HUT63181A

HUT63181A - Process for producing gm-csf antagonists originating from carboxy terminal of gm-csf

Info

Publication number: HUT63181A
Application number: HU9287A
Authority: HU
Inventors: Gail Foure Seelig; Julie Ellen Scheffler; Paul Phillip Trotta
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1989-07-14
Filing date: 1990-07-12
Publication date: 1993-07-28
Also published as: AU6148790A; KR920701246A; IE902562A1; WO1991001330A1; NZ234479A; NO920176L; IL95061A0; EP0482086A1; HU9200087D0; ZA905480B; PH27534A; MY105946A; EP0409091A1; AU630496B2; CA2062975A1; US5475087A; FI920150A0; NO920176D0; JPH04503815A

Description

A granulocita makrofág kolónia stimuláló faktor (GM-CSF) egy számos emlősben megtalálható polipeptid. A GM-CSF egy olyan limfokin, amely az immunválaszban szereplő számos differenciálatlan őssejt szaporodását serkenti. A csontvelő számos sejtkomponenséről ismert, hogy a GM-CSF serkenti őket [MacDonald et al., J.Bone Mineral Rés., 1(2), 227 (1986); Begley et al., Exp.Hematol., 13., 956 (1985)]. A GM-CSF komplementer DNS-ét (cDNS) nemrég klónozták, és számos laboratóriumban szekvenálták

[Gough et al., Natúré, 309, 763 (1984), 85/04188 számú PCT bejelentés (egér); Cantrell et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82., 6250 (1985) , 183 350 számú európai szabadalmi bejelentés (ember)]. Emellett nem-rekombináns GM-CSF-et számos tenyészet felülúszójából tisztítottak [4 438 032 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés (Mo sejtvonal); Burgess et al., Exp.Hematol., 2, 983 (1981) (egér); Sparrow et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82. 292 (1985) (egér GM-CSF tisztítása és részleges aminosav-szekvencia meghatározása); Wu et al., Exp.Hematol., 12. 267 (1984) (patkány); Gasson et al., Science 230, 1171 (1985) (humán); Burgess et al., Blood, 69, 43 (1987) (humán). A humán GM-CSF-ek között nukleotid- és aminosav-szekvencia (elsődleges szerkezet) heterogenitás figyelhető meg. Például, a humán GM-CSFekben aminosav szinten mind treonin, mind izoleucin megfigyelhető a 100-as pozícióban, ezzel azt sugallva, hogy a humán populációban a GM-CSF-ek között alléi formák vagy polimorfizmus létezhet .

Emellett különböző leader szekvenciák jelennek meg az aminosavszekvenciák N-terminális részén. Ezek a leader szekvenciák különböző hosszúságúak és aminosav-összetételűek lehetnek, ami érinti vagy nem érinti a biológiai aktivitásukat. A leader szekvencia gyakran egy metionin csoportot tartalmaz az N-terminálisán. A GM-CSF érett fehérjéje körülbelül 127 aminosavból áll. (Lásd a 86/03225 és a 86/00639 számú PCT bejelentéseket, amelyekben a humán GM-CSF szekvenciát hasonlítják össze az egér és a gibbon szekvenciájával).

A GM-CSF másodlagos és harmadlagos szerkezete még felderítésre vár, jóllehet Hopp és Woods már készítettek egy hidrofilitási görbét a humán GM-CSF-re [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78., 3824-8 (1981) ] . A GM-CSF által indukált sejtszaporodás részletei továbbra is homályban maradnak.

Mindazonáltal, a GM-CSF számos betegségben szerepet játszik valamilyen faktorként. A megnövekedett szintű GM-CSF jelenléte, ami együtt jár különböző betegségi állapotokkal, azt sugallja, hogy a GM-CSF szerepet játszhat az aberrált sejtek növekedésének autokrin vagy parakrin szabályozásában. Ilyen szabályozást megfigyeltek és/vagy feltételeztek a leukémia/limfómáknál, szilárd tumoroknál, metasztatikus lézióknál, a makrofág beszűrődést is tartalmazó betegségeknél és a ciklikus neutropéniánál. Megfigyelték, hogy a nem-leukémia gyanús hematopoietikus sejtvonalaknak a malignus fenotípussá való transzformációja ahhoz a képességhez kapcsolódott, hogy kolónia stimuláló faktorokat tudtak szintetizálni (Hapel et al., 1981; Schrader and Cappel, 1983). Azt a feltételezést, hogy a GM-CSF-fel való autokrin stimuláció eredményezheti a leukémiára való hajlamot, közvetlenül leellenőrizték, egy retrovirus vektort használva a GM-CSF FDC-Pj^-ben (ez egy faktor-függő rágcsáló sejtvonal) (Láng,R.A., Metcalf,D._zGough,N.M. et al., 1985) való expressziójára (lásd alább). Ezekben az esetekben a kolónia stimuláló faktor az IL-3 volt (multi-CSF). Azaz eredményeik azt sugallják, hogy a CSF-ek elleni megfelelő antagonisták használhatók leukémiahajlam-ellenes szerekként .

A GM-CSF konstitutív expressziójának megfigyelése akut mié• · • · · logén leukémiában (AML) szenvedő betegeknél [Young et al., J.Clin.

Invest., 79. 100-106 (1987)] számos kutatót arra indított, hogy óvatosságra intsenek [Begley et al., Leukémia, 1, 1-8 (1987)] a GM-CSF terápiás alkalmazásában az AML és talán más beteg állapot kezelésében.

Az autostimuláns és autokrin szintézis szerepet játszik a mieloid sejtek onkogenezis mechanizmusában. Az egyes citokinek autológ termelődéséről, ami autostimulációt eredményez, azt feltételezik, hogy egy kritikus onkogén lépés [Schrader et al., J. Cell Biochem.Abstract (1988)]. Schrader és munkatársai azt sugallják azonban, hogy a limfokin gének rendellenes aktiválása lehet egy általános mechanizmusa az onkogén progressziónak, a megfelelő célsejt esetében. Összecseng ezzel a javaslattal az, hogy egy vizsgálatban, ami 24 esetre terjedt ki, beleértve mieloid leukémiás sejteket is [Mannoni et al., J.Cell Biochem.Abstract (1988)], leírták, hogy ezek a sejtek szaporodással válaszolnak a GM-CSF-re, és nem differenciálódással.

A GM-CSF autokrin szintézisének kísérletes indukciója [Gonda et al., Cell., 51. 675-686 (1987)] azt sugallja, hogy az autokrin növekedés egy fontos lépés lehet a teljesen kifejlett leukémia kialakulása felé.

Azok a vizsgálatok, amelyek közvetlen kapcsolatot mutattak ki a GM-CSF autokrin stimulációja és a leukemogenicitás között, azok egy GM-CSF-et FCD-P^-ben, egy faktor-függő rágcsáló sejtvonalban expresszáló retrovírus vektoron alapulnak [Láng,R.A., Metcalf,D., Gough,N.M. et al., Cell, 43. 531-542 (1985)]. A virálisan fertőzött sejtekről kimutatták, hogy a GM-CSF-et szintetizál• · ·*··· · · · • · · · · · ······ · · · ···· ják, és szaporodnak kívülről hozzáadott GM-CSF nélkül is. Ez az eredmény ellentétben van azokkal az adatokkal, amelyeket fertőzetlen sejtekkel kaptunk, amelyek exogén IL-3-at vagy GM-CSF-et igényelnek a túléléshez és szaporodáshoz. Emellett megfigyelték, hogy a fertőzött sejtvonalak nagy, diffúz módon beszűrődő tumor-tömeget hoznak létre szingenlkus DBA egerekben. Ezzel szemben, FD sejtekkel injekciózott állatokban nem fejlődött ki leukémia a 26 hetes megfigyelési peródus alatt. Azaz egyszerően az, hogy az FD sejteket képessé tették GM-CSF szintézisére, elegendő ahhoz, hogy tumorigén fenotípusúvá alakítsa őket.

Olyan vizsgálatokat végeztek [Laker et al._z Proceedings of the Natíonal Academy of Sciences, USA, 84. 8458-8462 (1987) ]^ amelyekben a GM-CSF génnek faktor-független sejtekbe való átvitele faktor-független növekedést eredményezett, közbenső követelmény a külső stimuláció majd egy második mutáció, amely eliminálja a külső GM-CSF iránti igényt. A növekedés függetlenségére való áttérés nagymértékben korrelált a termelt GM-CSF mennyiségével, de nem lehetett kimutatni, hogy a GM-CSF egy küszöbértékétől függött volna. Ezek a vizsgálatok azt sugallják, hogy az autokrin szintézis és az autonóm növekedés két lépése különálló, de egymáshoz kapcsolódik egy malignus állapot felé való fejlődésben.

