol/Radiant² (kcal·mol^–1·rad^–2) für Distanzen bzw. Diederwinkel eingesetzt. Im letzten Berechnungsdurchgang wurden 60 Strukturen in DGII eingebettet und durch rMD verfeinert.
Zirkulardichroismus
CD-Spektren wurden auf einem Aviv-G2-Spektrometer mit einer temperaturgesteuerten Zelle mit einer Weglänge von 0,1 Zentimeter (cm) erhalten. Lösungen für Analysespektren wurden durch Verdünnung von NMR-Proben auf etwa 100 Mikromol/Liter (μM) mit zusätzlichem NMR-Puffer vorbereitet. Punkte wurden alle 0,2 Nanometer (nm) mit einer Bandbreite von 0,2 nm und einer Mittelungszeit von 2 Sekunden genommen. Die kürzeste erreichbare Wellenlänge wurde durch Absorption des Acetatpuffers eingeschränkt. Die dargestellten Kurven wurden mit Standardparametern geglättet (10-Punkt-Glättung).
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Überlegungen zum Aufbau
Ausgehend von synthetischen und geometrischen Überlegungen wurde bestimmt, dass die Amidchemie eingesetzt werden sollte, um die I- und I+7-Seitenketten zu verbinden. Disulfidbindungen sind zwar synthetisch machbar, führten jedoch eine ungewünschte 90°-Drehung in die Bindung ein. Um die Fähigkeit von einfachen Alkylkettenlinkern zu nutzen, eine sterische Zusammendrängung im Bereich nahe der I+3- und I+4-Reste zu vermeiden, wurden Bindungsverfahren zur Verbrückung von entweder Gln oder Asn bei I und I+7 mit einer Alkandiylkette in Betracht gezogen. Gln wurde ausgewählt, weil seine größere Länge die Verwendung einer minimalen Fessel zur Verbindung dieser Seitenketten erlaubt. Eine veranschaulichende Gruppe von Proteinkristallstrukturen aus der Brookhaven-Datenbank (F.C. Bernstein; T.F. Koetzle; G.J.B. Williams; E.F. Meyer; M.D. Brice; J.R. Rodgers; O. Kennard; T. Shimanouchi; M. Tasumi, J. Mol. Biol. 112, 535–542 (1977)) wurde auf jegliches Vorkommen von Glutamin in einem helikalen Kontext durchsucht (ϕ = –60° ± 30° und ψ = 45° ± 30°). Die resultierende Datengruppe wurde verwendet, um die Seitenketten-Rotamerverteilungen von natürlich vorkommenden helikalen Glutaminresten zu bestimmen. Im Allgemeinen weisen Aminosäurereste in einem α-helikalen Kontakt χ₁ = –60° auf, eine Konformation, die für die I+7-Position eines Seitenkettenlinkers geeignet ist. Glutamin weist eine relativ hohe Population (14,6 %) des Rotamers χ₁ = 180° auf, was eine signifikante natürlich Konformation darstellt, welche die Seitenkette in Richtung des C-terminalen Endes der Helix ausrichtet. Es wurden Rotamerkombinationen identifiziert, welche die Nε2-Nε2-Distanz zwischen der I- und I+7-Seitenkette in einem helikalen Peptidmodell verringern. In Abhängigkeit von den χ₃-Werten wurden Abstände im Bereich von 5,3 Ä bis 7 Ä gefunden, wenn das I-Glutamin χ₁- und χ₂-Winkel von 180° und 60° annimmt und das I+7-Glutamin χ₁- und χ₂-Werte von –60° bzw. 180° annimmt.
Der Bau eines Modells zeigte, dass eine 4-Methylen-„Brücke" diese beiden Glutamin-Seitenketten effizient verbinden kann, ohne dass ungünstige Drehwechselwirkungen auftreten. Modelle von 3-, 4- und 5-Methylen-verbrückten helikalen Peptiden wurden unter Einsatz von distanzgeometrischen Verfahren (Quantum Chemistry Program Exchange, Program Nr. 590, mit dem Titel DGEOM von Blaney et al.), gefolgt von Energieminimierung konstruiert. Alle Reste mit Ausnahme der gebundenen Glutamine waren Alanin. Die Konformationsstabilität der helikalen Peptide wurde unter Einsatz von 1 Nanosekunde (Nucleinsäure) nichteingeschränkter molekularer Dynamik bei 298 K nach einer anfänglichen Äquilibrierungsperiode von 100 Picosekunden (ps) beurteilt, während derer harmonische Einschränkungen (25 Kilokalorien/Mol/Ångström (kcal·mol^–1·Å^–1)) angewendet wurden, um die Helizität aufrechtzuerhalten. Als Kontrolle wurde eine Polyalaninhelix 1 ns lang in Gegenwart von identischen Einschränkungen berechnet.
Peptide mit einer 2-Methylenbrücke behielten eine konstante helikale Konformation bei, weisen aber eine deutliche „Krümmung" der Helixachse auf. Peptide mit einer 4-Methylenbrücke behielten die Helizität mit geringer Verzerrung bei und wiesen mit dem Kontrollpeptid vergleichbare Rückgrat-Diederwinkel auf; die χ₁- und χ₂-Winkel der gefesselten Glutamine veränderten sich während der Simulation nicht. Peptide, die auf einer 5-Methylenbrücke basierten, entkamen der helikalen Konformation vorübergehend und bildeten verschachtelte Drehungen um den I+5-Rest. Mehrere Seitenketten-Rotamere wurden ebenfalls im I+7-Rest gefunden. Ausgehend von diesen Beobachtungen wurde bestimmt, dass die 4-Methylenbrücke die bevorzugte Fessellänge bereitstellen würde.
Synthese und Charakterisierung
Aminosäuresequenzen für Testpeptide basierten auf der C-terminalen Helix von Apamin (E. Habermann und K.G. Reiz, Biochem. Z 343, 192–203 (1965); G.L. Callewaert, R. Shipolini und C.A. Vernon, FEBS Lett. 1, 111–113 (1968); R. Shipolini, A.F. Bradbury, G.L. Callewaert und C.A. Vernon, Chem. Commun. 679–680 (1967)) und auf dem S-Peptid, das vom C-Peptid von RMAse A abgeleitet ist (J.E. Brown; W.A. Klee, Biochemistry 10, 470–476 (1971)). Die Sequenzen dieser Peptide sind in der nachstehenden Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1. Strukturen der Peptide 1–4
Die linear geschützten Peptide 1a, 1f und 2a wurden durch herkömmliche Merrifield-Verfahren unter Verwendung von t-Butyloxycarbonyl-(BOC-) Chemie synthetisiert. Die Kontrollpeptide 1b und 2b wurden aus 1f und 2a durch gleichzeitige Entschützung beider Glutamatreste nach einer Kupplung mit Methylamin hergestellt (1). Die Synthese von 1d aus 1f durch doppelte Entschützung und Kupplung mit 1,4- Butandiamin ergab geringe Ausbeute/Reinheit. Die eingeschränkten Peptide 1c–e und 2c–e wurden aus 1a und 2a durch Entfernung des Fluorenylmethylesters aus Glu3, Verbindung mit dem geeigneten Alkandiamin, Entfernung des Allylesters aus Glu10 und Zyklisierung erhalten (1). Die Ausbeuten wurden durch den Einsatz von einfach BOC-geschütztem Alkandiamin im ersten Kupplungsschritt und durch den Einsatz eines Polystyrolharzes mit 2 % Divinylbenzol-(DVB-) Vernetzer verbessert. Die vollständigen Peptide wurden vom Harz mit Flusssäure (HF) abgespalten und durch präparative Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) gereinigt. Der Einbau der Fessel in die feste Phase erlaubte die Vervollständigung der Synthese mit nur einer einzigen Reinigung.
