PT99791B

PT99791B - Processo para a preparacao de peptidos seleccionados do antigene especifico de grupo (gas) do virus da imunodeficiencia humana (hiv) e de composicoes farmaceu-ticas que os contem

Info

Publication number: PT99791B
Application number: PT99791A
Authority: PT
Inventors: Matthias Niedrig; Susanne Modrow; Maus Wolf
Original assignee: Chiron Behring Gmbh & Co
Priority date: 1990-12-14
Filing date: 1991-12-13
Publication date: 1999-05-31
Also published as: EP0490383A2; JP3369585B2; ES2095899T3; JPH06107697A; KR920012114A; DE59108261D1; CA2057612C; DE4039925A1; EP0490383B1; ATE216706T1; DK0490383T3; DE59109235D1; AU8976691A; EP0732339B1; DK0732339T3; ATE143974T1; EP0732339A1; US5612453A; PT99791A; EP0490383A3

Description

Descrição referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e eomercial, com sede em D-3550 Marbuxg República Federal Alemã, (inventores: Dr. Matthias Niedrig, Dr. Susanne Modrow e Prof. Dr, Maus Nolf, residentes na República Federal Alemã), para: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÉPTIDOS SELECCIONADOS DO ANTIGENE ESPECÍFICO DE GRUPO (gag) DO VIRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA ÍHIV) E PE COMPOSIÇÕES

FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÉM».

A invenção refere-se a péptidos escolhidos da sequência gag do HTV que provocam uma inibição da síntese de vírus. No ensaio de Ul péptidos sequenciais em relação à inibição da proliferação do HIV descobriu-se que os péptidos coincidentes 4 e 5 com a sequência de aminoácidos.

Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Vai NPGLLETSEGCRQ e NPGLLETSEGCRQ Ile Leu Gly Glu Leu Glu Pro Ser Leu Glu Thr da proteína de submembrana pl7 e os dois péptidos 28 e 29 com as sequências de aminoácidos

Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro AATLEEMMTA e AATLEEMMTA Cys Glu Gly Vai Gly Gly Pro Gly His Lys Ala da proteína nuclear p24, inibem a proliferação do HIV (as regiões coincidentes encontram-se sublinhadas). Estes péptidos ou outros análogos, que contenham pelo menos as regiões coincidentes, são apropriados como medicamentos para o tratamento de infecções pelo HIV,

A doença provocada pelo HIV - 0 SIDA - cons titui um grande desafio para a investigação científica no que respeita ao desenvolvimento de substâncias activas e de novas vacinas. Mesmo quando a investigação mostra um largo espectro de métodos terapêuticos possíveis, apenas um pequeno número de substâncias prometem uma terapia com sucesso. Até agora, existe no mercado uma única substância eficaz contra o HIV - 0 ^Retrovir - com o ingrediente activo Zidovadin, da firma Wellcome. Es te análogo de nucleótido, azidotimidina (AZT), inibe muito eficazmente in vitro e in vivo a transcriptase reversa específica do HIV, mas não está contudo isento de propriedades desvantajosas. Até agora não existem alternativas à terapia com AZT.

