WO2013013602A1 - 一种鸡干扰素γ的制备复性方法 - Google Patents

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WO2013013602A1
WO2013013602A1 PCT/CN2012/078994 CN2012078994W WO2013013602A1 WO 2013013602 A1 WO2013013602 A1 WO 2013013602A1 CN 2012078994 W CN2012078994 W CN 2012078994W WO 2013013602 A1 WO2013013602 A1 WO 2013013602A1
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product
dialysis
expression
plasmid
culture
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PCT/CN2012/078994
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张勇
王立红
刘鼎阔
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鼎正动物药业（天津）有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma

Definitions

  • the invention belongs to the technical field of livestock and poultry medicine, in particular to a preparation and renaturation method of chicken interferon. Yes, the background technology is
  • Interferon ⁇ Interferon
  • the effect on the activity of host immune cells can increase the expression of MHC class II molecules on the surface of macrophages and enhance their antigen-presenting ability.
  • Fc receptors on the surface of macrophages and promote macrophage phagocytic immune complexes. , antibody-coated pathogens and tumor cells. Under suitable conditions, ⁇ can promote the differentiation of B cells and CD 8+ T cells. In addition, IFNY also has the effect of stimulating neutrophils, activating NK cells, etc., and has a broad spectrum of antiviral and antitumor effects. Yes
  • the product is in the form of inclusion bodies.
  • the expression product is dissolved in a solution of high concentration denaturing agent (phosphate buffer containing normal urea), and the affinity chromatography resin is added to completely wash away the impurity protein without this label.
  • the recombinant protein was purified by using a pot which was eluted with a buffer of «. Yes: After confirming that the purified product is the target protein, the concentration of the denaturant is slowly reduced to the following by dialysis, and then using renaturation buffer, total » oily. Yes
  • Interferon is a small molecule protein, which has the disadvantages of conformational instability and over-expression in the expression process and aggregation into inclusion bodies.
  • the expression product is prone to the form of tight inclusion bodies, which is not conducive to purification and complexation. Sex, not conducive to the spatial conformation of interferon.
  • a high concentration of denaturing agent needs to be introduced, and the purity of the purified product is not high (about maintenance, the renaturation process is cumbersome, the success rate of renaturation between batches is small, and the biological activity of the refolding product is low, resulting in the final drug formation. The cost is extremely high.
  • the object of the present invention is to overcome the deficiencies of the prior art and to provide a method for preparing a chicken interferon Y with high yield and high protein activity. (5)
  • a method for preparing a chicken interferon Y which comprises the following steps: (5)
  • step (1) subcloning the product of step (1) onto an expression vector with a marker
  • step (3) transforming the product of step (2) into E. coli cells; (5)
  • step (3) inducing and expressing the product of step (3), followed by cleavage to obtain an expression product; (5)
  • the purified recombinant protein is subjected to renaturation treatment to obtain a finished product.
  • the amplification process in the step (1) is: (5)
  • Taq enzyme (Takara): 1.25 U hPLOK: 32.75 ⁇ I Total reaction system volume: 50 ⁇ ;
  • step (2) the subcloning process in the step (2) is:
  • the product of the T clone was transformed into [>5 ⁇ competent cells, and a single bacterial clone picked up overnight was inoculated into a 5rrli LKt body culture set, and 220r ⁇ nil n was cultured overnight at 37 ° C with shaking;
  • the extracted plasmid was subjected to double enzyme digestion verification of I o I and H nd 111, and the positively verified plasmid was sequenced, and the sequencing result was compared with the cl FNY gene sequence, and the perfectly matched plasmid was judged as a positive plasmid;
  • the above ligated product was transformed into a competent cell, and a single bacterial clone picked up overnight was inoculated into the lower liquid culture concentration, and cultured overnight with shaking.
  • the plasmid of the culture product was extracted with a plasmid mini-kit and subjected to ⁇ and AV nd / / / double digestion, and the source strain of the plasmid which was verified to be positive by restriction enzyme was defined as a positive strain for expression of chicken interferon ⁇ . .
  • the conversion process in the step (3) is:
  • the induced expression product was collected by centrifugation.
  • the volume of the phosphate buffer containing urea (the value of the product was dissolved in the vine, during the period «, the interval was ultrasonicated to lyse the expression product.
  • the purification process in the step (5) is: adding, in the cleavage-expressed expression product, an affinity chromatography resin, and entanglement and shaking to adsorb the target protein entanglement, respectively, using a urea containing a value of « ⁇
  • the phosphate buffer was washed away to remove the heterologous protein, and the recombinant protein was eluted with a value of urea phosphate buffer. Minute
  • the process of the renaturation process in the step (6) is:
  • the value of the recombinant protein is dissolved in a phosphate buffer containing urea, firstly, the content of the target protein in the phosphate buffer is adjusted to 3 ⁇ 4 swollen, and then transferred to a dialysis bag;
  • the sample in the dialysis bag is taken out and placed in a beaker, and added thereto.
  • step (3) Put the product of step (3) into the dialysis bag again for two dialysis, and divide the first dialysis: the sodium dihydrogen phosphate, the urea of the dialysate, the sodium chloride of the tumor, the tumor of the tumor.
