JP2023527048A

JP2023527048A - インターロイキン２９変異体タンパク質

Info

Publication number: JP2023527048A
Application number: JP2022572748A
Authority: JP
Inventors: ▲楊▼柳; 李岩; ▲馮▼静; 郭万▲軍▼; 潘海
Original assignee: 杭州先▲為▼▲達▼生物科技有限公司
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2023-06-26
Also published as: AU2021280623B9; EP4159748A4; CN115667291A; AU2021280623A1; AU2021280623B2; WO2021238302A1; US20230265144A1; EP4159748A1

Abstract

インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質、前記変異体タンパク質を含む融合タンパク質、コンジュゲート、医薬組成物、製品、およびキットが提供される。提供されたＩＬ２９変異体タンパク質は、良好な活性および安定性を有し、ウイルス感染症、腫瘍、および体の免疫機能を調節する必要があるその他の疾患を効果的に予防および／または治療することができる。

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本願は、ポリペプチドの予防および／または治療の分野に関し、具体的には、本願は、生体の抗ウイルス能力を改善し、生体の免疫機能を調節するために使用されるインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質、前記変異体タンパク質を含む融合タンパク質、コンジュゲートおよび組成物に関する。

［背景技術］
インターフェロンは、広範囲の抗ウイルスおよび免疫調節効果を持つ重要なクラスの家族性サイトカインである。現在までに、インターフェロンの７つの型（α、β、ω、δ、τ、γ、λ）が特定されており、これらは大きく３つのグループ（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）に分けられる。いわゆる「Ｉ型」インターフェロンは、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンδ、およびインターフェロンτを含む。現在、ＩＩ型インターフェロンはインターフェロンγのみである。ＩＩＩ型インターフェロンは、最近発見されたサイトカインのファミリーであり、ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－２８Ｂ、およびＩＬ－２９とも呼ばれるインターフェロンλ１、λ２、およびλ３を含む。

ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－２８Ｂ、およびＩＬ－２９は、Ｉ型インターフェロンと配列相同性があり、ＩＬ－１０と遺伝子配列相同性がある。機能的には、ＩＬ－２８とＩＬ－２９はいずれも細胞内で抗ウイルス効果を誘導するという点でＩ型インターフェロンに類似しており、Ｉ型インターフェロンとの相違点は、特定のＢ細胞株に対して抗増殖活性を示していないことである。

野生型ＩＬ－２９（インターフェロンλ１、略してＩＦＮ－λ１）遺伝子は、配列番号３に示すように、２００アミノ酸のタンパク質をコードする。ここで、配列中の１～１９個のアミノ酸はシグナルペプチド配列であり、当該タンパク質の成熟アミノ酸配列は、配列番号２に示されるように１８１個のアミノ酸である。ＩＬ－２９分子は、６つのタンパク質ヘリックスＡ～Ｆで構成されており、ヘリックスＡ、Ｃ、Ｄ、およびＦは、典型的なアップアップダウンダウン（ｕｐ－ｕｐ－ｄｏｗｎ－ｄｏｗｎ）の４ヘリックスバンドルを形成する。ＩＬ－２９は、ＩＦＮ－λＲ１とＩＬ－１０Ｒ２とからなる受容体複合体と相互作用することにより、下流のシグナル伝達経路を開始する。なお、ＩＦＮ－λＲ１はＩＦＮ－λシグナル伝達経路に固有のものである。ＩＦＮ－λ１はＩＦＮ－λＲ１に特異的に結合してＩＦＮ－λ１／ＩＦＮ－λＲ１複合体を形成し、ここで、ＩＦＮ－λ１とＩＦＮ－λＲ１の結合の活性中心のアミノ酸残基はそれぞれ、Ｐｒｏ２５、Ｌｅｕ２８、ｌｙｓ３２、Ａｒｇ３５、Ａｓｐ３６、Ｇｌｕ３９、Ｔｒｐ４７、Ｐｈｅ１５２、Ｐｈｅ１５５、Ａｒｇ１５６、Ａｒｇ１６０である。

Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、ＩＩＩ型インターフェロンのいずれであっても、タンパク質薬剤としては、安定性が低く、活性が低く、インビボでの半減期が短いなどの要因により、その臨床使用は大きく制限されている。そのため、遺伝子工学技術により、より安定で比活性の高いインターフェロン組換え蛋白質薬剤を得ることが期待される。特に呼吸器疾患の予防及び／または治療にエアロゾル吸入療法を用いる場合、薬液を微細な粒子に霧化するネブライザー装置を使用し、気道や肺に薬を吸入させて気道や肺に沈着させる必要があり、この場合、薬剤の安定性及び活性に対する要求がより高いため、人々はより安定性がより高く活性がより優れた組換えＩＬ２９タンパク質を得ることを期待している。遺伝子工学技術は、野生タンパク質配列のある１つまたはあるいくつ
かのアミノ酸を変更することにより、比較的安定で比活性のより高い組換えタンパク質を取得でき、タンパク質薬剤によって引き起こされる不安定性の問題をある程度解決できる。しかし、それと同時に、ある１つまたはあるいくつかのアミノ酸の変異により、タンパク質の折り畳み及び空間構造が影響を受ける可能性があり、それによってタンパク質の活性に影響を与えてしまう。したがって、より安定で活性の高いＩＬ２９変異体タンパク質が得られるかは技術的な課題である。
［発明の概要］

以上によって、従来技術の問題を解決するために、本出願は、より高い安定性、より良好な活性、より少ない副作用を有し、エアロゾル吸入療法に使用できるＩＬ２９変異体タンパク質を提供する。

一態様では、本願は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６１番目または１６２番目のアミノ酸の置換変異を含むインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質を提供し、前記１６１番目のアスパラギン酸（Ｄ）または１６２番目のグリシン（Ｇ）が他の天然アミノ酸に置換されている。

一部の実施形態では、本願のインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６１番目のアスパラギン酸（Ｄ）がグルタミン酸、スレオニンまたはセリンに置換されている、または１６２番目のグリシン（Ｇ）が脂肪族アミノ酸に置換されている。

一部の実施形態では、本願のインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６５番目のアミノ酸のシステイン（Ｃ）からセリン（Ｓ）への置換変異をさらに含む。

本願において、シグナルペプチドを含む全長野生型ＩＬ２９タンパク質のアミノ酸配列は配列番号３に示され、２００のアミノ酸からなり、ここで、１～１９番目のアミノ酸はシグナルペプチドであり、２０～２００番目のアミノ酸（１８１ａａ）は、ＩＬ２９の成熟タンパク質を構成する（アミノ酸配列は配列番号２に示される）。

本願のインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質は、配列番号３に示される野生型タンパク質のＮ末端からの２６位から設計された。本願のインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６１番目または１６２番目のアミノ酸の置換変異を含む。

本願のいくつかの実施形態では、本願は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６１番目または１６２番目のアミノ酸の置換変異を含むインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質を提供し、前記１６１番目のアスパラギン酸（Ｄ）または１６２番目のグリシン（Ｇ）が他の天然アミノ酸に置換されており、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、フェニルアラニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、デイパルチン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンまたはヒスチジンから選択されるアミノ酸によって置換されている。

当業者は、配列番号１の１６１位および１６２位と、配列番号２（野生型インターロイキン２９成熟タンパク質）および配列番号３（シグナルペプチドを含む野生型インターロイキン２９全長タンパク質）の対応する位置との対応関係を理解するであろう。したがって、配列番号２または配列番号３（または配列番号２もしくは配列番号３に由来する、異なる長さのアミノ酸配列）の対応する位置に基づくアミノ酸変異も、本出願の保護範囲内
に含まれる。本願の保護範囲はまた、配列番号２または配列番号３に由来するが、異なる長さを有するアミノ酸配列の上記１６１位および１６２位の対応する位置で置換変異を含むインターロイキン２９変異体タンパク質をカバーする。

上記インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質のいくつかの実施形態では、前記インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６１番目または１６２番目のアミノ酸の置換変異を含み、前記１６１番目のアスパラギン酸（Ｄ）または１６２番目のグリシン（Ｇ）が他の天然アミノ酸に置換され、開始メチオニン（Ｍ）をも含む。これは、ＩＬ２９が原核細胞（例えば、大腸菌）で発現される場合、発現されたＩＬ２９タンパク質がＮ末端またはアミノ末端メチオニンを有するためである。

本願のいくつかの実施形態では、本願のＩＬ－２９変異体タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６１番目または１６２番目のアミノ酸の置換変異を含み、すなわち、配列番号１に示されるタンパク質のＮ末端またはアミノ末端からの１６１位または１６２位の変異を含み、例えば、前記１６１番目のアスパラギン酸（Ｄ）または１６２番目のグリシン（Ｇ）が他の天然アミノ酸によって置換されている。いくつかの実施形態では、本願のＩＬ－２９変異体タンパク質は、原核細胞（例えば、大腸菌）で発現される変異体タンパク質であり、１６２位または１６３位（Ｎ末端Ｍの付加のため、Ｍから起算）の置換変異を含み、例えば、前記１６２番目のアスパラギン酸（Ｄ）または１６３番目のグリシン（Ｇ）が、他の天然アミノ酸に置換されている。特定の実施形態では、本願のＩＬ－２９変異体タンパク質は、配列番号４～９に示される。

