DE3588082T2

DE3588082T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur verwendung in der diagnose und behandlung autoimmuner krankheiten

Info

Publication number: DE3588082T2
Application number: DE3588082T
Authority: DE
Inventors: Jack Keene
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 1984-12-31
Filing date: 1985-12-18
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2005-12-19
Also published as: WO1986004093A1; JPS62501314A; JP2680811B2; DE3588177T2; EP0205579B1; JPH09166596A; DE3588177D1; EP0205579A1; US5541291A; US4751181A; US5721110A; EP0690307B1; JP2736322B2; EP0205579A4; EP0690307A1; DE3588082D1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammen- Setzungen, welche bei der Behandlung und Diagnose von Autoimmunerkrankungen nützlich sind, und insbesondere solche Verfahren und Zusammensetzungen, welche durch Gentechnologie hergestellt wurden.

Stand der Technik

Bei normalen Menschen und Tieren wird ein Individuum auf eine Exposition an eine fremde Substanz mit der Produktion von spezifischen Antikörpern oder mit der Entwicklung einer zellvermittelten Immunität gegen die fremde Substanz antworten. Individuen sind im allgemeinen tolerant gegenüber Substanzen, die normalerweise ein Teil ihrer selbst sind, und werden somit als selbst-tolerant beschrieben. Die Entwicklung einer immunologischen Antwort gegenüber sich selbst wird Autoimmunität genannt und ist das Ergebnis eines gewissen Zusammenbrechens der Selbsttoleranz.
Verschiedene Theorien wurden vorgeschlagen, um die Entwicklung der Autoimmunität zu erklären. Beispielsweise wird angenommen, daß Viren eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der Autoimmunität spielen, wie in mehreren Tiermodellen gezeigt wurde. Es wird angenommen, daß die Expression von viralen Antigenen auf der Oberfläche der Wirtszellen Autoantikörper gegen Zellmembranantigene wie auch gegen die viralen Antigene hervorruft. Es wurde ebenfalls vorgeschlagen, daß die Autoimmunität eine Störung ist, welche durch eine abnormale immunologische Regulation, insbesondere eine Änderung bei der T-Zell-Aktivität, verursacht wird. Eine Abnahme der Suppressor-T-Zell-Aktivität oder eine Zunahme der Helfer-T-Zell-Aktivität würde zu einer überschüssigen Produktion von niedrigen Niveaus an Autoantikörpern führen. Diese Theorie findet eine Stütze in dem Auffinden von Autoimmunantikörpern in manchen normalen Personen ohne ein Anzeichen einer Autoimmunerkrankung und in verschiedenen Tiermodellen. Bei wenigstens einigen Autoimmunerkrankungen scheint ebenfalls eine Genkontrolle zu existieren, da von gewissen Mäusestämmen gezeigt wurde, daß sie eine Autoimmunerkrankung zeigen, die einem systemischen Lupus erythematodes (SLE) ähnelt. Eine große Übereinstimmung hinsichtlich SLE wird ebenfalls bei identischen Zwillingen gefunden. Zusätzlich wurde ein Zusammenhang von Autoimmunerkrankung mit Genen, die in dem HLA-D-Locus lokalisiert sind, bei rheumatoider Arthritis von Erwachsenen und bei Multipler Sklerose festgestellt.
Systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist eine ernste Autoimmunerkrankung, welche das Kollagen der Bindegewebe des menschlichen Körpers befällt. Da SLE eines oder mehrere einer großen Anzahl von verschiedenen Geweben oder Organen des Körpers, wie z.B. Blutgefäße, Herz, Nieren, Haut, seröse Membranen usw. befallen kann, ist die klinische Diagnose von SLE oft schwierig, da die Symptome einer Anzahl von anderen Erkrankungen, wie z.B. rheumatoider Arthritis, Hautkrebs, Serumkrankheit, rheumatischem Fieber, Multiplem Myelom und Sjögren Syndrom, ähneln können.
Aufgrund einer hohen Wahrscheinlichkeit von Schädigungen der Niere, des zentralen Nervensystems und der Gefäße durch die Erkrankung, ist es wichtig, in der Lage zu sein, SLE von anderen Krankheiten zu unterscheiden. Beispielsweise ist eine Lupusniere bei der Erkrankung sehr häufig und ist eins der ernstesten Merkmale von SLE. Nephritis ist eine häufige Todesursache bei SLE-Patienten und es wäre höchst vorteilhaft, in der Lage zu sein, SLE früh genug festzustellen, um eine ernste Schädigung der Niere zu verhindern oder zu mildern.
Es wurde gezeigt, daß Seren von Patienten mit Bindegewebsstörungen Antikörper gegen viele nukleäre Bestandteile enthalten. Beispielsweise wurde gefunden, daß zirkulierende Antikörper, die mit nativer DNA (Desoxyribonukleinsäure) reagieren, in hohem Maße spezifisch für Patienten sind, welche an systemischem Lupus erythematodes leiden. Das Erscheinen und die Verschlimmerung der Nephritis, welche mit SLE verbunden ist, scheint mit der Bildung und Ablagerung von Antikörper/DNA- und anderen Immunkomplexen in den Nieren und insbesondere den Nierenglomeruh zusammenzuhängen. Obwohl die genauen Gründe für die Produktion dieser Antikörper und die Gründe für ihre besondere Spezifität für SLE bis jetzt noch unbekannt sind, ist der Nachweis und die Messung dieser Autoantikörper bei der klinischen Diagnose und Beurteilung dieser Erkrankung zunehmend wichtig geworden.
Vor kurzem wurde ein präzises Verfahren zum Messen von verschiedenen kleinen Mengen an anti-DNA-Antikörper entwikkelt, wobei 14 C-markierte DNA verwendet wurde. Siehe T. Pincus et al, "Measurement of Serum DNA-Binding Activity In Systemic Lupus Erythematosus," New England Journal of Medcine, 281, 701 - 705 (1969). Dieses Verfahren scheint der definitivste Test für SLE zu sein, welcher derzeit zur Verfügung steht. Es wird berichtet, daß er bei 75 Prozent der untersuchten SLE-Patienten positiv ist, während andere führende Tests nur bei ca. 25 - 64 Prozent der SLE-Fälle positiv waren. Darüber hinaus hat dieser anti-DNA-Antikörpertest eine größere Spezifität für SLE gezeigt als andere verwendete diagnostische Tests, wie z.B. Immundiffusion, Komplement-Fixierung und Präzipitation.
Jedoch ist dieser Test ein Test für Antikörper, die mit DNA reagieren, obwohl die DNA nicht das authentische Antigen sein kann. Weiterhin ist dieses Verfahren nicht anwendbar auf Autoimmunstörungen, bei welchen das Antigen ein Protein ist. Proteinantigene stehen mit den meisten Formen von SLE wie auch mit anderen Typen von Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang. Solche Proteinantigene sind bei diagnostischen und Behandlungsverfahren als ein Ergebnis der Fähigkeit, spezifisch mit Autoantikörpern zu reagieren, die mit einer Autoimmunerkrankung in Zusammenhang stehen, nützlich. Jedoch war die Isolierung und Reinigung dieser Antigene aufgrund der Seltenheit und Instabilität des antigenen Materials und aufgrund der Komplexität der Trennungstechniken bis jetzt nicht erfolgreich. Demgemäß wird immer noch ein Verfahren zur Herstellung von Proteinantigenen, die mit einem Autoantikörper reagieren, der mit einer Autoimmunerkrankung in einem Wirt in Zusammenhang steht, benötigt.

Offenbarung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinantigens, das mit einem Autoantikörper reagiert, der mit einer Autoimmunerkrankung in Zusammenhang steht, zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das in der Lage ist, solche Antigene in großen Mengen und ohne die Spende großer Mengen an Material von einem Wirt herzustellen.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung, welche im folgenden leichter ersichtlich werden, wurden gelöst, indem ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinantigens, das mit einem Autoantikörper, der mit einer Autoimmunerkrankung in einem Wirt in Zusammenhang steht, reagiert, zur Verfügung gestellt wird, welches umfaßt: Einführen einer genetischen Information aus einer kreuzreaktiven Donor-Genbibliothek in mehrere Empfängerzellen, wodurch sich transformierte Zellen ergeben; Selektionieren einer Zelle, welche das Antigen exprimiert, indem eine Bindungsreaktion zwischen dem Autoantikörper, der von dem Wirt erhalten wurde, und einem Proteinantigen, welches durch eine Erzeugerzelle der transformierten Zellen, welche ein Gen enthält, das für das Proteinantigen codiert, exprimiert wird, nachgewiesen wird; Kultivieren der Zelle, welche das Antigen exprimiert, in einem Kulturmedlum; und Isolieren des Proteinantigens aus dem Kulturmedium.
Es ist ebenfalls eine Aufgabe dieser Erfindung, rekombinante DNA-Moleküle, welche beim Praktizieren des Verfahrens der Erfindung nützlich sind, wie auch Verfahren der Verwendung der Proteinantigene, welche nun erstmals in großen Mengen erhältlich sind, für die Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen zur Verfügung zu stellen.
Die Autoimmunerkrankung kann systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, gemischte Kryoglobulinämie, Thyreoiditis, Glomerulonephritis oder Sjögren Syndrom sein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Eine vollständigere Würdigung der Erfindung und viele ihrer begleitenden Vorteile werden leicht durch Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung erhalten werden, wenn diese im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet wird, worin:
FIGUR 1 (a) eine Serie von Fotografien von Kulturmedien ist, welche die Isolierung und Identifizierung von La-cDNA-Klonen durch immunologisches Screenen von rekombinanten λgt11-Phagenplaques mit Lupus Seren der La-Spezifität zeigt.
FIGUR 1 (b) eine Serie von Fotografien ist, welche ein immunologisches Screenen von λgt11-La-Klonen mit Lupus-Seren verschiedener Spezifitäten zeigt.
FIGUR 2 eine Serie von Fotografien ist, welche einen Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA) zeigt, der exprimiertes La-Antigen verwendet, das an Nitrocellulose gebunden ist und mit Seren von 18 Patienten mit Autoimmunerkrankungen und zwei normalen Seren reagiert.
FIGUR 3 eine Restriktionskarte der 1,5 kb-La-ProteincDNA zeigt.
FIGUR 4 eine fotografische Reproduktion einer Serie von Acrylamidgelelektrophoresen ist, die eine in vitro-Translation von hybridselektionierter HeLa-Zellen-mRNA unter Verwendung von cDNA für das La-Protein zeigt.
FIGUR 5 eine fotografische Reproduktion einer partiellen Peptidkartierung des La-Proteins ist, welche in vivo radioaktiv markiertes HeLa-Zell-La-Protein zeigt.