  • dialysis time is 3 ⁇ 41, hour; second dialysis: dialysate from sodium dihydrogen phosphate, urea, pass Sodium chloride, tumor surname,
  • M glycerin, parts, » tumor &] and ⁇ -cyclodextrin, dialysis time is 3 ⁇ 41, hour;
  • the dialysate consists of sodium dihydrogen phosphate, sodium sulfonate, sodium, and: M glycerin;
  • the present method uses an expression vector in which a small molecule thrombin sequence and an enterokinase restriction sequence and a plurality of amino acid helper sequences are added after the initiation codon, and the above sequence and target gene are expressed. Co-expression, so that the molecular weight of the expressed product reaches «, resulting in the product no longer exists in the form of tight inclusion bodies, easy for subsequent purification and renaturation work, and is conducive to ensuring the spatial conformation of interferon.
  • the method of using this method uses Escherichia coli vine cells as host cells, and the warm expression vector carrying the chicken interferon ⁇ gene can be highly expressed.
  • the final expression product although present in the form of inclusion bodies, can be used in a lower concentration of urea denaturing agent. Dissolving, reducing production costs, is conducive to improving the purity of recombinant proteins and the success rate of renaturation treatment.
  • the small molecule additive used in the method can increase the solubility of the folded intermediate and the unfolded molecule during the renaturation process to improve the renaturation success rate.
  • the cockroach belongs to the detergent and can remove the inclusions in the interferon molecule.
  • the heteroprotein molecule facilitates collision and correct folding of interferon molecules during renaturation.
  • ⁇ has a hydrophobic cavity that binds to the hydrophobic site of the denatured protein polypeptide chain, inhibiting aggregation and inactivation of each other, thereby promoting peptide
  • the strand is correctly folded into an active protein, and the urine belongs to an oxidative exchange system, which promotes the rapid exchange of disulfide bonds that are incorrectly formed in the interferon molecule, and improves the paired yield of the correctly paired disulfide bond.
  • the present invention uses a warm expression vector and an E. coli host cell, and the purified product of the chicken interferon gamma gene is purified to a purity of j3 ⁇ 4 which is much higher than the conventional method and the yield of the protein after renaturation can be earned, which is much higher than that.
  • the traditional method of 4 renaturation success rate is much higher than the increase in the total active protein in the total protein made by the traditional method, which improves the therapeutic effect and reduces the cost.
  • a method for preparing a chicken interferon Y comprises the following steps: cultivating the eleven chicken interferon Y gene for amplification;
  • the amplification process is: Acid Identification Primer Design and Synthesis: According to the obtained Y gene sequence culvert:
  • Wi upstream primer ⁇ «3 ⁇ 4 ⁇
  • J3 ⁇ 4 denaturing solution »Cycle: j3 ⁇ 4 denaturing acid, «annealing, ⁇ extension extension, ;
  • the plasmid was subjected to double enzyme digestion verification by N) I and H nd III, and the positively verified plasmid was sent to Shanghai Handsome Biotechnology Co., Ltd. for sequencing, and the sequencing result and cl FNy gene sequence ⁇ i" (Gfenbank accessi on nuntoer: AY705909) The matched, perfectly matched plasmid was positive.
  • a positive plasmid and pET32a expression vector were separately digested with ⁇ I and W nd / ⁇ , and the digested product was recovered by Takara Glue Recovery Kit.
  • the positive plasmid was digested and recovered: 0. 5 ⁇ I
  • the pEH32a expression vector was digested to recover the product: 4. 5 ⁇ I Total binding system volume: 10 ⁇ ⁇
  • the reaction system was mixed and incubated overnight at 16 °C.
  • the above ligated product was transformed into M5 competent cells, and a single bacterial clone picked up overnight was inoculated into a 5 rrli LB liquid culture set, and cultured overnight at 37 ° 0 with shaking.
  • the plasmid of the culture product was extracted with Taka "a plasmid miniprep kit and subjected to ⁇ I and AV nd / / / double digestion, and the source strain of the plasmid which was verified to be positive by restriction enzyme was defined as a positive strain for chicken interference.
  • the expression of prime Y The expression of prime Y.
  • step 3 The product of step 2 is transformed into E. coli M 5 cells;
  • step 4 Inducing and expressing the product of step 3, followed by cleavage to obtain an expression product
  • step 4 Purification of the expression product of step 4; the purification process is: in the cleavage of the expressed product, ⁇ - ⁇ affinity chromatography resin is added, and the target protein 30rrii n is shaken at intervals of 30 s, and the pH is directly 6. 3 and 5.9 phosphate buffers containing 4% were washed away with the 6H s-labeled heteroprotein, and the recombinant protein was eluted with a buffer containing 4 ⁇ g of ⁇ .
  • the purified recombinant protein is subjected to renaturation treatment to obtain a finished product.
  • the process of renaturation is:
  • a phosphate buffer containing 4% of the recombinant protein is dissolved in 0.45, and the content of the target protein in the phosphate buffer is first adjusted to 100 ⁇ g / rrli, and then It is transferred to the dialysis bag;
  • the dialysis bag was sequentially dialyzed into a phosphate buffer containing 5.9 ⁇ g, 5.9, 6.3, and 7.2, and dialyzed for 3 hours in three phosphate buffers; 3) After the three dialysis is completed, the sample in the dialysis bag is taken out and placed in a beaker, and 1°/c3 ⁇ 4 is added thereto.