A GM-CSF elleni antiszérumok jelentősen gátolják a spontán növekedést, amely a fiatalkori krónikus mielogén leukémiával van kapcsolatban [Gualtieri et al., Clin.Res., 36(1), 24A (1988)]. Santoli és munkatársai [J.Immunoi., 139. 3348-3354 (1987)] valamint Valtieri és munkatársai [J.Immunoi., 138. 4042 (1987)] létrehoztak egy T-limfocitás eredetű sejtvonalat, a Tall 101-et. A

GM-CSF-ről kimutatták, hogy támogatja ezeknek a sejtvonalaknak a hosszútávú növekedését, és szinergisztikusan hat az IL-3-mal a T-limfoblasztos leukémia szaporodásának serkentésében.

A GM-CSF konstitutív expresszióját számos szilárd tumorban kimutatták. A GM-CSF-nek a tumor fejlődésében való részvételére az alábbi bizonyítékok vonatkoznak.

A GM-CSF expresszióját a tüdő pikkelyes karcinómájában Manó és munkatársai figyelték meg [Japan J. Cancer Rés., 78. 1041-1043 (1987)].

Baldwin és munkatársai közölték a GM-CSF kötődését a kissejtes karcinóma sejtvonalak nagy affinitású receptoraihoz [Cell Bio chem.Abstracts (Suppl.12A). 97 (1988)]. Ugyanebben a vizsgálatban kimutatták, hogy ezek a sejtvonalak válaszolnak a GM-CSF-re egy in vitro telepnövekedési vizsgálatban.

A GM-CSF konstitutív növekedését figyelték meg Manó és munkatársai [Japan J. Cancer Rés., 78, 1041-1043 (1987)] egy olyan sejtvonalban, amely egy betegből származó tüdő nagysejtes karcinóma eredetű. A GM-CSF konstitutív expresszióját Manó és munkatársai figyelték meg [Japan J. Cancer Rés., 78. 1041-1043 (1987)] egy olyan sejtvonalban, amely egy 9000-10000/mm³fehérvérsejtszámmal rendelkező 43 éves férfi betegből származik.

Dedhar and Gallaway [Abstracts of the Seventy-Ninth Annual

Meeting of the American Association fór Cancer Research, 51. old (1988)], valamint Dedhar és munkatársai [J.Cell. Biochem.

Abstracts (Suppl. 12A) . 128 (1988)] leírták, hogy a GM-CSF ekősegíti az MG-63 és HŐS humán oszteogén szarkóma sejtvonalak szaporodását.

• · • · · • · · · • · · · · ······ ·· · ··· ·

A Hayashi és munktársai által végzett egyik vizsgálatban [J. Cancer Rés., 78, 1224-1228 (1987)] azt találták, hogy egy humán húgyhólyag karcinóma sejtvonal (HTB9) expresszálja a GM-CSF gén mRNS-ét.

Ensoli et al._z [Congress on Cytokine Rés. (1988)] közölték, hogy AIDS-KS betegekből származó Kaposi szarkóma (KS) sejtvonalak bőségesen expresszálják a GM-CSF mRNS-t. Miközben leírnak egy lehetséges mechanizmust az autokrin növekedés stimuláló szerepéről a KS-léziók iniciálásában, Biberfeld és munkatársai [J. Cell Biochem. Abstracts., 143 (1989)] számos növekedési faktor, beleértve a GM-CSF-et is, jelentős szintjét figyelték meg.

hogy a metasztatikus folyamat, főleg a késői állapotokban, termeléssel.

meg olyan

Például a tüdő áttéteknek az egerekben, amelyek jelentős granulocitózissal rendelkeznek [Ishikawa and Ziff, Arthritis and Rheumatism,

12,

Hasonlóképpen Glaves [Invasion Metastasis, 2, adatokat közölt, amelyek azt mutatják, hogy a

160

PMNek az elcsökevényesedett melanóma sejtek felgyorsult távozását okozzák a tüdőből. A GM-CSF in vitro termelését leírták egy olyan metasztatizáló sejtvonallal (TS/A), amely egy spontán egér emlőkarcinómából származik [Nicoletti et al., Bio. J. Cancer, 52.

215 (1985)], és ezekben a vizsgálatokban összefüggést állapítottak meg a telepstimuláló faktor in vitro termelése és a spontán áttétel kapacitása között. Egy további, új vizsgálatsorozatban Nicoletti és munkatársai [Anti-cancer Rés. 2, 695-700 (1987)] vizsgál-

ták a telepstimuláló faktor termelését különböző TS/A sejtvariánsokban, amelyeket tüdőáttét csomók sorozatos in vivő szelekciójával izoláltak.

Azok a vizsgálatok, amelyekben a rágcsáló GM-CSF gént hordozó transzgenikus egerekben a gén egy retrovirális promoterről expreszszálódik, a GM-CSF megnövekedett szintjét eredményezik a szérumban, a vizeletben, peritoneális üregben és a szemben [Láng et al., Cell, 51. 675-686 (1987) ] . Az egerek olyan léziókat fejlesztettek ki, amelyek makrofágokat tartalmaztak a harántcsíkolt izomzatban, valamint makrofág akkumulációkat a szemekben, a peritonális és mellhártya üregekben. A nagy halálozási arány a makrofág aktiválás következtében beálló izomvesztésnek volt tulajdonítható.

Az alábbiakban egy listát adunk meg azokról a betegségekről, amelyek makrofág beszűrődéssel állnak kapcsolatban, és amelyekben egy GM-CSF antagonista hasznos lehet.

Firestein és Zwailfler [Arthritis and Rheumatism, 30, 857863 (1987)] azt a faktort keresték, amelyik a monocita aktiválásért felel krónikus gyulladásos artrítiszben szenvedő betegek perifériális vérének monocitáiban valamint izületi nedveik monocitáiban. Az a megfigyelés, hogy csak alacsony szintű gamma interferon található az izületi folyadékban valamint az izületi szövetben, azt sugallja, hogy a gamma interferon valószínűleg nem felelős ezért az aktiválásért [Firestein and Zvaifler, Arthritis and Rheumatism, 30. 864-871 (1987) ] .

A makrofágok számának megnövekedése a bőrben fontos tényező a bőrbetegségekben. Az ebbe a kategóriába tartozó betegségek például a fertőző betegségek, úgymint a Leishmaniasis és a lepra, valamint a nem-fertőző betegségek, például a szarkodiózis, a granulóma és az annulare. A Chodakewitz és munkatársai által végzett vizsgálatok [J. Immunoi., 140, 832-836 (1988) ] a GM-CSF konstitutív expresszióját mutatták ki keratinocitákban, amelyek szerepet játszhatnak a bőr makrofágok válaszának szabályozásában. Danner és munkatársai [J.Invest.Derm., 89, 339-340 (1987)] azt állítják a neutrofil aktiválás és az oxigéngyök-kibocsátás alapján, hogy a GM-CSF szerepet játszhat a gyulladásos bőrbetegségekben, amelyekben a neutrofil aktiválás egy prominens tulajdonság.

Ezzel a lehetséges szereppel összecseng az a megfigyelés [Griel et al., Abstract of XIXth Meeting of the Society of Immunology (1988)], hogy a Leishmania major-ral fertőzött egerek szisztémás kezelése GM-CSF-fel súlyosbítja a parazita terhelést, ahelyett hogy eliminálná. így a makrofág aggregátumokhoz és mononukleáris fagocitákhoz kapcsolódó betegségek, például a szarkodiózis és más, az előzőkben említett betegségek, jó célpontjai lehetnek a GM-CSF antagonistáival való kezelésnek.

A Listeria monocytogenes [Cheers et al., Infection and Immunity, 56. 247-251 (1988)] fertőzés hasonlóképpen kapcsolódott a GM-CSF megnövekedett szérumszintjéhez.

A vizsgálatok azt sugallták [Wright et al., Clinical Rés., 36. 436A (1988)], hogy a neutrofil és monocita termelés oszcillálása a csontvelőben, ami rendszeres időközönként alapos neutropéniát eredményez, a mielold őssejteknek a GM-CSF-re adott abnormális válaszából következik. Számos közleményben írnak le jelentős, de átmeneti neutropéníát olyan betegekben, akiket GM-CSF-fel kezeltek [Devereux et al., Láncét, 121, 1523-1524 (1987)].