上記のインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質のいくつかの実施形態では、前記インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６１番目または１６２番目のアミノ酸の置換変異を含み、例えば、前記１６１番目のアスパラギン酸（Ｄ）がグルタミン酸、スレオニンまたはセリンに置換されているか、または１６２番目のグリシン（Ｇ）が脂肪族アミノ酸に置換されている。いくつかの実施形態では、本願のＩＬ－２９変異体タンパク質は、原核細胞（例えば、大腸菌）で発現される変異体タンパク質であり、１６２位または１６３位（Ｎ末端Ｍの付加のため、Ｍから起算）の置換変異を含み、例えば、前記１６２番目のアスパラギン酸（Ｄ）がグルタミン酸、スレオニンまたはセリンに置換されているか、または１６２番目のグリシン（Ｇ）が脂肪族アミノ酸に置換されている。

上記のインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質のいくつかの実施形態では、前記インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質は、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４、配列番号６、または配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる。

上記インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質のいくつかの実施形態では、前記インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６５番目のシステイン（Ｃ）からセリン（Ｓ）への置換変異をさらに含む。前述のように、ＩＬ２９変異体タンパク質は原核細胞（例えば、大腸菌）で発現されると、前記１６５番目のシステイン（Ｃ）からセリン（Ｓ）への置換変異が１６６位で起こる。

上記のインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質のいくつかの実施形態では、前記インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質は、配列番号５、配列番号７、または配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号５、配列番号７、または配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる。

本願のいくつかの実施形態では、本願は、以下の配列番号４に示されるインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質（ＩＬ２９ＤＥ）を提供する。
ＭＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＥＧＮＬＣＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ

本願のいくつかの実施形態では、本願は、以下の配列番号５に示される２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質（ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳ）を提供する。
ＭＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＥＧＮＬＳＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ（配列番号５）

本願のいくつかの実施形態では、本願は、以下の配列番号６に示される２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質（ＩＬ２９ＤＳ）を提供する。
ＭＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＳＧＮＬＣＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ（配列番号６）

本願のいくつかの実施形態では、本願は、以下の配列番号７に示される２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質（ＩＬ２９ＤＳ＋ＣＳ）を提供する。
ＭＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＳＧＮＬＳＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ（配列番号７）

本願のいくつかの実施形態では、本願は、以下の配列番号８に示される２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質（ＩＬ２９ＧＡ）を提供する。
ＭＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＤＡＮＬＣＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ（配列番号８）

本願のいくつかの実施形態では、本願は、以下の配列番号９に示される２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質（ＩＬ２９ＧＡ＋ＣＳ）を提供する。
ＭＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＤＡＮＬＳＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ（配列番号９）

上述のインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質のいくつかの実施形態では
、前記インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質は、タンパク質の精製を促進する短い配列（例えば、６個のヒスチジンの短い配列）、または半減期を延長する短いアミノ酸配列をさらに含む。

いくつかの実施形態では、本出願は、Ｎ末端またはＣ末端で他のポリペプチドまたはタンパク質に融合されたインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質の融合タンパク質に関する。例えば、ヒトアルブミン、トランスフェリン、ヒトＩｇＧ分子のＦｃ部分などと融合して融合タンパク質を形成し、インビボでのタンパク質の半減期を延長することができる。前記インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質はまた、薬剤の予防および／または治療効果を改善するために、異なる標的を標的とする他のタンパク質と融合して組み合わせた予防および／または治療効果を発揮することができる。例えば、ＤＡＳ１８１と融合させて、本発明の変異体タンパク質のウイルス予防および／または治療活性を増強することができる。ＤＡＳ１８１は、独自の宿主指向アプローチを利用して、ヒト気道のシアル酸受容体を切断することにより、呼吸器ウイルス感染をブロックする。これらの受容体はほとんどの主要な呼吸器ウイルスに結合し、患者に感染を引き起こす。ＤＡＳ１８１は、インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、メタニューモウイルス（ＭＰＶ）、及びヒトエンテロウイルス６８（ＥＶ－６８）を含む４つの主要な呼吸器系ウイルスに対する抗ウイルス活性を示している。

いくつかの実施形態では、本願は、ポリアルコキシ化合物にコンジュゲートされている、インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質のコンジュゲートに関する。前記ポリアルコキシ化合物は例えば、線状または分岐ポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、具体的にはモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧプロピオンアルデヒド）、例えば、２０ｋＤ、３０ｋＤまたは４０ｋＤのｍＰＥＧプロピオンアルデヒドである。インターロイキン２９変異体タンパク質をＰＥＧで修飾してコンジュゲートを形成するプロセスは、ＰＥＧ化と呼ばれる。本願における変異体タンパク質のＰＥＧ化は、アシル化反応またはアルキル化反応を使用するなど、当技術分野で知られているＰＥＧ化方法のいずれかによって実施することができる。タンパク質の治療的半減期は、全体のサイズを大きくする１つまたは複数のＰＥＧをタンパク質にコンジュゲートすることによって人為的に増加させることができ、インビボでの急速な分解を回避することができる。

いくつかの実施形態では、本出願は、上記のタンパク質または融合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドに関する。

いくつかの実施形態では、本願は、上記のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。簡単に言えば、インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入することによって、ポリヌクレオチドがマルチクローニングサイトに作動可能に連結されて対応するタンパク質を発現する。

上記のベクターとしては、ｐＥＴ－３ａ、ｐＥＴ－９ａ、ｐＥＴ－１１ａ、ｐＥＴ－１４ｂ、ｐＥＴ－１５ｂ、ｐＥＴ－１６ｂ、１７ｂ、１９ｂ、２０ｂ、２１ａ、２２ｂ、２３ａ（＋）、２４ａ、２５ｂ（＋）、２６ｂ（＋）、２７ｂ（＋）、２８ａ（＋）、２９ａ（＋）、３０ａ（＋）、３１ｂ（＋）、３２ａ（＋）、３９ｂ（＋）、４０ｂ（＋）、４１ａ（＋）、４２ａ（＋）、４３．１ａ（＋）、４４ｂ、４５ｂ、４７ｂ、４８ｂ、４９ｂ（＋）、５０ｂ（＋）、５１ｂ（＋）、５２ｂ（＋）などのｐＥＴシリーズのベクター；ｐＭａｌ－ｃ２Ｘ、ｐＭａｌ－ｃ５ＸなどのｐＭａｌシリーズのベクター；ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６Ｐ－２などのｐＧＥＸシリーズのベクター；ｐＲＳＥＴＡ、Ｂ、ＣなどのｐＲＳＥＴシリーズのベクター；ｐＴｒｃＨｉｓＡ、Ｂ、ＣなどのｐＴｒｉｃＨｉｓシリーズのベクターが挙げられる。好ましくは、前記ベクターはｐＥＴ－３０
ａ（＋）である。

いくつかの実施形態では、本願は、上記のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、本発明のＩＬ２９変異体タンパク質を発現するために使用される。宿主細胞とは、例えば、形質転換または形質導入によって外来遺伝子を受け取った受容体細胞を指す。一般的な宿主細胞は、原核受容体細胞および真核受容体細胞を含む。本願は、その宿主細胞として原核受容体細胞が好ましい。ここで、前記宿主細胞は、大腸菌コンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳまたはＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳである。好ましくは、前記宿主細胞は大腸菌コンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）である。

一部の実施形態において、本願は、上記のＩＬ２９変異体タンパク質、その融合タンパク質、またはそのコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物に関する。

前記医薬組成物は、注射剤、錠剤、カプセル剤、吸入剤、坐剤などの形態をとることができる。好ましくは、前記医薬組成物は、噴霧吸入器、定量吸入器、乾燥粉末吸入器などの吸入装置によって投与される乾燥粉末吸入剤や液体吸入剤などの吸入剤であり、例えば、ネブライザー、エアロゾル、ソフトミストおよびスプレーなどである。

いくつかの実施形態では、本願のＩＬ２９変異体タンパク質、融合タンパク質、またはコンジュゲートを含む医薬組成物は、様々な呼吸器ウイルス感染の予防および／または治療のための肺投与に適した担体も含む。

いくつかの実施形態では、本願のＩＬ２９変異体タンパク質、融合タンパク質、またはコンジュゲートを含む医薬組成物は、新規コロナウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防および／または治療のための肺投与に適した担体も含む。

いくつかの実施形態では、本出願は、インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質を調製する方法に関し、この方法は、上記のインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を宿主細胞に導入して宿主細胞において前記インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質を発現させること、例えば、前記核酸を発現ベクターに挿入すること；前記ベクターを宿主細胞（例えば、大腸菌）に移して、前記変異体タンパク質を対応的に発現する宿主細胞（操作細菌）を得ること；前記宿主細胞（操作細菌）を培養（例えば発酵）し、前記宿主細胞（操作細菌）における前記変異体タンパク質の発現を誘導すること；前記変異体タンパク質を収穫することを含む。