  • step (3) The product of step (3) is again placed in a dialysis bag for two dialysis, the first dialysis: the dialysate consists of 40r «sodium dihydrogen phosphate, 2.5 urea, 150r « sodium chloride, 0.4 L- Ar g, 20° glycerol, 4 token 0. 4r «GBSa 0.
  • dialysate consists of sodium dihydrogen phosphate, urea, tumescent sodium chloride, tumor surname, : M glycerol, pieces, » tumor &] and
  • the composition of ⁇ -cyclodextrin, dialysis time is 3 ⁇ 41, hour; sub-(5) dialysis bag after two dialysis continues to be placed in the following dialysate for dialysis, when the dialysate is sodium dihydrogen phosphate, Sodium chloride, » and: M glycerol;
  • the yield of the current process protein can be quantitatively detected after the thorn is refolded.
  • the protein concentration is about medium. According to the cytological test, it is found that the total protein concentration obtained by the present invention is in the middle, wherein the content of the interferon active ingredient is equivalent to the total protein concentration of the conventional method, and it can be seen that the interferon is used by the method of the present invention. The active ingredients are greatly improved. Minute
  • the activity test of the recombinant protein obtained by the conventional method and the present invention is shown in Fig. B.
  • the test cell is a cell, and the virus is .
  • the ordinate on the graph indicates the value (absorbance), the larger the value indicates the higher the cell viability; the abscissa indicates the data without adding virus and interferon; the data indicating that the interferon is not added with the virus; indicates that no interferon is added Only viruses are added; other values indicate the concentration of interferon added. From the data of Fig. 2, it can be seen that the interferon produced by the present invention protects cells significantly better than the conventional method.
  • the expression vector and the Escherichia coli host cell are used, and the purified product of the chicken interferon Y gene is purified to have a purity higher than that of the conventional method. 3 ⁇ 4 and the protein yield after renaturation can be achieved, which is much higher than that of the traditional method. The renaturation success rate is much higher than that of the traditional method -m. The total active protein in the total protein is increased. Improve the treatment effect and reduce the cost. Minute