Beste Weise zur Ausführung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung entsprang teilweise der Erkenntnis, daß mehrere cDNA-Klone, die aus einer Expressionsbibliothek aus menschlicher Leber erhaltenwurden, durch Autoantikörper erkannt wurden, welche mit gewissen Autoimmunstörungen zusammenhingen. Vor der vorliegenden Erfindung war es nicht bekannt, daß Peptide, die mit Autoimmunantikörpern reagierten, auf diese Weise erzeugt werden konnten. Außerdem war es, wenn ein Arzt oder Forscher von einem bestimmten Patienten oder einem anderen betroffenen Individuum ein Antigen haben wollte, nötig, das Antigen aus dieser Quelle zu isolieren. Solche Antigene waren im allgemeinen nicht frei in Lösung und waren auf jeden Fall nur in winzigen Mengen verfügbar, was diese Identifizierung, Analyse und Verwendung praktisch unmöglich machte, da die Herstellung großer Mengen an Antigen große Mengen an Material von dem betroffenen Menschen oder Tier, zum Nachteil dieses Individuums, nötig machte.
Da die Quelle, welche die ursprüngliche Boten-RNA spendete, aus welcher die cDNA-Klone in dem Labor des Erfinders hergestellt wurden, nicht dieselbe war, wie die Quelle der Autoantikörper, wurde erkannt, daß Proteinantigene, welche mit Autoantikörpern reagieren, die mit einer Autoimmunerkrankung in Zusammenhang stehen, welche vorher nicht in großen Mengen verfügbar waren, erzeugt werden konnten, wobei nicht mehr als eine Serumprobe von einem Wirt mit einer Autoimmunerkrankung benötigt wurde, indem das Serum oder daraus abgeleitete Antikörper mit einer cDNA-Bibliothek aus einer anderen Quelle umgesetzt wurden. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung erstmals ein wirksames Mittel zur Verfügung, um Autoimmunerkrankungen in einem Wirt auf eine für diesen Wirt spezifische Weise zu behandeln.
Mit "Wirt" ist jeder Mensch oder jedes Tier gemeint, das von einer Autoimmunerkrankung befallen ist. Obwohl die Erfindung zuerst an einem menschlichen Wirt demonstriert wurde und es erwartet wird, daß menschliche Wirte ein Gebiet von Interesse bleiben werden, kann die vorliegende Erfindung ebenfalls auf dem Gebiet der Veterinärmedizin verwendet werden. Beispielsweise bei Pferden, Vieh, Schafen und Geflügel (z.B. Hühnern, Enten und Truthähnen), Primaten, Hunden, Katzen, Schweinen, Ziegen (insbesondere zur Behandlung der Ziegenarthritis) und Nerzen (insbesondere zur Behandlung der Aleutenkrankheit des Nerzes).
Ein Reagens, das beim Praktizieren der Erfindung verwendet wird, ist Antiserum (oder ein gereinigter Antikörper) aus dem Wirtsserum. Eine Serum- oder Plasmaprobe wird typischerweise durch Venenpunktion von einem Wirt erhalten und rote Blutzellen und Gerinnsel werden entfernt. Die Antikörper werden dann durch irgendeine geeignete Technik von anderen Proteinen abgetrennt. Die antigene Reaktivität des Wirtes wird durch Immunpräzipitation von radiomarkierten Wirtszellextrakten oder durch Immunoblotten von unmarkierten Wirtszellextrakten bestimmt. In beiden Fällen werden die reaktiven Antigene durch Molekulargewichtsfraktionierung (Acrylamidgelelektrophorese) und Binden von Immunkomplexen an Protein A aus Staphylococcus aureus charakterisiert, wie in Towbin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 - 4354 (1979) und Francoeur et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6772 - 6776 (1982) beschrieben ist, obwohl viele andere Verfahren zur Durchführung dieser Reaktionen gleichermaßen geeignet sind.
Ein weiteres Reagens, das zum Praktizieren der vorliegenden Erfindung benötigt wird, ist eine Genbibliothek von einer Donorspezies, die mit dem Wirt ausreichend verwandt ist, um so ein kreuzreaktives Proteinantigen herzustellen. Wie in dieser Beschreibung verwendet bezieht sich "Genbibliothek" auf eine Sammlung von Vektoren mit funktionsfähig darin eingefügten oder daran befestigten DNA-Fragmenten aus einer Zelle oder Zellen der Donor-Spezies. Da der Wirt und Donor, wie in dieser Beschreibung beschrieben, eukaryotische Organismen sind, sind komplementäre DNA(cDNA)-Bibliotheken besonders bevorzugt, wenn auch nicht notwendig, da antigene Determinanten auf Proteinen vorhanden sein können, die über DNA-Segmente hergestellt wurden, welche sowohl Introns als auch funktionale Gensegmente enthalten, wenn diese DNA-Segmente in einzelligen Empfängerorganismen als Peptide exprimiert werden. Jedoch ist es wohl anerkannt, daß die cDNA, die aus Boten-RNA hergestellt wird und der dadurch die Introns fehlen, welche normalerweise in eukaryotischen Zellen vorhanden sind, eine höhere Erfolgsrate beim Exprimieren von Proteinen hat, wenn sie in prokaryotische Empfängerzellen eingeführt wird, und die Verwendung einer cDNA- Bibliothek ist demgemäß bevorzugt.
Es wird von den Fachleuten, die mit der in dieser Beschreibung ausgeführten Offenbarung ausgerüstet sind, anerkannt werden, daß die Donor-Spezies nicht dieselbe wie die Wirtsspezies sein muß. Jedoch ist es nötig, das die Donor-Spezies in der Lage ist, ein Protein mit einer antigenen Stelle (Determinante) zu exprimieren, die mit dem Autoantikörper des Wirtes kreuzreaktiv ist. Die Selektionierung einer Donor-Spezies kann leicht durch radioaktives Markieren von kultivierten Zellen aus einer vorgeschlagenen Donor-Spezies (mit beispielsweise ³&sup5;S-Methionin), Herstellen eines rohen Zellextraktes aus den kultivierten Zellen und Immunopräzipitieren des Zellextraktes mit einem Autoantikörper, der aus dem Wirt erhalten wurde, zusammen mit Protein A aus Staphylococcus aureus erreicht werden. Wenn Radioaktivität ausgefällt wird, ist ein Antigen in dem Donorzellenextrakt vorhanden, das mit dem aus dem Wirt erhaltenen Autoantikörper reagiert, und die Genbibliothek von diesem Donor kann in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden. Wahlweise kann die Donor-Spezies oder ein spezifisches Gewebe aus dem Donor extrahiert werden, und die extrahierten Proteine können in einer Matrix fraktioniert werden. Die abgetrennten Proteine werden durch übertragung auf eine Membran immobilisiert und mit dem Autoantikörper aus dem Wirt umgesetzt. Wenn Protein A aus Staphylococcus aureus an den Filter bindet, kann eine entsprechende Genbibliothek aus dem Donorgewebe in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden. Nichtsdestotrotz ist es, um den Prozentsatz an Erzeugerzellen (Zellen, die ein geeignetes Proteinantigen erzeugen) bei einer gegebenen Transformation zu erhöhen, bevorzugt, daß der Donor und der Wirt derselben Gattung, vorzugsweise derselben Spezies angehören, obwohl die Verwendung eines Säugetier-Donors mit einem Säugetier-Wirt ebenfalls geeignet ist.
Mit "kreuzreaktiv" ist in dieser Anmeldung gemeint, daß ein Autoantikörper des Wirtes mit einem Proteinantigen, das von dem Donor erzeugt wurde, reagiert. Dieses Proteinantigen des Donors muß nicht mit dem normalen in dem Wirt vorhandenen Proteinantigen identisch sein, welches die antigene Determinante für den Autoantikörper, welcher mit der Autoimmunerkrankung des Wirtes in Zusammenhang steht, zur Verfügung stellt. Die Kreuzreaktivität ist durch die Fähigkeit des in Frage stehenden Antigens definiert, mit dem Autoantikörper zu reagieren. Natürlich wird, wenn die Proteinantigene identisch sind, eine Kreuzreaktivität existieren. Jedoch ist es für das kreuzreaktive Antigen ebenfalls möglich, insgesamt oder teilweise eine unterschiedliche biochemische Zusammensetzung zu der des Wirtsantigens zu umfassen.
Innerhalb der rheumatischen Erkrankungen und insbesondere in Bezug auf systemischen Lupus erythematodes gibt es verschiedene Klassen von klinisch definierten Autoantikörpern, welche Hauptklasse (major) und Nebenklasse (minor) genannt werden können. Die Hauptklasse besteht aus vier herkömmlichen antigenen Protein-Spezifitäten, die als La, Ro, Sm und RNP bekannt sind. Obwohl die meisten menschlichen Wirte Mischungen dieser Spezifitäten enthalten, können viele Wirte unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren der Immunpräzipitation und des Immunoblotting als eine einmalige, einzige Klasse an reaktivem La-, Ro-, Sm- oder RNP Autoantikörper aufweisend identifiziert werden. Daher können beim Praktizieren dieser Technik Autoantikörper aus ausgewählten Wirten mit einer einzigen antigenen Spezifität verwendet werden, um genetische Rekombinanten aus Donor- Bibliotheken zu erhalten, die häufig mit jedem Wirt derselben herkömmlichen Spezifität oder Klasse reagieren. Bei SLE zeigen mehr als eine Hälfte aller Patienten Autoantikörper, die mit einer dieser vier Hauptspezifitäten oder Klassen reagieren. Verfahren, wie die hierin beschriebenen, werden den Fachleuten erlauben, gereinigte Antigene jeder Klasse als allgemeine diagnostische oder therapeutische Reagenzien für andere Individuen herzustellen, welche Autoantikörper derselben Spezifität oder Klasse enthalten.
Der Ausdruck "genetische Information" bezieht sich allgemein auf DNA, welche für das gesamte oder einen Teil des Proteinantigens codiert. Jedoch umfaßt dieser Ausdruck ebenfalls RNA, wenn er im Zusammenhang mit einem RNA-Virus oder einem anderen Vektor, welcher auf RNA basiert, verwendet wird.
Eine Zelle, welche die genetische Information&sub1; die für das Proteinantigen codiert, empfangen hat und welche das Proteinantigen, entweder intrazellulär zurückgehalten oder in das Kulturmedium freigesetzt exprimiert, wird als "Erzeugerzelle" bezeichnet.
Der Begriff "Vektor" wird wohl verstanden und ist synonym mit dem oft verwendeten Ausdruck "Klonierungsvehikel". Ein Vektor ist eine nicht-chromosomale doppelsträngige DNA, welche ein intaktes Replikon umfaßt, so daß der Vektor, wenn er, beispielsweise durch einen Transformationsprozess, in einen einzelligen Organismus eingebracht wird, repliziert wird.
Ein Material ist "gereinigt", wenn es keine anderen Bestandteile enthält, welche die Reaktivität oder die gesuchte Eigenschaft stören würden und die in dem Material, wie es natürlicherweise gebildet ist, vorhanden sein würden. Insbesondere enthält gereinigtes Material wenigstens 95 Gew%, noch bevorzugter 99 % und am meisten bevorzugt 99,8 % eines einzigen Materials. Wasser wird beim Messen der Reinheit nicht gezählt.
Fortschritte in der Biochemie in den letzten Jahren haben zu der Konstruktion von "rekombinanten" Vektoren geführt, in welchen beispielsweise Plasmide so gemacht werden, daß sie exogene DNA enthalten. In besonderen Fällen kann der rekombinante Vektor heterologe DNA einschließen, womit DNA gemeint ist, die für ein Polypeptid codiert, das gewöhnlich durch den Organismus, der für die Transformation durch den rekombinanten Vektor empfänglich ist, nicht erzeugt wird. Die Herstellung von rekombinanten DNA-Vektoren bei dem Verfahren zur Herstellung einer Genbibliothek wird wohl verstanden und muß nicht im Detail beschrieben werden. Jedoch ist eine kurze Beschreibung dieses Verfahrens hier als Referenz eingeschlossen.