Die auf Thiolysin basierenden Peptide 3a und 4a wurden unter Einsatz herkömmlicher Merrifield-Verfahren und FMOC-Chemie, gefolgt von der Abspaltung vom Harz mit Trifluoressigsäure/Triethylsilan (9:1 Vol./Vol.) und Reinigung durch präparative HPLC in der linearen, Acetamidomethyl-geschützten Form hergestellt. Diese wurden durch gleichzeitige Entschützung und Oxidation mit Essigsäure und molekularem Iod in Trifluorethanol in die Disulfidformen 3b und 4b in Lösung übergeführt.
Die Peptide 1–4 wurden durch Massenspektrometrie und durch quantitative Aminosäureanalyse charakterisiert. Alle Peptide ergaben Ergebnisse, die mit den gewünschten Strukturen übereinstimmten.
Geschütztes D- (7) und L-Thiolysin (10) wurden wie in 2 dargestellt hergestellt. Schöllkopf-Reagens (U. Schöllkopf, U. Groth, C. Deng, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 20, 798–799 (1981)) wurde mit n-Butyllithium gefolgt von 1,4-Dibrombutan behandelt, um das bekannte Brombutylpyrazin 5 zu erhalten. Das Bromid wurde mit dem Kaliumsatz von Methoxytoluolthiol ersetzt, um 6 zu erhalten. Das Pyrazin wurde mit wässriger Salzsäure (HCl) hydrolysiert, und das Thiol wurde mit Quecksilberacetat (Hg(OAc)₂) in TFA, gefolgt von H₂S entschützt. Der rohe Thiolysinethylester wurden dann erneut mit Acetamidomethanol in TFA geschützt. Der Ester wurde mit Lithiumhydroxid (LiOH) hydrolysiert, und die freie S-geschützte Aminosäure wurde mit Fmoc-N-Hydroxysuccinirnid in Dioxan N-geschützt, um 7 zu erhalten. Die gleichen Verfahren wurden für die Synthese von 10 eingesetzt.
Protonen-NMR
Die Peptide 1–4 wurden durch 2D-¹H-NMR untersucht. Resonanzpositionen wurden durch herkömmliche Sequenzzuordnungsverfahren erhalten (K. Wüthrich, NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wi1ey, N.Y. (1986)) und sind in der nachstehenden Tabelle 2 angeführt. Tabelle 2. Chemische Verschiebungen^a (Rückgrat-Kopplungskonstanten^b) der Apaminsequenzpeptide 1 und 3

^a Chemische Verschiebungen wurden bei pH 4,5 und 5°C erhalten. Verschiebungen beziehen sich auf die interne H₂O-Resonanz bei 4,96 Teilen pro Million (ppm) und sind auf ±0,01 ppm genau.
^b ³J_HN-Hα sind in Klammern in Hertz-Einheiten (Hz) angegeben.

Repräsentative TOCSY- und ROESY-Spektren eines diamideingeschränkten Peptids (1c) sind in den 10 und 3 dargestellt. Eine Zusammenfassung der H^N-H^N- und H^α-H^N-ROEs zwischen benachbarten Resten, die für diese Zuordnungen verwendet wurden, sind in 4 für 1b und 1c dargestellt. Der Grad der Helizität der einzelnen Peptide wurde anhand dieser Spektren aufgrund der Gegenwart von starken sequentiellen H^N-H^N-ROE-Kreuzpeaks, der Gegenwart von I-, I+3-H^α-H^N- oder -H^α-H_β-ROE-Kreuzpeaks und einer ³J_HN-Hα unter 6,0 Hz beurteilt. Die in 4 zusammengefassten Daten zeigen, dass das Peptid 1c zwischen den Resten Asn2 und Gln10 helikal ist. Unter Gln10 steigt ³J_HN-Hα über 6,0 Hz, aber gewisse ROEs im mittleren Bereich sind immer noch vorhanden, was auf einen teilweisen oder vorübergehenden helikalen Charakter hinweist. Solch ein Ausfransen an den Helixtermini tritt bei NMR-Untersuchungen von Peptiden und Proteinen häufig auf. Die chemischen ¹H-Verschiebungen von 1c verändern sich um weniger als 0,02 über den Konzentrati onsbereich von 8,0–0,06 mM; dies zeigte, dass die helikale Konformation nicht durch einen Eigenassoziationsvorgang stabilisiert war.
Der Einbau der Diamidvernetzung in die Peptide 1 und 2 verringerte den Mittelwert von ³J_HN-Hα in der eingeschränkten Region deutlich, steigerte die Anzahl an beobachtbaren (I,I+3)-ROES und erhöhte die durch Zirkulardichroismus bestimmbare prozentuelle Helizität, wie in der nachstehenden Tabelle 3 dargestellt ist. Somit waren die Peptide 1c–1e und 2c–2e deutlich stärker helikal als die Kontrollpeptide 1b und 2b. Die Ergebnisse für Peptid 4 zeigten, dass die Ausbildung der Disulfidbindung das Peptid helikal eingeschränkte. Ein Reihe von ROEs im mittleren Bereich konnte jedoch nicht beobachtet werden, und die ³J_HN-Hα Werfe für die beiden Thiolysin-Reste und für Leu9 in 4b lagen über 6,0 Hz; dies wies auf eine Verzerrung der helikalen Struktur im Bereich des D-Thiolysin-Rests hin, was aus einfachen Strukturüberlegungen zu erwarten war. Die Daten in der nachstehenden Tabelle 3 zeigen, dass der Einbau der Disulfidbindung in das Peptid 3b keinen helikalen Charakter verlieh, was vermuten lässt, dass das Thiolysinverfahren von der Primärsequenz abhängt und folglich nicht allgemein einsetzbar ist.
Tabelle 3. Evaluierung der Peptidhelizität
Werte unter 6 für die mittlere 3-Bindungs-NH-Na-Kopplungskonstante weisen auf Helizität hin. I-I+3-ROEs im mittleren Bereich sind als beobachteter Anteil der Gesamtanzahl an solchen ROEs, die möglich ist, angegeben, wobei jedes schwache ROE halb gezählt wurde. Die durch CD bestimmte prozentuelle Helizität wurde wie von Lyu et al., J.C. Shermanm, A. Chen, N.R. Kallenbach, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5317–5320 (1991) und W.C. Johnson, I. Tinoco Jr., J. Am. Chem. Soc., 94, 4389–4390 (1972) beschrieben erhalten.
Das Peptid 1c wurde für eine detailliertere Analyse durch NMR ausgewählt. ROESY-Spektren mit höherer Empfindlichkeit (erhöhte Gesamtaufzeichnungsdauer und Peptidkonzentration) und NOESY-Spektren wurden erhalten und analysiert, um Eingabeeinschränkungen für Strukturberechnungen bereitzustellen. Neben den oben beschriebenen ROEs wurden H^α-N^N-(I,I+4)-Wechselwirkungen beobachtet, was darauf hinweist, dass die angenommenen helikale Konformation nicht vom 3₁₀-Typ sondern eine reguläre α-helikale Varietät ist (K. Wüthrich, NMR of Proteins and Nucleic Acids., Wiley, New York, UASA (1986)). Interprotonen-Abstandseinschränkungen wurden aus den ROESY- und NOESY-Daten abgeleitet und als Basis für die Berechnung einer Struktur für 1c unter Verwendung von Distanzgeometrie (DG) und eingeschränkter molekularer Dynamik (rMD) verwendet. Nahezu die Hälfte (66) der 141 Einschränkungen lag zwischen zwei bis vier Reste voneinander entfernten Aminosäuren in der Primärsequenz, was für eine helikale Konformation zu erwarten war. Diederwinkeleinschränkungen, die auf den erhaltenen ³J_HN-Hα und ³J_HN-Hβ basierten, wurden ebenfalls in diesen Berechnungen verwendet, aber explizite Wasserstoffbrückenbindungseinschränkungen wurden nicht eingesetzt.