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Abstract

提供了一种鸡干扰素Y的制备和复性方法，包括以下步骤：（1）对鸡干扰素Y基因进行PCR扩增；（2）将步骤（1）的产物亚克隆到带有6His标记的pET32a表达载体上；（3）将步骤（2）的产物转化到大肠杆菌M15细胞内；（4）将步骤（3）的产物进行诱导与表达，然后裂解获得蛋白质表达产物；（5）将步骤（4）的表达产物纯化；（6）将纯化后的重组蛋白复性处理后得到产品。通过使用pET32a和大肠杆菌M15，使鸡干扰素Y基因的表达产物纯化后的纯度为95%，高于传统方法的85%，复性后蛋白质得率可达到95μg/ml，高于传统方法的30μg/ml，复性成功率达到38-39%，高于传统方法的20%。制备的总蛋白中的有效成分增加，提高了治疗效果，降低了成本。

Description

种鸡干扰素 Y的制备复性方法是 技术领域是
本发明属于畜禽药物技术领域， 尤其是一种鸡干扰素 Υ的制备复性方法。 是 背景技术是
在禽类养殖业中， 由病毒引起的传染病约占病害总量的 些殖 防治这些病害常采用疫 苗和抗生素， 但疫苗无法抵挡病原的变异和新型病害的出现， 抗生素存在药物残留、 药效 较低的缺点。 人们通过研究， 开发出可干扰病毒在感染和非感染组织中复制的干扰素， 其 中的干扰素 Υ ( 型干扰素） 具有很强的免疫调节能力， 是体内最重要的免疫调节因子， 主要 表现在对宿主免疫细胞活性的影响， 可使巨噬细胞表面 MHC II类分子的表达增加， 增强其抗原递呈能 力；还能增强巨噬细胞表面表达 Fc受体,促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。 适宜条件下， ΙΞ^γ可促进 B细胞和 CD8+ T细胞的分化。 此外， IFNY还具有刺激中性粒细胞、 活化 NK 细胞等作用， 具有广谱的抗病毒抗肿瘤效用。 是
如申请号为
Figure imgf000003_0001
公开号为 ， 专利名称为鸡干扰素 Y 及其制 备方法和用途的中国专利公开的技术方案： 是
«据 Y基因序列 ： i ， 设计含是 和 是 限制性酶切位点的引物， 对经聚肌胞用 感染的依莎褐鸡脾脏 进行扩 增， 获得 γ 成熟肽基因的编码序列， 将该序列亚克隆到 端带有这 标记的 Si 表达载体上， 并转化到大肠杆菌感受态细胞中。 是
经酶切测序鉴定的阳性克隆经 培养基培养并用 诱导表达 Y。 是
«达产物以包涵体形式存在， 在高浓度变性剂 （含有 常 尿素的磷酸缓冲液） 溶液 中溶解表达产物， 加入 亲和层析树脂， 用缓冲液 彻底洗掉不带有 这 标记的杂蛋白， 重组蛋白分别用是鍋是 和是 « 的缓冲液洗脱得到纯化产物。 是 «测确定纯化产物为目标蛋白后， 通过透析将变性剂浓度缓慢降至 遷治 以下， 然 后利用 复性缓冲液 s提 ， ， 总 »油 性。 是
干扰素属于小分子蛋白， 其本身具有构象不稳定和在表达过程中易过量表达而聚集成 包涵体等缺点， 采用上述方法时， 表达产物容易出现紧密的包涵体的形式， 不利于纯化和 复性， 不利于干扰素的空间构象。 是 表达产物纯化过程中需要引入高浓度的变性剂， 纯化后产物纯度不高（约保職， 复性 过程繁琐， 批次间复性成功率小， 而且复性产物生物学活性低导致最终成药的成本极高。 （5) 发明内容 (5)
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处， 提供产率高、 蛋白活性高的一种鸡干扰 素 Y的制备复性方法。 （5)
本发明采用的技术方案是： （5) 一种鸡干扰素 Y的制备复性方法， 其特征在于： 包括以下步骤： （5)
(1)对鸡干扰素 Y基因进行 扩增； （5)
(2)将步骤 (1)的产物亚克隆到带有延 标记的 表达载体上； （5)
(3)将步骤 (2)的产物转化到大肠杆菌 细胞内； （5)
(4)将步骤 (3)的产物进行诱导与表达， 然后进行裂解获得表达产物； （5)
(5)将步骤 (4)的表达产物纯化； （5)
(6)将纯化后的重组蛋白进行复性处理后得到成品。 （5) 而且， 所述步骤 (1)中的 扩增过程是： （5)
(1)根据获得的 Y基因序列， 设计含 和〃/^〃/限制性酶切位点的引物 和 ； （5)
(2)用 法提取经聚肌胞琼 感染的依莎褐鸡脾脏的 并反转录成 作为 扩增模板； （5)
(3) 扩增 (5) 模板： （TOTOffi¾ii (5) 反应缓冲液： （& (5) 歡 5) « (¾TOTOfn (5)
t mmm (5)
上游引物： （TO5KTti (5) 10nMf游引物： 1 μΙ
