CN103937824A - 一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法 - Google Patents

一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103937824A
CN103937824A CN201410185795.8A CN201410185795A CN103937824A CN 103937824 A CN103937824 A CN 103937824A CN 201410185795 A CN201410185795 A CN 201410185795A CN 103937824 A CN103937824 A CN 103937824A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tilapia
lysozyme
preparation
transgenosis
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410185795.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103937824B (zh
Inventor
叶星
孙成飞
董浚键
瞿兰
卢迈新
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Original Assignee
Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pearl River Fisheries Research Institute CAFS filed Critical Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority to CN201410185795.8A priority Critical patent/CN103937824B/zh
Publication of CN103937824A publication Critical patent/CN103937824A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103937824B publication Critical patent/CN103937824B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于转基因技术领域，具体公开了一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法。本发明将携带有Hsp70启动子驱动的溶菌酶C3基因的Tgf2转座子引入到罗非鱼受精卵内，利用转座子的转座特性将Hsp70启动子和溶菌酶C3基因一起整合到罗非鱼的基因组上，得到能够诱导表达罗非鱼溶菌酶C3的罗非鱼新品系。这一技术不仅能提高罗非鱼的免疫力，达到育成具有较强抗病力的罗非鱼新品种，而且还是首次将Tgf2转座子引入到转基因罗非鱼的构建中，为养殖鱼类导入外源基因开辟了新的方法，具有重要的理论意义和应用价值。