Investigações sobre a estrutura virai do HIV e sobre o papel das várias proteínas da estrutura virai no amadurecimento do vírus conduziram à conclusão de que são neces sárias várias substâncias para uma inibição eficaz da síntese do vírus, sendo a inibição da protease virai por quimioterápicos apenas um exemplo do que vários grupos de trabalho estão ac tualmente a levar a cabo. 0 facto de a sequência gag pertencer às regiões altamente conservadas do genoma do HIV leva a supor que se trata de uma proteína muito importante para a proliferação do vírus; as pequenas diferenças de sequências em vários isolados de HIV apoiam esta suposição (vide Tab. l). 0 processo da síntese do vírus passa pela síntese da proteína gag e pela necessária miristimilação da proteína gag. A síntese continua-se nas lipomembranas da célula infectada. Por justaposições de proteínas gag ocorre a obstrução das membranas celulares e a li bertação (Budding) de partículas ou de vírus não maduros. Pode demonstrar-se que este processo também ocorre quando se introduz apenas o gene gag na célula, através de investigação com sequências gag recombinantes em vectores Vaccinia ou Báculo (Karacostas et al. (1989) Humam immunnodeficiency virus-like partides produced by vaccinia virus expression veetor. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 86, 8965-8967; Gheysen et al. (1989) Assembly and release of HIV-1 precursor prgag 55 virus- like partides from recombinant baculovirus - infected insect cells. Cell, 59, 103-112). Outras publicações demonstram que existem no interior da sequência gag zonas importantes para o processamento. Introduzindo mutações adequadas no interior da sequência gag identificaram-se várias regiões relevantes para o processamento (G8 Hlinger et al. (ΐ95θ) Role of capsid precursor Processing and myristoylation in morpbogenesis and infectivity of human immunodeficiency virus type 1. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 86, 5781-5785).

Por outro lado não existe qualquer evidência de que determinadas zonas da sequência gag codifiquem para péptidos que inibem a síntese virai do HIV.

Nos ensaios que estiveram na base da presente invenção testaram-se 4l péptidos sintéticos coincidentes da sequência gag do H3V-1 no que respeita à sua função inibidora da síntese virai, num teste in vitro. Sintetizaram-se os péj> tidos com 24 aminoácidos de comprimento de modo análogo ao da sequência publicada por Ratner et al. (Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III, Nature, 313, 277-284 (1985)).

Administraram-se estes péptidos, em concentrações variadas (200-40 p.g/ml) a células Jurkat recentemente infectadas. A infecção efectuou-se com 100-1000 TCID^q· A análise da infecção fez-se por observação microscópica e por deter minação do teor de HIV infeccioso na camada sobrenadante. Para tal adicionou-se sobrenadante celular de células Jurkat não infectadas. Após duas semanas de incubação submeteu-se esta cultu ra celular de identificação a observação microscópica e a testes de transcriptase reversa. Descobriu-se que existem duas regiões gag que possuem um efeito inibitório sobre a síntese virai. Estas duas regiões são ambas representadas por dois péptidos, existindo o primeiro (péptido 4 + 5) no interior de pl7 e o segundo (péptido 28 -t- 29) no interior de p24.

Como se verifica na Tabela 4, não se observa qualquer p24 em células infectadas com HIV, após tratamento com estes péptidos. A camada sobrenadante destas culturas celu

lares não contém HIV infeccioso, capaz de infectar uma cultura de controle. As Figuras 1 e 2 mostram a actividade de transcriptase reversa (RT) de ambas as culturas celulares de identificação. Os quatro péptidos escolhidos permitem inibir a síntese do HIV em concentrações do 200-40 jig/ml, de um modo muito eficaz (para detalhes sobre a identificação da inibição do HTV, vide exemplos).

A influência de concentrações variáveis de j virus infecciosos sobre os resultados dos testes é relativamente pequena e reflecte-se principalmente no valor da actividade de RT medida (vide ensaio 1, Fig, 1, ensaio 2, Fig. 2). As concentrações variáveis de péptidos adicionados não têm também uma influência significativa sobre a inibição, o que deixa supôr que a concentração dos péptidos adicionados pode ainda diminuir-se sem influenciar o efeito. 0 resultado do terceiro ensaio apresenta-se na Figura 3, As actividades de transcriptase reversa aqui r<3 presentadas mediram-se apos duas semanas de incubação das culturas celulares de identificação, a partir do sobrenadante de cultura celular numa concentração cinco vezes maior. Também aqui se verifica o forte efeito inibidor dos péptidos 2,4,5,9,28 e 2q sobre a síntese do HIV-1, A inibição da síntese do HIV-2 pelos péptidos 4,5,28 e 29 é também facilmente reconhecível. Neste caso, contudo, os péptidos adicionados parecem ser mais fracos na sua acção inibidora. Assim, no caso dos péptidos 2 e 9 não ocorre inibição, no caso do péptido 28 sé com uma dose de 200 p.g/ml se consegue uma inibição total da síntese do vírus. De entre todos os 4l péptidos testados sé o péptido n2 9 revelou alguma toxicidade celular.