A jelen talámány tárgyát polipeptidek képezik, amelyek aminosav szekvenciája megfelel az érett (natív) humán GM-CSF karboxi-terminális szekvenciájának. Pontosabban, a találmány szerinti polipeptidek körülbelül 5-23 aminosavat tartalmaznak, és az (I) általános képletű aminosav-szekvenciát —

H-X(Ser)-X(Phe)-X(Lys)-X(Glu)-X(Asn)X(Leu)-X(Lys)-X(Asp)-X(Phe)-X(Leu)X (Leu) -X (Val) -X (He) -X (Pro) -X (Phe) X(Asp)-Cys - Trp - X(Glu)-X(Pro)X(Val)-X(Gin)-X(Glu)-OH , ahol X(Xaa) az Xaa aminosavval szinoním amlnosavak csoportját jelenti — vagy annak egy részletét tartalmazzák.

Az egy csoporton belüli szinoním aminosavak elegendő fiziko-kémiai hasonlósággal rendelkeznek ahhoz, hogy ha a csoporton belül a tagokat egymással helyettesítjük, akkor megőrizzük a polipeptid biológiai és immunológiai funkcióját [Grantham, Science, 185, 862-864 (1974); Dayoff et al., Atlas in Protein Sequence and Structures, 5. 89-99.oldal, National Blomedical Research Foundation, Washington, D.C.(1972)]. A helyettesítéseket előnyösen az

1.táblázatból választjuk ki, még előnyösebben a 2.táblázatból.

• · »·· · « · · • « · · · « ··» ·*» *· « ·4«·

1. Táblázat

A szinoním aminosavak előnyös csoportjai

Aminosav Ser Phe	Szinoním csoDort
Ser, Alá, Phe, Tyr	Thr, Gly, Asn
Lys	Lys, Arg,	Asn
Glu	Glu, Gin,	Asp
Asn	Asn, Asp,	Ser, Lys
Leu	Leu, Val
Asp	Asp, Asn,	Glu
Val	Val, Ile,	Alá, Leu
Ile	Ile, Val,	Leu
Pro	Alá, Pro
Gin	Gin, Glu,	His

2. Táblázat

Szinoním aminosavak még előnyösebb csoportjai

Aminosav csooort	Szinonimák
Ser	Ser,	Alá,	Thr
Phe	Phe
Lys	Lys
Glu	Glu,	Asp
Asn	Asn,	Asp
Leu	Leu
Asp	Asp,	Glu,	Asn
Val	Val,	Ile
Ile	Ile,	Val
Pro	Pro
Gin	Gin

Nyilvánvaló, hogy az 1. és 2.táblázat csak irányt szab az e lőnyös aminosavak között, amelyek alkalmasak a helyettesítésre.

• · ·

Világos az is, hogy aminosavakat inszertálhatunk és deletálhatünk is a fenti szekvenciából, anélkül, hogy a biológiai és immunológiai funkciójuk megváltozna, különösen akkor, ha az inszerciók és deléciók csak néhány aminosavat érintenek, azaz 2-3-nál kevesebbet, és nem távolítunk el vagy helyettesítünk így olyan aminosavakat, amelyek kritikusak a funkcionális konformáció szempontjából [Anfinsen, Science, 181. 223-230 (1973)]. Az (I) általános képlettől minor deléciókban vagy inszerciókban eltérő peptidek még a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Az alábbi közleményben javasolt aminosav nomenklatúrát használjuk a továbbiakban: Cohn, Methods in Enzymology, 106. 3-17 (Academic Press, New York, 1984); valamint a IUPAC-IUB Commission J.Biol.Chem., 247, 977-983 (1972)].

Előnyösen a szinoním aminosavak azok, amelyeket az 1.táblázatban határoztunk meg. Még előnyösebben a szinoním aminosavakon azokat értjük, amelyeket a 2.tblázatban határoztunk meg; és a találmány szerinti legelőnyösebb peptidet a (II) képlettel ábrázolt alábbi aminosav-szekvenciával határozhatjuk meg:

H-Ser-Phe-Lys-Glu-Asn-Leu-Lys-Asp-Phe-Leu-Leu-Val-Ile-Pro-Phe-Asp-Cys-Trp-Glu-Pro-Val-Gln-Glu .

Az előnyös polipeptidek tartalmazzák az (I) általános képletű peptid karboxi-terminálisának 18 aminosavát, a legelőnyösebb polipeptid tartalmazza a (II) képletű peptid 18 karboxi-terminális aminosavát (ez megfelel a humán GM-CSF 110-127-es csoportjai • · • · · nak). A 18 aminosav a natív GM-CSF karboxi-terminálisát alkotja, és a leghidrofilebb (112-124-es csoportok), valamint a leginkább hidrofób régiót (125-127-es csoportok).

A találmány oltalmi körébe tartoznak az (I) általános képletű peptidek az aminosav helyettesítésekkel együtt [a (II) képletű peptid aminosava és egy szinoním aminosav között] egyetlen vagy több pozícióban. Az n-szeresen helyettesített kifejezést az (I) általános képletű peptidekkel kapcsolatban olyan peptid alcsoport leírására használjuk, amelyben a (II) képletű peptidben az aminosavakat n-nél nem több pontban helyettesítettük. így például az egyszeresen helyettesített (I) általános képletű peptidek csoportja 60 polipeptidből áll a szinoním aminosavak csoportjára vonatkoztatva, és 34 polipeptidből az előnyösebb aminosav csoportra vonatkoztatva. Az egyszeresen helyettesített kifejezésben az egyszeres kifejezés olyan polipeptidekre vonatkozik, amelyek a legelőnyösebb szekvenciától [(II) képlet] legfeljebb 1 aminosavban különböznek. Hasonlóképpen az n-szeresen helyettesített kifejezés olyan polipeptidre vonatkozik, amely a legelőnyösebb szekvenciától maximum 4 aminosavban tér el.

Meglepő módon, a találmány szerinti polipeptidek antigénként használhatók olyan antitestek előállítására, amelyek képesek a GM-CSF biológiai hatását antagonizálni.

A találmány tárgyát képezik továbbá olyan antitestek is, amelyek specifikusan kötődnek a GM-CSF-hez, valamint a találmány szerinti olyan polipeptidek, (anti-GM-CSF antitestek), amely antitestek GM-CSF antagonista aktivitással rendelkeznek. A GM-CSF antagonista aktivitást úgy határozzuk meg, mint azt a képességet, • · · · hogy gátolni tudja a GM-CSF-nek a receptorával való kölcsönhatását a GM-CSF receptort tartalmazó sejteken és/vagy csökkenti a GM-CSF reaktív sejtek szaporodásának serkentését GM-CSF jelenlétében, az ilyen sejtek szaporodására jellemző GM-CSF serkentés szintje alá. Ezek az antitestek kötődnek a GM-CSF-hez, ennélfogva megakadályozzák, hogy a GM-CSF kötődjön a sejt receptoraihoz. Az ilyen antitestek előnyösen monoklonális antitestek.

A találmány tárgyát képezik továbbá olyan antitestek, amelyek specifikusan kötődnek a találmány szerinti polipeptidek elleni antitestekhez (anti-ant-GM-CSF vagy anti-idiotipusos antitest). Ezek az anti-idiotipusos antitestek utánozzák a GM-CSF-et a sejtreceptorokhoz való kötődésében, ezáltal vetélkednek a GM-CSF-fel a sejtreceptorhoz való kötődésben, és blokkolják a GM-CSF receptor helyeket a GM-CSF receptorokat tartalmazó sejteken, csökkentik a GM-CSF reaktív sejtek szaporodásának serkentését GM-CSF jelenlétében, az ilyen sejtekre jellemző sejtszaporodás serkentésének normális szintje alá. Az anti-idiotipusos sejtek előnyösen monoklonális antitestek.

A találmány szerinti antitestek hasznosak különböző olyan betegségek kezelésében, amelyek a GM-CSF hatásának tulajdoníthatók. Hasznosak emellett a GM-CSF-nek a celluláris receptoraihoz való kapcsolódásának vizsgálatában és/vagy receptor alapú rendszerekben, hogy azonosítsunk más, GM-CSF antagonistát és/vagy agonistát.

Az ábrák rövid ismertetése:

1. ábra A GM-CSF és a 110-127 fehérje felismerése a 349-6-os antitesttel. Az ELISA vizsgálat körülményeit a C • · * ·

2. ábra

3. ábra

4. ábra

5. ábra

- 15 - : ···· példában írjuk le. A 349-6 nyúl anti-szérumot 1:500 arányban hígítjuk, mielőtt a lyukakat 50 μΐ-rel beborítjuk. A nyúl pre-immun szérum nem kötődött a GM-CSF-hez vagy a 110-127 pepiidhez.

A GM-CSF és a 110-127 peptid kötődése a 345-ös antitesthez immunszorbens vizsgálatban. A nyúl 345-6 antiszérumot 1:500 arányban hígítjuk, mielőtt a lyukakat 50 μΐrel borítanánk.