いくつかの実施形態では、上記の方法は、前記収穫した変異体タンパク質を精製するおよび／または変異体タンパク質を再生することをさらに含む。

図１は、実施例２のＩＬ２９変異体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である（図１の左から右へ、レーン１～４は、順にＩＬ２９コントロール、ＩＬ２９ＤＥ、ＩＬ２９ＤＳ、およびＩＬ２９ＧＡである）。図２は、実施例２のＩＬ２９変異体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である（図２では、レーン１～４は、順にＩＬ２９ＣＳ、ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳ、ＩＬ２９ＤＳ＋ＣＳ、ＩＬ２９ＧＡ＋ＣＳである）。図３は、ＩＬ２９コントロールの安定性逆相高速液体クロマトグラフィー純度（逆相高性能液相純度）スペクトラムである（メインピークの含有量が高いのは０日測定曲線を表し、メインピークの含有量が低いのは１４日の曲線を表している）。図４は、ＩＬ２９ＤＥの安定性逆相高速液体クロマトグラフィー純度（逆相高性能液相純度）スペクトラムである（メインピークの含有量が高いのは０日測定曲線を表し、メインピークの含有量が低いのは１４日の曲線を表している）。図５は、ＩＬ２９ＤＳの安定性逆相高速液体クロマトグラフィー純度（逆相高性能液相純度）スペクトラムである（メインピークの含有量が高いのは０日測定曲線を表し、メインピークの含有量が低いのは１４日の曲線を表している）。図６は、ＩＬ２９ＧＡの安定性逆相高速液体クロマトグラフィー純度（逆相高性能液相純度）スペクトラムである（メインピークの含有量が高いのは０日測定曲線を表し、メインピークの含有量が低いのは１４日の曲線を表している）。図７は、ＩＬ２９ＣＳの安定性逆相高速液体クロマトグラフィー純度（逆相高性能液相純度）スペクトラムである（メインピークの含有量が高いのは０日測定曲線を表し、メインピークの含有量が低いのは１４日の曲線を表している）。図８は、ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳの安定性逆相高速液体クロマトグラフィー純度（逆相高性能液相純度）スペクトラムである（メインピークの含有量が高いのは０日測定曲線を表し、メインピークの含有量が低いのは１４日の曲線を表している）。図９は、ＩＬ２９ＤＳ＋ＣＳの安定性逆相高速液体クロマトグラフィー純度（逆相高性能液相純度）スペクトラムである（メインピークの含有量が高いのは０日測定曲線を表し、メインピークの含有量が低いのは１４日の曲線を表している）。図１０は、ＩＬ２９ＧＡ＋ＣＳの安定性逆相高速液体クロマトグラフィー純度（逆相高性能液相純度）スペクトラムである（メインピークの含有量が高いのは０日測定曲線を表し、メインピークの含有量が低いのは１４日の曲線を表している）。図１１は、ＩＬ２９変異体の噴霧安定性実験におけるエアロゾル収集装置の図である。図１２は、ＲＳＶ感染マウスモデルにおけるリバビリンおよび異なる投薬計画下でのＩＬ２９変異体のインビボ効果の結果を示す図である。図１３は、ＲＳＶ感染コトンラットモデルにおけるリバビリンおよび異なる投薬計画下でのＩＬ２９変異体のインビボ効果の結果を示す図である。図１４は、インフルエンザウイルス感染マウスの治療後の体重変化を示す図である。図１５は、インフルエンザウイルス感染マウスの治療後の生存率の変化を示す図である。図１６は、マウスにおける肺細気管支および肺細動脈損傷の病理学的変化を示す図であり、ここで、Ａ：群１、Ｂ：群２、Ｃ：群３、Ｄ：群４、Ｅ：群５である。図１７は、マウスの肺胞損傷の病理学的変化を示す図であり、ここで、Ａ：群１、Ｂ：群２、Ｃ：群３、Ｄ：群４、Ｅ：群５である。図１８ａは、マウスの肺の各部分における病理学的損傷スコアの統計図であり、群１と比較して、＊＊＊Ｐ＜０．００１；群２と比較して、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１である。図１８ｂは、マウスの肺の各部分における病理学的損傷スコアの統計図であり、群１と比較して、＊＊＊Ｐ＜０．００１；群２と比較して、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１である。図１８ｃは、マウスの肺の各部分における病理学的損傷スコアの統計図であり、群１と比較して、＊＊＊Ｐ＜０．００１；群２と比較して、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１である。図１９は、Ｖｅｒｏ細胞に対する異なる濃度のＩＬ２９変異体の毒性効果を示す図である。図２０は、予防群、治療群、及び陽性対照群における新型コロナウイルスの阻害レベルを示す図である。図２１は、新型コロナウイルスに感染したＶｅｒｏ細胞に対する、予防群におけるさまざまな濃度の試験薬の阻害効果を示す図である。図２２は、新型コロナウイルスに感染したＶｅｒｏ細胞に対する、治療群における異なる濃度の試験薬の阻害効果を示す図である。図２３は、新型コロナウイルスに感染したＶｅｒｏ細胞に対する、異なる濃度のレムデシビルの阻害効果を示す図である。

［発明の詳細な説明］
本願は、インターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質、前記変異体タンパク質を含む融合タンパク質またはコンジュゲート、前記変異体タンパク質の調製方法、ならびにウイルス感染症、腫瘍疾患、呼吸窮迫症候群の予防及び／または治療における前記変異体タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート、または医薬組成物の使用を提供する。本発明者らは、複数の変異部位をスクリーニングし、最終的に、本出願によって提供されるＩＬ２９変異体タンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の不活性中心部位の１６１番目のＤがＥに変異した後、または原核細胞（例えば、大腸菌）において発現して得られた配列番号１の変異体タンパク質の１６２番目のＤがＥに変異した後、得られたＩＬ２９変異体タンパク質の活性は、野生型ＩＬ２９と比較して予想外に約３倍増加し、且つより安定しており、既存の抗ウイルスタンパク質薬の低活性、安定性不良、および深刻な副作用などの問題を解決できることを発見した。

［定義］
「組換え発現ベクター」または「ベクター」という用語は、目的のポリペプチドをコードするフラグメントを含む線状または環状のＤＮＡ分子を指すために使用され、そのフラグメントは、その転写を担う追加のフラグメントに作動可能に連結されている。これらの追加のフラグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含み、また、１つまたは複数の複製起点、１つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどをさらに含むことができる。発現ベクターは通常、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来するか、または両方のエレメントを含む場合がある。

「ポリヌクレオチド」は、５’末端から３’末端までリーディングするデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。ポリヌクレオチドはＲＮＡ及びＤＮＡを含み、天然源から単離したり、インビトロで合成したり、天然分子と合成分子を組み合わせたりすることで調製できる。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（略して「ｂｐ」）、ヌクレオチド（「ｎｔ」）、またはキロベース（「ｋｂ」）で表される。後者の２つの用語は、文脈が許せば、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドを表す場合がある。ポリヌクレオチドおよび核酸は、本発明において交換可能に使用される。

「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを指し、天然または合成によって生成され得る。本出願において、ポリペプチド、タンパク質、およびタンパク質は交換可能に使用される。

「変異」タンパク質は、野生型タンパク質のアミノ酸配列が改変され、例えば、遺伝子工学方法によって野生型タンパク質のアミノ酸配列を突然変異させることによって得られるタンパク質を指す。本出願において、「変異タンパク質」、「変異体タンパク質」または「変異体」は同じ意味を表し、交換可能に使用することができる。

「薬学的に許容される」または「薬理学的に適合する」とは、生物学的またはその他の
点で望ましくない物質ではないことを意味し、例えば、重大な有害な生物学的反応を引き起こすことなく、または有害な方法で組成物に含まれる他の成分と相互作用することなく、患者に投与される医薬組成物に組み込むことができる物質を意味する。薬学的に許容される担体または賦形剤は、好ましくは、毒物学または製造試験に必要な基準を満たし、および／または米国食品医薬品局によって作成された不活性成分ガイドラインに含まれているものである。

本願のいくつかの実施形態では、治療有効量の本発明のインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質を被験者に提供することを含む、被験者におけるウイルス感染を予防および／または治療する方法が提供される。

本願のいくつかの実施形態では、被験者に治療有効量の本発明のインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質を提供することを含む、腫瘍を予防および／または治療する方法が提供される。

本願のいくつかの実施形態では、治療有効量の本発明のタンパク質のインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体を被験者に提供することを含む、被験者における呼吸窮迫症候群を予防および／または治療もしくは改善する方法が提供される。

本願のいくつかの実施形態では、被験者に治療有効量の本発明のインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質を提供することを含む、新型コロナウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防および／または治療する方法が提供される。

本明細書で使用される「治療する」という用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。前記効果は、疾患の完全もしくは部分的な予防またはその症状の発症や発作の完全もしくは部分的な予防、疾患および／またはその症状の部分的または完全な緩和、および／または疾患および／またはその症状の部分的または完全な治癒であり得、これは、（ａ）疾患の素因を有する可能性があるが、疾患と診断されていない被験者における疾患の発生または発症を予防すること；（ｂ）疾患を阻害する、すなわち、その発症をブロックすること；及び（ｃ）疾患および／またはその症状を緩和する、すなわち、疾患および／またはその症状を鎮静または消失させることを含む。

本出願における「被験者」という用語は、マウス（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。

「治療有効量」または「有効量」とは、疾患を治療するために哺乳動物または他の被験者に投与された場合に、疾患の予防および／または治療を実現するのに十分な量を指す。「治療有効量」は、使用される薬剤、治療される被験者の疾患および／またはその症状の重症度、ならびに年齢や体重などに応じて変化する。当業者は、様々なパラメータ、特に治療される被験者の年齢、体重および状態、疾患または状態の重症度、および投与経路に基づいて、本発明のタンパク質または組成物の適切な治療有効量及び投与頻度を容易に決定することができる。投与経路は、経腸、局所、座薬、吸入、および皮下、筋肉内、または静脈内注射などの非経口投与を含むが、これらに限定されない。