Deste modo, a invenção refere-se a péptidos que contêm pelo menos uma das duas sequências peptídicas NPGLLETSEGCRQ e AATLEEMMTA e que não tenham um comprimento superior a 50 aminoácidos, em especial a 40 aminoácidos, principalmente a 30 aminoácidos e de preferência a 20 aminoácidos. Preferem-se em especial os péptidos que contêm os péptidos 4, 5, 28 ou 29.

Um outro objectivo da invenção são os pépti¹ t

dos que contêm pelo menos tuna das duas sequências peptídicas NPGLLBTSEGCRQ e AATLEEMMTA , cujas sequências podem estar encur tadas no terminal azotado e/ou carbonado de até 7 aminoácidos, de preferência até h aminoácidos, sem no entanto terem um comprimento inferior a 6 aminoácidos. Muitas vezes é também vantajoso prolongar os péptidos de acordo com a invenção de um ou mais aminoácidos, por exemplo cisteína, de modo a conseguir acoplar os péptidos uns aos outros ou a um suporte,

A invenção refere-se ainda a derivados das duas sequências peptídicas NPGLLBTSEGCRQ e AATLEEMMTA, nas quais se efectuaram uma ou mais das seguintes substituições, de acordo com métodos conhecidos do especialista: asparagina por glutamina, ou glutamina por asparagina, prolina por hidroxiprolina, leucina por isoleucina ou norleucina, ácido glutâmico por ácido aspártico, treonina por serina ou serina por treonina, cis. teína por serina, arginina por lisina, alanina por glicina e/ou metionina por norleucina. Prefere-se a substituição de um aminoá eido natural por um aminoácido não natural, como por exemplo hidroxiprolina por norleucina.

Pode deste modo impedir-se que as proteases específicas do corpo degradem o derivado, o que conduz em geral a um aumento do tempo de vida média. Os derivados podem também possuir uma melhor solubilidade e/ou uma melhor ressorpção, em comparação com as duas sequências peptídicas de acordo com a invenção .

Outros objectivos da invenção são as misturas de proteínas ou a preparação por engenharia genética, bem e<> mo a utilização dos péptidos de acordo com a invenção como medicamentos ,

De preferência, os péptidos de acordo com a invenção preparam-se por métodos da química das proteínas, por exemplo de acordo com BARANI, G. e MERRIFIELD, R.B. em «The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Vol, 2, Academic Press I98O, Bd. Erhard Gross, Johannes Meyerhofer,

A invenção encontra-se ilustrada em detalhe nos exemplos que se seguem e nas reivindicações da patente.

Exemplo 1; Aspectos gerais

Células

Utilizaram-se linféeitos-T em crescimento permanente (células Jurkat ou H9) para as experiências in vitro. Como meio utilizou-se RPMI 1640 convencional com 10$ de FKS, 2$ de NaHCO^ (a 5$) , 1$ de solução de penicilina (estreptavidina e 2 mg/l de polibreno. As experiências efectuaram-se em placas de microtitulação de 96 orifícios (Nunc) ou de 24 orifícios (Nunc). Vírus