Die letztendendliche Zusammensetzung von 20 Strukturen ist in 5 dargestellt. Die Strukturen stimmten gut mit den Eingabedaten überein, ohne Verletzung der Distanzeinschränkung über 0,1 Ångström (Å), ohne Verletzung des Diederwinkels über 1,0° und mit einem mittleren Einschränkungsverletzung-Energieterm von 0,10 ± 0,09 Kilokalorien/Mol (kcal·mol^–1). Die verfügbaren NMR-Daten definierten die Rückgratatome der Reste Thr1 bis Gln10 gut (quadratisches Mittel der Abweichung von der mittleren Struktur: 0,38 ± 0,08 Å), aber die beiden C-terminalen Glutaminreste sind nicht gut definiert. Die Seitenketten von Thr1, Gln3, Asp4, Leu6 und Gln10 weisen gut definierte χ₁-Werte auf, aber nur Gln1 wies einen übereinstimmenden Wert für χ₂ in allen Strukturen auf.
H^N(I)-O(I-4)-Wasserstoffbrückenbindungen zu den Amidprotonen von Leu5, Ala6 und gln10 waren in mehr als 90 % der Strukturen vorhanden, was darauf hinweist, dass diese Reste eine vorwiegend α-helikale Konformation annahmen. Obwohl (i,i-4)-Wasserstoffbrückenbindungen für die Amidprotonen von Ala7, Arg8 und Arg9 in etwa 50 % der Strukturen erkennbar waren, waren H^N(I)-O(I-3)-Wasserstoffbrückenbindungen in 25–35 % der Strukturen vorhanden, was darauf hinweist, dass in diesem Bereich eine leichte Verzerrung der Helix gegeben war. Die in der nachstehenden Tabelle 4 angeführten Daten zeigen, dass in Peptid 1c die Amidwasserstoffe von Leu5 bis Gln10 alle vor Austausch mit einem Lösungsmittel geschützt waren, im Vergleich zum Kontrollpeptid 1b mit Faktoren von bis zu 25. Diese Beobachtung stimmt auch damit überein, dass die Amidwasserstoffe dieser Reste an den Wasserstoffbrückenbindungen beteiligt sind. Interessanterweise waren Wasserstoffbrückenbindungen von Asp4-H^N bis Thr1-O^γ2 in 80 % der Strukturen vorhanden, was darauf hinweist, dass eine N-Kappen-Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkung (E.T. Harper, G.D. Rose, Biochemistry 32, 7605–7609 (1993)) sogar in diesem kurzen Peptid vorhanden war. Das Amidproton von Asp4 war jedoch nicht merklich vor Austausch geschützt (Tabelle 4), sodass diese Wasserstoffbrückenbindung von eher vorübergehendem Charakter sein könnte. Tabelle 4. Amidwasserstoff-Austauschgeschwindigkeitskonstanten^a und Schutzfaktoren^b für Peptid 1b und 1c

^a Die Geschwindigkeitskonstanten sind in der Einheit Sekunden^–1 (s^–1) angegeben. n.b. bedeutet, dass der Austausch schnell genug stattfand, dass kein Peak im NMR-Spektrum erkennbar war, das 300 Sekunden (s) nach dem Zusatz von D₂O erhalten wurde. Unter der Annahme, dass mehr als 90 % der Wasserstoffe in 300 s ausgetauscht wurden, ist in diesen Fällen die Berechnung einer Untergrenze von 0,013 s^–1 (lokg k = –1,89) für die Geschwindigkeitskonstante möglich.
^b Schutzfaktoren werden berechnet als Geschwindigkeitskonstante für Peptid 1c, dividiert durch jene für Peptid 1b.

Mit Ausnahme der ψ-Winkel von Ala6 und Gln10 lagen die Rückgrat-Diederwinkel in der gesamten gefesselten Region nahe dem für eine ideale α-Helix erwarteten (mittlerer ϕ = –63° ± 8°, mittlerer ψ = –42° ± 8°), was darauf hinweist, dass Abweichungen vom Idealwert sehr gering waren. Der ψ für Ala6 war 15° niedriger als für eine α-Helix erwartet und der für eine 3₁₀-Helix erwarteten ähnlicher; der höhere Wert von ψ für Gln10 spiegelte das Ausfransen außerhalb der gefesselten Region wider. Die leichte Verzerrung bei Ala6 könnte das Ergebnis der kürzeren Fessel sein, die in diesem Peptid vorhanden ist (nur drei Methylengruppen). Obwohl die Diamidbindung durch die NMR-Daten nicht gut definiert war, nahmen die Seitenketten von Gln3 und Gln10 Konformationen an, die den von den oben beschriebenen Modellierungsexperimenten ähnelten (Gln3 χ₁ = –173° ± 17°; χ₂ = 34° ± 47°; Gln10 χ₁ = –71° ± 7°, χ₂ = 174° ± 22°). Die Gesamtschlussfolgerung war, dass 1c in einer Lösung eine α-helikale Struktur von Asp1 bis Gln10 mit einer N-terminalen Capping-Box und einer sehr leichten Verzerrung in der zentralen Umkehrschleife der Helix annahm.
Zirkulardichroismus (CD)
CD-Spektren wurden mit wässrigen Lösungen von 1–4 mit zwischen 20 und 120 Mikromol/Liter (μM) bei 280 K, pH 5 erhalten. Die Spektren der Peptide 1 und 3 (Apaminsequenz) sind in 8 dargestellt, und jene der Peptide 2 und 4 (C-Peptidsequenz) in 8. Die Zahlenwerte für die prozentuelle Helizität, die aus der molaren Elliptizität pro Rest für die Peptide bei 222 Nanometern (nm) berechnet wurden, sind in der obigen Tabelle 3 angeführt.
Die CD-Daten stützen die aus den NMR-Untersuchungen abgeleiteten Schlussfolgerungen. Beide Fesselungsverfahren steigerten die Helizität der C-Peptidsequenz deutlich (8). Aber nur das Diamidverfahren konnte die Apaminsequenz unter den eingesetzten Bedingungen helikal machen; das Thiolysin-eingeschränkte Peptid 3b schien nicht helikal zu sein (7). Das CD-Spektrum von 4b wies trotz der wesentlichen negativen Elliptizität bei 222 nm mehrere Merkmale auf, die auf einen geringeren Helizitätsgrad hinweisen als bei 2c–2c: die niedrige minimale Wellenlänge in 4b war von 208 nm (ein typischer Wert für eine α-Helix) zu 204 nm verschoben, und die erkennbare Schulter des 190-nm-Maximums war viel geringer als bei 2c–2e.
Hitzedenaturierungsexperimente wurden an den Apamin-basierten Peptiden 1b–1e durchgeführt. Im ersten Experiment wurden CD-Spektren der Peptide 1b–1e in 10-°C-Intervallen von 7°C (280 K) bis 57°C (330 K) aufgenommen. Angesichts der Tatsache, dass 1c–1e die Helizität in diesem Temperaturbereich gut aufrechterhielten, wurden Spektren von 1c bis zu 97°C (370 K) aufgenommen, wo ein gewisser Helizitätsverlust zu beobachten war (6). Die molare Elliptizität von 1c bei 97°C und 22 nm war immer noch wesentlich stärker negativ als die des nichthelikalen Kontrolipeptids 1b bei 7°C und 222 nm.