インターロイキン２９（ＩＬ２９）タンパク質活性の一般的な検出方法には、細胞変性法とレポーター遺伝子法がある。

細胞変性法とは、ヒト網膜色素上皮細胞ＡＲＰＥ－１９を使用し、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）で感染させ、クリスタルバイオレット染色の比色法を使用して、ＩＬ２９に
よる細胞の保護の程度を評価し、さらにＩＬ２９の活性を評価することを指す（ＫｏｔｅｎｋｏＳｅｒｇｅｉＶ，ＧａｌｌａｇｈｅｒＧｒａｎｔ，ＢａｕｒｉｎＶｉｔａｌｉｙＶｅｔａｌ．ＩＦＮ－ｌａｍｂｄａｓｍｅｄｉａｔｅａｎｔｉｖｉｒａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈａｄｉｓｔｉｎｃｔｃｌａｓｓＩＩ
ｃｙｔｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｃｏｍｐｌｅｘ．［Ｊ］．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，４：６９－７７）。

レポーター遺伝子法は、ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎＲｅｓｐｏｎｓｅＥｌｅｍｅｎｔ（ＩＳＲＥ）プロモーターをアルカリフォスファターゼｃＤＮＡに結合させ、それをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、ＩＬ２９で刺激した後、ＨＥＫ２９３血球の上清中のアルカリフォスファターゼを測定することによってＩＬ２９の活性を評価する方法である（ＬａＦｌｅｕｒＤＷ，ＮａｒｄｅｌｌｉＢ，ＴｓａｒｅｖａＴｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｋａｐｐａ，ａｎｏｖｅｌｔｙｐｅＩｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｈｕｍａｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．［Ｊ］．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６：３９７６５－７１）。

インターロイキン２９（ＩＬ２９）タンパク質の安定性を検出する方法も多数ある。例えば、逆相高性能液相クロマトグラフィーは、疎水性および極性の異なる不純物を分析するために使用でき、イオン交換高速液体クロマトグラフィーは、電荷差の大きい不純物の分離に使用され、モレキュラーシーブ排除クロマトグラフィーはダイマー、ポリマー、モノマーの分析に使用される。各検出方法は焦点が異なるが、いずれもタンパク質の純度を特徴付け、そのタンパク質の安定性を判断するために使用できる。

以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
［実施例］

［実施例１ＩＬ２９変異体タンパク質の調製］
１．１変異体タンパク質発現操作細菌の構築
ＩＬ２９変異体タンパク質遺伝子フラグメント配列番号１１～１７を化学合成により得、ＮｏｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位を介して上記フラグメントを原核細胞発現プラスミドｐＥＴ－３０ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入し、シーケンシングして検証した。形質転換アッセイに使用するための発現プラスミドを得た。上記で得られた標的遺伝子を含むプラスミドを使用して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、５０μｌのＢＬ２１コンピテント細胞を氷浴で解凍し、プラスミドを加えて穏やかに振とうし、氷浴に３０分間放置した。次に、４２℃の水浴で３０秒間ヒートショックを与え、遠心管を振らずに、遠心管を氷浴にすばやく移して２分間放置した。５００μｌの無菌ＬＢ培地（抗生物質を含まない）を遠心管に加え、均一に混合し、３７℃に置き、１８０ｒｐｍで１時間インキュベートして細菌を蘇生させた。２００μｌの形質転換されたコンピテント細胞をカナマイシン耐性のＬＢ寒天含有培地プレートにピペットで移し、細胞を均一に広げた。液体が吸収されるまでプレートを３７℃に置き、プレートを反転させ、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、接種ループを使用して形質転換プレートのモノクローナルコロニーをピックアップし、１５ｍｌの無菌ＬＢ培地（カナマイシン含有）に接種し、３０℃で一晩培養した。

１．２ＩＬ２９変異体タンパク質の発現および精製
ＬＢ培地５０ｍｌに上記菌の菌液５０μｌを加え、同時にカナマイシン５０μｌを加えて均一に混和し、３０℃の恒温振とう器に入れ、一晩接種した。一晩接種した菌液１０ｍｌをＬＢ培地１０００ｍｌに加え、同時にカナマイシン１０００μｌを加えた。均一に振とうし、３７℃のシェーカーに入れ、２００ｒｐｍで菌液のＯＤ６００まで０．４～０．
６時間をかけて培養し、最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを加えて誘導し、４時間培養し続けて細菌を収集した。発現したＩＬ２９変異体は、主に封入体の形で、総細菌タンパク質の約３０～５０％を占めた。
発酵した菌体をＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）溶液（ｍ：Ｖ＝１：１０）で３回洗浄し、６０Ｍｐａの高圧ホモジナイズ・破砕し、ホモジナイズした後、顕微鏡で細菌の破砕率を検査した。菌体の破砕率が約９５％（約２～３回の菌破砕）になったら、８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、破砕した菌体ペレットを収集した。破砕した菌体ペレットをビーカーに入れ、封入体洗浄液（１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋１ｍＭＥＤＴＡ＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、ｐＨ６．５、ｍ：Ｖ＝１：１０）を加え、マグネチックスターラーで３０分間攪拌し、３～５回洗浄した。封入体を封入体溶解緩衝液（７Ｍ塩酸グアニジン＋５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ＋１０ｍＭＤＴＴ、ｐＨ６．５、ｍ：Ｖ＝１：１０）で溶解し、室温で一晩撹拌した。溶解したタンパク質を、タンパク質最終濃度が０．２ｍｇ／ｍｌになるように再生溶液（１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５Ｍアルギニン、０．５％ＰＥＧ３３５０（ｍ：Ｖ）、２ｍＭＧＳＨ：０．５ｍＭＧＳＳＧ、ｐＨ８．５）にゆっくりと加えて、室温で一晩撹拌した。
再生溶液を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収した。ポアサイズ１０ｋＤａの限外濾過膜パックを用い、２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で限外濾過膜を平衡化した後、上清１Ｌを１０倍に濃縮した。ロードするために濃縮液を５倍の量の注射用水で希釈し、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ充填剤をカラムに充填し、５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌで平衡化し、サンプルをロードした。そして、５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌで溶出し、溶出ピーク画分を回収し、最終的に６００ｍｌのサンプル溶液を回収した。ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ充填剤をカラムに充填し、検出器のベースラインが安定するまで、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩、ｐＨ７．４、０．０５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌで平衡化し、サンプルをロードした。２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩、ｐＨ７．４、０．２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌで洗浄し、溶出ピーク画分を回収した。
それぞれＩＬ２９ＤＥ、ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳ、ＩＬ２９ＤＳ、ＩＬ２９ＤＳ＋ＣＳ、ＩＬ２９ＧＡ、ＩＬ２９ＧＡ＋ＣＳ、ＩＬ２９ＣＳと名付けられた、タンパク質アミノ酸配列番号４～１０に対応する７つのＩＬ２９突然変異体タンパク質（略してＩＬ２９変異体）を得た。
同時に、タンパク質アミノ酸配列番号１に対応し、Ｎ末端にＭアミノ酸が付加されたＩＬ２９野生型タンパク質（ＩＬ２９コントロールと略称）も上記と同様の方法で合成した。

［実施例２得られたＩＬ２９変異体の各種指標の検出］
２．１ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動による得られたＩＬ２９変異体の分子量および純度の検出：
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動ローディングバッファーを用い、メルカプトエタノールを添加した場合はマーカーおよび上記で得られたタンパク質１０μｇをそれぞれローディングして電気泳動し、電気泳動条件は２００Ｖ定電圧、４５分とした。クーマシーブリリアントブルーＧ－２５で染色してタンパク質の分子量及び純度を検出した。結果を図１と２に示す。
図１と２から、ＩＬ２９変異体タンパク質及びコントロールの分子量がそれぞれ２０ｋＤａであることがわかる。これは、得られた標的タンパク質が正しく、１つのバンドだけがあり、他の不純物バンドがなく、純度が１００％に達することができることを示している。

２．２クロマトグラフィーによるＩＬ２９変異体のインビトロＲＰ－ＨＰＬＣ純度の検出
２．２．１逆相液相クロマトグラフィー
アセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸の体積比２０：８０：０．１で移動相Ａを調製し、アセトニトリル：水：イソプロパノール：トリフルオロ酢酸の体積比７０：２０：１０：０．１で移動相Ｂを調製し、クロマトグラフィーカラム（ＸＢｒｉｄｇｅＢＥＨＣ１８カラム、１３０Ａ、５μｍ、４．６ｍｍ＊１００ｍｍ）を使用して、各タンパク質試験サンプルを分析した。分析条件は、流速１．０ｍｌ／分、捕集時間６５分、捕集波長２１４ｎｍ、カラム温度４５℃であり、溶出勾配は下記表１の通りである。

試験サンプル原液を２回並行して注入し、注入量をサンプル濃度に応じて設定し、注入量を１５μｇ～２０μｇとし、最終的に、試験サンプルのメインピーク純度を面積正規化法に従って積分することによって計算した。
２．２．２イオン交換クロマトグラフィー
移動相Ａを、２５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．０、移動相Ｂを、２５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムｐＨ６．７）で調製し、クロマトグラフィーカラム（ＴｈｅｒｍｏＰｒｏＰａｃＷＣＸ－１０４．０×２５０ｍｍ）を使用し、各タンパク質試験サンプルを分析した。分析条件は、流速０．８ｍｌ／分、捕集時間５５分、捕集波長２１４ｎｍ、カラム温度２５℃であり、溶出勾配は下記表２の通りである。