A 345-6 nyúl antitest felismerése birka antitesttel, ELISA elemzéssel. A mikrotiter lemezeket 0,52 /zg 345-6 nyúl antiszérummal mint antigénnel borítjuk. A mosási és blokkolási eljárás után (C példa), a lyukakat különböző higitású 1418 birka anti-szérummal borítjuk. A kötést tormaproxidázzal konjugált szamár anti-birka IgG-vel mutatjuk ki.

A I-GM-CSF leszorítása a placenta membránról a 349-6

5 antitesttel. A placenta membránokat 0,49 nmól I-GM-CSF-fel (40600 cpm) inkubáljuk az antitest jelenlétében

5 illetve távollétében 1 óra hosszat 22°C-on. A I-GM-CSF specifikusan kötődött az antitest távollétében (3456 cpm).

A ¹²⁵I-GM-CSF leszorítása a receptorokról a 345-6 antitesttel. (A) 4χ10θ KG-1 sejtet inkubálunk 0,20 nmól ¹²⁵I-GM-CSF-fel (85760 cpm), majd különböző kon125 centrációjú antitestekkel 1 óra hosszat 22°C. A IGM-CSF specifikus kötődése az antitest távollétében 3072 cpm. (B) Placenta membránokat inkubálunk 0,49 nm • · · ¹2⁵i-GM-CSF-fel (7,2xl0⁵ cpm) majd antitesttel 1 óra hosszat 22°C-on. 4110 cpm kötődött specifikusan az antitest távollétében.

5

6. ábra A I-GM-CSF kompetitív leszorítása a receptorokról a

1418 birka antitesttel. (A) 5χ10θ KG-1 sejteket inkubálunk 0,54 nmól ¹²⁵I-GM-CSF-fel (2,02xl0⁵ cpm) antitest jelenlétében illetve távollétében 1,5 óra hosszat 4°C-on. Az antitestet nem tartalmazó kontroll vizsgálatokban megfigyelt specifikus kötés 3515 cpm volt. (B) 4,85 nmól ¹²⁵I-GM-CSF-et (68850 cpm) inkubáltunk placenta membránokkal 1 óra hosszat 22°C-on. Az antitest távollétében megfigyelt specifikus kötés 16397 cpm volt.

A találmány ismertetése

Amint a fentiekben ismertettük, a találmány szerinti polipeptidek körülbelül 23 aminosavat tartalmaznak £(I) és (II) képleA találmány szerinti antitestek, amelyeket ezek ellen a polipeptidek ellen készítettünk, a polipeptideken található egy vagy több antitest determináns (epitop) ellen irányulnak. A szakterületen jól ismert, hogy az antigén determinánsok legalább 5 aminosavat tartalmaznak [Ohno et al._z Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82. 2945 (1985)].

Ennélfogva a találmány szerinti polipeptidek 5-23 aminosavat tartalmazhatnak, és aminosav szekvenciájuk megfelelhet az előbb

Ír, ······ / — ····«· ·· · ···· említett szekvenciáknak vagy azok egy részének (I) és (II) képletek) . Azt, hogy egy adott polipeptidek a találmány oltalmi körébe tartoznak-e, könnyen meghatározható rutinkísérletekkel az alábbiakban ismertetett módszerekkel.

Peptidszintézis

A találmány szerinti peptideket standard technikákkal szintetizáljuk [Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1984)]. Előnyösen egy kereskedelmi forgalomban levő szintetizátort használunk, például Vega Biochemicals (Tuscon, AZ) 296A vagy B modellt, vagy Applled Biosystems, Inc. (Foster City, CA) 430A modellt.

A védett (II) képletű peptidet szilárd fázisú szintézissel lehet összeállítani térhálósított polisztirol hordozón, a karboxi-terminális csoporttól kiindulva és az aminosavakat lépésenként kapcsoljva, míg a teljes 23 tagú láncot létrehozzuk. A szintézist teljesen automatizált peptidszintetizátoron hajtjuk végre (Applied Biosystems, Inc. 430A modell). A szintézis során használt kémiai módszert az alábbi szakcikkekben találhatjuk meg:

Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85. 2149 (1963); Kent et al.,

Peptides 1984 185. old. Ragnarsson, Ed. (Almquist and Weksell, Stockholm 1984); Kent et al., Peptide Chemistry 84, 217. old.

Izumiya, Ed. (Protein Research Foundation, B.H. Osaka 1985) ; Merrifield, Science, 232. 341-347 (1986), valamint az utolsóként említett cikkben idézett közlemények.

A szilárd fázisú szintézis során az a legfontosabb, hogy elimináljuk a melléktermékek szintézisét, amelyek elsődlegesen ···« ·♦ ···· ·· • · · · · · «·· 4 · · · • · · * · ··· ·· · ···· terminációs, deléciós vagy modifikációs peptidek. A legtöbb mellékreakciót eliminálni illetve minimalizálni lehet tiszta, jól jellemzett gyanták, tiszta aminosavszármazékok, tiszta oldószerek használatával, valamint a megfelelő kapcsolási és hasítási módszerek illetve reakciókörülmények alkalmazásával [Bárány and Merrifield, The Peptides, Cross and Meienhofer Eds., 2., 1-284 (Academic Press, New York 1979) ] . Fontos, hogy kövessük a kapcsolási reakciókat, abból a célból, hogy meghatározzuk vajon teljesen lejátszódtak-e, ezzel a deléciós peptidek, amelyekből egy vagy több aminosav hiányzik, elkerülhetők. Erre a célra a kvantitatív ninhidrin reakció alkalmas [Sárin et al., Anal. Biochem., 117. 147 (1981)]. Να-t-Butoxi-karbonil (t-BOC) aminosavak használhatók a megfelelő oldallánc védőcsoportokkal, amelyek a lánc összeállításának körülményei között stabilak, de erős savakra elbomlanak. A védett peptidlánc összeállítása után a védőcsoportokat el lehet távolítani, és a peptidet rögzítő kötést el lehet hasítani, alacsony koncentrációjú, majd magas koncentrációjú vízmentes hidrogén-fluoriddal, tioészter megkötő anyag jelenlétében [Tam et al., J. Amer. Chem. Soc. 105, 6442 (1983)].

Más, alkalmazott szerves szintetikus módszerek közé tartozik az oldatban végzett szintézis [The Peptides: Analysis, Synthesis and Biology, Vol I, Major Methods of Peptíde Bond Formatíon, E, Gross and J. Meienhofer editors, Academic Press (1979); Chemistry of the Amino Acids, Greenstein and Winitzeditors, John Wiley and Sons (1961)].

A peptideket emellett elő lehet állítani jól ismert rekom- 19

bináns DNS molekulák alkalmazásával. A kívánt peptidet kódoló pozitív szálú hírvivő RNS-t (mRNS) kódoló komplementer cDNS-eket izolálhatunk vagy szintetizálhatunk, és a megfelelő vektorba és gazdaszervezetekbe építhetünk be. A cDNS pontos bázissorrendjét a kívánt polipeptid aminosavszekvenciája és a használt expressziós gazdaszervezet határozza meg. Bizonyos gazdaszervezetek, például a baktériumok és az élesztők előnyben részesítenek egyes kodonokat, amelyeket egyes aminosavak transzlációjára használnak [Bennetzen and Hall, J. Bioi. Chem., 257, 3026-3031 (1982); Boer and Kastelian Biased Codon Usage: An Exploration of its Role in Optímization of Translation 8. fejezet, 225-283, Benzikoff and Gold, Eds., Biotechnology Series, 19851. Ezeket a rekombináns úton előállított polipeptideket a szakterületen ismert módszerekkel lehet előállítani. A találmányban az affínitáskromatográfia egy hasznos és előnyben részesített módszere az izolálásnak, mivel a polipeptideket úgy terveztük, hogy specifikusan reagáljanak a GM-CSF receptorokkal és/vagy a GM-CSF reaktív antitestekkel.

A találmány szerinti polipeptideket úgy is előállíthatjuk, hogy hosszabb polipeptideket kémiailag elhasítunk vagy proteolítikusan leemésztünk, majd a keresett hasítási terméket izoláljuk és tisztítjuk.