Experimente zur Untersuchung der Auswirkungen von Erhitzen und Wiederabkühlen der Peptide waren aufgrund mehrerer Faktoren kompliziert: Das CD-Spektrometer zeigte bei längeren Expreimenten eine Verschiebung der Grundlinie; die Konzentration der Proben veränderte sich aufgrund der Verdampfung bei höheren Betriebstemperaturen; und es schien zu einer gewissen Schwankung des Probenverhaltens in Abhängigkeit von Aufheiz- und Abkühlungsgeschwindigkeit zu kommen. Eine Gruppe von CD-Spektren von 1c wurde vor, während und nach dem Erhitzen auf 87°C für einen Tag aufgenommen. Die Auswirkung der Verschiebung der Grundlinie wurde durch eine lineare Normalisierung der Spektren basierend auf Utas reduziert. Die Auswirkung der Konzentrationsänderung aufgrund von Probenverdampfung wurde durch Normalisierung des Spektrums nach dem Erhitzen auf die gleiche Amplitude wie das Spektrum vor dem Erhitzen bei einer Wellenlänge (λ) von 204 nm korrigiert. Diese Wellenlänge wurde als Punkt gewählt, an dem eine α-Helix und ein Zufallsknäuel gleiche Beträge zur Elliptizität leisten, sodass eine Interkonversion eines Peptids zwischen diesen Konformationen das Ausmaß der Elliptizität nicht beeinflusst. Die resultierenden Spektren sind in 9 dargestellt. Die starke Übereinstimmung der Kurvenform zwischen den Spektren vor und nach dem Erhitzen weisen darauf hin, dass die meisten der oder alle helikalen Strukturen beim Abkühlen nach teilweiser Denaturierung durch Erhitzen auf 87°C wiedererhalten wurden. Der kleine Unterschied in der Gesamtamplitude könnte auf ein geringes Maß an bleibender Denaturierung zurückzuführen sein oder könnte ein Überbleibsel des Normalisierungsvorgangs sein. Dieses Experimente zeigt, dass die α-Helix von 1c gegenüber relativ rauen Bedingungen stabil war, ein Merkmal, das ihre allgemeine Nutzbarkeit verbessert.
Schlussfolgerung
Ein neues Verfahren zur Einschränkung von kleinen Peptiden auf eine α-helikale Konformation wurde entworfen. Diese I- bis I+7-basierte Fessel ist ein erfolgreiches allgemeines Verfahren zur Induktion von α-Helizität in kleinen Peptiden und weist mehrere wünschenswerte Merkmale auf. Erstens erlaubt es maximal mögliche Sequenzvariabilität. Jeder Rest, außer den beiden Fesselungsresten selbst, kann verändert werden. Zweitens liegt die durch dieses Verfahren induzierte Helizität in wässriger Lösung bei Raumtemperatur (RT) nahe 100 %. Der Vergleich der helikalen Peptide 1c–1e mit dem nichthelikalen Peptid 1b zeigt, dass die Helizität durch Einführung des Linkers erreicht wird und keine Eigenschaft der Primärsequenz ist. Drittens werden diese gefesselten Peptide durch herkömmliche Festphasen-(Merrifield-) Chemie synthetisiert und erfordern lediglich kostengünstige, im Handel erhältliche Reagenzien. Viertens kann das Verfahren sogar für Peptide eingesetzt werden, die nur acht Reste lang sind. Fünftens stellt es keine chemische Anforderungen in Bezug auf die Umgebung, und es wurde gezeigt, dass es trotz Veränderungen der Temperatur- und Pufferbedingungen gute Helizität induziert. Dieses Verfahren ist allgemein nützlich für Untersuchen an biologisch aktiven helikalen Regionen von Proteinen, für die experimentelle Untersuchung von Helixbildung, -propagation und -stabilität und für physikalische organische Experimente bezüglich der Wechselwirkungen von helikalen Peptiden mit ihrer Umgebung.
BEISPIEL 2
Das zyklisierte Peptid FNM(5)QQRRFY(6)ALH (11) wurde unter Einsatz von Fmoc-Chemie nach herkömmlichen Festphasen-Vorschriften, worin Fmoc-Glutamin säure-δ-(5-allyloxycarbonyl-1,5-diaminopentan) (5) (wie nachstehend beschrieben synthetisiert) und Fmoc-Glutaminsäure-δ-allylester (6) (im Handel von Millipore erhältlich) als Standard-Aminosäuren in die Peptidsynthese eingebaut wurden, gefolgt von einer Zyklisierung synthetisiert, wie in 11 dargestellt ist. Fmoc-Glutaminsäure-δ-(5-allyloxycarbonyl-1,5-diaminapentan) (5) wurde wie im nachstehenden Schema 1 dargestellt synthetisiert.
Schema 1
Mono-t-butyloxycarbonyl-(BOC-) 1,5-pentandiamin wurde unter Verwendung von 1,5-Diaminopentan (12,5 g, 122 mmol) anstelle von 1,3-Diaminopropan in der Synthese von Monoallyloxycarbonyl-1,3-diaminopropan, wie in Beispiel 1 oben beschrieben, synthetisiert, was 10 g (49 mmol) Mono-terf-butyloxycarbonyl-1,5-diaminopentan (1) ergab. Mono-tert-butyloxycarbonyl-1,5-diaminopentan (1) (5,8 g, 28,7 mmol) wurde in 75 ml Dichlormethan mit 7,5 ml Diisopropylethylamin gelöst und auf 0°C abgekühlt. Ein Lösung von Allylchlorformiat (3,3 ml) in Dichlormethan (25 ml) wurde über fünf Minuten zugesetzt. Die Reaktion wurde ein Stunde lang auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, und dass wurde das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml Ethylacetat gelöst und mit drei 100-ml-Portionen 10%iger Citronensäure, einmal mit 100 ml gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat und einmal mit 100 ml gesättigtem wässrigem Natriumchlorid gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt. Das resultierende Öl (2) wurde 30 Minuten lang mit 25 ml Trifluoressigsäure behandelt. Die Trifluoressigsäure wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, und der resultierende Rückstand wurde zweimal in Dichlormethan gelöst und dann eingedampft, um restliches Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde in 50 ml 3 N Salzsäure gelöst und mit zweimal 50 ml Dichlormethan gewaschen. Die wässrige Phase wurde in einem Eisbad gekühlt, und der pH wurde mit 50%igem wässrigem Natriumhydroxid auf etwa 13 eingestellt. Die basische wässrige Phase wurde mit dreimal 100 ml Dichlormethan extrahiert, die vereinigten organischen Phase wurden mit 100 ml gesättigtem wässrigem Natriumchlorid gewaschen und dann über Kaliumcarbonat getrocknet. Das Gemisch wurde filtriert und das Lösungsmittel zuerst durch Rotationsverdampfung und dann im Hochvakuum entfernt, um 3,95 g Monoallyloxycarbonyl-1,5-diaminopentane(3) als farbloses Öl zu erhalten.
Fmoc-Glutaminsäure-α-tert-butylester, 9,0 g (21,1 mmol, Bachem Calif., USA) wurde in 100 ml Dichlormethan gelöst. Dicyclohexylcarbodiimid (4,4 g, 21,3 mol) und N-Hydroxybenzotriazol (0,3 g, 2,1 mmol) wurden zu dieser Lösung zugesetzt, gefolgt vom Monoallyloxycarbonyl-1,5-diaminopentan (3) (3,95 g, 21,2 mmol). Die Reaktion wurde 14 Stunden lang bei 25°C gerührt, dann über eine Stunde auf 0°C abgekühlt. Unlösliches Material wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde durch Rotationsverdampfung eingeengt. Der Rückstand wurde in 150 ml Ethylacetat gelöst und zweimal mit 100 ml 10 % wässriger Citronensäure, zweimal mit 100 ml gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat und einmal mit 100 ml Kochsalzlösung gewaschen. Nachdem das Ganze über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert worden war, wurde das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt. Der Rückstand wurde unter Erhit zen in etwa 75 ml Ethylacetat gelöst, und Nexan:Ethylacetat (2:1) wurde zugesetzt, bis die Lösung trüb wurde. Nachdem das Ganze einige Stunden lang stehen gelassen worden war, wurde der kristalline Niederschlag abfiltriert, und die weißen Kristalle wurden mit Hexan:Ethylacetat (2:1) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um 11,4 g von (4) zu erhalten (90 %).
Der tert-Butylester (4) (11 g, 18,5 mmol) wurde unter Rühren in 50 ml Trifluoressigsäure gelöst. Nach 45 Minuten wurde die Trifluoressigsäure durch Rotationsverdampfung entfernt; die restliche Trifuoressigsäure wurde durch dreimaliges Eindampfen aus 50 ml Dichlormethan entfernt. Der Rückstand wurde unter Erhitzen in 75 ml Ethylacetat gelöst, durch Celite filtriert, und Hexan:Ethylacetat (3:1) wurden zugesetzt, bis eine Trübung auftrat. Kristalle wurden drei Stunden lang bei 25°C wachsen gelassen, wonach das Ganze eine Stunde lang auf 0°C abgekühlt wurde. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit Hexan:Ethylacetat (3:1) gewaschen und dann im Vakuum getrocknet, um 9,5 g (95 %) von (5) als grauweiße Kristalle zu erhalten.