注入量は２０μｇとし、試験サンプルの並行な２回のメインピーク純度を面積正規化法に従って積分することによって計算した。

２．３レポーター遺伝子法によるＩＬ２９変異体のインビトロ細胞生物学的活性の測定
ＨＥＫ２９３－ＩＳＲＥ－Ｌｕｃ細胞（中国国家食品医薬品管理研究所から購入）を、完全培地で壁に付着して増殖させた。週に２～３回、１：４で継代し、完全培地で増殖させた。培養細胞を取り、培養液を捨て、ＰＢＳで１回洗浄後、細胞を消化・回収し、アッセイ培地（ＢＩＢＣＯ）を用いて、１ｍｌあたり３．５×１０^５～４．５×１０^５個の細胞を含む細胞懸濁液を調製した。調製したＩＬ２９変異体タンパク質とＩＬ２９コントロールを、細胞培養および化学発光マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）読み取りに使用できる９６ウェルプレートに移し、各ウェルに１００μｌを加え、上記の細胞懸濁液を同一の９６ウェルプレートに接種し、各ウェルに１００μｌを
加えた。３７℃、５％二酸化炭素の条件で１９～２３時間インキュベートした。９６ウェルプレートの上清を慎重に吸引し、ルシフェラーゼ検出キット（Ｂｒｉｇｈｔ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）の取扱説明書に従って細胞ライセート及びルシフェラーゼ基質を加え、化学発光マイクロプレートリーダーを使用して測定し、ＩＬ２９変異体及びＩＬ２９コントロールのＥＣ_５０値をそれぞれ記録した。その相対生物学的活性は、ＩＬ２９コントロールを基準として、その０ポイントの活性を「１００％」と定義し、相対生物学的活性＝ＩＬ２９コントロールＥＣ５０（０ポイント）／ＩＬ２９変異体ＥＣ５０によって計算した。
ＩＬ２９変異体の各試験サンプルのＥＣ５０を測定し、ＩＬ２９コントロールを対照物質として使用して、各変異体の相対生物学的活性を計算した。具体的な結果を以下の表３に示す。

以上のことから、ＩＬ２９の１６２番目のＤはＩＬ２９受容体に結合する活性中心に位置していないにもかかわらず、予想外に単一変異ＩＬ２９ＤＥのＥＣ５０がわずか１．６９７であることが実験により分かった。これは、ＩＬ２９コントロールの４．７８３よりも遥かに低く、生物学的活性は３倍近く増加したに対して、他の単一変異部位の変異体ＩＬ２９ＤＳ、ＩＬ２９ＧＡ、ＩＬ２９ＣＳは、ＩＬ２９コントロールと比較してＥＣ５０／生物学的活性に基本的には変化がなかった。二重変異のＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳは、ＩＬ２９の１６２番目のＤ変異に加えて１６６番目のＣがＳに変異し、単一変異のＩＬ２９ＤＥよりもその生物学的活性がさらに向上しているが、二重変異のＩＬ２９ＤＳ＋ＣＳおよびＩＬ２９ＧＡ＋ＣＳ変異体は、ＩＬ２９コントロールと比較して生物学的活性が有意に改善しなかった。この結果は、ＩＬ２９受容体に結合する活性中心に位置しない１６２番目のＤからＥへの変異が、変異後のタンパク質の生物学的活性を改善するという予想外の効果を有することを示している。

［実施例３ＩＬ２９変異体の５０℃安定性の測定結果］
本願におけるタンパク質の安定性は、主に逆相高速液体クロマトグラフィー純度（逆相高性能液相純度）によって特徴付けられる。
５０℃±２℃／７５％相対湿度±５％相対湿度の条件下で、表４に準じてサンプリング
し、ＩＬ２９変異体の各試験サンプルの逆相高性能液相純度を実施例２の２．２．１と同じ方法で測定し、ＩＬ２９変異体の各試験サンプルの生物学的活性を実施例２の２．３と同じ方法で測定した。詳細については表５を参照されたい。また、図３～１０に示すように、表５の０日目と１４日目の純度値のクロマトグラムを比較した。

上記の表５および図３～１０の結果からわかるように、純度が最も低下した２つの試験サンプルは、それぞれＩＬ２９コントロールとＩＬ２９ＣＳであり、ＩＬ２９コントロールの純度は１４日以内に８５．８２％から３４．４６％に急激に低下し、低下率は５１．３６％と高く、ＩＬ２９ＣＳの純度は１４日以内に９７．０３％から４６．２０％に急激に低下し、低下率は５０．８３％と高かった。低下が最小の２つの試験サンプルはＩＬ２９ＤＥおよびＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳであり、そのうちＩＬ２９ＤＥの純度は１４日以内に９２．６８％から７７．３９％に低下し、低下率はわずか１５．２９％であり、ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳの純度は１４日以内に９７．２２％から８６．６６％に低下し、低下率はさらに小さく、１０．５６％にすぎなかった。他の単一点変異体ＩＬ２９ＤＳおよびＩＬ２９ＧＡの純度は、１４日以内にそれぞれ２４．２２％および１９．６５％低下し、他の二重点変異体ＩＬ２９ＤＳ＋ＣＳおよびＩＬ２９ＧＡ＋ＣＳの純度は１４日以内にそれぞれ１８．２５％および１４．９７％低下した。
上記の結果から、１６２位部位のＤからＥへの変異を含む単一点変異体のうちＩＬ２９
ＤＥが最も安定しており、１４日以内の純度の低下が最も小さいと推測できる。さらに、ＩＬ２９ＣＳの安定性はＩＬ２９ＤＥの安定性よりもはるかに小さいため、従来の推論によれば、二重点変異体ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳの安定性はＩＬ２９ＤＥの安定性よりも低い可能性があり、本発明におけるＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳの安定性はＩＬ２９ＤＥよりもはるかに高く、これは、二重点同時変異が、変異体の安定性を向上させる相乗効果を有することを示している。同時に変異体の生物学的活性を検出したところ、変異体ＩＬ２９ＤＥおよびＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳの生物学的活性はほとんど１４日以内に変化しないことがわかった。

［実施例４ＩＬ２９変異体の２５℃光安定性試験結果］
２５℃±２℃／６０％相対湿度±５％相対湿度／５０００±５００ルクスの条件下で、表６に示すようにサンプリングし、ＩＬ２９変異体の安定性を実施例２と同様の方法で測定した。結果を表７に示し、ＩＬ２９ＣＳをコントロールとした。

上記の結果から、ＩＬ２９変異体ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳの安定性は、２５℃の光条件下でＩＬ２９ＣＳよりも優れていることが分かった。

［実施例５ＩＬ２９各変異体の霧化安定性実験］
霧化実験は、ドイツのＰＡＲＩＬＣＤタイプのジェットネブライザー及びＴｕｒｂｏＢＯＹＮネブライザーポンプを使用して実施し、合計２ｍｌのサンプルを霧化し、エアロゾルを以下の図１１に示す方法で収集し、収集したサンプルについて、実施例２の２．２．１と同じ方法を用いて、ＩＬ２９変異体の各試験サンプルの逆相高性能液相純度測定を行い、各変異体の霧化安定性を確認した。このうち、ＩＬ２９ＣＳをコントロールとして使用し、その結果を下記表８に示す。

上記の表の結果から、ＩＬ２９変異体ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳおよびＩＬ２９ＧＡ＋ＣＳの純度は霧化後に約３％しか減少せず、ＩＬ２９ＤＳ＋ＣＳの純度は霧化後に８．１％減少し、また、ＩＬ２９ＣＳの純度は霧化後に大幅に低下し、実際には１１％近く低下したことがわかる。これから見ると、ＩＬ２９変異体の霧化安定性は、ＩＬ２９ＣＳと比較して大幅に増強され、特に、ＩＬ２９変異体ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳおよびＩＬ２９ＧＡ＋ＣＳは、霧化後の安定性が特に良好であり、エアロゾル吸入製剤の調製に特に適している。

［実施例６ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）のＲＳＶ感染に対するＩＬ２９変異体のインビトロ効果の測定］
ＨＢＥＣ（ｈｕｍａｎｂｒｏｎｃｈｉａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ，ヒト気管支上皮細胞）の細胞分化（ＣｅｌｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が完了した後、２倍希釈したＩＬ２９変異体（ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳ）および陽性対照薬（ＢＭＳ－４３３７７１、ＳｈａｎｇｈａｉＷｕＸｉＡｐｐＴｅｃより提供され、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質阻害剤）を分化したＨＢＥＣ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターでインキュベートした。呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ、ＳｈａｎｇｈａｉＷｕＸｉＡｐｐＴｅｃ提供）を感染の２４時間前、感染の１時間後および２４時間後に接種し、力価１００ＴＣＩＤ５０（組織培養感染量の半分）のＲＳＶを活性試験ウェルの各ウェルに添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで３日インキュベートした後、ＲＮＡ抽出キット（カタログ番号７４１８１、Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＳＶＲＮＡを細胞から抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲで定量した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して、化合物の用量反応曲線を分析し、ＥＣ_５０値及び平均静菌率を計算した。結果を表９および表１０に示す。

その結果、ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳは、ヒト気管支上皮細胞のインビトロモデルで優れた抗ＲＳＶ効果を示し、ＥＣ_５０は０．１３ｎｇ／ｍｌ（６．５ｐＭ）であり、対照薬の１／１０００００であり、対照薬よりはるかに低かった。