Utilizaram-se vírus HTV-1 da estirpe HTLV-III B e vírus HIV-2 da estirpe ROD,

Síntese peptídica e purificação dos péptidos

Prepararam-se os péptidos de acordo com a sequência HIV-l publicada por Ratner et al, (1985) num sintetizador automático (Milligen 9050, Milligen GmbH, Eschborn, RFA) utilizando aminoácidos protegidos com Fmoc (Bachem AG, Heidelberg, RFA) (Atherton et al, (ΐ97θ)í A mild procedure for solid phaso peptide synthesis; use of Fluorenylmethyloxycarbonyl aminoacids: J, Chem, Soc. Chem, Comntun. 13, 539-540). Como material de suporte utilizou-se resina Tentogel com lincantes A M estáveis em meio ácido (Polímero Rapp, Tfibingen, RFA) , Dissolveram-se os aminoácidos em DMF antes do acoplamento e transformaram-se em ésteres activados de hidroxibenzotriazole, Para o acoplamento efectuaram-se oiclos de síntese rápida com tempos de reacção de 10 minutos. Por fim, removeu-se o grupo Fmoc com piperidi na a 20$. Testou-se por fluorometria o grau de avanço da reacção.

Após completada a síntese suspendeu-se a re sina com o péptido protegido em 50$ de TFA/DCM. Como captor utilizou-se 1$ de anisole, 1$ de m-cresol, 1$ de fenol e, no caso em que a sequência em questão continha Trp, 5$ de mercaptoetanol, A ligação à resina e os grupos protectores Trt e tBoc removeram-se por incubação durante 4 horas, à temperatura ambiente e sob atmosfera inerte de argon. Para a remoção do grupo protector Mtr da Arg separou-se o péptido desligado da resina, evaporou-se . o solvente num evaporador rotativo e incubou-se o resíduo solido «

= 6 = obtido a 100$, incluindo o captor habitual (vide acima), durante a noite. Os péptidos desprotegidos, após remoção do solvente, dissolveram—se em ácido acético a 5θ$» precipitaram—se com um grande volume de éter ter-butile tílico gelado, lavaram-se várias vezes e liofilizaram-se. Tomou-se o produto bruto seco em bicarbonato de amónio a 1,5$· Filtraram-se os componentes insolúveis. Secou-se novamente o filtrado. A purificação dos péptidos efectuou-se numa coluna de HPLC em fase reversa semi-preparativa Propep (copolímero Cg/C-^g» Pharmacia/LKB, Freiburg, RFA), utilizando-se para a eluição, como habitualmente, gradientes de 0-70$ de acetonitrilo em TFA a 0,1$ des gaseificado com hélio. Tejs taram-se as sequências dos péptidos purificados num sequenciador de fase gasosa (Applied Biosystems, Westerstadt, RFA). Os péptidos utilizados correspondem às sequências de aminoácidos apresen tadas na Tabela 2. iS evidentemente possível preparar também os péptidos acima referidos por engenharia genética, por exemplo co mo proteínas de fusão apropriadas em sistemas celulares procarijS ticas ou eucarióticos.

Teste de transcriptase reversa microteste para a identificação da transcriptase reversa virai efectuou-se de acordo com o método de Gregersen et al. (Gregersen et al. (1988) Detection of human immunodeficiency vírus and other retroviruses in cell culture supernatants by a reverse transcriptase microassay, J. Virol. Methods 19, I6I-I68). Concentraram-se cinco vezes os sobrenadantes da cultura celular por precipitação com PEG. Como controles posd. tivos (VK) utilizaram-se sobrenadantes de culturas celulares infectadas não tratadas, como controles negativos (NK) utilizaram-se sobrenadantes de culturas celulares de células não infectadas. 0 valor medido com os NK duplicou-se e utilizou-se como valor de exclusão para as células negativas. Para facilitar a interpretação representam-se os valor de RT medidos em escala logarítmica (vide também Figuras 1, 2 e 3),

Exemplo 2: Identificação da inibição da síntese do HIV

A sequência do teste representa-se esquematicamente na Tabela 3. Efectuaram-se em cada caso dois ensaios

para a inibição da síntese do HIV com todos os 4l péptidos disponíveis .

No primeiro ensaio pipetaram-se 50 jil (lx xlO /ml) de células Jurkat para os orifícios de placas de 96 ori fícios e infectaram-se com 50 jul (1000 TCID^ HTLV-III b). Ajustou-se a concentração do péptido gag a 200 jig/ml ou 40 jug/ml.