Taq酶 （Takara): 1.25U hPLOK: 32.75 μ I 反应体系总体积： 50μΙ；
94°C变性 5nii n; 30个循环： 94°C变性 1nii n， 54°C退火 45s， 72°C延伸 45s; 72°C延伸 10nii n;
10°C保温。 而且， 所述步骤 (2)中的亚克隆过程是：
(1)将 PCF扩增后的产物用 1.5° 琼脂糖凝胶进行电泳， 用 Takara胶回收试剂盒回收目 标基因；
(2)进行 隆：
10Xi¾¾EUffer， 含 T4连接酶： 5μΙ P 18T载体： 0.5μΙ
PGR回收产物： 4.5μΙ 连接体系总体积： 10 μΙ
混匀反应体系， 置于 16°C孵育过夜；
(3) PCR产物的验证：
①将 T克隆的产物转化至 [>5α感受态细胞， 挑取过夜培养的单个细菌克隆接种于 5rrli LKt体培养集中， 220r ρητί nil n于 37°C振荡培养过夜；
②用 Taka「 a质粒小提试剂盒提取培养产物的质粒；
③提取的质粒进行 I o I和 H nd 111双酶切验证， 将验证为阳性的质粒进行测序， 测 序结果与 cl FNY基因序列比对， 完全匹配的质粒判为阳性质粒；
(4)进行亚克隆：
①将阳性质粒和 pET32a表达载体分别进行 Ato I和〃 nd I〃双酶切， 用 Takara胶回收 试剂盒回收酶切产物； ②回收产物连接： 分 连接 ， 含件连接酶： 分 分 阳性质粒酶切回收产物： 分¾»分 表达载体酶切回收产物： 分 分 连接体系总体积： 應分
混匀反应体系， 置于 «孵育过夜； 分
③将上述连接产物转化至 ^感受态细胞， 挑取过夜培养的单个细菌克隆接种于 下 液体培养集中， 中 于«振荡培养过夜。 用 质粒小提试剂盒提取培 养产物的质粒并进行 Λ^ο 和 AV nd / / /双酶切， 将酶切验证为阳性的质粒的来源菌株定义 为阳性株， 用于鸡干扰素 γ的表达。 分 而且， 所述步骤 (3)中的转化过程是： 分
(1)取出冻存的 感受态细胞受勾自促 ， 冰浴 Ί¾ 待其溶解， 加入 » 连接 产物， 轻微振荡混匀， 立即静置冰浴 ； 分
(2)将此混合物置于 a水浴 ¾g， 迅速将反应物置于冰上宜 ， 加入^ ¾ι分 培养 基于«摇床上逮權巾 振荡培养 f ； 分
(3)取出培养物， 将培养液涂布于含 的平板上， 待反应液被平板吸干后， 倒置平板于«恒温摇床培养过夜； 分
(4)化后， 取出平板检查， 并进行克隆筛选； 分 而且， 所述步骤 (4)中的诱导与表达及裂解的过程是： 分
(1)将筛选所得的阳性克隆接种于適 含 及 的 培养基中 中 于«振 荡培养过夜； 分
(2)按 Ί¾接种量转接过夜培养产物于新鲜的 培养基中， 中 于«振荡培 至 为瘤 加入痛化 的 诱导表达培养件； 分
(3Μ 离心下 收集诱导表达产物。 用 体积的含有件尿素的磷酸盐缓冲液 （ 值为外藤 溶解表达产物， 期间 «， 间隔化超声化超声通 裂解表达产物。 分 而且， 所述步骤 (5)中的纯化的过程是： 在裂解完成的表达产物中， 加入 亲和层 析树脂， 间隔缠翻转摇动吸附目标蛋白缠 ， 分别用 值为 «ΒΊϋ的含有件尿素的磷 酸缓冲液洗去不带有化 标记的杂蛋白， 用 值为 含有件尿素磷酸缓冲液洗脱得到 重组蛋白。 分
而且， 所述步骤 (6)中的复性处理的过程是： 分
(1)纯化后得到的是溶解有重组蛋白的 值为 含有件尿素的磷酸缓冲液， 首先将 该磷酸缓冲液中目标蛋白的含量调至¾肿 ， 然后将其转移至透析袋内； 分
(2)将透析袋依次放入 值为 H刺 «口]¾的含有条尿素的磷酸缓冲液内透析， 三种 值的磷酸缓冲液中均透析: a、时； 分
(3)在三次透析完毕后， 将透析袋中的样品取出并置于烧杯内， 向其中加入
， 于放置在 c的磁力搅拌器上 中 搅拌 ， 再加入终浓度为 菌 的 β 环糊精中， 于放置在 j€的磁力搅拌器上催中 搅拌 ； 分
(4)将步骤 (3)的产物再次放入透析袋内进行两次透析， 分 第一次透析：透析液由 的磷酸二氢钠、達^ "的尿素、通瘤 的氯化钠、瘤姓的 、
： M甘油、 件 的 、 » 的 、 瘤&] 和 f瘤 的 β 环糊精构成， 透析 时间为 ¾1、时； 分 第二次透析：透析液由 的磷酸二氢钠、通 的尿素、通瘤 的氯化钠、瘤姓的 、
： M甘油、 件 的 、 » 的 、 瘤&] 和 的 β 环糊精构成， 透析 时间为 ¾1、时； 分
(5)两次透析后的透析袋继续放入以下透析液内透析适 W、时， 透析液由 的磷酸二氢 钠、 通瘤 的氯化钠、 »的 和: M甘油构成； 分
(6)转移步骤 (5)得到的产物于烧杯中， 向其中加入: 1ψ 的重组牛肠激酶， «条件下 作用适 ω、时后即完成复性处理。 分
本发明的优点和积极效果是： 分
适 本方法使用 表达载体， 该表达载体中在起始密码子后添加一小分子凝血酶 序列和和肠激酶酶切序列以及 多个氨基酸的辅助序列， 在表达式上述序列与目标基因 共同表达， 使得表达产物的分子量达到 « ， 导致产物不再以紧密的包涵体形式存在， 易于后续的纯化和复性工作， 并有利于保证干扰素的空间构象。 鉴