Beispielsweise kann ein Plasmidvektor gespalten werden, um eine lineare DNA mit ligierbaren Enden zur Verfügung zu stellen. Diese Enden werden an exogene DNA mit komplementär gleichen ligierbaren Enden gebunden, um ein biologisch funktionelles rekombinantes DNA-Molekül mit einem intakten Replikon und einer gewünschten phänotyischen Eigenschaft zur Verfügung zu stellen. Eine Vielzahl von Techniken ist für eine DNA-Rekombination verfügbar, bei welcher aufeinandertreffende Enden von getrennten DNA-Fragmenten maßgeschneidert werden, um die Ligation zu vereinfachen. Die Ligation betrifft die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen benachbarten Nukleotiden, am häufigsten durch die Tätigkeit des Enzyms T4-DNA-Ligase. Somit können glatte Enden direkt ligiert werden. Wahlweise können Fragmente, die an ihren aufeinandertreffenden Enden Einzelstränge enthalten, welche durch Wasserstoffbindung an komplementäre Einzelstränge binden, ligiert werden. Solche Einzelstränge, die als kohäsive Enden bezeichnet werden, können durch die Zufügung von Nukleotiden unter Verwendung der terminalen Transferase zu glatten Enden gemacht werden. Jedoch werden am häufigsten Restriktionsendonukleasen verwendet, um kohäsive Enden zu erzeugen. Diese Enzyme spalten Phosphodiesterbindungen in und um einmalige Nukleotidsequenzen mit ca. 4 - 6 Basenpaaren in der Länge. Viele Restriktionsendonukleasen und ihre Erkennungsstellen sind bekannt, wobei die sogenannte Eco RI-Endonuklease die am weitesten bekannte ist. Typischerweise wird ein Plasmid oder ein anderes Klonierungsvehikel gespalten, wobei Enden zurückbleiben, welche jeweils die Hälfte der Erkennungsstelle der Restriktionsendonuklease umfassen, und ein Spaltungsprodukt von exogener DNA, welches mit derselben Restriktionsendonuklease erhalten wurde, das komplementäre Enden aufweist, wird in den gespaltenen Vektor eingefügt. Viele Variationen dieser Techniken sind den Fachleuten bekannt und können bei der Praktizierung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die exogene, d.h. Donor-DNA, welche zum Erzeugen der Genbibliothek der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird aus geeigneten Zellen eines Donors erhalten, der wie oben beschrieben identifiziert wurde. Wenn eine cDNA-Donor-Genbibliothek erzeugt wird, ist es bevorzugt, Zellen zu verwenden, die aus einem Organ des mRNA-Donors erhalten wur den, das dasselbe ist wie das Organ, welches durch die Autoimmunerkrankung in dem Wirt angegriffen wird. Wenn beispielsweise eine Autoimmunerkrankung die Leber eines Wirtes angreift, sind Leberzellen des Donor bevorzugt, da es bei Zellen von anderen Organen wahrscheinlicher ist, daß sie Peptide exprimieren, welche nicht mit dem Autoantikörper reagieren, gegen welchen ein Schutz gewünscht wird. Wenn cDNA-Fragmente hergestellt werden, wird Boten-RNA durch irgendeine der verschiedenen Techniken, welche für diesen Zweck existieren, aus den Donorzellen erhalten.
Beispielsweise kann das folgende Verfahren verwendet werden, um Boten-RNA aus irgendeinem Säugetier-Gewebe oder einer Zellkultur, welche zu einzelnen Zellen dispergiert werden können, zu isolieren. Eine detailliertere Beschreibung dieser Technik ist in Maniatis et al, molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982, Seiten 191 - 199, angegeben, worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Zellen werden von dem Kulturmedium abgetrennt und in phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Die Zellen werden dann zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, und in einem Lysepuffer resuspendiert, welcher ungefähr 1.000 Einheiten/ml RNasin oder 10 mN Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexe enthält. Nach Mischen, Lagern und Zentrifugieren auf einem Gradienten wird die zytoplasmatische Schicht gewonnen und zu einem Puffer zugegeben, welcher ein Denaturierungsmittel enthält. Dann wird eine Proteinase zugegeben, um das Protein zu zerstören. Proteine werden durch einmaliges Extrahieren mit Phenol/Chloroform entfernt. Die wäßrige Phase wird gewonnen und gelagert, nachdem Ethanol zugegeben wurde. Die gelagerte Lösung wird dann zentrifugiert, um ein Pellet zu erhalten, welches Nukleinsäuren enthält. Die Nukleinsäuren werden erneut in einem kleinen Puffervolumen gelöst, welches Rnasin oder Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexe enthält. Eine DNase wird zugegeben, um die DNA zu zerstören. Nach einer Inkubation wird das resultierende Material einmal mit Phenol/Chloroform extrahiert. Eine Lösung von Natriumacetat wird zugegeben und die Nukleinsäuren werden mit Ethanol gefällt. Ausgefällte RNA wird bei -70ºC in wäßrigem Ethanol gelagert. Als Alternativen können das Verfahren mit Guanidin und heißem Phenol und das Guanidin/Cäsiumchlorid-Verfahren verwendet werden. Beide diese Techniken sind in der Veröffentlichung von Maniatis et al, welche oben zitiert wurde, beschrieben. Wenn gewünscht, kann polyadenylierte RNA von nicht-polyadenylierten RNAs abgetrennt werden. Das Verfahren der Wahl ist eine Chromatographie auf Oligo(dT)-Cellulose, welche im Labor hergestellt werden kann oder kommerziell erhalten wird. Eine detaillierte Technik zur Selektion von polyadenylierter RNA ist in der Veröffentlichung von Maniatis et al, welche oben zitiert wurde, ausgeführt.
Komplementäre DNA wird dann aus der isolierten mRNA durch das Enzym reverse Transkriptase hergestellt. Die resultierende einzelsträngige DNA wird unter Verwendung von DNA- Polymerase zu doppelsträngiger DNA umgewandelt. Wenn auf diese Weise aus der gesamten mRNA, die in einer Zelle vorhanden ist, cDNA hergestellt wird und in ein Klonierungsvehikel eingefügt wird, wird die resultierende cDNA-Sammlung als eine "Donor-Genbibliothek" bezeichnet, da sie DNA- Sequenzen enthält, die für die Genprodukte des Donors codieren, welche zur Zeit, als die ursprüngliche mRNA gesammelt wurde, exprimiert wurden.
Es sollte zur Kenntnis genommen werden, daß die Herstellung einer Donor-Genbibliothek selbst wohl bekannt ist und daß diese Diskussion der Herstellung einer Donor-Bibliothek lediglich dazu dient, die Natur der biochemischen Reaktionen darzulegen, welche bei der Praktizierung der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden. Die Erfindung hängt nicht von der Existenz einer bestimmten Genbibliothek ab, sondern kann jede Genbibliothek verwenden, welche die in dieser Beschreibung ausgeführten Erfordernisse erfüllt, egal ob sie speziell für den Zweck dieser Erfindung oder für irgendeinen anderen Zweck zusammengestellt wurde.
Der Vektor, welcher bei der Herstellung der Wirts-Genbibliothek verwendet wird, kann jeder Vektor sein, der sich in einem einzelligen Organismus repliziert. Beispielsweise wurden viele Plasmide, welche für eine Verwendung bei der Praktizierung dieser Erfindung geeignet sind, in neueren U.S.-Patenten, wie z.B. den U.S.-Patenten 4,273,875; 4,304,863; 4,419,450; 4,403,036; 4,363,877; 4,356,270; 4,349,629 und 4,332,901 beschrieben. Andere Vektoren, welche für eine Verwendung bei der Praktizierung dieser Erfindung geeignet sind, umfassen pAJ 655 (Wirtsbakterien E. coli FERM-BP 136) pAJ 611 (Wirtsbakterien E. coli FERM-BP 138), pAJ 440 (Wirtsbakterien Bacillus subtilis ATCC 391391), pAJ 1844 (Wirtsbakterien E. coli FERM-BP 137) und pAJ 3148 (Wirtsbakterien Corynebacterium glutamicum ATCC 39137). Besonders bevorzugt ist der Phagenvektor λgt11, welcher aus öffentlich zugänglichen Phagen gemäß dem Verfahren, das in Young et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1194 - 1198 (1983) beschrieben ist, hergestellt werden kann. Kurz gesagt kann dieser bevorzugte Phagenvektor wie folgt hergestellt werden: λgt7-lac5 und λ540 (ΔB imm21 nin5) werden mit Hind III gespalten und die Fragmente werden gepoolt und dann mit T4- DNA-Ligase ligiert. Die gewünschte Phagenrekombinante erzeugt trübe (imm21) blaue (lac5) Plaques, wenn die DNA in E. coli BNN93 transfiziert wird und die Zellen auf einem Medium plattiert werden, das den chromogenen Indikator 5- Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) enthält. Das λgt7-lac5-λ540-Hybrid wird dann mit λgt4 (c1857 S100 nin5) gekreuzt und Rekombinanten, die bei 42ºC kultiviert wurden, werden auf die Bildung von klaren (c1857) blauen Plaques auf X-Gal-Platten hin ausgezählt. Die Gegenwart der amber- Mutation S100 wird bestätigt, indem die relative Plattierungseffizienz mit Wirten untersucht wird, die den amber Suppressor supF (BNN45 bzw. BNN93) enthalten oder nicht enthalten. Schließlich wird der lac5-c1857-S100-Phage auf EcoRI-Spaltstellen hin kartiert. Der Phage λgt11 enthält eine einzige EcoRI-Spaltstelle.
Wenn eine Donor-Genbibliothek, entweder gemäß den oben beschriebenen Verfahren oder durch irgendein anderes Verfahren, zur Verfügung steht, werden Empfängerzellen mit der Genbibliothek transformiert, um eine Serie von transformierten Zellen herzustellen, welche die verschiedenen Donor-DNA- (oder cDNA-)Fragmente enthalten. Die Inkorponerung der rekombinanten DNA in die Empfängerzellen kann erreicht werden, indem die einzelligen Empfängermikroorganismen mit Calciumchlorid behandelt werden, um die Durchlässigkeit der Zellmembranen für DNA zu erhöhen, wie in Mandel et al, J. Mol. Biol. 53, 159 (1970) berichtet wird. Andere Verfahren zum Transformieren von Empfängerzellen schließen ein Inkorporieren der rekombinanten DNA in einem Wachstumsstadium ein, wenn es den Zellen möglich wird, DNA zu inkorporieren (das sogenannte kompetente Zellstadium), wie es in Young et al, Gene 1, 153 (1977) berichtet wird. Plasmide können ebenfalls in DNA-Empfänger inkorporiert werden, indem Protoplasten oder Sphäroplasten von den DNA- Empfängern gebildet werden (insbesondere für Hefe verwendet), wie in Chang et al, Mol. Ec. Gen. Genet. 168, 111 (1979) beschrieben wird. Jedes andere Verfahren des Transformierens von Empfängerzellen kann bei der Praktizierung dieses Aspektes der Erfindung verwendet werden.