Antitest előállítás

Az alábbi módszerek használhatók GM-CSF antagonista hatású poliklonális antitestek előállítására. Megfelelő mennyiségű antigént (azaz a 110-127-es peptidet, vagy más karboxi terminális • · · ♦ · · «·· ♦ ♦ · · • · · · · ··· ♦· · ···· régiót) injektálhatunk megfelelő állatokba antitestek előállítása céljából. A karboxi terminális peptidekkel szembeni antitest előállításában előnyben részesített állat a nyúl, és az antitestekkel szembeni antitest előállításában pedig a birka. A beinjekciózott antigén mennyisége függ az állat méretétől, súlyától és egészségi állapotától, és az injekciózást bármilyen úton, szubkután vagy intradermális úton végezhetjük. A többszörös injekciók növelhetik az immunválaszt, és az ilyen injekciók gyakran, azaz hetenként, illetve ritkábban, azaz néhány havonta adhatók be. Az injekciós oldat előnyösen megfelelő biológiai pufferrel például TRIS-HC1 (pH=6,8) pufferőit oldat. Az oldat tartalmazhat még áltlános immunstimulátorokat, például szamárköhögés vakcinát, adjuvánst (például Freund féle komplett adjuvánst) vagy mindkettőt, és egy stabilizáló anyagot, például 1/10000 thimersolt. Az érzékenyített állat teljes szérumát, ami a GM-CSF antagonista antitesteket tartalmazza, használhatjuk a GM-CSF aktivitás blokkolására, de előnyösen az antitesteket a szakterületen ismert módszerekkel tisztítjuk. Egy különösen előnyös és hasznos technika az affinitás kromatográfia. Az ilyen kromatográfia az érzékenyítéshez alkalmazza a GM-CSF-et, a GM-CSF receptorokat, illetve előnyösen a karboxi terminális régiót mint affinitás ligandot, a kereskedelmi forgalomban levő számos kromatográfiás gyanta közül az egyikhez vagy másikhoz hozzákötve.

Ha az antitestek forrása a nyúl, akkor a tisztítást előnyösen úgy végezhetjük, hogy egymás után dializáljuk megfelelő pufferrel szemben (például 0,1 mólos nátrium-acetát ; pH=5,5; éjszakán át 4°C-on), centrifugáljuk az oldhatatlan anyagok eltáΛ4 »······· — 71 - ······· · ώ Λ ·«···· ······ · · · ···· volítása végett, ioncserélő kromatográfiához adszorbeáljuk (például S-Sepharose, Pharmacia, az említett 0,1 mólos nátriumacetát pufferrel egyensúlyba hozva), sóval eluáljuk (például 1,0 M NaCl 0,05 mólos nátrium-acetát pufferben; pH=5,5), adszorbeáljuk egy Protein A-Sepharose oszlopra (kapható a Pharmacia-tól [például 17-0628-01, 17-0629-01], a Sigma Chemical Company-tól [például P7786, P3391, P6649] és a Miles-Yeda Ltd-től [például 79-700]), amelyet egy lúgos pufferrel hoztunk egyensúlyba (körülbelül 1,5 mólos glicin; pH=8,8), majd egy savas pufferrel (0,1 mólos citromsav; pH=2,5) eluáljuk. A membránfehérjék tisztítása során a Protein A használatát Schneider és munkatársai írják le [J. Bioi. Chem., 257, 10766-10769 (1982)].

A GM-CSF karboxil régiójához specifikusan kötődő monoklonális antitestek, illetve az ilyen anti-karboxil antitestek elleni antitesteket a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel lehet előállítani. Az ilyen monoklonális antitestek általában egy háromlépéses folyamat eredményei: érzékenyítés, fúzió és átvizsgálás.

A gazdaállat, előnyösen egér, nyúl vagy birka érzékenyítése (immunizálás) lehet néhány antigén (akár a karboxil régió, akár az antikarboxil antitest) injekció formájában. Az antigént számos alkalmas formában használhatjuk, például a komplett Freund féle adjuváns (CFA) formájában, foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS) emulgeálva, (előnyösen 1:1 arányban). Az injekciók száma, és a beadott antigén mennyisége olyan kell hogy legyen, hogy hesználható mennyiségű alkalmasan feltöltött lépsejtet kapjunk, amelyeket a fúzióban lehet felhasználni. Előnyösen, az immunizálás

- 22 három intraperitonális injekcióból áll, az injekciók 10-10 μ,ς antigént tartalmaznak, körülbelül kéthetes intervallumokban, majd ezt követi egy újabb megerősítés 10 ng antigénnel foszfáttal puffereit sóoldatban, intravénásán beadva, majd 10 /zg antigénnel CFA/PBS-ben, intraperitonálisan beadva. Az immunizált állatok lépeit eltávolítjuk, majd a lépszuszpenziókat jól ismert technikák alkalmazásával állítjuk elő.

A immunizált állatokból származó lépsejteket önállóan szaporodó sejtvonalakkal fúzionáltathatjuk, például egér mielóma sejtekkel [Kohler and Milstein, Natúré, 256. 495-497 (1975)]. A fúzionált sejteket úgy választjuk ki a nem fúzionált sejtek közül, hogy a keveréket olyan táptalajban tenyésztjük, amely elimínálja a fúzionálatlan sejtvonalakat, például egy HAT táptalajban (ez egy olyan táptalaj, amely hipoxantint, aminopterint és timidint tartalmaz). A fúzionálatlan lépsejtek, amelyek nem képesek önállóan szaporodni, (azaz nem malignusak), normális körülmények között leállnak a növekedéssel egy rövid idő elteltével, míg a fúzionált sejtek, amelyek a lépsejtekből származó szelekciós gént tartalmaznak, például HGPRT⁺-t (hipoxantin guanozil-foszforibozil transzferáz), képesek a HAT táptalajon növekedni.

Ha egyszer előállítottuk a karboxi-terminális régió elleni antitesteket, akkor már meg lehet vizsgálni GM-CSF antagonista aktivitásukat, és az alábbiak szerint meg is tisztíthatjuk őket.

Átvizsgálás

1. Seltszaporodási vizsgálat A GM-CSF vizsgálata azon • · · · • · · · •«· · · · • · · · •·· ·· · alapul, hogy a GM-CSF megfelelő sejtek például a KG-1 sejtek (ezek olyan sejtek, amelyeket egy akut mielogén leukémiában szenvedő beteg csontvelejéből hoztak létre) szaporodását képes serkenteni. Az AML-193 sejtek is használhatók ebben a vizsgálatban. Az AML-193 sejteket B. Lángé és munkatársai írták le [Blood, 70. 192-199 (1987) ] . A sejteket mikrotiter lemezen inkubáljuk

GM-CSF különböző hígításaival körülbelül 6 napig, majd további 4 óra hosszat inkubáljuk az MTT tetrazólium sóval [3-(4,5-dimetiltiazol-3-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid]. Az MTT-t a mitokondriális dehidrogenáz enzimek színes reakciótermékké alakítják, azaz formazéúánná [Mosmann, I., J. Immunological Methods, 65, 55-63 (1983) ] . A formazánt savas izopropanollal extraháljuk, majd spektrofotometriásán mérjük. A megfigyelt optikai sűrűség közvetlenül arányos a sejt-koncentráció 2-es alapú logaritmusával. Az eredményeket delta-O.D. formában fejezzük ki, ahol a delta-O.D. a minta optikai sűrűsége, mínusz a GM-CSF-et nem tartalmazó alapvonal kontroll optikai sűrűsége.

2. A GM-CSF receptorkötési vizsgálat

A GM-CSF-et Bolton és Hunter módszerével radioaktív jóddal jelezzük [Bolton, A.E., Hunter, W.M., Biochem J., 133. 529-539 (1973), majd gélszűréssel tisztítjuk Sephadex G-25 oszlopon (PD10, Pharmacia). A keletkező I-GM-CSF specifikus radioaktivitása körülbelül 1-3χ10θ ^Ci/mól, sztöchiometriája

5 pedig 0,4-1,2 mól per mól GM-CSF. A specifikus radioaktivitást és a sztöchiometriát az önleszorítási módszerrel lehet meghatározni [Calvo et al., Biochem. J., 212, 259-264 (1983)]. A • · · • ·· ···♦ ·· • · · · · • · * · • ♦ · · · · ··· ·♦· ·· · ···· n c

I-GM-CSF-nek ugyanaz a biológiai aktivitása mint a jelzetlen GM-CSF-nek, a KG-1 sejtszaporodási vizsgálat alapján mérve.

5

A I-GM-CSF-nek a KG-1 sejtek receptoraihoz való kötődését mérő vizsgálatok (magas affinitási hely Kj=6,7 pmól, 70 hely/sejt; alacsony affinitási hely K_d=0,73 nmól, 2700 hely/sejt), vagy az AML-193 sejtek tartalma körülbelül: 0,2-0,5 nmól ¹²⁵I-GM-CSF, 4-6xl0⁶ KG-1 sejt, és Iscove féle módosított Dulbecco táptalaj, amely 10% borjúmagzat szérumot tartalmaz (IMDM-10% FCS), 0,4 ml össztérfogatban. 2,5 percig 600xg-vel való centrifugálással üledéket kapunk, amelyet kétszer mosunk IMDM-10% FCS-sel.