［実施例７ＲＳＶ感染マウスモデルにおけるＩＬ２９変異体のインビボ有効性の測定］
０日目に、すべてのマウス（メス、６～７週齢、１６～１８ｇ、特定病原体フリー（ＳＰＦ）グレードのＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳｈａｎｇｈａｉＷｕＸｉＡｐｐＴｅｃ提供））にペントバルビタールナトリウム（７５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射により投与してマウスを麻酔した後、ＲＳＶ（ヒト呼吸器合胞体ウイルスＡ２（ＲＳＶ－Ａ２、ＢＥＩＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨＢｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから購入）を鼻腔内法で接種し、接種剤量は１．１×１０^５ＰＦＵ／匹であり、接種量は５０μＬであった。
０日目から３日目まで、表１１のスキームに従って動物に投与した。投与方法は、肺スプレーでマウスを麻酔した後、薬液で事前に満たされた液体ネブライザー装置（ＳｈａｎｇｈａｉＹｕｙａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入）のマイクロノズルカニューレをマウスの気管の適切な位置に軽く挿入し、ネブライザーの高圧プッシュデバイスのピストンを素早く押して、定量的な量の薬剤をマウスの肺に１日１回の頻度で噴霧した（参考文献ＪｏｓｅｐｈＤ．Ｂｒａｉｎ，ＤｗｙｎＥ．Ｋｎｕｄｓｏｎ，ＳｅｒｇｅｉＰ．Ｓｏｒｏｋｉｎ，ＭｉｃｈａｅｌＡ．Ｄａｖｉｓ，Ｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｐａｒｔｉｃｌｅｓｇｉｖｅｎｂｙｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎｏｒｂｙａｅｒｏｓｏｌｉｎｈａｌａｔｉｏｎ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｒｅｓｅａｒｃｈ１１，
Ｖｏｌｕｍｅ１１，Ｉｓｓｕｅ１，１９７６，Ｐａｇｅｓ１３－３３の投与計画）。感染後５日目は、インビボ実験の終点であり、すべての動物を安楽死させ、肺組織を採取してウイルス力価を検出した（プラークアッセイ）。結果を表１２と図１２に示す。

データによって明らかに、ＲＳＶが接種後にマウスの体内で大量に複製でき、陽性対照薬であるリバビリンはマウスにおけるＲＳＶの複製を有意に阻害し、インビボで予想される抗ＲＳＶ活性を示し、このモデル系の有効性を証明した。リバビリンの投与時点は、ウイルス感染の１時間前（予防モデル）であり、試験薬ＩＬ２９変異体は、設定されたアッセイ条件（ウイルス感染の１時間前、ウイルス感染の１時間後、およびウイルス感染の２４時間後）では、マウスにおけるＲＳＶウイルスの複製を有意に阻害することができ、初回投与群のマウスの肺組織におけるウイルス力価は、接種１時間前（１０μｇ）および接種１時間後（１０μｇ）で検出下限以下であり、インビボでの優れた抗ＲＳＶ効果を示した。感染後２４時間の投与群も良好な抗ＲＳＶ効果を示した。感染の１時間後に投与され
た治療モデルにおけるＩＬ２９変異体の抗ウイルス効果は、リバビリンを感染の１時間前に投与した予防モデルの結果に匹敵した。これはまた、ＩＬ２９変異体が非常に優れた抗ウイルス治療の可能性を持っていることを完全に示している。

［実施例８ＲＳＶ感染コットンラットモデルにおけるＩＬ２９変異体のインビボ有効性の測定］
０日目に、すべてのマウス（Ｓｉｇｍｏｄｏｎｈｉｓｐｉｄｕｓコトンラット、メスオス半分ずつ、５週齢、ＳＰＦグレード（Ｅｎｖｉｇｏから購入））にペントバルビタールナトリウム（７５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射により投与してマウスを麻酔した後、ＲＳＶ（ヒト呼吸器合胞体ウイルスＡ２（ＲＳＶ－Ａ２、ＢＥＩＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨＢｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから購入）を鼻腔内法で接種し、接種剤量は１．１×１０^５ＰＦＵ／匹であり、接種量は５０μＬであった。
０日目から３日目まで、表１３の測定スキームに従って動物に投与した。投与方法は、肺スプレーであり（参考文献ＪｏｓｅｐｈＤ．Ｂｒａｉｎ，ＤｗｙｎＥ．Ｋｎｕｄｓｏｎ，ＳｅｒｇｅｉＰ．Ｓｏｒｏｋｉｎ，ＭｉｃｈａｅｌＡ．Ｄａｖｉｓ，Ｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｐａｒｔｉｃｌｅｓｇｉｖｅｎｂｙｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎｏｒｂｙａｅｒｏｓｏｌｉｎｈａｌａｔｉｏｎ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｒｅｓｅａｒｃｈ１１，Ｖｏｌｕｍｅ１１，Ｉｓｓｕｅ１，１９７６，Ｐａｇｅｓ１３－３３の投与計画）、１日１回の頻度で投与した。２２Ｇ針付きの３ｍｌ注射器を気管に挿入し、２ｍＬの０．９％生理食塩水を肺に注入し、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を収集した。収集したＢＡＬＦを無菌の１．５ｍＬＥＰチューブに分注し、ドライアイスで凍結し、プラークアッセイ分析まで－８０℃で保存した。結果を表１４と図１３に示す。

表１４および図１３のデータより明らかに、ＲＳＶが接種後にコットンラットにおいて大量に複製でき、試験薬ＩＬ２９変異体が設定された条件下（接種の１時間後に投与された治療モデル）でマウスにおけるＲＳＶウイルスの複製を有意に阻害でき、初回投与群（群２、３、４）のコットンラットの気管支洗浄液中のウイルス力価は、接種後１時間（１μｇ）で対照群と比較して統計学的な差を持っており、３つの用量群（群２～４）は、用量に関連した関係を示し、インビボでの優れた抗ＲＳＶ効果を示した。コットンラットがＲＳＶに感染した後、ウイルスは肺の気管支で大量に複製され、気管支洗浄液のウイルス負荷量は、肺でのウイルス複製を非常によく反映する。したがって、ＩＬ２９変異体は、呼吸器合胞体ウイルスに対して非常に優れた治療の可能性を示している。

［実施例９新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏｖ）に対するＩＬ２９変異体のインビトロ有効性の測定］
濃度が５×１０^４細胞／ｍｌＶｅｒｏＥ６細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞株）２００μｌを無菌９６ウェル培養プレートの各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間培養した。試験薬ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳを１００ｎｇ／ｍｌに希釈し、５つの複製ウェルをセットし、各ウェルに１００μｌを加え、２４時間作用させた。力価１００ＴＣＩＤ５０／ｍｌのウイルス２０１９－ｎＣｏＶ（中国医学科学院医学実験動物研究所病原体センターにより－８０℃で保存、力価１０^５ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）１００μｌを各ウェルに加え、ブランク対照（溶媒対照）およびウイルス対照（陰性対照）を取り、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４～５日間インキュベートした。光学顕微鏡で細胞病変効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ、ＣＰＥ）を観察し、完全な細胞病変を「＋＋＋＋」、７５％の病変を「＋＋＋」、５０％の病変を「＋＋」、２５％の病変を「＋」、病変なしを「－」として記録した。
その結果、１００ｎｇ／ｍｌ（５ｎｍｏｌ／Ｌ）の濃度で、ＩＬ２９変異体の病変は「－」と記録され、ＶｅｒｏＥ６細胞を新型コロナウイルスの感染から１００％保護し、非常に優れた抗新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏｖ）感染効果を示した。

［実施例１０マウスにおけるインフルエンザウイルスに対するＩＬ２９変異体の有効性の測定］
表１５の投与計画に従って、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳｈａｎｇｈｉａＬｉｎｇｃｈａｎｇＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．提供）におけるインフルエンザウイルスのインビボ有効性を測定し、各群８匹のマウスとした。結果を図１４と１５に示す。

これから見ると、Ａ型インフルエンザウイルスＷＳＮ／３３のマウス感染モデルでは、感染後４８時間に投与された場合、ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳが感染マウスの生存期間を大幅に延長し、マウスを保護する役割を果たすことができる。

［実施例１１重度の呼吸窮迫症候群の治療におけるＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳのインビボ有効性］
Ｃ５７オスマウス（１８～２２ｇ、３０匹、ＳｈａｎｇｈａｉＬｉｎｇｃｈａｎｇＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．）を麻酔した後、皮膚を切って気管を露出させ、リポ多糖ＬＰＳ溶液（５０ｕｌ／匹、０．３ｍｇ／ｋｇ）を気管よりゆっくりと注射して急性肺疾患傷害モデルを複製した。モデリングの開始から測定の終了まで、合計２４時間、動物の体重及び健康状態を監視した。
表１６の投与スキームに従って、重度の呼吸窮迫症候群のマウスモデルにおけるデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，ＤＥＸ）およびＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳの有効性を測定した。モデリングの２４時間後にマウスを安楽死させ、肺組織を採取し、その後の病理学的検査のために固定した。結果を図１６－１８ａ－ｃに示す。

ＬＰＳ誘発マウス急性肺損傷モデルについての研究から明らかに、組織学的評価において、モデル群と比較して、ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳ噴霧および皮下投与群は、肺損傷および炎症を有意に軽減した治療効果を有する。