Autoimmunantigene können aus Empfängerzellen unter Verwendung irgendeiner aus einer Mehrzahl bekannter Techniken erhalten werden. Beispielsweise können Zellen, die auf eine solche Weise Peptidantigene exprimieren, daß die Antigene durch die Zellmembran in den umgebenden Raum transportiert werden, in einem Kulturmedium kultiviert werden, und das gewünschte Antigen kann direkt aus dem Medium erhalten werden. Wenn das gewünschte Antigen innerhalb der Zellmembran zurückgehalten wird, können die Zellen lysiert werden, um das Antigen in den Zellüberstand freizusetzen, welcher dann gereinigt werden kann, um das gewünschte Antigen zu erhalten. Wenn das Antigen, welches produziert wird, eine nachteilige Wirkung auf die Zelle, welche das Antigen exprimiert, aufweist, erlaubt das Unterstellen des Gens für das Antigen unter die Kontrolle eines Induktors eine Expression des Gens nur zur Zeit der Sammlung. Beispielweise kann ein λ-Phage in Zellen kultiviert werden, die pNC9, ein pBR322- Derivat, das laciQ enthält, enthalten. In den Zellen wird ausreichend lac-Repressor produziert, um die Expression des Hybridproteins während des lytischen Phagenwachstums zu reprimieren. Die Expression des Hybrids kann in infizierten Zellen mit IPTG induziert werden, und das so produzierte Antigen wird bei der Zellyse von den Zellen freigesetzt.
Wenn der λgt11-Phage unter einem der bevorzugten Aspekte der Erfindung verwendet wird, ist das folgende Verfahren zum Screenen mit Antikörpern bevorzugt, um die Gegenwart von Autoimmunantigenen zu bestimmen. Ein empfohlener Wirt ist E. coli Y1090, welcher ΔlacU169 proA&spplus; Δlon araD139 strA supf [trpC22::Tn10] (pMC9) ist. Das Wirtsbakterium wird infiziert und in Softagar plattiert, worauf die Platte für ungefähr 5 Stunden bei ca. 42ºC inkubiert wird. Für eine gleichmäßige Verteilung der Phagen werden ungefähr 10&sup4; Phagen pro kleiner Platte und 10&sup5; Phagen pro großer Platte empfohlen. Die Platte wird mit einer trockenen Nitrocellulosefilter-Scheibe überschichtet, die vorher in 10 mM IPTG getränkt wurde. Die Platte wird bei ungefähr 37ºC inkubiert. Der Filter wird dann entfernt und für ungefähr 5 - Minuten bei Raumtemperatur in Tris-gepufferter Salzlösung, pH 8,1, gewaschen. Der Filter wird dann in TBS, wel cher ca. 20 % fötales Kalbsserum (oder 3 % BSA oder Ovalbumin) enthält, inkubiert. Die Inkubation findet für ungefähr Minuten bei Raumtemperatur statt. Der Filter wird dann in TBS +20% fötales Kalbsserum plus Antikörper inkubiert (ungefähr eine 1:1-Verdünnung von Serum oder IgG; wenn IgG verwendet wird, ist IgG anfangs mit 10 mg/ml vorhanden). Die Inkubation findet für ungefähr eine Stunde bei Raumtemperatur statt. Der Filter wird dann gewaschen, um nicht gebundenen Antikörper zu entfernen, und wird für ca. eine Stunde bei Raumtemperatur in TBS, welcher ¹²&sup5;I-Protein A (ungefähr 10&sup6; cpn/Filter) enthält, inkubiert. Radioaktivität wird an den Stellen vorhanden sein, wo eine Antikörperbindung die Gegenwart eines exprimierten Antigens zeigte.
Obwohl diese Technik eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellt, sind andere Verfahren zum Screenen mit Antikörpersonden den Fachleuten bekannt und können leicht anstelle dieser Technik verwendet werden.
Das Wort "Transformante" wird in dieser Anmeldung in seinem breitesten Sinne verwendet und bezieht sich auf jede Empfängerzelle, welche eine exogene genetische Information darin eingefügt hat. Zusätzlich zu der eingeschränkteren Bedeutung von Transformante (eine Zelle, welche ein Plasmid inkorporiert hat) bezieht sich Transformante in dieser Anmeldung auf Zellen, die exogene DNA in ihr Chromosom (oder ihre Chromosomen) eingefügt haben, wie auch auf Zellen, welche irgendeinen rekombinanten Vektor, wie oben beschrieben, enthalten.
Die mehrfachen Empfängerzellen, welche unter Verwendung einer Donor-Genbibliothek transformiert werden, werden als Expressionsbibliotheken bezeichnet, da die Transformanten Genprodukte aus den rekombinanten DNA-Vektoren, die zufällig in die individuellen einzelligen Organismen insertiert wurden, exprimieren. Typischerweise werden die Transforman ten kloniert, um eine Serie von Zellinien zu erzeugen, die von individuellen ursprünglichen Transformanten abstammen. Eine Probe wird aus jeder Zellinie ausgewählt und wird (wenn gewünscht nach einem Lysieren) an den Autoantikörper, der mit der Immunerkrankung in dem Wirt zusammenhängt, welcher wie oben beschrieben hergestellt wurde, ausgesetzt. Bindungswechselwirkungen zwischen dem Autoantikörper und dem Antigen, welches durch die Transformante, die das richtige Gen enthält, exprimiert wird, können durch irgendeines der verschiedenen Verfahren, welche für diesen Prozeß zur Verfügung stehen, nachgewiesen werden. Beispielsweise können Proteine aus Kolonien der Transformanten auf Nitrocellulose-Filterpapier adsorbiert werden, welches über die Kolonien gelegt wurde, gefolgt von einer Zugabe des Autoimmunantikörpers, ein Waschen, um nicht umgesetzten Antikörper zu entfernen, und ein Nachweisen von mit dem Protein gefundenem Antikörper mit radioaktiv markiertem Protein A. Auf diese Weise identifizierte Zellkolonien können in großer Menge kultiviert werden, um die gewünschte Menge des Gens, welches für das Proteinantigen codiert, zur Verfügung zu stellen. An diesem Punkt sind mehrere Variationen möglich. Den Zellen, welche das Gen für das Proteinantigen enthalten, kann erlaubt werden, das Antigen zu exprimieren, und das Antigen kann unter Verwendung bekannter Techniken aus dem Kulturmedium gewonnen werden. Wahlweise kann das Donor-cDNA-Fragment aus dem ersten Vektor herausgeschnitten werden (z.B. durch Herausschneiden mit derselben Endonuklease, die verwendet wurde, um ursprünglich das Plasmid zu spalten und die DNA einzufügen), in einen neuen Klonierungsvektor eingefügt werden, und verwendet werden, um eine Empfängerzelle für eine Produktion der cDNA oder des Proteinantigens in großem Maßstab zu transformieren. Wahlweise ist es ebenfalls möglich, wenn einmal relativ große Mengen des Proteinantigens oder der cDNA, die es produziert, verfügbar sind, die Sequenz der molekularen Spezies zu bestimmen. Wenn diese Sequenz bekannt ist, ist es möglich, das Peptidantigen unter Verwendung eines automatisierten Peptid-Synthesegerätes oder eines anderen geeigneten Synthesemittels zu synthetisieren. Sowohl Laborsynthesetechniken, typischerweise Festphasen-Synthese, als auch automatisierte Peptid-Synthesegeräte sind in der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise Seite 34 der Ausgabe von November/Dezember 1984 der Genetic Engineering News, welche eine kommerzielle Werbung für eine solche Ausrüstung enthält. Da eine gegebene DNA-Sequenz für ein einziges Peptid codiert, kann die genetische Information, welche in dem klonierten DNA-Segment vorhanden ist, leicht in einer nicht biologischen Synthese eines Peptids verwendet werden. Da hydrophobe Bereiche eines Peptids im allgemeinen im Inneren des Peptids liegen und hydrophile Bereiche im allgemeinen auf der Außenseite liegen, ist es möglich, mit ziemlicher Sicherheit jene Bereiche des Peptids vorherzusagen, die auf den äußeren Oberflächen liegen werden und daher verfügbar sind, um als antigene Determinanten zu wirken. Eine Hydrophihe-Analyse unter Verwendung des Verfahrens von Hopp und Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3824 - 3828 (1981), kann verwendet werden, um Bereiche von Peptiden mit hoher Hydrophihe zu identifizieren. Antigene Determinanten weisen oft eine Sequenz von 3 - 10 Aminosäuren mit höheren als mittleren Hydrophiliewerten auf. Künstliche Peptide, welche unter Verwendung der genetischen Information hergestellt wurden, enthalten, wie oben beschrieben wird, vorzugsweise den gesamten hydrophilen Bereich. Insbesondere haben künstliche Peptide eine Sequenz, welche mit der Sequenz, die durch das klonierte DNA-Segment codiert wird, hinreichend identisch ist, um die antigene Determinante für eine Reaktion mit dem Autoantikörper verfügbar zu machen. Eine identische Sequenz ist am meisten bevorzugt, aber es wird leicht von den Fachleuten erkannt werden, daß kleinere Modifikationen in der Proteinstruktur gemacht werden können, ohne die antigene Determinante zu beeinträchtigen. Beispielsweise sind sowohl eine Substitution von nahe verwandten Aminosäuren (Leucin für Isoleucin) als auch eine Herstellung von Peptiden mit substituierten (z.B. Cystein) oder fehlenden terminalen Aminosäuren (vorzugsweise nicht mehr als 10 Prozent des gesamten Aminosäuregehaltes) möglich.
Andere typische Modifikationen umfassen die Zufügung von anderen Aminosäuren, um ein Koppeln des Antigens an verschiedene Oberflächen zu erlauben. Beispielsweise erlaubt die Addition oder Substitution eines Cysteins eine Befestigung der Sulfhydrylgruppe an einer funktionalisierten Oberfläche und die Addition oder Substitution von hydrophoben Aminosäuren erlaubt eine Befestigung durch eine hydrophobe Bindung an Plastikoberflächen. Beide diese Verfahren können beispielsweise in ELISA-Assays und anderen Standard-Immunoassays verwendet werden. Modifikationen, welche in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen, können leicht durch ihre Fähigkeit, mit dem Autoimmunantikörper zu reagieren, bestimmt werden.
Jedes dieser oder anderer gleichwertiger Verfahren ist geeignet, um ein Antigen zu erhalten, das mit dem Autoantiklrper, welcher mit der Autoimmunerkrankung des Wirtes, aus welchem ursprünglich Serum erhalten wurde, in Zusammenhang steht, reagiert.
Zusätzlich zu den obigen allgemeinen Verfahren, welche verwendet werden können, um rekombinante DNA-Moleküle und transformierte einzellige Organismen gemäß den Praktiken dieser Erfindung zu erzeugen, können andere bekannte Techniken und Modifikationen davon verwendet werden, um die praktische Ausführung der Erfindung durchzuführen. Insbesondere die Techniken, welche mit der Gentechnologie zusammenhängen, haben kürzlich ein explosives Wachstum und eine Entwicklung erfahren. Viele neuere U.S.-Patente offenbaren Plasmide, gentechnologisch veränderte Mikroorganismen und Verfahren zur Ausführung von Gentechnologie, welche bei der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Beispielsweise offenbart das U.S.-Patent 4,273,875 ein Plasmid und ein Verfahren zur Isolierung desselben. U.S.-Patent 4,304,863 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Bakterien durch Gentechnologie, in welchem ein Hybridplasmid konstruiert wird und verwendet wird, um einen Bakterienwirt zu transformieren. U.S.-Patent 4,419,450 offenbart ein Plasmid, welches bei der Arbeit mit rekombinanter DNA als ein Klonierungsvehikel nützlich ist. U.S.-Patent 4,362,867 offenbart Konstruktionsverfahren für rekombinante cDNA und dadurch hergestellte Hybridnukleotide, welche in Klonierungsverfahren nützlich sind. U.S.- Patent 4,403,036 offenbart genetische Reagenzien, um Plasmide zu erzeugen, die mehrere Kopien von DNA-Segmenten erhalten. U.S.-Patent 4,363,877 offenbart Transfervektoren für rekombinante DNA. U.S.-Patent 4,356,270 offenbart ein Klonierungsvehikel für rekombinante DNA und ist eine besonders nützliche Offenbarung für jene mit begrenzter Erfahrung auf dem Gebiet der Gentechnologie, da es viele der Begriffe, die in der Gentechnologie verwendet werden, und die grundlegenden dabei verwendeten Verfahren definiert. U.S.-Patent 4,336,336 offenbart ein fusioniertes Gen und ein Verfahren zur Herstellung desselben. U.S.-Patent 4,349,629 offenbart Plasmidvektoren und die Herstellung und Verwendung davon. U.S.-Patent 4,332,901 offenbart einen Klonierungsvektor, welcher für rekombinante DNA nützlich ist.