Description

一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法
技术领域
本发明涉及转基因技术领域，具体公开了一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法。
背景技术
罗非鱼隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(Tilapia)，是一种世界性的养殖鱼类。但近年来，由于养殖密度高、养殖环境恶化等原因，养殖罗非鱼暴发了链球菌病，导致养殖罗非鱼的大量死亡，造成巨大的经济损失并威胁着罗非鱼养殖业的健康发展。因此，需要建立一种能有效抵御链球菌病的罗非鱼新品系。
转基因是一种快速高效的改良水产养殖品种性状的方法，关于转基因的方法有很多，而转座子转基因技术因为其操作方便且整合效率高而得到广泛应用。 Tgf2转座子是迄今为止在鱼类中发现的第二例有活性的转座子，能高效地介导目的基因与受体基因组的整合与遗传。目前关于Tgf2转座子报道多集中在产生带红色荧光蛋白标记的团头鲂和斑马鱼，但未见利用Tgf2转座子制备抗病转基因罗非鱼的相关报道。现有技术中关于转基因罗非鱼的报道一直都很少见，原因在于，罗非鱼特殊的繁殖特点导致了体外获得罗非鱼刚受精的卵是非常困难的。
发明内容
本发明为了克服现有技术中难于体外获得刚受精的罗非鱼卵的困难，导致转基因罗非鱼制备受限制的技术缺陷，提供一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案步骤如下：
S1.构建携带罗非鱼Hsp70启动子和溶菌酶C3基因的Tgf2 转座子质粒；
S2.获取产卵后1小时以内、处于单细胞时期的罗非鱼受精卵，具体方法为：将雌性罗非鱼进行室内饲养，控制温度25~30℃，每天14小时的光照，10小时的黑暗，每周投喂二次维生素E；观察、掌握雌性罗非鱼的产卵周期；对处于产卵期的雌性罗非鱼进行人工挤卵，与挤出的雄性罗非鱼的精液混合获得处于单细胞时期的刚受精的罗非鱼卵；
S3.将S1所述的Tgf2 转座子质粒和能够提供转座酶的mRNA一起导入罗非鱼的受精卵中，得转基因F0代罗非鱼；
S4.当F0代罗非鱼长至二月龄时，剪取鳍条提DNA，PCR检测，筛选出阳性个体，待阳性个体饲养至成鱼后与野生罗非鱼交配续代，即得到转基因F1代罗非鱼，再对转基因F1代罗非鱼进行阳性率检测，筛选得到能稳定遗传Hsp70与溶菌酶C3基因的转基因罗非鱼。
罗非鱼在繁殖过程中，雌性罗非鱼将受精卵含在嘴里孵化，孵出小鱼后再吐出来。即雌鱼排卵的同时，雄鱼排精，卵子完成受精后被随即被雌鱼含在口腔中。正是由于罗非鱼这一特殊的生殖方式，导致了难于获得刚受精的罗非鱼卵即处于单细胞期的受精卵以供显微注射。另外罗非鱼的产卵时间和周期会受到营养及外界环境（如温度、光照等）的影响，人工很难准确把握罗非鱼的产卵时间。
本发明首先研究出一种准确获取刚受精的罗非鱼卵的方法，在获取刚受精的罗非鱼卵的基础上，再利用Tgf2 转座子将Hsp70启动子和溶菌酶C3基因一起整合到罗非鱼的基因组上，得到能够诱导表达罗非鱼溶菌酶C3的罗非鱼新品系。从而提高罗非鱼的抗病菌能力。
    所述携带罗非鱼Hsp70启动子和溶菌酶C3基因的Tgf2 转座子质粒包含有Tgf2 转座子的2个转座臂、Hsp70启动子、C型溶菌酶基因3和SV40的多聚腺苷酸识别序列，辅助质粒包含Tgf2 转座子的转座酶基因。
本发明在制备得到转基因F0代罗非鱼后，将其培育达性成熟后，通过与野生型罗非鱼交配，获得能够稳定遗传Hsp70与溶菌酶C3基因的转基因罗非鱼F1代，进而性成熟的F1代个体间配对即可获得F2代转C3基因的罗非鱼。现有技术中在制备转基因鱼时，转植基因的整合率与可遗传率都偏低，因此通常难于获得可遗传品系。本发明借助转座子技术所制备的转溶菌酶C3罗非鱼，经过连续2代的传代筛选，已获得了能够稳定遗传的品系。
不同类型的溶菌酶的抗菌能力不同，不同鱼类来源的溶菌酶的抗菌能力也不同，优选地，本发明所述溶菌酶C3基因为奥利亚罗非鱼的溶菌酶C3基因，经前期实验验证其对无乳链球菌（GBS）等的溶菌能力较强。
优选地，本发明所述罗非鱼受精卵为尼罗罗非鱼的受精卵。
    所述的采用显微注射转植基因的方法的注射时间是产卵后1小时以内、处于单细胞时期的罗非鱼受精卵，优选地，显微注射的Tgf2 转座子的浓度为50ng/μl，转座酶的mRNA的浓度为100 ng/μl，每粒受精卵的注射体积为2nl。
    转溶菌酶基因罗非鱼的挑选和验证方法为：剪取二月龄转基因罗非鱼鳍条提取DNA，在Hsp70启动子上设计上游引物，在溶菌酶C3上设计下游引物，上游引物和下游引物的序列如SEQ ID NO：3~4所示。用上述引物对所提DNA进行PCR扩增。电泳检测PCR结果是否出现阳性带，如果出现就判定为该鱼体为转基因阳性，如果没有阳性带，则判定为该鱼体为阴性个体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首先研究出一种准确获取刚受精的罗非鱼卵的方法，在获取罗非鱼刚受精的卵的基础上，再利用Tgf2 转座子将Hsp70启动子和溶菌酶C3基因一起整合到罗非鱼的基因组上，得到能够诱导表达罗非鱼溶菌酶C3的罗非鱼新品系。从而提高罗非鱼的抗病菌能力。
本发明利用PCR检测方法筛选转基因罗非鱼阳性个体，这种转C3溶菌酶的罗非鱼能够提升罗非鱼的免疫力，达到育成具有抗病能力罗非鱼新品种，为对抗罗非鱼日益严重的病害提出的新的解决方案和对策。另外，开拓了Tgf2 转座子应用于罗非鱼的先河，为拓宽转基因鱼的研究空间打下坚实基础。