［実施例１２アフリカミドリザル腎細胞Ｖｅｒｏに対するＩＬ２９変異体の毒性効果］
Ｖｅｒｏ細胞培養システムでは、ＣＣＫ－８メソッドを使用して、Ｖｅｒｏ細胞に対するさまざまな濃度の抗体の毒性を検出した。
Ｖｅｒｏ細胞を９６ウェル培養プレートに５０００細胞／ウェルの濃度で播種し、細胞単層になるまで培養した後、培養液を捨て、Ｈａｎｋ’ｓ液で細胞を２回洗浄した。被験薬ＩＬ２９変異体ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳ及びレムデシビル（Ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ）を、それぞれ１０００ｎｍｏｌ／Ｌ（１９．６μｇ／ｍＬ）及び５０μｍｏｌ／Ｌの初期濃度から、ＭＥＭ培地で８つの濃度を連続して３倍段階希釈した。薬剤濃度ごとに３つの複製ウェルを設定し、各ウェルに１５０μＬの薬剤溶液を添加すると同時に、Ｖｅｒｏ細胞の通常の増殖対照ウェルを設定し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４８時間インキュベートした。次に、１５μＬのＣＣＫ－８試薬を各ウェルに添加し、３時間後に４５０ｎｍでのＯＤ値をマイクロプレートリーダーで測定し、細胞に対する薬剤の用量毒性効果および最大無毒性濃度を計算し、薬剤－細胞毒性反応曲線を描いた。
その結果、１０００ｎｍｏｌ／Ｌ（１９．６μｇ／ｍＬ）および１０００ｎｍｏｌ／Ｌ以下の濃度の試験薬ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳは、Ｖｅｒｏ細胞に対して明らかな毒性効果を持たず、細胞生存率は９０％を上回った。５０μｍｏｌ／Ｌおよび５０μｍｏｌ／Ｌ以下の濃度のレムデシビルも、Ｖｅｒｏ細胞に対して明らかな毒性効果はなく、細胞生存率は９０％を上回った。試験薬ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳＣＣ_５０＞１０００ｎｍｏｌ／Ｌ（１９．６μｇ／ｍＬ）、具体的には図１９に示すように、レムデシビルＣＣ_５０＞５０μｍｏｌ／Ｌであった。

［実施例１３新型コロナウイルスに対するＩＬ２９変異体のインビトロ阻害効果］
Ｖｅｒｏ細胞培養モデルでは、免疫蛍光法および核酸検出キット（蛍光ＰＣＲ法）を使用して、新型コロナウイルスに対するさまざまな濃度のＩＬ２９変異体の予防および治療効果を検出した。

２．１薬剤ウイルス混合液の調製
実験群：被験薬ＩＬ２９変異体ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳを、最高１００ｎｇ／ｍＬの濃度から、７つ濃度のサンプルを１０％ＦＢＳのＭＥＭ培地で連続して５倍段階希釈し、新型コロナウイルス株のウイルス液（浙江大学感染症の診断・治療の国家重点実験室に保管されており、ＴＣＩＤ５０は１０^－５．５／ｍＬである）とＭＯＩ＝１００の比率で混合した。
陽性対照群：レムデシビル陽性対照群を１０％ＦＢＳのＭＥＭ培地で１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭの６つの終濃度に希釈し、新型コロナウイルス株ウイルス液とＭＯＩ＝１００の比率で混合した。
ここで、本実験では予防モデル群と治療モデル群を設定し、Ｖｅｒｏ細胞を上記実験群のウイルスと混合する前の異なる濃度の被験薬ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳサンプルで２４時間予備処理したものをインビトロ予防モデル群とし、予備処理なしの細胞をインビトロ治療モデル群とした。

２．２実験プロセス
Ｖｅｒｏ細胞を１０，０００細胞／ウェルの濃度で４８ウェル培養プレートに播種し、細胞の対数増殖期まで培養した。予防群、実験群、陽性対照群、陰性対照群（ウイルス溶液のみを添加）、単純細胞群（ウイルスなし）に分け、各サンプルについて３つの複製ウェルを設けた。
予防群の細胞培地をきれいに吸引し、異なる濃度の被験薬ＩＬ２９ＤＥ＋ＣＳサンプルを１ウェルあたり５００μＬ添加した。残りの細胞は未処理のまま、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。次に、４つの群の細胞培地をきれいに吸引し、上記で調製した薬剤－ウイルス混合液を対応して加え、陰性対照群と単純細胞群の足りない部分には培地を補充した。３５℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで３時間インキュベートし、細胞培地をきれいに吸引し、ＰＢＳで洗浄してから、対応する濃度の薬剤希釈液５００μＬを各ウェルに加え、３５℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４８時間インキュベートした。

２．２．１新型コロナウイルスの核酸検出
培養上清を２００μＬ吸引し、磁気ビーズ核酸抽出キット（ＭＶＲ０１、上海之江生物科技有限公司、ＳｈａｎｇｈａｉＺＪＢｉｏ－ＴｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ．）および自動核酸抽出装置（ＥＸ３６００、ＳｈａｎｇｈａｉＺＪＢｉｏ－ＴｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ）でウイルス核酸を抽出し、最終溶出量は５０μＬであった。５μＬの核酸抽出物を取り、ワンステップの新型コロナウイルス核酸検出キット（蛍光ＰＣＲ法、カタログ番号Ｚ－ＲＲ－０４７９－０２－５０、国機注準２０２０３４０００５７、ＳｈａｎｇｈａｉＺＪＢｉｏ－ＴｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ）を使用してウイルス核酸レベルを検出した。
結果は、ウイルスのレベルをＣｔ値で表した。Ｃｔ値とウイルスコピー数の対応関係は、ｙ＝－３．３３ｘ＋４８．６９であり、ここでｙはＣｔ値、ｘは１０を底とするウイルス数の対数である。阻害率の計算式は、阻害率＝［１－１０＾（（ｙ_{ウイルス対照}－ｙ）／３．３３）］×１００％である。実験結果を表１７及び図２０に示す。

以上の結果から分かるように、予防群では、濃度０．００６４ｎｇ／ｍＬ以上の被験薬は新型コロナウイルス感染の複製を抑制する効果を持っており、濃度が４ｎｇ／ｍＬおよび４ｎｇ／ｍＬ以上の被験薬はウイルス抑制率が９８％以上であり、治療群では０．００６４ｎｇ／ｍＬおよび０．００６４ｎｇ／ｍＬ以上の濃度の試験薬は新型コロナウイルス感染の複製に対して一定の抑制効果があるが、阻害効果が予防群に劣り、０．８ｎｇ／ｍＬを除いて、いずれも７５％を下回っていた。陽性対照群では、０．３μＭおよび０．３μＭ以上の濃度のレムデシビルはウイルスに対する阻害率が９０％以上に達した。
計算した結果、被験薬予防群のＩＣ_５０＝０．０１９６ｎｇ／ｍＬ、投与群のＩＣ_５０＝０．０６１２ｎｇ／ｍＬ、陽性対照群のＩＣ_５０＝０．１２μｍｏｌ／Ｌであった。計算によると、予防群の被験薬の安全指数ＳＩは＞１０^６、治療群の安全指数ＳＩは＞３．２×１０^５であり、良好な細胞毒性選択性を示している。

２．２．２免疫蛍光検出
上記４８ウェルプレートで培養した細胞培養上清をきれいに吸引し、ＰＢＳで洗浄した後、氷の８０％アセトン溶液２００μＬを各ウェルに加え、４℃で３０分間固定した後、ＰＢＳで洗浄し、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳブロッキング溶液２００μＬを加えて室温で３０分間ブロッキングし、ＰＢＳで洗浄した後、２００μＬの一次抗体（２０００倍に希釈したウサギ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ＮＰ）タンパク質血清（ＢｅｉｊｉｎｇＳｉｎｏＢｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｃ．）を加え、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を吸引し、ＰＢＳで洗浄し、１５００倍に希釈した２００μＬのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を加え、室温で２時間、暗所でインキュベートした。二次抗体を吸引し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで１：５００に希釈した２００μＬのＤＡＰＩを加え、室温で５分間、暗所でインキュベートした。ＤＡＰＩ染色液を吸引し、ＰＢＳで洗浄し、顕微鏡で調べた。
免疫蛍光検査の結果は核酸検出結果と一致しており、予防群の０．０３２ｎｇ／ｍＬおよび０．０３２ｎｇ／ｍＬ以上の濃度の被験薬は、新型コロナウイルスのインビトロ感染に対して一定の阻害効果を示し、そのうち４ｎｇ／ｍＬおよび４ｎｇ／ｍＬ以上の濃度の被験薬は、ウイルス感染に対して有意な阻害効果を示した。治療群の０．０３２ｎｇ／ｍＬおよび０．０３２ｎｇ／ｍＬ以上の濃度の被験薬は、新型コロナウイルスのインビトロ感染に対して一定の阻害効果を示したが、その阻害効果は予防群よりも低かった。陽性対照群では、０．３μＭおよび０．３μＭ以上の濃度のレムデシビルはウイルスのインビトロ感染に対して有意な阻害効果があった。具体的な結果を図２１、図２２、及び図２３に示す。

配列表：
配列番号１
ＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＤＧＮＬＣＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ

配列番号２
ＧＰＶＰＴＳＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＤＧＮＬＣＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ

配列番号３
ＭＡＡＡＷＴＶＶＬＶＴＬＶＬＧＬＡＶＡＧＰＶＰＴＳＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＤＧＮＬＣＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ

配列番号４
ＭＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＥＧＮＬＣＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ

配列番号５
ＭＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶ
ＡＥＧＮＬＳＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ

配列番号６
ＭＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＳＧＮＬＣＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ

配列番号７
ＭＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＳＧＮＬＳＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ

配列番号８
ＭＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＤＡＮＬＣＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ

配列番号９
ＭＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＤＡＮＬＳＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ

配列番号１０
ＭＫＰＴＴＴＧＫＧＣＨＩＧＲＦＫＳＬＳＰＱＥＬＡＳＦＫＫＡＲＤＡＬＥＥＳＬＫＬＫＮＷＳＣＳＳＰＶＦＰＧＮＷＤＬＲＬＬＱＶＲＥＲＰＶＡＬＥＡＥＬＡＬＴＬＫＶＬＥＡＡＡＧＰＡＬＥＤＶＬＤＱＰＬＨＴＬＨＨＩＬＳＱＬＱＡＣＩＱＰＱＰＴＡＧＰＲＰＲＧＲＬＨＨＷＬＨＲＬＱＥＡＰＫＫＥＳＡＧＣＬＥＡＳＶＴＦＮＬＦＲＬＬＴＲＤＬＫＹＶＡＤＧＮＬＳＬＲＴＳＴＨＰＥＳＴ

配列番号１１
１ＡＴＧＡＡＡＣＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＧＧＴＣＧＣＴＴＴＡＡＧＴＣＧＣＴＧＴＣＧＣＣＧ
６１ＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧ
１２１ＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＧＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴ
１８１ＣＧＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧ
２４１ＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＴＣＡＴＡＴＴ
３０１ＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＴＴＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＴＣＣＧＣＧＣＧＧＣ
３６１ＣＧＴＣＴＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＴ
４２１ＣＴＧＧＡＡＧＣＧＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＡＣＧＴＴ
４８１ＧＣＧＧＡＡＧＧＣＡＡＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＧＴＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣ

配列番号１２
１ＡＴＧＡＡＡＣＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＧＧＴＣＧＣＴＴＴＡＡＧＴＣＧＣＴＧＴＣＧＣＣＧ
６１ＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧ
１２１ＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＧＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴ
１８１ＣＧＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧ
２４１ＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＴＣＡＴＡＴＴ
３０１ＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＴＴＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＴＣＣＧＣＧＣＧＧＣ
３６１ＣＧＴＣＴＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＴ
４２１ＣＴＧＧＡＡＧＣＧＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＡＣＧＴＴ
４８１ＧＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＧＴＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣＴＡＡＴＡＡＴＡＡ

配列番号１３
１ＡＴＧＡＡＡＣＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＧＧＴＣＧＣＴＴＴＡＡＧＴＣＧＣＴＧＴＣＧＣＣＧ
６１ＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧ
１２１ＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＧＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴ
１８１ＣＧＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧ
２４１ＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＴＣＡＴＡＴＴ
３０１ＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＴＴＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＴＣＣＧＣＧＣＧＧＣ
３６１ＣＧＴＣＴＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＴ
４２１ＣＴＧＧＡＡＧＣＧＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＡＣＧＴＴ
４８１ＧＣＧＧＡＣＧＣＧＡＡＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＧＴＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣＴＡＡＴＡＡＴＡＡ

配列番号１４
１ＡＴＧＡＡＡＣＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＧＧＴＣＧＣＴＴＴＡＡＧＴＣＧＣＴＧＴＣＧＣＣＧ
６１ＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧ
１２１ＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＧＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴ
１８１ＣＧＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧ
２４１ＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＴＣＡＴＡＴＴ
３０１ＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＴＴＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＴＣＣＧＣＧＣＧＧＣ
３６１ＣＧＴＣＴＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＴ
４２１ＣＴＧＧＡＡＧＣＧＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＡＣＧＴＴ
４８１ＧＣＧＧＡＡＧＧＣＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＴＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣ

配列番号１５
１ＡＴＧＡＡＡＣＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＧＧＴＣＧＣＴＴＴＡＡＧＴＣＧＣＴＧＴＣＧＣＣＧ
６１ＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧ
１２１ＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＧＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴ
１８１ＣＧＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧ
２４１ＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＴＣＡＴＡＴＴ
３０１ＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＴＴＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＴＣＣＧＣＧＣＧＧＣ
３６１ＣＧＴＣＴＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＴ
４２１ＣＴＧＧＡＡＧＣＧＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＡＣＧＴＴ
４８１ＧＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＴＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣＴＡＡＴＡＡＴＡＡ

配列番号１６
１ＡＴＧＡＡＡＣＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＧＧＴＣＧＣＴＴＴＡＡＧＴＣＧＣＴＧＴＣＧＣＣＧ
６１ＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧ
１２１ＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＧＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴ
１８１ＣＧＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧ
２４１ＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＴＣＡＴＡＴＴ
３０１ＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＴＴＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＴＣＣＧＣＧＣＧＧＣ
３６１ＣＧＴＣＴＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＴ
４２１ＣＴＧＧＡＡＧＣＧＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＡＣＧＴＴ
４８１ＧＣＧＧＡＣＧＣＧＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＴＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣＴＡＡＴＡＡＴＡＡ

配列番号１７
１ＡＴＧＡＡＡＣＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＧＧＴＣＧＣＴＴＴＡＡＧＴＣＧＣＴＧＴＣＧＣＣＧ
６１ＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧ
１２１ＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＧＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴ
１８１ＣＧＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧ
２４１ＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＴＣＡＴＡＴＴ
３０１ＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＴＴＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＴＣＣＧＣＧＣＧＧＣ
３６１ＣＧＴＣＴＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＴ
４２１ＣＴＧＧＡＡＧＣＧＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＡＣＧＴＴ
４８１ＧＣＧＧＡＣＧＧＣＡＡＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＧＴＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣＴＡＡＴＡＡＴＡＡ

配列番号１８
１ＡＡＡＣＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＧＧＴＣＧＣＴＴＴＡＡＧＴＣＧＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＡＧ
６１ＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＡＣ
１２１ＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＧＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＧＣ
１８１ＧＡＡＣＧＴＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡ
２４１ＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＴＣＡＴＡＴＴＣＴＧ
３０１ＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＴＴＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＴＣＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＴ
３６１ＣＴＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＴＣＴＧ
４２１ＧＡＡＧＣＧＴＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＡＣＧＴＴＧＣＧ
４８１ＧＡＣＧＧＣＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＴＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＣＣＴＡＡＴＡＡＴＡＡ

Claims

配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６１番目または１６２番目のアミノ酸の置換変異を含むインターロイキン２９（ＩＬ２９）変異体タンパク質であって、前記１６１番目のアスパラギン酸（Ｄ）または１６２番目のグリシン（Ｇ）が他の天然アミノ酸に置換されている、タンパク質。
前記１６１番目のアスパラギン酸（Ｄ）がグルタミン酸、スレオニンまたはセリンに置換されているか、または１６２番目のグリシン（Ｇ）が脂肪族アミノ酸に置換されている、請求項１に記載のタンパク質。
配列番号４、配列番号６、または配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のタンパク質。
配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６５番目のシステイン（Ｃ）からセリン（Ｓ）への置換変異をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質。
配列番号５、配列番号７、または配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のタンパク質。
前記タンパク質がＮ末端またはＣ末端で別のポリペプチドまたはタンパク質と融合している、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質の融合タンパク質。
前記タンパク質がポリアルコキシ化合物に結合されており、前記ポリアルコキシ化合物が例えば、線状または分岐ポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコール、具体的にはモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧプロピオンアルデヒド）、例えば、２０ｋＤ、３０ｋＤまたは４０ｋＤのｍＰＥＧプロピオンアルデヒドである、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質のコンジュゲート。
請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項６に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項６に記載の融合タンパク質を調製する方法であって、請求項１０に記載の宿主細胞において前記タンパク質または融合タンパク質を発現させ、前記宿主細胞培養物から前記タンパク質または融合タンパク質を単離することを含む、方法。
請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項６に記載の融合タンパク質、または請求項７に記載のコンジュゲート、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
前記医薬組成物が吸入剤である、請求項１２に記載の医薬組成物。
前記吸入剤がネブライザー、エアロゾル、乾燥粉末吸入器、ソフトミストおよびスプレーである、請求項１３記載の医薬組成物。
請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項６に記載の融合タンパク質、請求項７に記載のコンジュゲート、または請求項１２～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む製品またはキット。
ウイルス感染症及び腫瘍を予防および／または治療する薬剤の調製における、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項６に記載の融合タンパク質、請求項７に記載のコンジュゲート、または請求項１２～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
前記ウイルス感染症が、ウイルス感染によって引き起こされる呼吸器疾患または肝炎である、請求項１６に記載の使用。
呼吸窮迫症候群を予防および／または治療する薬剤の調製における、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項６に記載の融合タンパク質、請求項７に記載のコンジュゲートまたは請求項１２～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
新型コロナウイルスによって引き起こされる疾患を予防および／または治療する薬剤の調製における、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項６に記載の融合タンパク質、請求項７に記載のコンジュゲート、または請求項１２～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
治療有効量の請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項６に記載の融合タンパク質、請求項７に記載のコンジュゲート、または請求項１２～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、ウイルス感染症および腫瘍を予防および／または治療する方法。
前記ウイルス感染症が、ウイルス感染による呼吸器疾患または肝炎である、請求項２０記載の方法。
治療有効量の請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項６に記載の融合タンパク質、請求項７に記載のコンジュゲート、または請求項１２～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、呼吸窮迫症候群を予防および／または治療する方法。
前記タンパク質、融合タンパク質、コンジュゲート、または医薬組成物が、１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて使用される、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の他の薬剤が、抗ウイルス薬、化学療法薬、免疫調節薬、抗炎症薬を含む、請求項２３に記載の方法。
治療有効量の請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項６に記載の融合タンパク質、請求項７に記載のコンジュゲート、または請求項１２～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、新型コロナウイルス感染症に起因する疾患を予防および／または治療する方法。