Alle diese Patente, wie auch alle anderen Patente und anderen Veröffentlichungen, die in dieser Offenbarung zitiert sind, weisen auf den Grad des fachmännischen Könnens von Fachleuten hin, welche diese Erfindung betrifft, und auf all diese wird hierin vollinhaltlich Bezug genommen.
Obwohl einige dieser Patente auf die Herstellung eines bestimmten Genproduktes gerichtet sind, welches nicht innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt, können die darin beschriebenen Verfahren von den Fachleuten auf dem Gebiet der Gentechnologie leicht für die praktische Ausführung der Erfindung, die in dieser Beschreibung beschrieben ist, modifiziert werden. Beispielsweise kann die Herstellung von fusionierten Proteinen eine erhöhte Protein- und antigene Stabilität zur Verfügung stellen, welche bei der praktischen Ausführung der beschriebenen Erfindung nützlich ist. Antigene, welche mit Autoantikörpern reagieren, sind normale Wirtsbestandteile und sind besonders anfällig für einen Abbau. Für eine Langzeitlagerung unter diagnostischen und eine Exposition in großen Volumen unter therapeutischen Aspekten dieser Erfindung ist eine erhöhte Stabilität erwünscht. Zusätzlich kann für eine Vielzahl von verschiedenen antigenen Materialien, welche in einer gemeinsamen diagnostischen oder therapeutischen Vorrichtung verwendet werden sollen, eine gemeinsame fusionierte Proteinhälfte (z.B. β-Galaktosidase) die Flexibilität des Verfahrens erhöhen.
Obwohl das Verfahren der Erfindung bei der Behandlung jeder Autoimmunerkrankung verwendet werden kann, ist es für eine Verwendung bei SLE und damit in Zusammenhang stehenden Autoimmunstörungen, wie z.B. Sklerodermie, Sicca-Syndrom, gemischter Bindegewebskrankheit (MCTD) und Sjögren Syndrom, besonders bevorzugt.
Antigene, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert und erzeugt werden, haben viele Verwendungen, beispielsweise bei der Identifizierung und Behandlung von Autoimmunstörungen. Bei vielen Autoimmunstörungen werden die Symptome durch ein Entfernen von Autoantikörpern aus dem befallenen Menschen oder Tier gemildert. Ein selektives Entfernen ist erwünscht, so daß der befallene Wirt immer noch in der Lage sein kann, normale Immunantworten auf exogene Antigene zu zeigen. Wie in Terman et al, Clinical Immunology and Immunopathology 8, 90 - 96 (1977) diskutiert, wurde ein Entfernen von DNA-Antikörpern in vivo durch eine extrakorporale Blutzirkulation über DNA, die auf Kohle immobilisiert war, erreicht. Diese Technik kann leicht für eine Verwendung mit Autoimmunerkrankungen, welche Proteinantigene einschließen, angepaßt werden, indem die DNA, welche auf der Kohle immobilisiert ist, durch geeignete Proteinantigene, die wie hierin beschrieben hergestellt wurden, ersetzt wird, die auf einem geeigneten Substrat immobilisiert werden. Ein anderes Beispiel eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen ist in dem U.S.-Patent 4,362,155 ausgeführt. Dieses Patent offenbart ein Entfernen von Interferon und/oder Autoantikörpern aus dem Blut. Das Verfahren und die Vorrichtung können leicht angepaßt werden, um die in der vorliegenden Erfindung offenbarten Antigene anstelle der allgemeinen Adsorbtionsstoffe, die in dem Patent offenbart sind, zu verwenden.
Die gereinigten Antigene, welche mit Autoantikörpern eines Patienten reagieren, können an festen Matrizen befestigt und verwendet werden, um die reaktiven Autoantikörper aus dem Plasma der befallenen Wirte zu entziehen, einzufangen oder auf andere Weise zu entfernen. Verfahren zum Befestigen von Peptiden an Oberflächen sind wohl bekannt und können leicht für eine Verwendung mit dieser Erfindung angepaßt werden. Beispielsweise kann eine terminale Aminosäure eines Peptidantigens mit einer reaktiven Carbonyl-, Carboxylat-, Hydroxyl- oder Aminogruppe eines festen Polymers (oder einer Verknüpfungsgruppe, welche an dem Polymer befestigt ist) reagieren. Ein Beschichten des unmodifizierten Peptids auf Plastik- oder Glasoberflächen kann ebenfalls verwendet werden, um eine immunologisch reaktive Oberfläche zur Verfügung zu stellen.
Patienten mit Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Myasthenia gravis und systemischem Lupus, wie auch jene mit einigen Formen von Krebs wurden erfolgreich mit subtraktiven Therapien behandelt, bei welchen alle Antikörper aus dem Blut des Patienten entzogen werden. Diese Verfahren haben daran gelitten, daß chemisch reine, reaktive Antigene nicht zur Verfügung standen; das hierin beschriebene Verfahren stellt zum ersten Mal große Mengen an antigenen Proteinen zur Verfügung, welche verwendet werden können, um dem Wirtsplasma spezifische Autoantikörper zu entziehen. Somit können in der Praxis die nützlichen Antikörper zu dem Wirt zurückgeführt werden, womit die Verwendung von teueren und möglicherweise Komplikationen hervorrufenden Austauschfluids (z.B. Albumin) vermieden wird.
Beispielsweise kann bei Patienten mit SLE oder Sjögren Syndrom, welche Autoantikörper produzieren, die mit dem La- Protein reagieren, eine Krise mit einhergehender zellulärer Zerstörung und Entzündung auftreten. Ein solcher Patient kann durch eine Zirkulation oder Perkolation seines Serums durch eine Apherese-Vorrichtung, in welcher genetisch hergestelltes La-Protein in hohen Konzentrationen eingebaut wurde, behandelt werden. Die Vorrichtung kann so gestaltet werden, daß jeder potentielle La-Autoantikörper an einem immobilisierten La-Antigen angeordnet ist. Das Antigen kann mittels eines Proteinabschnitts, welcher genetisch fusioniert und exprimiert wurde (Z.B. β-Galaktosidase oder ein starkes matrixbindendes Protein, wie z.B. Avidin), an der festen Matrix befestigt werden. Eine Befestigung mittels eines fusionierten Griffes, Arms oder Anhängers (tag) hat die Vorteile, daß (1) eine gemeinsame chemische Befestigungsquelle erlaubt wird, so daß verschiedene Antigene identisch an eine gemeinsame Matrix konjugiert werden können, (2) eine maximale Freiheit der Mobilität des Antigens erlaubt wird, eine Qualität, von welcher bekannt ist, daß sie die Antikörper-Antigen-Reaktivität verbessert, und (3) für eine verstärkte Stabilität des Antigens gesorgt wird. Die resultierende Subtraktion von La-Autoantikörpern aus dem Blut des Patienten wird die Möglichkeit verhindern oder verändern, daß sich Immunkomplexe bilden, und eine Ablagerung von Komplexen in entzündeten Geweben eines Patienten kann vermindert werden. Der anfängliche Schritt in diesem Verfahren macht die Subtraktion von vorgebildeten La-Immunkomplexen unter Verwendung einer Rohplasmapherese oder eines Immunglobulinentzugs mit Staph A-Protein nötig, gefolgt von einem spezifischen Entzug der neu hergestellten La-Autoantikörper bevor sie in dem Wirt auf Antigene treffen können, mit welchen sie reagieren können. Somit könnte das Blut des Patienten dann von Immunkomplexen, die das La- Antigen enthalten, frei bleiben.
Proteinantigene, welche gemäß der Erfindung hergestellt werden, könnten ebenfalls durch direkte Injektion des Antigens in den befallenen Wirt verwendet werden, um die Bildung von Immunkomplexen zu stören. Immunkomplexe, die sich als ein Ergebnis der Autoimmunität bilden, hängen von der Gegenwart von kritischen Konzentrationen der Reaktanden (Antigen und Antikörper) ab, und das Verhältnis der Reaktanden zueinander bestimmt, ob eine Bindung auftreten wird. Es wird angenommen, daß dieses Verhältnis während der Perioden der Krise in dem Autoimmunerkrankungszustand optimal ist. Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung können homogen reine Antigene in das Blut des Wirtes injiziert werden und somit das Antigen-Antikörper-Verhältnis ändern. Das resultierende Versagen, neue Immunkomplexe zu bilden, wird dem retikubendothelialen System und den Phagozyten erlauben, erfolgreich vorgebildete Immunkomplexe zu entfernen, womit die Möglichkeit der Immunkomplexe vermindert wird, sich in Zielgeweben abzulagern, wo sie mit der Autoimmunpathologie in Zusammenhang stehen. Beispielsweise kann gereinigtes La-Antigen intravenös in einen Patienten, welcher La-Autoantikörper produziert, wahrend einer lebensbedrohlichen Autoimmunkrise injiziert werden, bei welcher sich Immunkomplexe mit La-Antigen schneller bilden, als sie beseitigt und zerstört werden können. In einem durchschnittlichen menschlichen Wirt mit 68 kg Gewicht und mit 4,8 Litern Vollblut gibt es ca. 5 x 10&sup4; mm IgG. Bei typischen Patienten mit zirkulierenden La-Autoantikörpern entspricht dieses einem ungefähren Gegenwert von 10¹&sup5; Molekülen La-Antikörper insgesamt. Somit würde eine Injektion mit einem molaren Äquivalent an La-Antigen (ungefähr 1,6 Nanomol) die Bildung von Immunkomplexen verhindern, welche optimal während Stadien hoher Antikörpergeringer Antigen-Verhältnisse resultieren. Die derzeitige Hypothese der Autoimmunität, welche auf der Bildung von pathogenen Immunkomplexen an der Stelle der Ablagerung, eher als in einer freien Zirkulation beruht, behauptet, daß die Gegenwart eines Antigens mit hoher Affinität in der Zirkulation die Ablagerungsgeschwindigkeit von Immunkomplexen in Zielgeweben vermindern sollte. Um die Menge der zirkulierenden Autoantikörper genau zu bestimmen, können die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen quantitativen diagnostischen Verfahren angewendet werden, und die Menge des gereinigten injizierten Antigens kann entsprechend eingestellt werden, so wie das Niveau an Autoantikörpern steigt oder fällt.
Die Erfindung, welche nun im allgemeinen beschrieben wurde, wird besser durch Bezug auf gewisse spezifische Beispiele verstanden werden, welche hierin nur zu Zwecken der Veranschaulichung eingeschlossen sind, wobei nicht beabsichtigt ist, daß sie die Erfindung oder irgendeine Ausführungsform davon beschränken sollen, außer wenn dieses angegeben ist.