附图说明
    图1是Tgf2 转座子质粒的结构图。
    图2是F0代转基因鱼PCR检测结果之一。
    图3是F1代转基因鱼PCR检测结果之一。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作详细的说明，但是实施例记载的范围不会对本发明的保护范围做任何形式的限制。实施例中使用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备，实施例中未详细说明的分子生物学方法可参考本领域常规技术方法。
实施例1：转基因供体质粒pTgf2-Hsp70-C3的构建
以奥里亚罗非鱼cDNA 为模板，采用带有酶切位点的溶菌酶C3-F（AgeI）和C3-R（ClaI）为引物，利用PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TAKARA公司）进行PCR扩增溶菌酶C3基因，条带纯化、回收后克隆到载体pUM19-T 质粒上，酶切、测序鉴定获得 pUM19-T-C3 重组质粒。然后用 AgeⅠ和ClaⅠ双酶切 pUM19-T-C3 重组质粒，回收C3目的片段。
对实验室先前构建保存的pTgf2-Hsp70-eGFP质粒用限制性内切酶AgeI和Cla I进行双酶切，切除pTgf2-Hsp70-eGFP质粒中的 eGFP 片段，回收载体骨架片段。把得到的载体骨架片段与回收的C3目的片段，用 T4 连接酶进行连接，转化到感受态大肠杆菌DH5α中，挑取菌落，在氨苄抗性 LB 液体培养基中培养，取 1 μL 菌液进行 PCR验证，阳性克隆送测序确定结果。酶切、测序鉴定获得pTgf2-Hsp70- C3表达质粒。
扩增带有酶切位点的溶菌酶C3所用的引物如下：
引物C3-F序列：CCACCGGTCGCCACCATGAGGAGTGTGTTTGTTT
引物C3-R序列：CCATCGATTTAAAGACGACATCCGGACAAATAG
    现有技术中，转基因研究中通常选用的管家基因启动子如β-actin以及elongation factor (EF)启动子可能导致外源基因在各组织中过量表达，甚至导致宿主的异常生理状态。本发明中应用的罗非鱼Hsp70启动子属于诱导型启动子，只是在机体受到热激或病菌刺激时才表达，避免了所转植的溶菌酶C3基因持续与广泛的组织表达，从而保障了转基因鱼的正常生理状态。
实施例2：尼罗罗非鱼受精卵的获得
尼罗罗非鱼刚受精的卵的获取非常困难，为获得尼罗罗非鱼1细胞期的受精卵来进行显微注射，需要对罗非鱼进行人工受精。先将健壮的发育成熟的雌雄罗非鱼分别放入室内玻璃缸中饲养，将雌雄罗非鱼用挡板隔开。室内温度控制在25-30℃，并人工控制光照与黑夜时间，每天14小时的光照，10小时的黑暗。而且在罗非鱼的饲料中，每周投喂二次维生素E，增加罗非鱼的繁殖能力。
每日重点观察雌鱼的繁殖活动，定期检测雌性罗非鱼口中是否含有卵。记下雌性罗非鱼每一次产卵的时间，以找到雌性罗非鱼的产卵周期。当到了其产卵周期时，挤出雌鱼的卵和雄鱼的精子进行混合，即得到罗非鱼的受精卵。将受精卵放入流水中孵化，取刚受精的卵进行显微注射即可。
实施例3：尼罗罗非鱼受精卵的显微注射
    采用显微注射方法，将携带溶菌酶基因的Tgf2 转座子质粒pTgf2-Hsp70-C3（如图1所示）及转座酶的mRNA按1：2的比例混合，Tgf2 转座子质粒pTgf2-Hsp70-C3的浓度为50ng/μl，能够编码转座酶的mRNA的浓度为100 ng/μl，然后在罗非鱼产卵1小时内采用显微注射导入受精卵中，导入部位为受精卵的动物极，导入总体积为2nl。在受精卵的动物极注射完毕后，将受精卵放入特制的孵化装置中进行孵化，25 ~28 ℃孵育，定期挑除死胚胎。孵化后即得到转溶菌酶C3基因的F0代罗非鱼。
实施例4：转基因F0代的阳性率检测
    当转基因的F0代罗非鱼长至二月龄时，剪取少量鳍条，提取基因组DNA。并在Hsp70启动子上设计上游引物，在C3溶菌酶上设计下游引物，检测引物如下：
C3转基因检测引物 引物信息
上游引物C3-F-737 GTATCTGAGTCGTTCTTTCG
下游引物C3-R-1799 CTGTGATGCCTTGTTCCCTA
退火温度 55℃
扩增片段长度 1063bp
    用上述引物对提取出的转基因鱼的DNA进行PCR扩增，并对PCR产物进行电泳结果的检测，看其是否有1063的阳性带，如有则判定为阳性个体，否则为阴性个体（如图2）。其中，检测了417尾F0代，其中阳性个体125尾，阳性率为29.98%。
实施例5：转基因F1代的阳性率检测
待F0代阳性罗非鱼长至三月龄，性成熟后与野生罗非鱼进行人工受精，获得F1代的转基因罗非鱼。对获得的F1代转基因罗非鱼采用与实施例4相同的PCR扩增的方法进行阳性率检测。共选取了5尾已达性成熟的雄性F0代与野生型雌性罗非鱼交配，得到子一代F1，再对5组F1代进行检测，其中有3组发现存在阳性个体。其中一组检测了629尾F1代，其中阳性个体246尾，阳性率为39.11%。得到的F1代个体可继续进行自交提纯，同时可以用于后期的病原性的敏感检测和抗病品系的培育纯化。
    综上所述，利用转基因的方法获得转溶菌酶基因的罗非鱼，大大提高了罗非鱼的免疫力，增强了其抗病能力，同时拓展了Tgf2转座子在养殖鱼类中的应用范围，所获得的阳性率与整合率的数据，为考量Tgf2转座子在鲈形目鱼类中的应用前景提供了基础的材料。
                                                SEQUENCE LISTING
 