缓本方法使用大肠杆菌藤细胞作为宿主细胞， 带有鸡干扰素 γ基因的 暖 表达 载体可以高效表达， 最后表达产物虽然以包涵体形式存在， 但可以在较低浓度的 液 的尿 素变性剂中溶解， 降低了生产成本， 有利于提高重组蛋白的纯度和复性处理的成功率。 鉴 冲 本方法中使用的 属于小分子添加剂， 可增加复性过程中折叠中间体和未折叠 分子的可溶性来提高复性成功率， 醵瞵 属于去污剂， 能剔出干扰素分子中夹杂的 杂蛋白分子， 有利于复性过程中干扰素分子间的碰撞和正确折叠， β 具有疏水性空腔， 能与变性蛋白质多肽链的疏水性位点结合， 抑制其相互聚集失活， 从而促进肽链正确折叠 为活性蛋白质， 尿 属于氧化交换系统， 能促进干扰素分子中不正确形成的二硫键快 速交换， 提高正确配对的二硫键的配对产率。 鉴
液本发明使用 暖 表达载体和大肠杆菌 ^宿主细胞， 使鸡干扰素 γ基因高效表 达的产物纯化后的纯度为 j¾ 大大高于传统方法的 而且复性后蛋白得率可以达到 賺 ， 大大高于传统方法的 4蒙 ， 复性成功率高达 远远高于传统方法的 im 制成的总蛋白中有效成分增加， 提高了治疗效果， 降低了成本。 鉴
具体实》式
下面结合实施例， 对本发明进一步说明， 下述实施例是说明性的， 不是限定性的， 不 能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 鉴 一种鸡干扰素 Y的制备复性方法包括以下步骤： 鉴 應肘鸡干扰素 Y基因进行 扩增； 鉴
扩增过程是： 鉴 酸 引物设计并合成： 根据获得的 Y基因序列涵盤 ：
， 用溶 软件设计含 Ato f 和 H nd〃/限制性酶切位点的引物 ， (ΧΆΤΟ^Φ ， 細藤 ， - fiAK T 冲 ， ？ 有下划线的黑体分别代表/ Nfco / nd〃/限制性 酶切位点形 提交上海英俊生物技术有限公司合成。 鉴 缓 获取模板： 用 法提取经聚肌胞析 感染的依莎褐鸡脾脏的 并反转录 成 作为扩增模板。 鉴
冲 扩增反应体系： 鉴
m 反应缓冲液： »鉴
wi 上游引物： ^^«¾ί鉴
WI 下游引物： ^^»¾ί鉴
水： 墨飾鉴 反应体系总体积： »鉴
j¾变性溶 ； »循环： j¾变性酸 ，«退火 ， ^延伸 延伸, ；
«保温。 鉴
缓輕步骤動产物亚克隆到带有解 标记的？暖 表达载体上； 鉴
酸 将所述步骤 的 扩增产物用酸 »]琼脂糖凝胶进行电泳， 用 胶回收试 剂盒回收目标基因。 鉴
缓 参照下述方法进行 克隆： 鉴
«连接 （含液连接酶， 购自 ）： »鉴
« 载体： 鉴
回收产物： 鉴 连接体系总体积： »鉴
混匀反应体系， 置于醆 孵育过夜。 鉴
冲 产物的验证： 鉴
. 将上述连接产物转化至溶 α感受态细胞， 挑取过夜培养的单个细菌克隆接种于 5rrli LKt体培养集中， 220r ρητί nil η于 37°C振荡培养过夜。
B用 Taka「 a质粒小提试剂盒提取培养产物的质粒。
C将质粒进行 N ) I和 H nd I I I双酶切验证， 将验证为阳性的质粒送至上海英俊生物 技术有限公司测序， 测序结果与 cl FNy基因序歹 i」（Gfenbank accessi on nuntoer： AY705909 ) 比对， 完全匹配的质粒判为阳性。
4) 参照下述方法进行亚克隆：
A将阳性质粒和 pET32a表达载体分别进行 Λ^Ο I和 W nd /〃双酶切， 用 Takara胶回收 试剂盒回收酶切产物。
B回收产物连接：
10Χίί接 EUf f er (含 T4连接酶， 购自 Takara): 5 l
阳性质粒酶切回收产物： 0. 5 μ I
pEH32a表达载体酶切回收产物： 4. 5 μ I 连接体系总体积： 10 μ Ι
混匀反应体系， 置于 16°C孵育过夜。
C将上述连接产物转化至 M5感受态细胞， 挑取过夜培养的单个细菌克隆接种于 5rrli LB 液体培养集中， 220|^^ ^^于37°0振荡培养过夜。 用 Taka「 a质粒小提试剂盒提取培养产物 的质粒并进行 Λ^Ο I和 AV nd / / /双酶切， 将酶切验证为阳性的质粒的来源菌株定义为阳性 株， 用于鸡干扰素 Y的表达。
3.将步骤 2的产物转化到大肠杆菌 M 5细胞内；
1 ) 取出冻存的 M5感受态细胞 (购自 Takara)， 冰浴 5- 10nii n待其溶解， 加入 10 μ I连接 产物， 轻微振荡混匀， 立即静置冰浴 30rrii n。
2) 将此混合物置于 42°C水浴 90s， 迅速将反应物置于冰上 2nii n， 加入 800 μ I SGC培养 基于 37°C摇床上 140r pn?( nil n振荡培养 45nii n。
3)取出培养物， 将培养液涂布于含 lOO g/ rrli AIVP的平板上， 待反应液被平板吸干后， 倒置平板于 37°C恒温摇床培养过夜。 4) 16h后， 取出平板检查， 并进行克隆筛选。
4.将步骤 3的产物进行诱导与表达， 然后进行裂解获得表达产物；
1 ) 将筛选所得的阳性克隆接种于 10rrli含 ;^I f¾K¾na的 LBt咅养基中 220r pn?( nil n于 37°C振 荡培养过夜。
2) 按 5°/釣接种量转接过夜培养产物于新鲜的 LBt音养基中， 220r pnTf rri n于 37°C振荡培 养至 C oo约为 0. 6， 加入 0. 6r«l F G秀导表达培养 4h。