Beispiel

Isolierung und Analyse von cDNA-Klonen, die das menschliche Lupus La-Antigen exprimieren.

Einleitung

Die vorliegende Erfindung wurde in die Praxis umgesetzt und veranschaulicht, indem rekombinante cDNA-Klone, welche aus menschlicher Leber erzeugt wurden, die das La-Protein exprimierten, das mit systemischem Lupus erythematodes und Sjögren Syndrom in Zusammenhang steht, identifiziert wurden. Vor der vorliegenden Erfindung war kein Verfahren bekannt, das eine Identifizierung des spezifischen antigenen Materials erlauben würde, und es war nur eine ungefähre Zuordnung von antigenen Spezifitäten gegenüber standardmäßigen Prototyp-Antiseren möglich (1). Es wurde gefunden, daß das La-Protein aus Säugetierzellen mit Vorläuferformen von RNA-Polymerase III-Transkripten, einschließlich TRNA, 4,5S-RNA, 5S-RNA und 7-2-RNA, assoziiert war (3,4,5,6). Von einigen kleinen viralen Transkripten, wie z.B. der VAI-RNA des Adenovirus (7,8), EBER-RNAs des Epstein-Barr-Virus (9) und den Leit-RNsS des Stomatitis vesiculosa-Virus (2,10) und des Tollwut-Virus (11) wurde ebenfalls gezeigt, daß sie mit dem La-Protein komplexiert sind. Durch Immunpräzipitation von Ribonukleoprotein-Kornplexen unter Verwendung von La-Antikörpern wurde gezeigt, daß die Stelle der La-Protein-Bindung mit mehreren dieser RNA-Spezies nahe bei dem 3'- Ende liegt (4,8,12). Die Gegenwart von Uridylat-Resten an den 3'-Enden dieser RNAs könnte zur Bindung benötigt werden. Weiterhin wurde gefunden, daß die Zufügung von zusätzlichen 3'-terminalen Uridylat-Resten die Bindung des La- Proteins an VAI-RNA (13) und an Transfer-RNA (14) verstärkt. Da La-Protein vorzugsweise an nicht prozessierte Transkripte bindet, haben Steitz und Mitarbeiter (4,5) vorgeschlagen, daß La-Protein ein Transkriptionsfaktor für RNA-Polymerase III ist. Trotz einer Ungewißheit bezüglich seiner genauen Funktion im RNA-Metabolismus ist es klar, daß das La-Protein bei der Regulation der Genexpression biologisch wichtig ist, da es mit einer Vielzahl von zellulären und viralen RNAs assoziiert, von denen viele bekannte Funktionen haben.
Um die biochemischen Funktionen des La-Proteins weiter zu charakterisieren, wurden Versuche unternommen, es aus Säugetierzellen zu reinigen (14). Die Rückgewinnung betrug bei diesen Reinigungsverfahren weniger als 7 % und das La-Protein zeigte eine biochemische Heterogenität, welche scheinbar auf Wechselwirkungen mit RNA-Bestandteilen beruhte. Um große Mengen an hochgereinigtem La-Protein zu produzieren, leiteten die Erfinder rekombinante cDNA-Klone ab, welche für das La-Protein codierten. La-cDNA-Kolonien aus λgt11- Expressionsbibliotheken (15) wurden identifiziert, indem Seren von ausgewählten Lupus-Patienten als Antikörpersonden verwendet wurden.

MATERIALIEN UND METHODEN

Enzyme

Enzyme wurden von den Bethesda Research Laboratories und New England Biolabs gekauft. Das Kaninchen-Retikulozyten- Lysat-System für eine in vitro-Translation war von New England Nuclear.

Antiseren

Lupus-Antiseren wurden von dem Duke University Medical Center Fluorescent Antinudear Antibody Laboratory erhalten. Seren, die mit einzelnen spezifischen Antigenen in hohem Maße reaktiv waren, wurden identifiziert und in größeren Mengen durch Venenpunktion erhalten.

Zellen und Immunpräziditation

HeLa-Zellen wurden für Antikörper-Fällungen in Methioninfreiem Medium 5 Stunden lang mit [³&sup5;S)-Methionin (New England Nudear) bei 0,2 - 0,5 mCi/ml markiert. Proteinextrakte wurden hergestellt und Immunpräzipitationen wurden wie beschrieben (8) durchgeführt, indem Pansorbin (Calbiochem) als eine Quelle von Protein A verwendet wurde. Immunpräzipitierte Proteine wurde durch 15 %ige SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) (16), gefolgt von Fluorographie, analysiert.

Bakterienstämme und λgt11-Expressionsbibliotheken

Die E. coli-Stämme Y1088 und Y1090 wurden von D. Stafford (Universität von North Carolina in Chapel Hill) erhalten. cDNA-Bibliotheken aus menschlicher Leber, welche mit λgt11 konstruiert wurden, wurden von D. Stafford und P. Modrich (Duke University Medical Center) und R.A. Lazzarini (National Institutes of Health) zur Verfügung gestellt.