A placentamembránokat homogenizálással állítjuk elő, centrifugáljuk a lOOxg frakció eltávolítására, majd alaposan mossuk a 27300xg frakciót. A homogenizátumban és a mosó pufferben 12 5 protáz inhibitorok lehetnek jelen. A I-GM-CSF-nek a placenta membránok receptoraihoz való kötődésének számításához (Κ^=0,86 nmól) a placentamembránokat 1 óra hosszat inkubáljuk 0,5-5,0 nmól ¹²⁵I-GM-CSF-fel, és IMDM-10% FCS-sel 0,4 ml össztérfogatban. Miután körülbelül 1 óra hosszat inkubáltuk körülbelül 22°C-on, a mintákat lecentrifugáljuk (körülbelül 2,5 perc 800xg-vel, majd a placentamembrán üledéket kétszer mossuk IMDM-10% FCS-sel. A sejtüledékeket gamma számlálóval határozzuk meg. A jelzetlen GMCSF telítési koncentrációit hozzáadjuk a kontroll vizsgálatokhoz, így kapjuk a nem-specifikus kötődést.

125

Ahhoz, hogy megmérjük a I-GM-CSF leszorítását a receptorokról poliklonális antitestekkel, az antiszérumokat vagy a preimmun szérumokat is bevesszük a kötési vizsgálatokba. Azokat ·· ·· ·« ···· ·· • · · * · · ··· · · · · • · · « · ·*· ·· · ··♦· antitesteket, amelyek felismerik a GM-CSF-et, körülbelül 10 percig inkubáljuk ¹²⁵I-GM-CSF-fel, mielőtt a kötődést KG-1 sejtek, placentamembránok vagy AML-193 sejtek hozzáadásával iniciálnánk. Az 1418-as birka monoklonális antitestet, amely felismeri a GM-CSF receptort, előinkubáljuk körülbelül 10 percig KG-1 sejtekkel, AML-193 sejtekkel vagy placenta membránokkal. A kötődést ¹²⁵I-GM-CSF hozzáadásával iniciáljuk.

Jóllehet a találmány szerinti antitestek antagonista hatásait az alábbiakban AML-193 sejtekkel, KG-1 sejtekkel vagy placentamembránokkal illusztráljuk, az nyilvánvaló, hogy az antitestek számos más típusú sejteken vagy szöveteken is hatásosak, amelyek a felszínükön GM-CSF receptorokat tartalmaznak.

3. Enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA)

Nyúl és birka antiszérumoknak vizsgáljuk a specifikus kötődését az antigénekhez, közvetlen szilárd fázisú ELISA alkalmazásával szobahőmérsékleten. Egy 96 lukas mikrotiter lemezt (Beckton-Dickinson) borítunk körülbelül 50 μΐ antigénnel lukanként, körülbelül 1 óra hosszat, szobahőmérsékleten. A lemezt körülbelül ötször mossuk Tris-szel puffereit sőoldattal (TBS), amely 0,1% Tween 20-t tartalmaz. A lemezt ezután 1% szarvasmarha szérumalbuminnal blokkoljuk körülbelül egy óra hosszat, majd ismét ötször mossuk TBS-sel. Az immunoglobulinnal való blokkolást az 1418-as antitest esetében kihagyjuk. A lyukakat a vizsgálandó antitesttel borítjuk körülbelül 1 óra hosszat, ötször mossuk TBS-sel, majd 2,5 ng kecske anti-nyúl IgG-hez konjugált tormaperoxidázzal borítjuk (vagy 5,0 ng szamár anti-birka IgG-vel). Az 1 ·· *· «

- 26 - : .:..

órás Inkubálást követően a lemezt ötször mossuk TBS-sel. A lemezt 2,2'-azino-bis[3-et11-benztiazolin-szulfonát]-nak és hidrogénperoxldnak az egyes lukakhoz való adásával hívjuk elő. A tormaperoxidáz reakcióterméket kolorimetriásan lehet kimutatni, az enzim-szubsztrát hozzáadása után 20 perccel. A kontroll lukakat is előhívjuk, amelyekből egy vagy több vizsgálati komponens hiányzik (antigén, antitest, peroxidázzal jelzett antitest).

4. A 1418-as anti-idiotipusos antitest fluoreszcenciával aktivált sejtszeparálásos elemzése

Az anti-idiotipusos antitestnek a KG-1 sejtek receptoraihoz való közvetlen kötődésének mérését az alábbiak szerint végezzük: 4xl0⁶ KG-1 sejtet mosunk Iscove féle módosított Dulbecco táptalajban, amely 10% borjúmagzat szérumot tartalmaz (IMDM10% FCS), majd 5 percig 1000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk, így kapunk egy csapadékot. A felülúszót eltávolítjuk, majd a sejteket 100 μΐ GM-CSF-fel (10 ng/ΙΟΟμΙ IMDM-10% FCS-ben) vagy IMDM-10% FCS-sel 10 percig 4°C-on. A sejteket 1 ml IMDM-10% FCSsel mossuk, centrifugáljuk, a felülúszót eltávolítjuk, majd a sejteket 100 μΐ antitesttel vagy anti-idiotipusos antitesttel inkubáljuk 30 percig. A sejteket kétszer mossuk 2-3 ml IMDM-10% FCS-sel, majd centrifugáljuk, a felülúszót eltávolítjuk, és a sejteket 100 μΐ fluoreszceinnel konjugált (FITC; 1,5 mg/ml IMDM10% FCS-ben) kecske anti-nyúl vagy anti-birka IgG-vel (amelyik megfelelő) inkubáljuk 30 percig. A sejteket ezután kétszer mossuk IMDM-10% FCS-sel, majd a kapott sejtüledéket 1 ml foszfáttal puffereit sóoldatban (pH=7,2) szuszpendáljuk. A sejteket azután ···« ·♦ ♦··♦ ·· _Λ « · « · · · • ·« · · * · • · · · · ·· · ·· ♦ ···· például egy Beckton-Dickinson Model 440 berendezésben vizsgáljuk. A negatív kontrollokat hasonló módon kezeljük, azzal a különbséggel, hogy az antitestet vagy az anti-idlotípusos antitestet kihagyjuk.

5. Az anti-idiotípusos antitest közvetlen kötődésének elemzése Immunfluoreszcenciával

A JÁR sejtek az ATCC-nél vannak letétbe helyezve (No. HTB 144). Ezekből lukanként 5xl0⁴ sejtet oltunk be kétlukas lemezekbe. Miután 3 napig inkubáltuk, a táptalajt eltávolítjuk, majd a sejteket háromszor mossuk hideg TBS-sel. A puffért eltávolítjuk, majd 0,5 ml anti-idiotípusos antitestet adunk hozzá, és 30 percig 4°C-on inkubáljuk. A sejteket 1 ml PBS-sel mossuk, a puffért eltávolítjuk, majd fluoreszceinnel konjugált (FITC) kecske antibirka IgG-t adunk hozzá, és 30 percig 4°C-on inkubáljuk. A sejteket ismét háromszor mossuk, és 20%-os, TBS-ben készült glicerinben vesszük fel. A sejteket LEITZ fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáljuk.

A találmány szerint emlősöknek adunk be antitestet vagy anti-idiotípusos antitestet (vagy peptidet) olyan mennyiségben, ami elegendő ahhoz, hogy megakadályozza a rendellenes sejtnövekedést a GM-CSF parakrin vagy autokrin szabályozása alatt. Az adagolás mennyisége, gyakorisága és periódusa változhat, a beteg korától, a GM-CSF válasz erősségétől és az antitest terápiára adott választól függően. Az adagolás lehet szubkután, intradermális, parenterális, intravénás. Az antitestet (vagy peptidet) bármely szokványos dózisformában beadhatjuk, beleértve ···· a 0,9% sóoldat/5% humán szérum albumint, illetve bármely más, jól ismert fiziológiailag elfogadható hordozót. Az antitestet (vagy peptidet) 10-100 mg/m mennyiségben adhatjuk be minden másnap, nyolc-tíz kezelésig. A folyamatos infúziós kezelést 30-80 mg/m értékkel végezhetjük nyolc napig, az össz-dózis értéke 250-1000 mg.