Nach der Peptidsynthese von FNM(5)QQRRFY(6)ALH wurde der N-Terminus des Festphasenpeptids an Mono-tert-butylbernsteinsäure gebunden, die Allyl- und Allyloxycarbonyl-Schutzgruppen wurden unter Verwendung von 500 mg Pd(PPh₃)₂Cl₂ in 20 ml 20%igem Piperidin in Dimethylacetamid über 1,5 Stunden bei Raumtemperatur entfernt. Das Harz wurden dann mit 20%igem Piperidin in Dimethylacetamid, Dimethylacetamid, Dichloromethan und schließlich mit 0,5%iger Trifluoressigsäure in Dichloromethan gewaschen. Das Harz wurde in Dichloromethan suspendiert, und 1,5 Äquivalente HATU mit 3 Äqu. N,N-Diisopropylethylamin in 5 ml Dimethylacetamid wurden zugesetzt. Nach zwei Stunden wurden das Harz durch den Ninhydrintest auf freie Amine untersucht und stellte sich als negativ heraus. Das Peptid wurde mit 95% Trifuoressigsäure, 5% Triethylsilan vom Harz abgespalten und unter Einsatz von RP-HPLC gereinigt.
Die helikale Struktur des zyklisierten Peptids, die in 11 dargestellt ist, wurde durch Zirkuiardichroismus (CD) und Magnetresonanz (NMR) bestätigt. Beide dieser Verfahren zeigten, dass das arretierte Helixpeptid vorwiegend α-helikalen Charakter besaß. Durch Mikrakalorimetrie und Oberflächen-Plasmonresonanz wurde bestimmt, dass das arretierte Helixpeptid IgG mit einer Affinität (Kd) von etwa 100 μM band. Bin Kontrollpeptid ohne Arretierabschnitt des Moleküls wies keine IgG-Bindung auf, die durch Mikrokalorimetrie nachweisbar wäre.
BEISPIEL 3
Um zu bestätigen, dass der kovalente Arretiermechanismus voll funktionsfähig ist und dass durch dieses Verfahren arretierte Peptide in der Lage sind, einen Liganden mit hoher Affinität zu binden, wurde ein 33-Aminosäure-Peptid, das auf Helix 1 der Z-Domäne von Protein A basierte, wie im nachstehenden Schema 2 dargestellt mit der i- bis i+7-Bindung synthetisiert. Schema 2
worin (5) und (6) die im obigen Beispiel 2 beschriebenen Allyloxycarbonyl- und Allylgeschützten Aminosäuren sind. Das Peptid wurde wie im obigen Beispiel 2 beschrieben synthetisiert und zyklisiert. Die Helizität des Peptids wurde durch CD und NMR verifiziert, und die durch CD überwachte Hitzedenaturierung des Peptids zeigte, dass sich das Peptid bei 90°C nur teilweise auffaltet, was mit der Stabilität der kovalenten Bindung übereinstimmt. Die IgG-Bindungsaffinität (Kd) dieses Peptids (gemessen durch Oberflächen-Plasmonresonanz) wurde mit etwa 20 nM bestimmt.
BEISPIEL 4
Von der Ektodomäne des HIV-1-Hüllproteins gp41 abgeleitete lineare Peptide hemmen bekanntermaßen virale Fusionsvorgänge. Die stärksten davon (DP178) entsprechen einer proximalen Membranregion von gp41, von der vorhergesagt wird, dass sie α-helikal ist. DP178 fehlt jedoch in Lösung eine erkennbare Struktur, was eine mechanistische Interpretation seiner Aktivität äußerst schwierig macht. Unter Anwendung der hierin gelehrten Helixarretierungschemie wurden eingeschränkte Versionen von DP178 hergestellt, um zu bestimmen, ob die Helizität für seine Hemmwirkung der Infektiosität notwendig oder ausreichend ist, und um eins wahrscheinliche Wirkungsweise dieses Moleküls bei einer Primärinfektion zu definieren (gemessen durch Virusinfektiositätstests).
Durch Einschränkung von DP178-Analoga auf eine helikale Konformation haben die Erfinder gezeigt, dass die Helizität notwendig, aber nicht ausreichend ist, um Hemmwirkung bereitzustellen. Die korrekte Fläche der Helix muss auch exponiert sein. Zwei neuere Kristallstrukturen von gp41 zeigen, dass diese Fläche in einer Furche verborgen ist, die durch ein Superhelixtrimer gebildet wird. Zusammen genommen zeigen diese Ergebnisse, dass DP178 die Infektiosität durch Blockierung dieser Furche hemmt und dass die durch Kristallographie bestimmte Konformation von gp41 den fusogenen Zustand darstellt.
Eine Reihe von Analoga von DP167, worin Segmente des Amidrückgrats helikal eingeschränkt waren (12), wurde vorbereitet. Da kurze α-Helices üblicherweise in Lösung unstrukturiert sind (Marqusee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5286–5290 (1989)), wurde eine kovalente Vernetzung zwischen den Aminosäure-Seitenketten an den Positionen i und i+7 der Polypeptidkette, wie hierin gelehrt (siehe auch Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119, 455–460 (1997), das durch Verweis hierin aufgenommen ist), bereitgestellt, welche die dazwischen liegenden Reste in einer stabilen α-helikalen Konformation arretiert.
Eine trunkierte Form von DP178, die als HIV35 (12) bezeichnet wird, wurde als Referenz verwendet. In Ermangelung detaillierter Informationen bezüglich der Assoziation von DP178 mit DP107 wurde die Neigung zur Bildung einer Superhelix (Lupas et al., Science 252, 1162–1164 (1991)) für 29 verschiedene gp160-Sequenzen berechnet, um zu bestimmen, ob die DP178 entsprechende Region als Superhelix zählt. Die N-terminalen 27 Reste von DP178, die für das Referenzpeptid HIV35 ausgewählt wurden, behielten einen hohen Gesamtpunktewert mit einer übereinstimmenden Heptaden-Anordnung bei. Die „a–d"-Fläche, die anhand der Punktealgorithmen vorhergesagt wurde, entsprach der Fläche, die sich an den Trimerkern anlagerte. Diese entsprechende Region ist in der Röntgenstruktur vollkommen helikal und wird unter Verwendung eines mit jenen in Superhelices verwandten 4-3-Heptaden-Repeats an den Trimerkern angelagert. Unter Einsatz der hierin gelehrten Helixarretierungschemie und -verfahren haben die Erfinder die Exposition dieses Repeats (Positionen „a" und „d" der Heptade) durch Einführung von Vernetzungen zwischen Paaren von benachbarten Resten auf der gegenüberliegenden Fläche der Helix (Position „f") verstärkt. Somit wurden Arretierungen (Fesseln) zwischen „f" und „f" gebildet, um die mögliche Helix einzuschränken. Analoga von HIV35 (12) wurden hergestellt, die entweder eine (HIV24) oder zwei (HIF31) Fesseln enthielten, um gesteigerte Helizität bereitzustellen. Ein Kontrollpeptid (HIV30) wurde hergestellt, worin eine Fessel zwischen aufeinander folgenden „d"-Resten eingeführt wurde, um die Helizität zu stabilisieren, während mögliche Bindungswechselwirkungen über die „a–d"-Fläche blockiert wurden.