Screenen von Expressionsbibliotheken mit Antikörpersonden

Wie von Young und Davies beschrieben (15) wurden rekombinante λgt11-Phagen mit 10&sup5; pfu pro 576 cm²-Platte (NUCU Inter Med) auf E. coli Y1090 plattiert. Die Expression von β-Galaktosidase-Fusionsproteinen wurde durch Überschichten mit Nitrocellulose-Filtern (Schleicher und Schuell), die mit 10 mM Isopropyl-Thiogalactopyranosid (IPTG) (Boehringer Mannheim Biochemicals) gesättigt waren, induziert. Seren von Lupus-Patienten wurden durch Immunpräzipitation von [³&sup5;S]-Methionin- und [³H]-Aminosäure-markierten HeLa-Zellextrakten oder durch Immunoblotting unter Verwendung der Technik von Towbin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 - 4354 (1979) gescreent, um die einmalige Spezifität der Autoantikörper zu bestätigen. Es wurde vor der Verwendung beim Screenen von Expressionsbibliotheken bestimmt, daß die La-Seren frei von Ro-, Sm-, RNP- und anderen Lupus- Autoantikörpern waren. Nach der Übertragung von induzierten Proteinen auf Nitrocellulose wurden die Filter mit fötalem Kalbsserum blockiert, mit 1:100-Verdünnungen von Lupus- Antiseren gescreent und mit [¹²&sup5;1]-markiertem Protein A (ICN Radiochemicals) sondiert.

Hybridselektion bei der in vitro-Translation

Die EcoRI-DNA-Inserts, welche in PBR322 rekloniert waren, wurden auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert und zur Hybridselektion verwendet. Die gesamte zytoplasmatische RNA der HeLa-Zelle wurde, wie von Maniatis et al (17) beschrieben, bei den Hybridselektionen verwendet. Hybridselektionierte mRNAs wurden in vitro unter Verwendung von Kaninchen-Retikulozyten-Lysaten in der Gegenwart von [³³5J- Methionin translatiert, und die Produkte wurden durch 15 %ige SDS/PAGE analysiert. Gelscheibchen, die durch Autoradiographie identifiziert wurden und das La-Protein enthielten, wurden in Probenvertiefungen eines zweiten Gels übertragen. Variierende Mengen an S. aureus V8-Protease (Sigma) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und es wurde erlaubt, daß gemäß dem Verfahren von Cleveland et al (18) ein Verdau in dem Stapelgel fortschritt. Die Peptide, welche durch begrenzte Proteolyse erzeugt wurden, wurden in demselben Gel fraktioniert und durch Fluorographie identifiziert.

DNA-Sequenzieren

EcoRI-Inserts, die aus λgt11-La-Klonen isoliert wurden, wurden unter Verwendung von Restriktionsenzymen fragmentiert und in M13-mp18- und M13-mp19-Vektoren subkloniert. Eine Dideoxy-DNA-Sequenzierung (19) wurde durchgeführt, indem [³&sup5;5]-dATP (Amersham) und Puffer-Gradientengele (20) verwendet wurden.

Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA)

Nitrocellulose-Blätter, welche in 10 mM IPTG getränkt waren, wurden durch Induktion von konfluenten Phagen-Plaques, welche die klonal gereinigte La-cDNA in der vollen Länge enthielten, mit dem La-Antigen beschichtet. Für empfindlichere Tests wurde das teilweise gereinigte β-Galaktosidase-La-Fusionsprotein verwendet, um Nitrocelluloseblätter zu beschichten. Mit Antigen beschichtete Nitrocelluloseblätter wurden mit einer BSA-haltigen Blockierungslösung (Kirkegaard and Perry Laboratories) behandelt und Verdünnungen der menschlichen Seren wurden 1 Stunde lang in Kontakt mit dem Antigen gebracht. Die Seren wurden entfernt und die Filter gründlich mit Puffer gewaschen, welcher 0,02 M Imidazol-gepufferte Salzlösung und 0,02 % Tween 20 (Kirkegaard and Perry Laboratories) enthielt. Die Nitrocelluloseblätter wurden jeweils 10 Minuten lang in dem Tween 20-Puffer und zweimal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Die mit Antikörper umgesetzten Blätter wurden 30 Minuten lang mit Lactoperoxidase-konjugiertem Protein A bei einer Konzentration von 1 µg/ml inkubiert. Nach 3 Waschzyklen wurden die Filter 10 Minuten lang mit 4- Chlor-1-naphthol in dem Peroxidase-Substratsystem (Kirkegaard und Perry) umgesetzt.

ERGEBNISSE

Isolierung und Identifizierung von La-cDNA-Klonen

Ein anfängliches Plaque-Screenen von 500.000 Rekombinanten identifizierte zwanzig mutmaßliche La-Klone. Nach mehreren Runden der Reinigung und des erneuten Screenens mit verschiedenen La-spezifischen Autoantikörpern wurden drei positive La-Klone isoliert und bestätigt. FIGUR 1(a) zeigt eine Reihe von Fotografien von Kulturmedien, welche eine Isolierung und Identifizierung von La-cDNA-Klonen über das immunologische Screening-Verfahren demonstrieren. Rekombinante Phagen wurden anfangs mit einer Dichte von ungefähr 200 pfu/cm² auf 576 cm²-Platten plattiert. Ein Agar-Stopfen mit 0,5 cm Durchmesser an der Position von jedem der Signale wurde entfernt und titriert, bevor bei einer Dichte von ungefähr 20 pfu/cm² auf Platten mit 9 cm Durchmesser erneut plattiert und erneut gescreent wurde. Das erneute Plattier- und Screen-Verfahren wurde mehrere Male wiederholt, bis jeder Phagen-Stopfen klonal gereinigte Rekombinanten enthielt, wie bestimmt wurde, wenn jeder Plaque auf der Platte mit La-Antiseren aus mehreren verschiedenen Patienten reagierte.
Wenn zwei der La-Klone als "λgt11"-Plaques exprimiert und mit einer Reihe von Seren aus Patienten mit SLE, welche keine La-spezifischen Autoantikörper enthielten (wie durch Immunpräzipitation von RNA und Protein, Zellfluoreszenz (ANA) und Gegenimmunelektrophorese (CIE) getestet wurde), wie auch mit normalen menschlichen Seren auf Reaktivität hin analysiert wurden, wurden die Daten aus FIGUR 1b erhal ten. Die verwendeten Seren zeigten La-, Sm- und RNP-Spezifitäten. Es ist klar, daß Klone, die La-Antigen exprimierten, nur mit Seren von SLE-Patienten der La-Spezifität reagierten.
Diese klonal exprimierten La-Antigene wurden weiterhin durch einen Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA) identifiziert. Ergebnisse eines typischen Punkt-ELISAs mit einem der La-Antigenklone sind in FIGUR 2 gezeigt. Seren von 18 SLE-Patienten wurden auf Reaktivität mit dem exprimierten La-Antigen hin analysiert. Seren von drei SLE-La-Patienten zeigten eine klare positive Antwort, während Patienten mit anderen Lupus-Spezifitäten (Sm, Ro, RNP, Ga, To und unklassifizierten Reaktivitäten) und Gesunde nur einen niedrigen Hintergrund an Reaktivität zeigten. Filter wurden wie in Materialien und Methoden beschrieben hergestellt und verarbeitet, und durch mit Lactoperoxidase verbundenes S. aureus Protein A analysiert. (1-2) La, (3) La/Ro, (4) Ro, (5) Sm, (6) RNP, (7) SM/RNP, (8) Sm/RNP, (9) unbekanntes SLE, (10) To, (11) RNP, (12) RNP + unbekannt, (13) Sm/RNP, (14) RNP, (15) unbekanntes SLE, (16) Sm/RNP, (17) unbekanntes SLE (La), (18) unbekanntes SLE, (19) normal, (20) normal. In manchen Fällen wurde bei Seren mit unbekannter Spezifität bei ANA und CIE über den ELISA gefunden, daß sie schwach positiv für das La-Protein waren. Eine nachfolgende Analyse durch RNA- und Proteinfällungen bestätigte die Gegenwart von La-Antikörpern in diesen Proben (Daten nicht gezeigt).
Daten von DNA-DNA-Hybridisierung (nicht gezeigt) und Restriktionsenzymanalyse zeigten, daß überlappende La-Klone isoliert worden waren, von denen alle den carboxylterminalen Bereich der codierenden Sequenz enthielten. Die erwartete Länge der codierenden Sequenz für das menschliche La- Protein mit 50.000 Dalton beträgt ca. 1,5 kb. Der größte der cDNA-Klone enthielt ein Insert von ca. 1,5 kb und schien die codierende Sequenz mit nahezu der vollen Länge darzustellen. Eine teilweise Restriktionskarte ist in FIGUR 3 gezeigt.