Após uma semana retiraram-se 100 ul de sobrenadante e removeram-se por centrifugação as células ainda eventualmente presentes.

Em seguida adicionaram-se 80 /al de sobrenadante a uma cultura de células Jurkat não infectada. A identificação de antigenes do ví rus nas células infectadas efectuou-se por meio de marcação imunológica por Western Blot. Para tal tomaram-se as células restantes após o ensaio de inibição em tampão de amostra SDS-PAGE duplo e separaram-se em PAG a l4$. Em seguida absorveram-se as proteínas separadas numa membrana de nitrocelulose e incubaram-se com um anticorpo monoclonal de HIV-1 anti-p24 para a identificação de proteínas virais. Á coloração específica efectuou-se com um segundo anticorpo anti-rato com fosfatase alcalina acopla da. A análise de HIV infeccioso no sobrenadante das células tratadas com péptido efectuou-se pelo teste da transcriptase reversa.

segundo ensaio efectuou-se de modo análogo ao do primeiro com uma concentração mais baixa em unidades in fecciosas (100 TCID^_Q). A análise de vírus infecciosos em sobrenadantes de culturas celulares ou de proteína HIV nas culturas celulares infectadas efectuou-se de modo análogo ao do primeiro ensaio. Num terceiro ensaio testaram-se péptidos escolhidos (2,

4, 5, 9, 28 e 29), que tinham um efeito inibitório sobre a síntese do HIV-1, em condiçQes análogas, no que respeita ao seu efeito inibitório sobre o HIV-2. Para este ensaio infectaram-se células H9 com 100 TCID-.. de HIV-2, A análise da infecção efectuou-se de modo análogo ao das duas experiências anteriores.

Nas duas primeiras experiências identificaram-se duas regiães no interior da sequência gag, representadas em cada caso por dois péptidos sobrepostos, que têm um efeito in:_: bitório sobre a síntese do HIV. Os péptidos 4 e 5 situam-se na sequência proteica de p!7, enquanto que os péptidos 28 e 29 se = 8 = situam na sequência proteica de p24.

Na Tabela 1, para a comparação de várias sequências proteicas de HlV-gag, as regiões representadas pelos péptidos 4, 5 e 28, 29, encontram-se marcadas por enquadramento A Tabela 2 apresenta a sequência de aminoácidos das 4l sequências coincidentes.

Legendas;

Tabela 1:

Comparação de várias sequências proteicas de HlV-gag. As regiSes representadas pelos péptidos 4, 5 ® 28, 29 estão marcadas por enquadramento.

Tabela 2:

Sequência de aminoácidos dos 4l péptidos gag sintéticos coincidentes. Os péptidos sintetizaram-se de modo análogo ao da sequência publicada por Ratner et al.

Tabela 3;

Representação esquemática dos ensaios efec tuados e planeados para a identificação da inibição da síntese de HIV pelos péptidos gag.

Tabela 4:

Inibição da síntese de HIV por péptidos gag. Resultados da identificação de p-24 em células infectadas com HIV após tratamento com péptidos duas semanas depois da infecção. As células da placa de partida misturaram-se com tampão de amostra duplo e separaram-se em PAG a 14$. Após o teste Blot” sobre nitrocelulose efectuou-se a identificação da proteína HIV por meio de Mabs específicos. - significa ausência de reacção, (+) significa reacção fraca observada, + significa reacção bastante positiva e ++ significa reacção muito forte. Figura li

Inibição da síntese virai de HIV por pépti dos gag (ensaio l). Utilizaram-se 1000 TCID^₀ de HIV-1 para a infecção de células Jurkat, A actividade de transcriptase rever

sa raediu-se em cpm em sobrenadantes de cultura celular da cultu ra celular de identificação. Concentrou-se o sobrenadante por precipitação com PEG (5 vezes). VK = controle de vírus; NK = » controle negativo. Utilizou-se o dobro do valor de NK como va lor de exclusão para as culturas celulares negativas. Para faci litar a interpretação apresentam-se os valores de RT na figura em escala logarítmica.