Lineare Peptide wurden gemäß herkömmliche Festphasenverfahren unter Einsatz von Fmoc-Chemie synthetisiert (Fields et al., Int. J. Peptide Protein Res. 35, 161–214 (1990)), wie dies hierin gelehrt wird. Genauer gesagt wurden Helixdipoleffekte minimiert, indem die C-Termini als Amide und die N-Termini als Succinatgruppen blockiert wurden. Nach der Bildung der Lactam-Brücken, wie hierin gelehrt (siehe auch Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119, 455–460 (1997)), wurden die Peptide vom Harz abgespalten und unter Einsatz von präparativer RP-HPLC mit Wasser/Acetonitril/0,1%-TFA-Gradienten in der mobilen Phase bis zur Homogenität gereinigt. Die Identität der einzelnen Peptide wurde durch Elektrospray- Massenspektrometrie bestätigt: HIV-24, berechnete Masse 3396,8, gefunden, 3396,0; HIV-30, berechnete Masse 3413,7, gefunden, 343,8; HIV-31, berechnete Masse 3520,0, gefunden, 3520,7; HIV-35, berechnete Masse 3330,8, gefunden, 3330,5.
Zirkulardichroismusanalyse (13) bestätigt, dass die Arretierungsstrategie die Nelizität der DP178-Trunkierungen deutlich erhöht. CD-Spektren wurden mit einem CD-Spektrometer AVIV 62DS unter Einsatz von Küvetten mit einer Weglänge von 0,05 cm aufgenommen. Die Spektren wurden durch Mittelung der Daten von drei Durchgängen von 250 nm bis 190 nm mit Steigerungen von 1,0 nm und einer Mittelungsdauer von 2 Sekunden bei jeder Wellenlänge erhalten. Die Peptidkonzentrationen betrugen etwa 200 μM in einer Lösung von 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 mit 6 Vol.-% Acetonitril. Zur Umrechnung der Rohdaten in molare Elliptizitätswerte wurden genaue Konzentrationen durch Messung von A₂₇₆ und A₂₈₀ (Edelhoch, Biochemistry 6, 1948–1954 (1967)) bestimmt; diese Werfe wurden durch quantitative Aminosäureanalysen bestätigt.
Das nichteingeschränkte Peptid HIV35 zeigte ein praktisch nichtssagendes Spektrum, ähnlich wie das für DP178 berichtete (Lawless et al., Biochemistry 35, 13697–13708 (1996)). Die CD-Spektren der Peptide mit einer einzelnen Einschränkung (HIV24 und HIV30) wiesen Minima bei 209 und 222 nm auf, die charakteristisch für α-Helices waren. Die Intensitätsverhältnisse zwischen diesen beiden Regionen weichen vom Idealwert ab, was vermuten lässt, dass Regionen des Peptidrückgrats außerhalb des eingeschränkten Segments fehlgeordnet sind. Im Gegensatz dazu scheint das doppelt eingeschränkte Analog HIV31 größtenteils helikal zu sein, wie durch CD bestimmt wurde, der die Form und das Intensitätsprofil einer typischen α-Helix ergab.
Virusinfektiositätstest wurden verwendet, um die helikal eingeschränkten Konstrukte zu charakterisieren. Normale menschliche Peripherblutzellen (PBMCs) wurden 24 Stunden lang mit Phytohämagglutinin (PGHA) in RPMI-1640-Medium, das Interleukin 2 enthielt, stimuliert. Das PHA-Medium wurde entfernt, und die Zellen wurden über Nacht in RPMI 1640 mit Glutamin, 20 % hitzeaktiviertem fötalem Kälberserum und Gentamicin gezüchtet. Zu Beginn des Tests wurden vorgetiterte Virus-Stammlösungen eine Stunde lang mit Peptiden äquilibriert, bevor sie zu den PBMCs zugesetzt wurden (2,5 × 10⁵ Zellen pro Well). Die Zellen wurden drei Tage lang gezüchtet, zur Entfernung von extrazellulären Viren und Peptiden gespült und dann mit frischem Medium ergänzt und weitere vier Tage lang gezüchtet. Nach sieben Tagen wurden die Zellen lysiert, und p24-Antigen wurden durch ELISA bestimmt. Die Peptide wurden in jeder Konzentration dreimal durchlaufen gelassen. Virustiter wurden für jeden Durchgang doppelt bestimmt. Jeder Test umfasste außerdem die folgende Kontrolle in dreifacher Ausführung: nichtinfizierte Zellen als negative Kontrolle, infizierte Zellen ohne Peptid als positive Kontrolle und Virus-Inokulum ohne Zellen zum Erhalt eines p24-Grundlinienwerts. Die Peptide wurden auf Zytotoxizität getestet, indem sie in der höchsten Testkonzentration (etwa 100 μM) mit nichtinfizierten Zellen inkubiert und dann die oben beschriebenen Zeilen gezüchtet wurden. Nach 7 Tagen wurden die Zellzahlen mithilfe von Mikroskopie geschätzt und mit einer identischen Charge von Zellen verglichen, die nicht mit dem Peptid behandelt worden war; keines der Peptide hemmte normales Zellwachstum unter diesen Bedingungen.
Als sie den Virusinfektiositätstests unterzogen wurden wiesen die Peptide ein auffallendes Muster relativer Wirksamkeit auf, das sich sowohl über Syncitium-induzierende (SI-) als auch Nicht-Syncitium-induzierende (NSI-) Stämme von HIV-1 erstreckten (Zhang et al., Nature 383, 768 (1996)), Wie in den 14A und 14B dargestellt führte eine Trunkierung des hydrophoben C-Terminus von DP178 (HIV35) zu einem dramatischen Rückgang der Aktivität, die teilweise wiederhergestellt wurde, als eine einzelne Einschränkung, d.h. ein eingeschränktes helikales Peptid (mit teilweise α-helikalem Charakter) eingeführt wurde (HIV24). Der Zusatz einer zweiten Einschränkung (HIV31) verlieh starken helikalen Charakter und steigerte die Wirksamkeit des Peptids auf Werte, die mit DP178 vergleichbar waren. Somit startete die zusätzliche Stabilisierung, die durch eine vorherige Anordnung von HIV31 in einer aktiven helikalen Konformation verliehen wird, den Verlust der Bindungsenergie durch Deletion des C-Terminus. Im Gegensatz dazu nahm eine einzelne Einschrän kung, die Helizität induzierte und gleichzeitige die „a–d"-Fläche blockierte (HIV30), die Aktivität vollkommen weg.
Eine Reihe von kürzeren eingeschränkten Peptiden, welche die Positionen 631–644, 643–656, 649–662, 656–669 und 663–678 von HIV-1_LAI überspannen, die zwischen benachbarten Resten an den „f"-Positionen der Heptade gefesselt sind, wurden vorbereitet, um zu bestimmen, ob eine Untergruppe von HIV35 oder seine N- und C-terminalen flankierenden Regionen ausreichten, um die Infektiosität zu blockieren. Alle Peptide, egal ob eingeschränkt oder nichteingeschränkt, zeigten keine signifikante Aktivität. Die Peptide 631–644 enthalten den hydrophoben Cluster, von dem in der Röntgenstruktur nachgewiesen wurde, dass er sich in einen Hohlraum im Trimerkern anlagert (Chan et al., Cell 89, 263–273 (1997)).
Die relativen Aktivitäten von HIV35, HIV24 und HIV31 zeigen eine klare Korrelation zwischen Helizität und Hemmwirkung auf. Die äußerst unterschiedlichen Aktivitäten von HIV30 und HIV24 zeigen, dass die Peptidhemmung auch die Exposition der Fläche der Helix erfordert, die sich, wie durch Kristallographie nachgewiesen wurde, an den N-terminalen Trimerkern von gp41 anlagert.
Die hierin präsentierten Daten stützen zusammen mit den vorangegangenen Modellstudien an isolierten Peptiden und den kürzlich veröffentlichten Kristallstrukturen die Hypothese, dass die Peptide Virusinfektiosität durch Bindung an die Ruheform von gp41 hemmen und die Bildung des fusogenen Zustands verhindern. Das Peptid HIV31 ist konformationell so eingeschränkt, dass es größtenteils helikal ist, und die Wahrscheinlichkeit ist hoch, dass es mit einer zugänglichen zugehörigen Qberfläche in der Ruheform von gp41 wechselwirkt. Da eine Röntgenanalyse zeigt, dass die Fläche von HIV31, die zur Hemmung der Virusfusion erforderlich ist, in der durch den N-terminalen Trimerkern gebildeten Furche verborgen ist, glauben die Erfinder (ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen), dass diese Furche die zugehörige Oberfläche für die Peptide darstellt.