3) 6000g离心 5rrii n收集诱导表达产物。 用 20倍体积的含有 4^素的磷酸盐缓冲液 （pH 值为 8. 0) 溶解表达产物， 期间 600W 间隔 6s超声 6s超声 150次裂解表达产物。
5.将步骤 4的表达产物纯化； 纯化的过程是： 在裂解完成的表达产物中， 加入 Ν - ΝΓΑ亲和层析树脂， 间隔 30s翻转摇动吸附目标蛋 白 30rrii n， 分别用 pHf直为 6. 3和 5. 9的含有 4^素的磷酸缓冲液洗去不带有 6H s标记的杂蛋 白， 用 ρΗί直为 4. 3的含有 4^素磷酸缓冲液洗脱得到重组蛋白。
6.将纯化后的重组蛋白进行复性处理后得到成品。 复性处理的过程是：
(1)纯化后得到的是溶解有重组蛋白的 ρΗί直为 4. 3且含有 4^素的磷酸缓冲液， 首先将 该磷酸缓冲液中目标蛋白的含量调至 100 μ g/ rrli， 然后将其转移至透析袋内；
(2)将透析袋依次放入 ρΗί直为 5. 9、 6. 3和 7. 2的含有 3^素的磷酸缓冲液内透析， 三种 ρΗί直的磷酸缓冲液中均透析 2小时； (3)在三次透析完毕后， 将透析袋中的样品取出并置于烧杯内， 向其中加入 1°/c¾
Tr i t onX- 100， 于放置在 4°C的磁力搅拌器上 60r pn?( nil n搅拌 30nii n， 再加入终浓度为 400η1/Ι 的 β -环糊精中， 于放置在 4°C的磁力搅拌器上 60r ρητί nil n搅拌 60nii n;
(4)将步骤 (3)的产物再次放入透析袋内进行两次透析， 第一次透析：透析液由 40r«磷酸二氢钠、 2. 5 尿素、 150r«氯化钠、 0. 4 L- Ar g、 20° 甘油、 4„ 0. 4r«GBSa 0. 1° Tr i t on- X100和 40r« β -环糊精构成， 透析 时间为 ¾l、时； 分 第二次透析：透析液由 的磷酸二氢钠、通 的尿素、通瘤 的氯化钠、瘤姓的 、 ： M甘油、 件 的 、 » 的 、 瘤&] 和 的 β 环糊精构成， 透析 时间为 ¾1、时； 分 (5)两次透析后的透析袋继续放入以下透析液内透析适 W、时， 透析液由 的磷酸二氢 钠、 通瘤 的氯化钠、 »的 和: M甘油构成； 分
(6)转移步骤 (5)得到的产物于烧杯中， 向其中加入: 1ψ 的重组牛肠激酶， «条件下 作用适 W、时后即完成复性处理。 分 复性后的重组蛋白的活性试验分 通在进行透析复性前， 蛋白质的浓度均为 中 ， 在复性过程中， 传统方法在变性 剂尿素浓度降至条左右时， 蛋白质开始大量聚集形成沉淀， 而本发明中没有沉淀的产生， 复性工艺完成后， 传统方法中蛋白质存量仅为纏中 左右， 损失约为雌， 现工艺的蛋白 得率可达刺呈 复性后通过定量检测其蛋白浓度约为 中 。 分 達通过细胞学试验验证得知， 本发明得到的总蛋白质浓度为應中 时， 其中干扰素 有效成分的含量相当于传统方法总蛋白质浓度为纏中 ， 可见， 使用本发明的方法， 干 扰素有效成分大大提高。 分
缀传统方法与本发明得到的重组蛋白的活性试验见图适 图寶 B图条 试验细胞为 细 胞， 病毒为 。 图中的纵坐标表示 值 （吸光度）， 数值越大表示细胞存活率越高； 横坐 标中， 表示不添加病毒和干扰素的数据； 表示添加干扰素不添加病毒的数据； 表示不添加干扰素只添加病毒； 其它的数值表示添加的干扰素的浓度。 分 由图^]数据可知， 本发明制得的干扰素对 细胞的保护明显好于传统方法。 分 本发明使用^: 表达载体和大肠杆菌 ^宿主细胞， 使鸡干扰素 Y基因高效表达的 产物纯化后的纯度为刺呈 大大高于传统方法的夕！ ¾ 而且复性后蛋白得率可以达到 謹中 ， 大大高于传统方法的纏中 ， 复性成功率高达条 菊歷 远远高于传统方法的 -m. 制成的总蛋白中有效成分增加， 提高了治疗效果， 降低了成本。 分

Claims

权利要求书
、 一种鸡干扰素 Y的制备复性方法， 其特征在于： 包括以下步骤：
(1)对鸡干扰素 Υ基因进行 扩增；
(2)将步骤 (1)的产物亚克隆到带有 标记的 表达载体上；
(3)将步骤 (2)的产物转化到大肠杆菌 细胞内；
(4)将步骤 (3)的产物进行诱导与表达， 然后进行裂解获得表达产物；
(5)将步骤 (4)的表达产物纯化；
(6)将纯化后的重组蛋白进行复性处理后得到成品。
、 根据权利要求 所述的一种鸡干扰素 Υ的制备复性方法， 其特征在于： 所述步骤 (1) 中的 扩增过程是：
(1)根据获得的 γ基因序列， 设计含 Λ^ο /和 H nd / / /限制性酶切位点的引物 和 ；
(2)用 法提取经聚肌胞 感染的依莎褐鸡脾脏的 并反转录成 作为 扩增模板；
(3) 扩增 模板： μ 反应缓冲液： μ
： μ
μ 上游引物： μ 下游引物： μ
酶 （ ）： 水： μ 反应体系总体积： μ ；
94°C变性 5nii n; 30个循环： 94°C变性 1nii n， 54°C退火 45s， 72°C延伸 45s; 72°C延伸 10nii n; 10°C保温。
3、 根据权利要求 1所述的一种鸡干扰素 Y的制备复性方法， 其特征在于： 所述步骤 (2) 中的亚克隆过程是：
(1)将 PCF扩增后的产物用 1.5° 琼脂糖凝胶进行电泳， 用 Takara胶回收试剂盒回收目 标基因；