Egy GM-CSF antagonistát egy olyan terápiás anyaggal együtt lehet alkalmazni, amely a szaporodó sejtpopulációkra Irányul. Az antagonista blokkolja fejlődő sejtek szaporodását, ezzel védelmet biztosít az elsődleges kemoterápiával szemben. A kemoterápia/GMCSF antagonista kezelést követően a GM-CSF-et lehet adagolni, hogy ezzel segítsük a megvédett sejtpopuláció fejlődésének stimulálását. A GM-CSF antagonisták erre a célra való adagolása ugyanaz, mint a fentiekben.

PÉLDÁK

A. Peptidszintézis

A peptideket Merrifield által közölt szilárd fázisú eljárással állítottuk elő [R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85. 2149-2154 (1963)]. A t-butoxi-karbonll amino-védőcsoportot, szimmetrikus anhidrideket és az Applied Biosystems Model 430A szilárd fázisú peptid szintetizátort használtuk. A védőcsoportok eltávolítása után a peptideket hidrogén-fluoriddal lehasítjuk a gyantárról. A gyantáról való lehasítás után kapott nyers peptideket fordított fázisú HPLC-vel vizsgáljuk Rainin Dynamax C-8 oszlopon (a részecskeméret 12μ, a pórusméret 300 A, 4,6 mm x 250 mm).

f ·· • · ·

B. Az antiszérum előállítása

Nvúl immunizálás

Két mg antigént (110-127-es peptid, vagy humán GM-CSF) oldunk 0,4 ml 0,5 mólos TRIS-HC1 pH=6,8 puffer és 0,1 ml szamárköhögés vakcina (18334-es törzs, hővel elpusztítva) összetételű oldatban. 0,5 ml Freund féle komplett adjuvánst adunk hozzá, majd a mintát egy fecskendőben homogenizáljuk. A nyulakat immunizáljuk 1 ml mintával, 0,1 ml (200 /zg antigén) intradermális injekciókkal.

A nvúl 110-127 antioeptid IaG tisztítása 345-6 nvúlszérumből

A nyúl IgG dot-blot elemzését úgy végezzük, hogy a minta egy alikvot részét nitrocellulózra csöppentjük, BSA-val (szarvasmarha szérum-albumin) blokkoljuk, alkalikus foszfatázzal jelzett antinyúl IgG-vel inkubáljuk, majd reagensekkel festjük, hogy az alkalikus foszfatázt kolorimetriás reakcióval kimutassuk.

A 345-6 nyúlszérumot (45 ml, 26 mg/ml fehérje) 0,1 mól nátrium-acetáttal szemben (pH=5,5) dializáljuk éjszakán át 4°Con. Miután lecentrifugáltuk (10000 per perc, 30 perc) az oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából, a mintát S-Sepharose oszlopra visszük, amelyet ugyanezzel a pufferrel hoztunk egyensúlyba. A 0,05 mól nátrium acetát (pH=5,5) és 1,0 mól NaCl-lel kapott eluátum 82 mg fehérjét tartalmazott, amely a dót biot elemzés alapján pozitív volt. Az a fehérje frekció, amely nem adszorbeálódott az oszlopon, a dót biot elemzés alapján negatív volt. 0,1 mólos glicinnel (pH=2,5) végzett elúcióval 23 mg fehérjét kaptunk (Lowry vizsgálat, standardként IgG-t használtunk), amely a nyúl IgG-re pozitívan festődött a nitrocellulóz dót biotton. A • · mintát 98%-os tisztaságú IgG-nek ítéltük a Coomassie Blue-val végzett festés alapján nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid gélelektroforézis után (SDS-PAGE) .

Birka immunizálás

Az 1418-as birka antiszérumot a 345-6 anti-szérumból tisztított nyúl IgG-vel való immunizálással állítottuk elő. 0,5 ml foszfáttal puffereit sóoldatban levő 1,5 mg 345-6 IgG-t adunk 0,5 ml Freund féle komplett adjuvánshoz, majd alaposan megkeverjük, emulzió előállítása céljából. A 349-6 antitestet Schneider és munkatársai módszerével tisztítottuk [J. Bioi. Chem., 257(18) . 10766-10769 (1982) ] . A mintákat szubkután injekciózzuk be. Az erősítéseket hasonló módon végezzük, azzal a különbséggel, hogy inkomplett Freund féle adjuvánst alkalmazunk.

Az immunizálás menetét nyulak és birkák esetében a 3. táblázatban adjuk meg.

3. táblázat

Az immunizálás menete

Állat	Jelzés	Antioén	Az immunizálás naDia
nyúl	349-6	GM-CSF	0,	185
nyúl	345-6	110-127-es	0,	113, 289
		peptid
birka	1418	345-6 IgG	0,	23, 47, 74, 94

·· · · · · · · • ··· w ♦ · · • · · * · · ··· »·· ·· · ····

C. Enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA)

Nyúl és birka szérumokat vizsgálunk át arra, hogy specifikusan kötődnek-e az antigénhez, közvetlen szilárd fázisú ELISA-t használva szobahőmérsékleten. Egy 96 ylukas mikrotiter lemezt (Becton-Dickinson) borítunk 50 μΐ antigénnel lukanként, 1 óra hosszat, szobahőmérsékleten. A lemezt ötször mossuk Tris-szel puffereit sóoldattal (TBS), amely 0,1% Tween 20-at tartalmaz. A lemezt ezt követően 1%-os szarvasmarha szérum-albuminnal blokkoljuk 1 óra hosszat, ötször mossuk TBS-sel, blokkoljuk 0,1% immunoglobulinnal 1 óra hosszat, majd ismét ötször mossuk TBSsel. Az immunoglobulinnal való blokkolást kihagyjuk az 1418-as antitesttel végzett eljárás során. A lyukakat a vizsgálandó antitesttel borítjuk egy óra hosszat, ötször mossuk TBS-sel, majd 2,5 ng, tormaperoxidázzal konjugált anti-nyúl IgG-vel borítjuk (vagy 5,0 ng, tormaperoxidázzal konjugált szamár anti-birka IgG-vel). Egy órás inkubálást követően a lemezt ötször mossuk TBS-sel.

A lemezt 2,2'-azino-bisz-[3-etil-benztiazolin-szulfonát]-nak és hidrogén-peroxidnak az egyes lyukakhoz való adásával hívjuk elő. A tormaperoxidáz reakcióterméket spektrofotometriásán mutatjuk ki 414 nm-en, 20 perccel az enzim-szubsztrát hozzáadása után. A kontroll lyukakat is előhívjuk, amelyekben az egyik vizsgálati komponens nincs meg (antigén, antitest, vagy peroxidázzal jelzett antitest).

Az 1., 2. és 3. ábra igazolja a GM-CSF és a 110-127-es fragment kötődését anti-GM-CSF-fel (349-6-os antitest, 1. ábra), valamint az anti 110-127-tel (345-6-os antitest, 2. ábra), amint az az ELISA-n látható. A 3. ábrán a 345-6 antitest kötődését ···· ·· ···· ·· ♦ · · ·* · · látjuk a 1418-as antitesthez (az anti-idiotípusos antitest a 345-6 antitestre).

D. GM-CSF receptor-kötési vizsgálat

A GM-CSF-et (kereskedelmi forgalomban levő anyag, például a Genzyme Corporation, Boston, MA, hozza forgalomba) radioaktív jóddal jelezzük Bolton és Hunter módszerével [Bolton, A.E and. Hunter, W.M., Biochem. J., 122, 529-539 (1973)], majd gélszűréssel tisztítjuk Sephadex G-25 oszlopon (PD-10,

5

Pharmacia). A keletkező I-GM-CSF specifikus radioaktivitása

1-3χ10θ gCi/gmől, sztöchiometrája pedig 0,4-1,2 mól ^²^ p_{er m}ól GM-CSF. A specifikus radioaktivitást és a sztöchiometriát az önleszorításos módszerrel határoztuk meg [Calvo, J.C., Radicella, J.P. and Charreau, E.H., Biochem. J. 212. 259-265 (1983)]. A ¹ °I-GM-CSF biológiai aktivitása azonos a jelzetlenével, amit a KG-1 sejt szaporodási vizsgálatával határozunk meg. A ¹²⁵I-GM-CSF-nek a KG-1 sejteken levő receptorokhoz való kötődésére (magas afinitású hely K_d= 6,7 pmól, 70 hely per sejt; alacsony affinitású affinitású hely K^=0,73 nmól, 2700 hely per sejt) a következő vizsgálatot alkalmazzuk: 0,2-0,5 nmől ¹²⁵I-GMCSF, 406χ10θ KG-1 sejt, és Iscove féle módosított Dulbecco féle táptalaj, amely 10 % borjúmagzat szérumot tartalmaz (IMDM-10% FCS) , 0,4 ml össztérfogatban. 2,5 percig 600xg-vel centrifugálva sejtüledéket kapunk, amelyet kétszer mosunk IMDM-10% FCS-sel.