15 ist eine schematische Darstellung eines derzeitigen Modells zur Anordnung des fusogenen Zustands von gp41 und des Mechanismus, durch den die eingeschränkten Helices diesen Vorgang hemmen. Das Modell ist in keiner Weise als Einschränkung der Erfindung zu verstehen und soll die Erfinder auf keine bestimmte Theorie zur Umsetzung der Erfindung einschränken. Die Ruheform von gp41 (oben links) wird vermutlich konstitutiv trimerisiert, wobei ein Superhelixbündel nahe dem N-terminalen Fusionspeptid vorhanden ist (Pfeil). Die Region, die dem C-Terminus der Ektodomänen entspricht (dunkle Linien), ist anfangs nicht an das Trimerbündel gebunden und weist eine unbekannte Konformation auf. Eine Konformationsverschiebung, die aus der Bindung von gp120 an entweder CD4, einen Corezeptor oder beides resultiert, kann dann eine Assoziation des C-terminalen Abschnitts von gp41 mit dem N-terminalen Bündel erlauben. Die resultierende antiparallele helikale Anordnung (oben rechts), die in den Röntgenstrukturen erkennbar ist, ist vermutlich der fusogene Zustand von gp41. Eine Umordnung in diesen Zustand kann blockiert werden, wenn die Trimerfurchen durch Hemmpeptide besetzt sind (unten links). Im Falle einer Blockierung auf diese Weise würde eine nachfolgende Konformationsverschiebung im gp41-Cluster das Protein aus dem Weg heraus maskieren (unten rechts).
Die Peptide DP178 und HIV24 hemmen die Infektiosität von genetisch entfernten und phänotypisch unterschiedlichen Subtypen von HIV-1 (Gao et al., Journal of Virology 70, 1651–1667 (1996)). Außerdem ist die Oberfläche, von der vorgeschlagen wird, dass sie daran binden, eine der höchstkonservierten Regionen im HIV-1-Genom. Die Erfinder haben DP178 gegen andere Stämme getestet und herausgefunden, dass es ähnlich starke Hemmwirkung gegen den im Labor angepassten Stamm MN/H9 und die primären Isolate 301660 und Th009 aufwiest. Der Stamm Th009 ist vom Subtyp E und genetisch vom vorherrschenden nordamerikanischen Subtyp B (z.B. JRCSF) (Zhang et al., Nature 383, 768 (1996)). Diese Ergebnisse stimmen mit Beobachtungen aus anderen Laboratorien überein (Wild et al., Prac. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10537–10541 (1992); Wild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9770–9774 (1994); Jiang et al., Nature 365, 113 (1993)). Neben JRCSF und BZ167 haben die Erfinder auch HIV24 gegen Th009 getestet und herausgefunden, dass es vergleichbare Stärke aufweist, was darauf hinweist, dass der vorgeschlage ne Membranfusionsmechanismus auf sehr unterschiedliche Stämme von HIV-1 zutrifft.
Andere Mittel, wie beispielsweise Antikörper, die auf diese Oberfläche abzielen, könnten somit viel versprechend für die therapeutische Behandlung von AIDS sein.
BEISPIEL 5
Um eine Vakzine herzustellen, die gegen eine HIV-Infektion wirksam wäre, entweder als Prophylaktikum oder als Therapeutikum nach einer Infektion (gegebenenfalls in Kombination mit Anti-HIV-Medikamenten oder anderen Untereinheitenvakzinen), wurden eingeschränkte α-helikale Peptide aus der 633-678-Region von gp41 hergestellt und als Immunogene verwendet.
Varianten von HIV 24 mit der Sequenz "Gly Gly Cys" am C-Terminus oder "Cys Gly Gly" am N-Terminus wurden hergestellt. Diese Peptide wurden unter Verwendung eines heterobifunktionellen Vernetzers, wie z.B. 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäure-3-sulfo-N-nydroxysuccinimidester, der von Sigma verfügbar ist, oder eines Äquivalents davon (z.B. „Sulfo-MBS" von Pierce) an KLH konjugiert. Immunisierungen wurden wie nachstehend beschrieben vorgenommen.
Polyklonale Antikörper gegen KLH-konjugierte HIV-Peptide wurden in weiblichen Meerschweinchen hergestellt (Hartley-Stamm von Simonson Labs). Fünfzig μg Peptid in 250 μl PBS wurden mit 250 μl Freundschem Adjuvans (komplettes Adjuvans für die Primärinjektion und inkomplettes Adjuvans für alle Auffrischungen) emulgiert. Injektionen von 70–100 μg Peptid/kg Körpergewicht wurden über eine Kombination aus subkutanen und intramuskulären Steilen in einem Dreiwochenzyklus verabreicht. In der zweiten und dritten Woche wurde nach der jeweiligen Auffrischung Blut abgenommen.
Die Seren von immunisierten Tieren wurden auf eine Protein-A-Säule geladen, um nach einer Elution gereinigtes Gesamt-Ig bereitzustellen. Für die arretierten Helices selektive Antikörper wurden erhalten, indem der Gesamt-Ig-Pool über eine Affinitätssäule laufen gelassen wurden, die einen mit immobilisierten arretierten Helices beladenen Träger enthielt. Dieser Träger wurde hergestellt, indem zuerst die oben beschriebenen cysteinhältigen Peptide (HIV 2, 27, 28 und 29) mit Biotin-Maleinimid (ebenfalls von Sigma; N-Biotinyl-N'-[6-maleinimidohexanoyl]hydrazid) umgesetzt wurden, um Peptide zu erhalten, die an einem Terminus biotinyliert waren. Diese Peptide wurden auf ein Harz geladen, das mit Streptavidin (Pierce, "Ultralink Avidin") vorbeladen worden war, um das beschriebene Affinitätsgel bereitzustellen.
Der Gesamt-Ig-Pool aus der Protein-A-Säule wurde über die geeignete Affinitätssäule laufen gelassen (d.h. jene mit dem passenden immobilisierten Hapten). Nichtspezifische Antikörper wurden im Durchfluss eluiert und als negative Kontrollen aufbewahrt. Spezifische Antikörper wurden aus der Protein-A-Säule eluiert, in einen Testpuffer dialysiert und gelagert.
Überraschenderweise waren die erhaltenen Antikörpertiter für gp41-Untereinheitenpeptide ziemlich hoch. Dies ist vor allem überraschend, weil diese Region von gp41 (633–678) auf dem Gebiet der Erfindung nicht dafür bekannt ist, HIV-neutralisierende Antikörper zu bilden.
Die affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörper werden dem Virusinfektiositätstest unterzogen, der zur Beurteilung der Peptide eingesetzt wird. Die zur Erzeugung von polyklonalen Antikörperpräparaten, welche die Infektiosität hemmen, verwendeten Haptene sind zur Verwendung in einer Vakzine wünschenswert. Am meisten bevorzugt sind Kandidaten, die zu breit kreuzreaktiven Antikörpern führen, welche in der Lage sind, verschiedene HIV-1-Isolate in vitro zu neutralisieren.