<110>  中国水产科学研究院珠江水产研究所
 
<120>  一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法
 
<130> 
 
<160>  4    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  34
<212>  DNA
<213>  C3-F
 
<400>  1
ccaccggtcg ccaccatgag gagtgtgttt gttt                                 34
 
 
<210>  2
<211>  33
<212>  DNA
<213>  C3-R
 
<400>  2
ccatcgattt aaagacgaca tccggacaaa tag                                  33
 
 
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  C3-F-737
 
<400>  3
gtatctgagt cgttctttcg                                                 20
 
 
<210>  4
<211>  20
<212>  DNA
<213>  C3-R-1799
 
<400>  4
ctgtgatgcc ttgttcccta                                                 20
 
 

Claims (5)

1.一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.构建携带罗非鱼Hsp70启动子和溶菌酶C3基因的Tgf2 转座子质粒；
S2.获取产卵后1小时以内、处于单细胞时期的罗非鱼受精卵，具体方法为将雌性罗非鱼进行室内饲养，控制温度25~30℃，每天14小时的光照，10小时的黑暗，每周投喂二次维生素E；观察、掌握雌性罗非鱼的产卵周期；对处于产卵期的雌性罗非鱼进行人工挤卵，与挤出的雄性罗非鱼的精液混合获得处于单细胞时期的刚受精的罗非鱼卵；
S3.将S1所述的Tgf2 转座子质粒和能够提供转座酶的mRNA一起导入罗非鱼的受精卵中，得转基因F0代罗非鱼；
S4.当F0代罗非鱼长至二月龄时，剪取鳍条提DNA，PCR检测，筛选出阳性个体，待阳性个体饲养至成鱼后与野生罗非鱼交配续代，即得到转基因F1代罗非鱼，再对转基因F1代罗非鱼进行阳性率检测，筛选得到能稳定遗传Hsp70与溶菌酶C 3基因的转基因罗非鱼。
2.根据权利要求1所述的转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法，其特征在于，所述溶菌酶C3基因为奥里亚罗非鱼的溶菌酶C3基因。
3.根据权利要求1所述的转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法，其特征在于，所述罗非鱼受精卵为尼罗罗非鱼的受精卵。
4.根据权利要求1所述的转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法，其特征在于，显微注射时，每粒受精卵的注射质粒的体积为2nl，其中，Tgf2 转座子质粒的浓度为50ng/μl，辅助质粒的浓度为100 ng/μl。
5.根据权利要求1所述的转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法，其特征在于，转溶菌酶基因罗非鱼阳性个体的筛选方法为：剪取二月龄转基因罗非鱼的鳍条，提取DNA，进行PCR扩增，所用上游引物设计在Hsp70上，下游引物设计在罗非鱼的溶菌酶C3上，能扩增出目的带的个体，即为阳性个体，上游引物和下游引物的序列如SEQ ID NO：3~4所示。
CN201410185795.8A 2014-05-05 2014-05-05 一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法 Expired - Fee Related CN103937824B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410185795.8A CN103937824B (zh) 2014-05-05 2014-05-05 一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410185795.8A CN103937824B (zh) 2014-05-05 2014-05-05 一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103937824A true CN103937824A (zh) 2014-07-23
CN103937824B CN103937824B (zh) 2017-05-10