A placentamembránokat homogenizálással állítjuk elő, majd centrifugáljuk a lOOxg frakció eltávolítása céljából, és alaposan mossuk a 27300xg frakciót. A homogenizáló és a mosó pufferekben • · · · · • · · · • · · · · ······ ·· · ····

5 proteáz inhibitorok vannak. A I-GM-CSF-nek a placenta membránokhoz való kötődésének számításához (K^=0,86 nmől) a placentamembránokat 1 óra hosszat inkubáljuk 22°C-on, a mintákat 2,5 percig 800xg-vel centrifugáljuk, majd a placentamembrán üledéket kétszer mossuk IMDM-10% FCS-sel. A sejtüledékeket gammaszámlálóval határozzuk meg. A jelzetlen GM-CSF telítési koncentrációját adjuk a kontroll vizsgálatokhoz, hogy az aspecifíkus kötődést vizsgáljuk.

5

Ahhoz, hogy a I-GM-CSF leszorítását mérjük a receptorokról poliklonális antitestekkel, antiszérumot vagy pre-immun szérumot teszünk a kötődés vizsgáló elegyébe. Azokat az antitesteket, amelyek felismerik a GM-CSF-et, a kötődés előtt 10 percig előinkubáljuk KG-1 sejtek vagy placentamembránok hozzáadásával. Az 1418 birka poliklonális antitestet, amely felismeri a GM-CSF receptort, 10 percig előinkubáljuk KG-1 sejtekkel vagy placentamembránokkal. A kötődést I-GM-CSF hozzáadásával inicíáljuk.

125

A 4., 5. és 6. igazolják a I-GM-CSF kompetitív leszorítását a receptorokról a 349-6 (4. ábra), A 345-6 (5. ábra) és az 1418 (6. ábra) antitestekkel a GM-CSF receptorkötési vizsgálatban.

E. KG-1 seit szaporodási vizsgálat

A GM-CSF vizsgálata azon alapul, hogy a KG-1 sejtek szaporodását serkenti. A KG-1 sejtek egy akut mielogén leukémiában szenvedő beteg csontvelejéből származnak. A sejteket mikrotiter lemez lukaiban inkubáljuk a GM-CSF különböző hígításaival 6 napig, majd újabb 4 óra hosszat inkubáljuk az MTT tetrazólium • · • · · sóval [3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazólium-bromid]. Az MTT-t a mitokondriális dehidrogenáz enzimek színes termékké alakítják, formazánná [Mosmann, T.J., Immunological Methods, 65. 55-63 (1983)]. A formazánt savas izopropanollal extraháljuk és spektrofotometriásán mérjük. A megfigyelt optikai sűrűség (lambda=570 nm) közvetlenül arányos a sejtkoncentráció kettes alapú logaritmusával. Az eredményeket delta O.D.-ben fejezzük ki, ahol a delta O.D. a minta optikai sűrűsége, mínusz a GM-CSF-et nem tartalmazó alapvonal kontroll optikai sűrűsége.

Az alábbi táblázat igazolja a birka anti-idiotípusos antitestek (antitestek a 110-127 fragment elleni antitestek ellen) hatását a KG-1 sejtek szaporodására. A táblázatban található értékek a minta optikai sűrűsége, mínusz a GM-CSF-et nem tartalmazó alapvonal kontroll optikai sűrűsége (delta O.D.). A mlkrotiter lemezek 10 ng/ml GM-CSF-et, 10⁴ KG-1 sejtet és birka antiidiotípusos antitest szérumot tartalmaznak, 100 /zl össztérfogatban. A kontroll lukak, amelyek nem tartalmaztak szérumot, optikai sűrűsége 0,087 és 0,019 volt, az I. illetve a II. kísérlet esetében .

4. Táblázat

A birka anti-idiotípusos antitest (1418) hatása a GM-CSF KG-1 sejtszaporodást serkentő hatására

I. Kísérlet II. Kísérlet

Szérum hígítás

Pre-immun

1418

Pre-immun

1418

1:10	0,106	0,059	0,048	0,002
1:20	0,100	0,048	0,053	-0,016
1:40	0,031	0,012	0,049	-0,003
1:80	0,030	-0,005	0,056	-0,006
1:160	0,043	-0,029	0,030	0,002
1:320	0,029	0,001	0,032	0,036

F. Fehérle meghatározások

A fehérje-koncentrációkat Lowry módszerével határozzuk meg [Lowry et al., J. Bioi. Chem., 193, 265 (1951)], ha másként nem említjük, akkor standardként szarvasmarha szérumalbumint használunk .

A találmányban számos módosítás, variáció tehető, anélkül, hogy eltérnénk a szellemétől és oltalmi körétől, amint az nyilvánvalóvá válik a szakterületen jártas szakember számára. Az ismertetett specifikus leírásokat csak példaként adjuk meg, és a találmányt csak a függelékben megadott igénypontok korlátozzák.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK • ·

1. Polipeptid, amely körülbelül 5-23 aminosavből áll, azzal jellemezve, hogy teljesen vagy részben az alábbi aminosav szekvenciával írható le:

H-X(Ser)-X(Phe)-X(Lys)-X(Glu)-X(Asn)X(Leu)-X(Lys)-X(Asp)-X(Phe)-X(Leu)X (Leu) -X (Val) -X (He) -X (Pro) -X (Phe) X(Asp)-Cys - Trp - X (Glu)-X (Pro) X(Val)-X(Gin)-X(Glu)-OH, ahol

X(Ser) jelentése Ser, Alá, Thr, Gly és X(Phe) jelentése Phe és Tyr; X(Lys) jelentése Lys, Arg és Asn; X(Glu) jelentése Glu, Gin, Asp; X (Asn) jelentése Asn, Asp, Ser és Lys; X(Leu) jelentése Leu és Val; X(Asp) jelentése Asp, Asn és Glu; X(Val) jelentése Val, Ile, Alá és Leu; X(Ile) jelentése He, Val és Leu; X (Pro) jelentése Alá és Pro; és X (Gin) jelentése Gin, Glu és His.

2. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy aminosav szekvenciáját az alábbiak közül választhatjuk:

• · · ·

H-Ser-Phe-Lys-Glu-Asn-Leu-Lys-Asp-Phe-Leu-Leu-Val-Ile-Pro-Phe-Asp-Cys-Trp-Glu-Pro-Val-Gln-Glu-OH és

H-Leu-Lys-Asp-Phe-Leu-Leu-Val-Ile-Pro-Phe-Asp-Cys-Trp-Glu-Pro-Val-Gln-Glu-OH.
3. Antitest, azzal jellemezve, hogy specifikusan kötődik a GM-CSF-hez és egy, az 1. igénypont szerinti polipeptidhez, valamint gátolja a GM-CSF kötődését a sejtreceptorokhoz.
4. A 3. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitest.
5. Hibridóma, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerinti monoklonális antitestet termeli.
6. A 3. igénypont szerinti antitest elleni anti-idiotípusos antitest, azzal jellemezve, hogy gátolja a GM-CSF kötődését a sejtreceptorokhoz.
7. A 6. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitest.
8. Hibridóma, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti monoklonális antitestet termeli.
9. Eljárás a GM-CSF sejtreceptoraihoz való kötődésének gátlására, azzal jellemezve, hogy a GM-CSF-et a 3. igénypont • ·· · •·· ··· szerinti antitesttel hozzuk érintkezésbe, mikoris az antitest kötődik a GM-CSF-hez, és ezzel gátolja a GM-CSF kötődését a sejtreceptoraihoz.
10. Eljárás a GM-CSF sejtreceptoraihoz való kötődésének gátlására, azzal jellemezve, hogy a GM-CSF receptorokat tartalmazó sejteket a 3. igénypont szerinti anti-idiotípusos antitesttel hozzuk érintkezésbe, mikoris az antitest kompétíciőba lép a GM-CSF-fel a sejtreceptorokhoz való kötődésben, és ezáltal gátolja a GM-CSF kötődését a sejtreceptoraihoz.
11. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerinti antitestet, valamint egy fiziológiailag elfogadható hordozót tartalmaz.
12. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerinti anti-idiotípusos antitestet és egy fiziológiásán elfogadható hordozót tartalmaz.
13. A 3. igénypont szerinti antitest alkalmazása gyógyászati készítmény előállítására, amely a GM-CSF emlősökben kifejtett hatásának antagonizálására használható.
14. A 6. igénypont szerinti anti-idiotípusos antitest alkalmazása gyógyászati készítmény előállítására, amely a GM-CSF emlősökben kifejtett hatásának antagonizálására használható.