(2)进行 隆：
10Xi¾¾EUffer， 含 T4连接酶： 5μΙ P 18T载体： 0.5μΙ
PGR回收产物： 4.5μΙ 连接体系总体积： 10 μΙ
混匀反应体系， 置于 16°C孵育过夜；
(3) PCR产物的验证：
①将 T克隆的产物转化至 [>5α感受态细胞， 挑取过夜培养的单个细菌克隆接种于 5rrli LKt体培养集中， 220r ρητί nil n于 37°C振荡培养过夜；
②用 Taka「 a质粒小提试剂盒提取培养产物的质粒；
③提取的质粒进行 N ) I和 H nd 111双酶切验证， 将验证为阳性的质粒进行测序， 测 序结果与 cl FNY基因序列比对， 完全匹配的质粒判为阳性质粒；
(4)进行亚克隆：
①将阳性质粒和 pET32a表达载体分别进行 Ato I和〃 nd I〃双酶切， 用 Takara胶回收 试剂盒回收酶切产物；
②回收产物连接：
10Xi¾¾EUffer， 含 T4连接酶： 5μΙ 阳性质粒酶切回收产物： 0.5 μ I pEH32a表达载体酶切回收产物： 4.5 μ I 连接体系总体积： 10 μΙ
混匀反应体系， 置于 16°C孵育过夜；
③将上述连接产物转化至 M5感受态细胞， 挑取过夜培养的单个细菌克隆接种于 5rrliLKt体培养集中， 220rpn?( nil n于 37°C振荡培养过夜。 用 Takara质粒小提试剂盒提取培 养产物的质粒并进行 Λ^ο I和 Hnd ///双酶切， 将酶切验证为阳性的质粒的来源菌株定义 为阳性株， 用于鸡干扰素 γ的表达。
4、 根据权利要求 1所述的一种鸡干扰素 γ的制备复性方法， 其特征在于： 所述步骤 (3) 中的转化过程是：
(1)取出冻存的 M 5感受态细胞（购自 Takara), 冰浴 5- 10nii n待其溶解， 加入 10μΙ连接 产物， 轻微振荡混匀， 立即静置冰浴 30rriin;
(2)将此混合物置于 42°C水浴 90s， 迅速将反应物置于冰上 2rrii n， 加入 800 μ I SGC培养 基于 37°C摇床上 140rpn?( nil n振荡培养 45nii n;
(3)取出培养物， 将培养液涂布于含 100 g/ rrli AIVP的平板上， 待反应液被平板吸干后， 倒置平板于 37°C恒温摇床培养过夜；
(4) 6h后， 取出平板检查， 并进行克隆筛选；
5、 根据权利要求 1所述的一种鸡干扰素 Y的制备复性方法， 其特征在于： 所述步骤 (4) 中的诱导与表达及裂解的过程是：
(1)将筛选所得的阳性克隆接种于 10rrli含 AIf¾K¾na的 LBt咅养基中 220rpn?( nil n于 37°C振 荡培养过夜；
(2)按 5° 接种量转接过夜培养产物于新鲜的 LBt音养基中， 220rpnT( nil n于 37°C振荡培养 至 C oo约为 0.6， 加入 0.6r«l F G秀导表达培养 4h;
(3) 6000g离心 5rriin收集诱导表达产物。 用 20倍体积的含有 4^素的磷酸盐缓冲液 （pH 值为 8.0) 溶解表达产物， 期间 600W 间隔 6s超声 6s超声 150次裂解表达产物。
6、 根据权利要求 1所述的一种鸡干扰素 Y的制备复性方法， 其特征在于： 所述步骤 (5) 中的纯化的过程是： 在裂解完成的表达产物中， 加入 亲和层析树脂， 间隔蓬 ij翻转 摇动吸附目标蛋白蓬 ij ， 分别用 值为 磨口«]含有筛尿素的磷酸缓冲液洗去不带有 及 标记的杂蛋白， 用 值为筛 的含有筛尿素磷酸缓冲液洗脱得到重组蛋白。 轻 按 根据权利要求†新述的一种鸡干扰素 Y的制备复性方法， 其特征在于： 所述步骤 (6) 中的复性处理的过程是： 轻
(1)纯化后得到的是溶解有重组蛋白的 值为筛 ffi含有筛尿素的磷酸缓冲液， 首先将 该磷酸缓冲液中目标蛋白的含量调至 吸 ， 然后将其转移至透析袋内； 轻
(2)将透析袋依次放入 值为 ί« 时«含有查尿素的磷酸缓冲液内透析， 三种 值的磷酸缓冲液中均透析樹、时； 轻
(3)在三次透析完毕后， 将透析袋中的样品取出并置于烧杯内， 向其中加入†¾ 憾制 ， 于放置在 的磁力搅拌器上 吸 搅拌蓬 ij ， 再加入终浓度为娜制 的 β 环糊精中， 于放置在 i 的磁力搅拌器上 吸 搅拌應 ij ； 轻
(4)将步骤 (3)的产物再次放入透析袋内进行两次透析， 轻 第一次透析：透析液由嫌 ij 的磷酸二氢钠、楡选的尿素、†¾¾ 的氯化钠、 ί¾ϋ的 栊¾的甘油、 筛 的 、 倒癤 的 、 倒 憾制 和嫌 ij 的 β 环糊精构成， 透析 时间为†劇、时； 轻 第二次透析：透析液由嫌 ij 的磷酸二氢钠、恼选的尿素、†¾¾ 的氯化钠、 ί¾ϋ的
«的甘油、 筛 的 、 倒癤 的 、 倒 憾制 和憾 ij 的 β 环糊精构成， 透析 时间为†劇、时； 轻
(5)两次透析后的透析袋继续放入以下透析液内透析†劇、时， 透析液由嫌 ij 的磷酸二氢 钠、 †¾¾ 的氯化钠、 倒癤的 和栊 ¾的甘油构成； 轻
(6)转移步骤 (5)得到的产物于烧杯中， 向其中加入 « 的重组牛肠激酶， «条件下 作用†¾J、时后即完成复性处理。 轻
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