Proteinidentität durch Hybridselektion und in vitro-Translation

Um die Identität der cDNA-Klone zu bestätigen, wurden die Techniken der Hybridselektion und der in vitro-Translation verwendet. DNA-Inserts aus den λgt11-La-Klonen, welche in pBR322 subkloniert wurden, wurden zur Hybridselektion von mRNA aus der gesamten zytoplasmatischen HeLa-RNA verwendet. Die selektierte an einen Filter gebundene mRNA wurde eluiert und unter Verwendung von Kaninchen-Retikulozyten-Lysaten in vitro translatiert. FIGUR 4 zeigt eine Fluorographie der mit [³&sup5;5J-Methionin markierten Produkte, die in vitro synthetisiert wurden und auf 15 %igen SDS/Acrylamid-Gelen fraktioniert wurden.
Die verschiedenen Gele sind in FIGUR 4 wie folgt gezeigt:
(a) Bahn 1, in vivo [³&sup5;5]-markierte HeLa-Zellproteine, immunpräzipitiert mit Lupus-Seren der La- und Ro-Spezifitäten. Bahn 2, in vitro translatierte Produkte von HeLa-mRNA, hybridselektioniert mit La-cDNA- Insert. Bahn 3, in vitro translatierte Produkte von HeLa-mRNA, hybridselektioniert mit La-cDNA-Plasmid. Bahnen 4 und 5, in vitro translatierte Produkte von HeLa-mRNA, hybridselektioniert mit dem Plasmid pBR322. Bahn 6, in vitro translatierte Produkte unter Verwendung von 10 µg Carrier-TRNA.
(b) Bahn 1, in vivo [³&sup5;5)-markierte HeLa-Zellproteine, immunpräzipitiert mit Lupus-Seren der La-Spezifität. Bahn 2, dasselbe wie Bahn 3 in (a). Bahn 3, translatiertes Material von Bahn 2, immunpräzipitiert mit anti-La-Serum. Bahn 4, dasselbe wie Bahn 4 in (a). Bahn 5, dasselbe wie Bahn 6 in (a). Bahn 6, in vitro translatierte Produkte unter Verwendung von 0,1 µg der gesamten HeLa-Zell-RNA.
Ein einzelnes Protein mit ungefähr 50.000 Dalton war die einzige Proteinspezies, welche allein bei der La-cDNA- selektionierten mRNA auftrat (FIGUR 4a, Bahnen 2 und 3; FIGUR 4b, Bahn 2). Dieses Protein wanderte zusammen mit dem in vivo markierten La-Protein, welches durch anti-La-Serum immunpräzipitiert wurde (FIGUR 4a und b, Bahn 1). Es wurde gefunden, daß die in vitro synthetisierte Spezies mit demselben Antiserum reagierte (FIGUR 4b, Bahn 3). Um weiterhin zu zeigen, daß das in vitro translatierte Protein tatsächlich das authentische zelluläre La-Protein war, wurde eine Hybridselektion und Translation durchgeführt und die Produkte wurden auf präparativen Gelen fraktioniert. Die präparativen Gele wurden autoradiographiert und die Gelscheibchen, die sowohl in vitro als auch in vivo markiertes La- Protein enthielten, wurden auf die Probenvertiefungen eines zweiten Gels überführt. Unter Verwendung des Verfahrens von Cleveland et al (17) wurden die Proben einer begrenzten Proteolyse mit S. aureus V8-Protease unterworfen und die erzeugten Peptide wurden analysiert. Fig. 5 zeigt eine Fluorographie einer Peptidkartierung des La-Proteins, das in vitro und in vivo synthetisiert wurde. In vivo [³&sup5;S]-markiertes HeLa-Zell-La-Protein und die damit zusammen wandernde Proteinbande, welche in vitro mit Kaninchen-Retikulozyten-Lysaten unter Verwendung von La-cDNA-hybridselektionierter mRNA synthetisiert wurde, wurden über ein Gelgereinigt, mit variierenden Mengen an S. aureus V8-Protease verdaut und auf einem 15 %igen SDS/Polyacrylamid-Gel analysiert. Die Proben wurden 30 Minuten lang in dem Stapelgel inkubiert, wobei die Bahnen 1 - 4 0, 10, 100 bzw. 1000 ng an Protease entsprachen. Diese Daten zeigen, daß das in vitro translatierte Produkt dasselbe partielle proteolytische Profil aufweist, wie das in vivo markierte La-Protein. Daher codieren und exprimieren die cDNA-Klone das menschliche La-Protein.

Kartieren einer antigenen Stelle des La-Proteins

Da λgt11 cDNA-Inserts im richtigen Leseraster exprimiert, wie durch die Antigenizität bestimmt wurde, war es möglich, die Aminosäuresequenz aus der DNA-Sequenz zu bestimmen, indem direkt nach der 5'-EcoRI-Spaltstelle begonnen wurde. Das kleinste isolierte cDNA-Insert war 390 Nukleotide lang, was 366 Basen, die für die carboxylterminalen 122 Aminosäuren des La-Proteins codierten, zusätzlich zu 24 Nukleotiden einer nicht-codierenden Information einschloß. Es wurde gefunden, daß die codierende Sequenz eines anderen cDNA- Inserts nur die carboxylterminalen 55 Aminosäuren einschloß. Da beide cDNA-Inserts als β-Galaktosidase-Fusionsproteine in dem λgt11-Vektor exprimiert wurden, liegt wenigstens eine antigene Stelle, welche mit La-Antiseren reagiert, in diesem Bereich von 55 Aminosäuren (terminalen 12 %) des Proteins. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen sind wie folgt:
Ein im Raster liegendes (in-frame) Stop-Codon war beginnend mit Position 166 vorhanden.
Diese Sequenz hat einen hohen Gehalt an hydrophoben Aminosäuren. Eine Hydrophilieanalyse unter Verwendung des Verfahrens von Hopp und Woods (21) identifizierte ein Decapeptid von Aminosäure 40 bis 49 mit einem Wert von +1,61. Die mittlere Hydrophihe des antigenen Bereiches der 55 Aminosäuren wurde auf +0,3 berechnet. Auf der Grundlage dieses Verfahrens hat dieser Decapeptidbereich eine hohe Wahrscheinlichkeit, an der Oberfläche des Proteins exponiert zu sein und er kann mit einer antigenen Determinante für das La-Protein überlappen. Demgemäß stellt diese Decapeptidsequenz Glu-Asp-Lys-Thr-Lys-Ile-Arg-Arg-Ser-Pro zum ersten Mal eine eindeutige antigene Determinante dar, welche mit einer Autoimmunerkrankung in Zusammenhang steht.
Das oben beschriebene Verfahren wurde ebenfalls auf die Herstellung von Klonen angewendet, die Antigene exprimieren, welche mit natürlichen Ro-, L-42-, Scl- und U&sub2;bp-Antigenen kreuzreaktiv sind.
Eine Hinterlegung wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A. vorgenommen, um diesen bevorzugten Aspekt der Erfindung als Beispiel dienen zu lassen. Die Hinterlegung ist identifiziert als E. coli HB1010-Lab und durch ihre Hinterlegungsnummer ATCC 39984. Dieser Stamm enthält ein pBR322- Plasmid, welches darin ein La-Antigen-Gen eingefügt hat und welches in E. coli HB101 transformiert ist.

Literaturangaben

1. Tan, E.M. (1982), "Autoantibodies to Nudear Antigens (ANA): Their Immunobiology and Medicine," in Advances in Immunology, Bd. 33, H. Kunkel und F. Dixon, Herausgeber, Academic Press, Inc., Seiten 167 - 240.
2. Kurilla, M.G. und Keene, J.D. (1963), Cell 34, Seiten 837 - 845.
3. Chambers, J.C., Kurilla, M.G. und Keene, J.D. (1983), J. Biol. Chem. 258, Seiten 11438 - 11441.
4. Hendrick, J.P., Wohn, S.L., Rinke, J., Lerner, M.R. und Steitz, J.A. (1981), Mol. Cell. Biol. 1, Seiten 1138 - 1149.
5. Rinke, J. und Steitz, J.A. (1982), Cell 29, Seiten 149 - 159.
6. Hashimoto, C. und Steitz, J.A. (1983), J. Biol. Chem. 258, Seiten 1379 - 1384.
7. Lerner, M.R., Boyle, J.A., Hardin, J.A. und Steitz, J.A. (1981), Science 211, Seiten 400 - 402.
8. Francoeur, A.M. und Mathews, M.B. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, Seiten 6772 - 6776.
9. Rosa, M.D., Gottlieb, E., Lerner, M.R. und Steitz, J.A. (1981), Mol. Cell. Biol. 1, Seiten 785 - 796.
10. Wilusz, J., Kurilla, M.G. und Keene, J.D. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, Seiten 5827 - 5831.
11. Kurilla, M.G., Cabradilla, C.D., Holloway, B.P. und Keene, J.D. (1984), J. Virol. 50, 773 - 778.
12. Reddy, R., Henning, D., Tan, E. und Busch, H. (1983), J. Biol. Chem. 258, Seiten 8352 - 8356.
13. Mathews, M.B. und Francoeur, A.M. (1984), Mol. Cell. Biol. 4, Seiten 1134 - 1140.
14. Stefano, J.E. (1984), Cell 36, Seiten 145 - 154.
15. Young, R.A. und Davis, R.W. (1983), Science 222, Seiten 778 - 782.
16. Laemmli, U.K. (1970), Nature (London) 227, Seiten 680 - 685.
17. Maniatis,T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
18. Cleveland, D.W., Fischer, S.G., Kirschner, M.W. und Laemmli, U.K. (1977), J. Biol. Chem. 252, Seiten 1102 - 1106.
19. Sanger, F., Coulson, A.R., Barrell, B.G., Smith, A.J.H. und Roe, B.A. (1980), J. Mol. Biol. 143, 161 - 178.
20. Biggin, M.D., Gibson, T.J. und Hong, G.F. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, Seiten 3963 - 3965.
21. Hopp, T.P. und Woods, K.R. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, Seiten 3824 - 3828.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen eines Proteinantigens, welches mit einem Autoantikörper reagiert, der mit einer Autoimmunerkrankung in einem Wirt in Zusammenhang steht, umfassend:

das Einführen von genetischer Information aus einer Genbibliothek in mehrere Empfängerzellen, wobei die Genbibliothek von einem Donor erhalten wird, der ein Proteinantigen exprimiert, welches mit dem Autoantikörper reagiert, wodurch transformierte Zellen hergestellt werden;

das Selektionieren einer transformierten produzierenden Zelle, welche ein Gen enthält, das für das Proteinantigen codiert, und welche das Antigen exprimiert, durch Nachweisen einer Bindungsreaktion zwischen dem Autoantikörper, der von dem Wirt erhalten wurde, und einem Proteinantigen, das durch die produzierende Zelle exprimiert wird, wodurch ein kloniertes DNA-Segment aus dem Donor identifiziert wird, welches bei der Herstellung des Proteins verwendet werden kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren weiterhin die Schritte des Klonierens der selektionierten Zelle und des Isolierens des Proteinantigens, das durch die selektionierten Zellen produziert wird, umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin das Sequenzieren des Gens oder des Peptidantigens und das Synthetisieren des Peptids durch chemische Mittel umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Donor-Genbibliothek eine cDNA-Genbibliothek ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Wirt ein Mensch ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, gemischte Kryoglobulinämie, Thyreoiditis, Glomerulonephritis oder Sjögren Syndrom ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythernatodes ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Antigen ein La-, Ro-, Scl-, Sm-, RNP-, U&sub2;bp- oder L-42-Antigen ist.

9. Rekombinanter DNA-Expressionsvektor, welcher ein exprimierbares DNA-Segment umfaßt, das für mindestens 66 Aminosäuren am Carboxylende eines menschlichen La- Proteinantigens codiert.

10. Injizierbare Zusammensetzung eines Antigens, das durch das Verfahren nach Anspruch 1 erhalten wurde, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung.

11. Peptid, umfassend einen Decapeptidbereich der Sequenz Glu-Asp-Lys-Thr-Lys-Ile-Arg-Arg-Ser-Pro, welcher mit einem Autoantikörper mit der La-Spezifität reagiert.

12. Peptid nach Anspruch 12, worin das Peptid eine mittlere Hydrophihe außerhalb des Decapeptidbereichs von nicht mehr als +0,3 hat.