HIV-1-Vakzinen-Kandidaten können in verfügbaren Tiermodellen getestet werden, beispielsweise in den von Berman et al., J. Virol. 7, 4464–9 (1992); Haigwood et al., J. Virol. 66, 172–82 (1992) und Salmon-Ceron et al., AIDS Res. and Human Retroviruses 11, 1479–86 (1995) beschriebenen Schimpansen für gp120-Untereinheitenvakzinen. Am meisten bevorzugt sind Kandidaten, die zur breit kreuzreaktiven Anti körpern führen, welche in der Lage sind, unterschiedliche HIV-1-Isolate in diesen Tierstudien zu neutralisieren und so Schutz bei einer Provokation mit homologen und heterologen Stämmen von HIV-1 bereitstellt. Der erfolgreiche Schutz von Schimpansen ist ermutigend und hat sich in der Geschichte als verlässlicher Indikator für die Wirksamkeit einer Vakzine bewährt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Konstruktion eines eingeschränkten helikalen Peptids, folgende Schritte umfassend: (a) das Synthetisieren eines Peptids, worin das Peptid eine Sequenz aus acht Aminosäureresten umfasst, worin die Sequenz aus acht Aminosäureresten einen ersten terminalen Rest und einen zweiten terminalen Rest aufweist, worin der erste terminate Rest und der zweite terminale Rest eine interne Sequenz aus sechs Aminosäureresten flankieren und worin der erste und der zweite terminate Rest eine Seitenkette aufweisen, die einen eine Amidbindung bildenden Substituenten enthält; (b) das Bereitstellen eines difunktionellen Linkers mit einer ersten funktionellen Gruppe, die zur Bildung einer Amidbindung mit dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des ersten terminalen Rests in der Lage ist, und einer zweiten funktionellen Gruppe, die zur Bildung einer Amidbindung mit dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des zweiten terminalen Restes in der Lage ist; und (c) das Cyclisieren des Peptids durch Reaktion des eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des ersten terminalen Rests mit der ersten funktionellen Gruppe des difunktionellen Linkers, um eine Amidbindung zu bilden, und das Umsetzen des eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des zweiten terminalen Rests mit der zweiten funktionellen Gruppe des difunktionellen Linkers, um eine Amidbindung zu bilden, was ein eingeschränktes helikales Peptid ergibt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin in Schritt (a) der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des ersten terminalen Rests mit einer ersten Schutzgruppe geschützt wird und der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des zweiten terminalen Rests mit einer zweiten Schutzgruppe geschützt wird, worin die erste Schutzgruppe und die zweite Schutzgruppe unterschiedlich entfernbar sind, und worin in Schritt (c) die erste Schutzgruppe entfernt wird, sodass der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des ersten terminalen Rests entschützt wird und der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des zweiten terminalen Rests nicht entschützt wird, bevor das Peptid mit dem difunktionellen Linker umgesetzt würde, wonach das Peptid mit dem difunktionellen Linker umgesetzt wird, um eine Amidbindung zwischen dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des ersten terminalen Rests und der ersten funktionellen Gruppe des difunktionellen Linkers zu bilden, wonach die zweite Schutzgruppe von dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des zweiten terminalen Rests entfernt wird und das Peptid cyclisiert wird, indem der eine Amidbindung bildende Seitenketten-Substituent des zweiten terminalen Rests mit der zweiten funktionellen Gruppe des difunktionellen Linkers intramolekular umgesetzt wird, um eine Amidbindung zu bilden.
Verfahren zur Konstruktion eines eingeschränkten helikalen Peptids, folgende Schritte umfassend: (a) das Synthetisieren eines Peptids, worin das Peptid eine Sequenz aus acht Aminosäureresten umfasst, worin die Sequenz aus acht Aminosäureresten einen ersten terminalen Rest und einen zweiten terminalen Rest aufweist, worin der erste terminale Rest und der zweite terminale Rest eine interne Sequenz aus sechs Aminosäureresten flankieren, worin der erste und der zweite terminale Rest eine Seitenkette aufweisen, die einen eine Amidbindung bildenden Substituenten enthält, worin der erste terminale Rest an einen difunktionellen Linker gebunden ist, der eine erste funktionelle Gruppe und eine zweite funktionelle Gruppe aufweist, worin die erste funktionelle Gruppe in einer Amidbindung mit dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des ersten terminalen Rests vorliegt und worin die zweite funktionelle Gruppe des difunktionellen Linkers zur Bildung einer Amidbindung mit dem eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des zweiten terminalen Rests in der Lage ist; und (b) das Cyclisieren des Peptids durch intramolekulares Umsetzen des eine Amidbindung bildenden Seitenketten-Substituenten des zweiten terminalen Rests mit der zweiten funktionellen Gruppe des difunktionellen Linkers, um eine Amidbindung zu bilden und ein eingeschränktes helikales Peptid zu erhalten.
Verbindung, ausgewählt aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe: Verbindung der Formel (1):
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff aller eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz bestehend aus sechs Aminosäuren ist; m und p unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass m + p kleiner als oder gleich 6 ist, und n eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (m + p)) bis (9 – (m + p)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass n größer als 1 ist; Verbindung der Formel (6):
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz bestehend aus sechs Aminosäuren ist; q aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, s aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass q + s kleiner als oder gleich 7 ist, und r eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7-(q + s)) bis (9 – (q + s)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass r größer als 0 ist; Verbindung der Formel (11):
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz bestehend aus sechs Aminosäuren ist; t aus den ganzen Zahlen von 0 bis 6, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist und v aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass t + v kleiner als oder gleich 7 ist, und u eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (t + v)) bis (9 – (t + v)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass u größer als 0 ist; und Verbindung der Formel (16):
worin S nicht vorhanden ist oder ein Makromolekül ist, X Wasserstoff oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Y nicht vorhanden ist oder Hydroxyl ist, wenn S nicht vorhanden ist, oder eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, Z eine beliebige Aminosäuresequenz bestehend aus sechs Aminosäuren ist; w und y unabhängig voneinander aus den ganzen Zahlen von 1 bis 7, Grenzen eingeschlossen, ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass w + y kleiner als oder gleich 8 ist, und x eine beliebige ganze Zahl im Bereich von (7 – (w + y)) bis (9 – (w + y)), Grenzen eingeschlossen, ist, mit der Maßgabe, dass x größer als oder gleich 0 ist.
Verbindung nach Anspruch 4, die der Verbindung der Formel (1) entspricht, worin Z Gln-Gln-Arg-Arg-Phe-Tyr ist.
Verbindung nach Anspruch 4, worin Z eine Aminosäuresequenz bestehend aus sechs Aminosäuren ist, worin die interne Sequenz aus sechs Aminosäuren die Form gabcde, defgab oder cdefga aufweist und aus einer Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, die eine Sequenz aus sechs zusammenhängenden Aminosäuren in der HIV-1LAI-Stamm-gp41-Aminosäuresequenz 633 bis 678, in seiner homologen Sequenz von einem anderen HIV-Stamm, in einer Consensus-Sequenz seiner homologen Sequenz von einer beliebigen HIV-Clade oder einer Aminosäure-substituierten Variante davon umfasst, worin der Aminosäure 633 oder ihrer entsprechenden Aminosäure in der homologen Sequenz, Consensus-Sequenz oder Sequenzvariante die Position a einer Grundaufstellung abcdefg zugeordnet ist.
Verbindung nach Anspruch 6, weiters S' umfassend, wenn S nicht vorhanden ist und X eine beliebige Aminosäure oder Aminosäuresequenz ist, worin S' ein an X gebundenes Makromolekül ist.
Verbindung nach Anspruch 6, worin die homologe oder Consensus-Sequenz in 16A–16M dargestellt ist.
Verbindung nach Anspruch 6, weiters ein zweites eingeschränktes helikales Peptid umfassend.
Antikörper, der an eine Verbindung nach Anspruch 6 bindet, worin der Antikörper spezifisch an ein Epitop bindet, das eine Aminosäure an Position a, d, e oder g im helikalen Peptid umfasst.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 6 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines Säugetiers, das HIV-gefährdet ist oder mit HIV infiziert ist.
Verwendung nach Anspruch 11, worin die zusammensetzung interne sechs Aminosäuren umfassende Sequenzen von unterschiedlichen HIV-Stämmen oder HIV-Claden umfasst.
Vakzine, zumindest eine Verbindung nach Anspruch 6 umfassend.
Verbindung nach Anspruch 6 zur Verwendung in der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines Säugetiers, das HIV-gefährdet oder mit HIV infiziert ist.