Figura 2;

Inibição da síntese de HIV por péptidos gag (ensaio 2). Utilizaram-se 100 ΤΟΙϋ^θ de HIV-1 para a infecção de células Jurkat. A actividade de transcriptase reversa me diu-se em cpm em sobrenadantes de cultura celular da altura celular de identificação. Concentrou-se o sobrenadante 5 vezes poi precipitação com PEG. VK = controle do vírus; NK β controle negativo. Usou-se o dobro do valor de NK como valor de exclusão para as culturas celulares negativas. Para facilitar a interpretação os valores de RT na figura apresentam-se em escala logarítmica.

Figura 3:

Inibição da síntese de HIV por péptidos gag (ensaio 3). Utilizaram-se 100 TCID^_Q de HIV-1 ou HIV-2 para a infecção de células Jurkat ou H9. A actividade de transcriptase reversa mediu-se em cpm em sobrenadantes de cultura celular de identificação. Concentrou-se o sobrenadante 5 vezes por precipitação com PEG. VK » controle do virus; NK as controle negativo. Usou-se o dobro do valor de NK como valor de exclusão para as culturas celulares negativos. Para facilitar a interpretação apresentam-se os valores de RT na figura em escala logarítmica.

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Tabela 2

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inibição da síntese virai

Péptido NS.:

11 12

21 22 de HIV por péptidos gag;

Identificação de p24:

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Tabela 4 (continuação)

Inibição da síntese virai

Péptido NS.;

de HIV por péptidos gag;

Identificação de p24:

Claims

REIVINDICAÇÕES

- Ι* Processo para a preparação de péptidos da proteína HlV-gag, contendo polo menos uma das duas sequências peptídicas Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Glu e Ala Ala Thr Glu Glu Met Asn Thr Ala, cujo comprimento não exceda 50 aminoácidos, caracterizado por se efectuar a síntese por via química (síntese proteica) ou por engenharia genética.

- 2< Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obterem péptidos contendo P4, P5» P28 ou 29.

- 3* Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por as duas sequências peptídicas Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Glu e Ala Ala Thr Glu Glu Met Asn Thr Ala serem encurtadas no terminal azotado e/ou carbonado por até 7 aminoácidos, não tendo contudo um comprimento inferior a 6 aminoácidos.

- 4* Processo de acordo oom pelo menos uma das rei vindicações 1 a 3» caracterizado por as duas sequências peptídicas Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Glu e Ala Ala Thr Glu Glu Met Asn Thr Ala possuírem uma ou mais das seguin tes substituições de aminoácidos:

asparagina por glutamina, ou glutamina por asparagina, prolina por hidroxiprolina, leucina por isoleucina ou norleucina, ácido glutâmico por ácido aspártico, treonina por serina ou serina por treonina, cisteína por serina, arginina por lisina, alanina por glicina e/ou metionina por norleucina.

- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, destinada ao combate da SIDA, caracterizado por se utilizarem como ingredientes activos péptidos preparados de acor do com pelo menos uma das reivindicações 1 a 4.

6® Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5» caraeterizado por se utilizar juntamente com o ingrediente activo um veículo inerte·

A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 14 de Dezembro de 1990, sob ο N2.

P 40 39 925.7»

Lisboa, 13 de Dezembro de 1991

RESUMO

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PÉPTIDOS SELECCIONADOS DO ΑΝΤΙGENE ESPECÍFICO DE GRUPO (gag) DO VIRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV) E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM

A invenção refere-se a um processo para a preparação de péptidos da proteína HlV-gag, contendo pelo menos uma das duas sequências peptídicas Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gin e Ala Ala Thr Glu Glu Met Asn Thr Ala, cujo comprimento não exceda 50 aminoácidos, que compreende efectuar-se a síntese por via química (síntese proteica) ou por engenharia genética.