Family

ID=51185695

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410185795.8A Expired - Fee Related CN103937824B (zh) 2014-05-05 2014-05-05 一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103937824B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110684788A (zh) * 2019-10-24 2020-01-14 岭南师范学院 金鱼c型溶菌酶亚型及其编码基因和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6476290B1 (en) * 1995-04-19 2002-11-05 Dalhousie University Transgenic tilapia comprising a humanized insulin gene
CN101999332A (zh) * 2010-11-26 2011-04-06 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种人工授精的尼罗罗非鱼繁殖方法
CN102337288A (zh) * 2011-09-19 2012-02-01 上海沈李科工贸有限公司 罗非鱼抗菌肽hepcidin的基因工程制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6476290B1 (en) * 1995-04-19 2002-11-05 Dalhousie University Transgenic tilapia comprising a humanized insulin gene
CN101999332A (zh) * 2010-11-26 2011-04-06 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种人工授精的尼罗罗非鱼繁殖方法
CN102337288A (zh) * 2011-09-19 2012-02-01 上海沈李科工贸有限公司 罗非鱼抗菌肽hepcidin的基因工程制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
REX A. DUNHAM: "Transgenic fish resistant to infectious diseases, their risk and prevention of escape into the environment and future candidate genes for disease transgene manipulation", 《COMPARATIVE IMMUNOLOGY, MICROBIOLOGY》 *
叶星等: "转基因鱼的研究进展与商业化前景", 《遗传》 *
瞿兰: "罗非鱼Lysozyme-C3基因在斑马鱼中的转植研究", 《万方学位论文》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110684788A (zh) * 2019-10-24 2020-01-14 岭南师范学院 金鱼c型溶菌酶亚型及其编码基因和应用
CN110684788B (zh) * 2019-10-24 2021-07-27 岭南师范学院 金鱼c型溶菌酶亚型及其编码基因和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103937824B (zh) 2017-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105132427A (zh) 一种以RNA介导的特异性敲除双基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA
CN103409448B (zh) 一种模型小鼠制备方法及条件性细胞剔除重组载体
CN101962660B (zh) 一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法及其载体和载体的制备方法
CN104673815B (zh) 复合型piggyBac重组载体及其制备方法和应用
CN107426986A (zh) 一种培育雄性不育库蚊的方法
Liu et al. The establishment of the fertile fish lineages derived from distant hybridization by overcoming the reproductive barriers
CN106282231A (zh) 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用
CN113088521A (zh) 一种基于CRISPR/Cas9技术的Ahnak2基因敲除动物模型的构建方法
CN103865933B (zh) 一种wap基因在果蝇转基因中的应用
CN105505879B (zh) 一种培养转基因动物胚胎细胞或转基因动物的方法及培养基
CN103141411B (zh) 一种灰海马亲海马配对方法
Liu et al. Interspecific hybridization and genetic characterization of Larimichthys polyactis (♀) and L. crocea (♂)
CN111549031A (zh) 一种草鱼和青鱼肌间刺变粗的分子育种方法
CN111560401A (zh) 一种翘嘴红鲌和团头鲂肌间刺变粗的分子育种方法
CN113234756A (zh) 一种基于CRISPR/Cas9技术的LAMA3基因敲除动物模型的构建方法
CN101962659A (zh) 一种基于Tgf2转座子的鱼类基因转移载体及其制备方法
CN102630616B (zh) 提高半滑舌鳎养殖苗种雌鱼比例的方法
CN105647973B (zh) 一种罗氏沼虾的雌雄性别调控方法
CN110184296B (zh) 一种制备雌雄均高度不育的鳞翅目昆虫的方法及其核酸构建物
CN103937824A (zh) 一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法
US20130053628A1 (en) Method for cultivating a transgenic animal with increased expression amount of porcine growth hormone
CN115720874A (zh) 养殖经济鱼类无肌间刺种质创制方法及应用
CN102241763B (zh) 一种鱼类持续激活生长激素受体基因及制备方法和用途
CN102106322B (zh) 卤虫封闭式培养系统及培养方法
CN101412999A (zh) 一种基因打靶定点转基因方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170510

Termination date: 20200505

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee