JP2736322B2 - 自己免疫自己抗体の存在決定方法 - Google Patents
自己免疫自己抗体の存在決定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料を自己抗体と
反応性の自己免疫抗原に接触させて抗原／抗体コンプレ
ックスを形成し、コンプレックスの存在を検出するるこ
とを包含する、試料における自己免疫自己抗体の存在を
決定する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】人および動物においては、個体が異物に
さらされたとき、個体は特異的な抗体を生産することに
より、または、異物に対する細胞介在性の免疫を発達さ
せることによりこれに応答する。個体は一般に、自己の
一部を通常に形成する物質については寛容（tolerant）
であり、従って、自己寛容（self-tolerant)であるとさ
れる。自己に対する免疫応答の発達は自己免疫（autoim
munity）と呼ばれ、自己寛容の障害の結果である。 【０００３】自己免疫の発達を説明するために多くの理
論が提出されてきた。例えば、いくつかの動物モデルで
証明されたように、ウイルスが自己免疫の病因に関して
重要な役割を果たすと考えられる。ウイルス抗原の宿主
細胞表面への発現（expression）が、ウイルス抗原に対
すると同様に細胞膜抗原に対する自己抗体を誘導すると
考えられている。また、自己免疫は、異常な免疫調節、
特にＴ細胞活性の変化によって引起こされる疾患である
とする説も提出された。サプレッサーＴ細胞活性の減少
またはヘルパーＴ細胞活性の増加は、低レベルの自己抗
体の過剰な生産を引き起こすだろう。この理論は、自己
免疫疾患が証明されない正常な数人の人に、また、種々
の動物モデルに自己抗体が見出されることにより支持さ
れる。あるマウス系は全身性エリテマトーデス（ＳＬ
Ｅ）と類似する自己免疫疾患を示すことが証明されたの
で、少なくともある種の自己免疫疾患では遺伝子制御も
存在するようである。ＳＬＥの高い相関は一卵性双生児
にも見出される。更に、ＨＬＡ−Ｄ座に位置する遺伝子
が自己免疫疾患に関与していることが、成人リウマチ様
関節炎および多発性硬化症で見出された。 【０００４】全身性エリテマトーデスは、人体の結合組
織のコラーゲンに影響を及ぼす重篤な自己免疫疾患であ
る。ＳＬＥは、血管、心臓、腎臓、皮膚、しょう膜など
体中の多くの異なる組織や器官の一つまたはそれ以上に
影響することがあるので、症状がリウマチ様関節炎、皮
膚癌、血清症、リウマチ熱、多発性骨髄腫およびシェー
グレン症候群などの多数の他の疾患と類似することもあ
って、臨床診断がしばしば困難となる。 【０００５】腎臓、中枢神経系および血管の損傷が高い
確率で起こるので、ＳＬＥを他の疾患と区別できること
が重要である。例えば、ループス腎炎はこの疾患に非常
に頻繁に見られ、ＳＬＥの最も重大な症状の一つであ
る。腎炎はしばしばＳＬＥ患者の死亡の原因となるの
で、ＳＬＥを重大な腎障害を防ぐまたは緩和することが
できるほど十分早く発見できれば非常な利益となるであ
ろう。 【０００６】結合組織の疾患を有する患者の血清は多く
の核成分に対する抗体を含むことが示された。例えば、
自身の（native）ＤＮＡ（デオ−キシリボ核酸）と反応
する循環する抗体は、全身性エリテマトーデスの患者に
非常に特異的であることが見出された。ＳＬＥに付随す
る腎炎の出現と悪化は、腎臓特に腎糸球体中での［抗体
／ＤＮＡ］および他の免疫複合体の形成と沈積に関連す
るようである。これらの抗体の生産の正確な理由および
それらがＳＬＥに対して特別に特異的である理由はまだ
分っていないが、これらの抗体の検出と測定は、この疾
患の臨床診断と評価において急速に重要になってきてい
る。 【０００７】最近、14Ｃ標識ＤＮＡを用いて種々の少量
の抗ＤＮＡ抗体を測定する正確な方法が発達してきた。
「全身性エリテマトーデスにおける血清ＤＮＡ結合活性
の測定」（T. Pincus et al, New England Journal of
Medicine, 281, 701-705 (1969))を参照。この方法は現
在利用できる最も確かな方法のようである。研究された
ＳＬＥ患者の７５パーセントが陽性であったと報告され
ている。一方、他の主要な試験ではＳＬＥ症例の約２５
〜６４パーセントが陽性であった。更に、この抗ＤＮＡ
抗体試験は、使用された免疫拡散法、補体結合や沈降な
どの他の診断試験とよりもＳＬＥに対して高い特異性を
示した。 【０００８】しかし、この試験はＤＮＡと反応する抗体
に対する試験であるが、ＤＮＡが真正な（authentic)抗
原でない可能性もある。更に、この方法は抗原が蛋白質
である自己免疫疾患には応用できない。蛋白質抗原は、
他の型の自己免疫疾患と同様にＳＬＥのほとんどの型に
関連している。そのような蛋白質抗原は、自己免疫疾患
に関連する自己抗体と特異的に反応できるので、診断お
よび治療方法において有効である。しかし、抗原物質の
不足と不安定性のためおよび分離技術が複雑なために、
これらの抗原の単離と精製はこれまで収穫のあるもので
はなかった。従って、宿主中で自己免疫疾患と関連する
自己抗体と反応する蛋白質抗原を生産する方法は、依然
として必要とされている。 【０００９】 【発明の解決しようとする課題、解決手段】本発明の目
的は、自己免疫疾患と関連する自己抗体と反応する蛋白
質抗原を生産する方法を提供することである。 【００１０】更に、本発明の目的はそのような抗原を大
量に、かつ、宿主からの大量の物質の供与を必要とせず
に生産できる方法を提供することである。 【００１１】この後次第に明らかとなる本発明のこれら
のおよび他の目的は、宿主中で自己免疫疾患と関連する
自己抗体と反応する蛋白質抗原を生産する方法によって
達成される。この方法は、交差反応性供与体（donor)遺
伝子ライブラリーからの遺伝子情報を複数の受入れ細胞
(recipient cell)に導入して、それにより形質転換細胞
を得る工程、上記の宿主から得られた上記の自己抗体
と、上記の蛋白質抗原のコードである遺伝子を含む上記
の形質転換細胞である産生細胞によって発現される蛋白
質抗原との結合反応を検出することにより、この抗原を
発現する細胞を選択する工程、この抗原を発現する細胞
を培養基（culture medium）中で培養する工程、およ
び、この培養基から上記の蛋白質抗原を単離する工程を
包含する。 【００１２】本発明の目的は、また、本発明の実施なら
びに、今や初めて大量に利用できることになった蛋白質
抗原を使用する自己免疫疾患の診断と治療の方法の実施
に有効な組換え体ＤＮＡを提供することである。 【００１３】添附した図面と共にこの後の詳細な説明を
参照することにより、本発明とそれに付随する多くの利
点がより完全に理解されるだろう。 【００１４】図１は一連の培養基の写真であり、Ｌａ特
異性のループス血清を用いるλｇｔ１１組換え体ファー
ジプラーク（溶菌斑）の免疫学的スクリーニングによる
ＬａｃＤＮＡクローンの単離と同定を示している。 【００１５】図２は、種々の特異性のループス血清を用
いるλｇｔ１１−Ｌａ クローンの免疫学的スクリーニ
ングを示す一連の写真である。 【００１６】図３は、ニトロセルロースに結合させた発
現したＬａ抗原を用いて、これを自己免疫疾患の１８人
の患者からの血清と２人の正常血清とに対して反応させ
たエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（酵素
結合免疫吸着剤分析）（ＥＬＩＳＡ）を示す一連の写真
である。 【００１７】図４では、１．５kbのＬａ蛋白質ｃＤＮＡ
の制限地図（restriction map)を示す。 【００１８】図５は一連のアクリルアミドゲル電気泳動
を写真で再現したものであり、Ｌａ蛋白質に対するｃＤ
ＮＡを使用するハイブリッド選択のＨｅＬａ細胞ｍＲＮ
Ａの試験管中の翻訳を示している。 【００１９】図６はＬａ蛋白質の部分的なペプチドマッ
ピングを写真で再現したものであり、体中で放射標識し
たＨｅＬａ細胞Ｌａ蛋白質を示している。 【００２０】 【発明の実施の最良の形態】本発明は、部分的に、人の
肝臓発現ライブラリー（expression library）から得ら
れたいくつかのｃＤＮＡクローンが、一定の自己免疫疾
患と関連する自己抗体により認識されたと認められたこ
とと共に始まった。本発明以前には、自己免疫抗体と反
応するペプチドをこのようにして生産できることは知ら
れていなかった。更に、医者または研究者が特定の患者
または他の感染した個体からの抗原を欲した場合には、
それを源として抗体を単離する必要があった。そのよう
な抗原は、一般に溶液中で遊離のままではなく、いずれ
の方法でもほんの少量しか手に入らず、この同定、分析
と使用を実際上不可能にしていた。というのは、大量の
抗原の生産は感染した人または動物からの大量の物質を
必要とし、その個体を損傷することとなったからであ
る。 【００２１】本発明者の実験室では、それからｃＤＮＡ
クローンが生産される初めの（original）メッセンジャ
ーＤＮＡの供与源は自己抗体の源と同一ではなかったの
で、自己免疫疾患と関連する自己抗体と反応する蛋白質
抗原、それは以前には大量に手に入れることができなか
った、その抗原が、自己免疫疾患を有する宿主からの一
つの血清試料以上のものを必要とすることなく、血清ま
たはそれから誘導された抗体を、異なる源からのｃＤＮ
Ａライブラリーと反応させることによって生産されるこ
とが認められた。従って、本発明は、宿主中でその宿主
に特異的な方法で自己免疫疾患を治療する効果的な方法
を始めて可能にした。 【００２２】「宿主」は自己免疫疾患にかかっている人
または動物を意味する。本発明は最初に人の宿主で証明
され、今後も人の宿主は関心の範囲に留まるだろうと予
測されるが、本発明は獣医学の分野でも使用できる。例
えば、馬、牛、羊、家禽（例えば、鶏、アヒル、七面鳥
など）、霊長類、犬、猫、豚、ヤギ（特にヤギの関節炎
の治療に）、ミンク（特にアリューシャンミンク病の治
療に）など。 【００２３】本発明の実施で使用される一つの試薬は宿
主血清からの抗血清（または精製した抗体）である。血
清または血しょう試料は宿主から典型的には静脈穿刺に
より得られ、赤血球および血餅が除かれる。抗体はそれ
から適当な任意の技術により他の蛋白質から分離され
る。宿主の抗原反応性は、放射標識した宿主細胞抽出物
の免疫沈降または未標識の宿主細胞抽出物のイムノブロ
ッティング（immunoblotting）により測定される。いず
れの場合も反応性の抗原は、これらの反応を行う他の多
くの方法が同じように適しているが、文献（Towbin et
al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354 (197
9)およびFrancoeur et al, Proc. Natl. A cad. Sci. US
A, 79, 6772-6776 (1982))に記述されるように、分子量
分別（アクリルアミドゲル電気泳動）と黄色ブドウ球菌
（Staphylococcus aureus ）からの蛋白質Ａ（protein
Ａ）に対する免疫複合体の結合によって同定される。 【００２４】本発明の実施に必要な他の試薬は、交差反
応性の蛋白質抗原を生産するための宿主に十分に関連し
た供与種からの遺伝子ライブラリーである。本明細書で
使用されているように、「遺伝子ライブラリー」は、細
胞または供与体種の細胞からのＤＡＮ断片がそこに操作
的に挿入されたまたはそれに連結されたベクターの集り
（collection) を意味する。本明細書に記載されるよう
に宿主および供与体は真核生物なので、ＤＮＡセグメン
トが受け入れの単核細胞生物中でペプチドとして発現さ
れるとき、抗原決定基は、イントロンと機能性（functi
onal）遺伝子セグメントの両方を含むＤＮＡセグメント
から生産される蛋白質に存在することができるので、必
須ではないけれども特に相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライ
ブラリーが好ましい。しかし、メッセンジャーＤＮＡか
ら生産され、そのため通常真核細胞に存在するイントロ
ンを欠いたｃＤＮＡが、受け入れの前核細胞に挿入され
たとき蛋白質の発現において高い成功率を有することは
よく知られている。従って、ｃＤＮＡライブラリーの使
用が好ましい。 【００２５】本明細書でこれまでに示したように、供与
体種は必ずしも宿主の種と同一である必要はないことは
当業者には明らかであろう。しかし、供与体種は、宿主
の自己抗体と交差反応性である抗原部位（決定基）を有
する蛋白質を発現できることが要求される。供与体種の
選択は、使用しようとする供与体種からの培養細胞を
（例えば、35Ｓメチオニンで）放射標識し、培養細胞か
ら粗細胞抽出物を製造し、この粗細胞抽出物を宿主から
得た自己抗体と黄色ブドウ球菌からの蛋白質Ａとを共に
用いて免疫沈降することにより容易に行われる。放射活
性物が沈降されるときには、宿主から得られる自己抗体
と反応する抗原が供与体細胞抽出物中に存在し、この供
与体からの遺伝子ライブラリーが本発明の方法に使用で
きる。その代わりに、供与体種または供与体からの特定
の組織を抽出して、抽出された蛋白質をマトリックス中
で分別することができる。分離された蛋白質は、膜へ移
し宿主からの自己抗体と反応させられることにより固定
化される。黄色ブドウ球菌からの蛋白質Ａがフィルター
と結合する場合は、供与体組織からの対応する遺伝子ラ
イブラリーが本発明で使用できる。しかし、与えられた
形質転換で産生細胞（適切な蛋白質抗原を生産する細
胞）のパーセントを増加させるために、供与体と宿主が
同じ属であること、好ましくは、同じ種であることが望
ましい。しかし、哺乳類の供与体と哺乳類の宿主の使用
も適切である。 【００２６】本明細書中で「交差反応性(crossreactiv
e) 」は、宿主の自己抗体が、供与体によって生産され
た蛋白質抗原と反応することを意味する。この供与体の
蛋白質抗原は、宿主の自己免疫疾患と関連する自己抗体
に対する抗原決定基を提供する、宿主中に存在する通常
の蛋白質抗原と同一である必要はない。交差反応性は、
問題とする抗原が自己抗体と反応する能力として定義さ
れる。本来は、蛋白質抗原が同一であるとき、交差反応
性が存在する。しかし、交差反応性の抗原が、宿主の抗
原の生化学組成物からの異なる生化学組成物を全部また
は一部包含していることも可能である。 【００２７】リウマチ性疾患の中で、特に全身性エリテ
マトーデスに関しては、メジャー（major)とマイナー
（minor)と呼ぶことができる臨床的に定義される自己抗
体の異なるクラスがある。メジャークラスは、Ｌａ、Ｒ
ｏ、ＲｍおよびＲＮＰとして知られている４つの通常の
蛋白質抗原特異性を含む。大部分の人の宿主はこれらの
特異性の混合物を有しているが、多くの宿主は上述の免
疫沈降およびイムノブロッティングの方法を使用して、
反応性のＬａ、Ｒｏ、ＲｍまたはＲＮＰ自己抗体のユニ
ークな一つのクラスを有するものとして同定できる。従
って、この技術の実施に当っては、単一の抗原特異性を
有する宿主から選んだ自己抗体を、供与体ライブラリー
から、通常の特異性またはクラスが同じであるいずれの
宿主とも共通に反応する遺伝子組換え体を得るために使
用できる。ＳＬＥでは、全患者の半数以上が、これらの
４つのメジャーの特異性またはクラスのうちの一つと反
応する自己抗体を示している。ここに記述される方法に
従って、当業者は、同じ特異性またはクラスの自己抗体
を有する他の個体に対する一般的な診断および治療の試
薬としての、それぞれのクラスの精製抗原を生産でき
る。 【００２８】「遺伝子情報」という語は、一般には蛋白
質抗原の全部または一部のコードであるＤＮＡを意味す
る。しかし、この語はまた、ＲＮＡウイルスまたは他の
ＲＮＡを基にするべクターと共に使用されるときには、
ＲＮＡも含む。 【００２９】蛋白質抗原のコードである遺伝子情報を受
け取った細胞であり、しかも、蛋白質抗原を発現して細
胞内に保持するかまたは培養基に放出する細胞は、「産
生細胞（producer cell)」と呼ばれる。 【００３０】「ベクター」という語はよく知られてお
り、しばしば使用される「クローニング ビーイクル
（cloning vehicle)」と同意である。ベクターは非クロ
モソーム性の二重らせんＤＮＡであり、例えば形質転換
の方法などにより単核生物中に置かれるときベクターが
複製されるような完全な（intact）レプリコンを包含す
る。 【００３１】物質が、問題としている反応性または性質
を妨害する他の成分、および天然に形成されたとき物質
中に存在する他の成分を含まないとき、その物質は「精
製されて」いる。精製した物質が少なくとも９５重量％
の単一物質を含有することが更に好ましく、９９％含有
することがそれ以上に好ましい。最も好ましいのは、９
９．８％の単一物質を含有することである。水は純度を
計る際には考慮しない。 【００３２】生化学における最近の進歩によって、例え
ば外来性のＤＮＡを含んでプラスミドがつくられるよう
な「組換え体」ベクターの構築が行われるようになっ
た。特殊な例では、組換え体ベクターは異種（heterolo
gous) のＤＮＡ、つまり、組換え体ベクターによって形
質転換されやすい生物によっては元来生産されないポリ
ペプチドのコードであるＤＮＡを含むことができる。遺
伝子ライブラリーを生産する工程中の組換え体ＤＮＡベ
クターの生産については、よく理解されており、詳細に
記述する必要はないが、この工程を参考のためにここに
簡単に説明する。 【００３３】例えば、プラスミドベクターを開裂して、
連結可能な末端を有する線状ＤＮＡを得ることができ
る。これらの末端は、連結可能な末端のような相補性を
有する外来性のＤＮＡと結合して、完全レプリコンと望
ましい表現型の性質を有する、生物学的に機能する組換
え体ＤＮＡ分子を与える。ＤＮＡ組換えに対しては多様
な方法が利用でき、そこでは別々のＤＮＡ断片の隣接
（adjoining)する末端を結合（tailor）して連結が容易
にされる。連結（ligation）は、最も頻繁には酵素Ｔ4
ＤＮＡリガーゼの作用を通して、隣接するヌクレオチド
間にリン酸ジエステル結合を形成することを意味する。
このように、ブラントエンド（blunt end)を直接連結す
ることができる。その代わりに、水素結合により相補的
な一重らせんと結合するような一重らせんを、その隣接
（adjoining)末端に含む断片の連結を行うことができ
る。付着端（cohesive termini）と呼ばれるそのような
一重らせんは、ブラントエンドにターミナル トランス
フェラーゼを使用してヌクレオチドを付加することによ
り形成される。しかし、付着端形成には、制限エンドヌ
クレアーゼが最も普通に使用される。これらの酵素は、
長さが約４〜６塩基対のユニークなヌクレオチド配列の
中およびその周辺のリン酸ジエステル結合を開裂する。
多くの制限エンドヌクレアーゼとその認識部位が既知で
あり、いわゆるＥcoＲＩエンドヌクレアーゼが最も広く
知られている。典型的には、プラスミドまたは他のクロ
ーニング ビーイクルが開裂されて、それぞれが制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位の半分を包含する末端が残さ
れ、それから、相補的な末端を有する同じ制限エンドヌ
クレアーゼで得られた外来性のＤＮＡの開裂生成物が、
この開裂されたベクターへ挿入される。これについて
は、多くの多様な技術が当業者には知られており、本発
明の実施に使用できる。 【００３４】本発明の遺伝子ライブラリーの生産に使用
される外来性の、例えば供与体のＤＮＡは、前述のよう
にして同定された供与体の適切な細胞から得られる。ｃ
ＤＮＡ供与体遺伝子ライブラリーが生産されるときに
は、宿主中で自己免疫疾患により攻撃された器官と同じ
である、ｍＤＮＡ供与体の器官から得られた細胞を使用
することが好ましい。例えば、自己免疫疾患が宿主の肝
臓を攻撃している場合には、異なる器官の細胞は、それ
に対する保護が望まれている自己抗体と反応しないペプ
チドを発現され易いので、供与体の肝細胞が好ましい。
ｃＤＮＡ断片が製造される場合には、この目的のための
任意の種々の方法によって、メッセンジャーＤＮＡが供
与体細胞から得られる。 【００３５】例えば、単一の細胞に分散できる任意の哺
乳類組織または細胞培養からメッセンジャーＲＮＡを単
離するために、次の方法が使用できる。この技術のより
詳細な説明は、ここに引用して挿入される文献(Maniati
s et al, molecular cloning : a laboratory manual, C
old Spring Harbor New York, 1982, pages 191-199）
に記載されている。細胞は培養基から分離され、リン酸
緩衝生理食塩水中で洗浄される。それから、細胞は遠心
分離されて上清を除かれ、約１，０００単位／ｍｌのＲ
Ｎasinまたは１０ｍＮのバナジル−リボヌクレオシド複
合体を含有する細胞溶液緩衝液（lysis buffer）中に懸
濁される。混合、貯蔵および勾配上での遠心分離の後、
細胞質層は回収されて、変成剤を含む緩衝液へ添加され
る。それから、蛋白質を破壊するためにプロテイナーゼ
が添加される。蛋白質はフェノール／クロロホルムで一
度抽出されることにより除かれる。水相は回収され、エ
タノール添加後貯蔵される。貯蔵された溶液を遠心分離
して、核酸を含むペレットが得られる。核酸は、ＲＮas
inまたはバナジル−リボヌクレオシド複合体を含有する
少量の緩衝液中に再溶解される。ＤＮase がＤＮＡを破
壊するために添加される。インキュベーション後、生成
の物質はフェノール／クロロホルムで一度抽出される。
酢酸ナトリウム溶液が添加され、核酸はエタノールで沈
澱する。沈澱したＲＮＡは水性エタノール中に−７０℃
で貯蔵される。その代わりに、グアニジニウム／ホット
フェノール法およびグアニジニウム／塩化セシウム法が
使用できる。これらの二つの方法は上に引用した文献に
説明されている。必要ならば、ポリアデニル化ＲＮＡを
非ポリアデニル化ＲＮＡから分離することができる。そ
のために選ばれた方法はオリゴ（ｄＴ）セルロース上で
のクロマトグラフィーである。オリゴ（ｄＴ）セルロー
スは実験室で製造でき、市販もされている。ポリアデニ
ル化ＲＮＡの選択のための詳細な技術は上に引用した文
献に説明されている。 【００３６】それから、相補的ＤＮＡが単離されたｍＲ
ＮＡから逆転写酵素により生産される。生成の一重らせ
んＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼを使用して二重らせんＤ
ＮＡはへ変換される。ｃＤＮＡがこの方法で細胞中に存
在する全てのｍＲＮＡから生産され、クローニング ビ
ーイクル中に挿入される場合には、本来の（original）
ｍＲＮＡが集められたときに発現されていた供与体の遺
伝子生成物のコードであるＤＮＡ塩基配列が含まれてい
るので、生成のｃＤＮＡの集まりは「供与体遺伝子ライ
ブラリー」と呼ばれる。 【００３７】供与体遺伝子ライブラリーの生産それ自体
はよく知られており、ここでの供与体ライブラリーの生
産についての議論は、単に、本発明の実施で行われる生
化学反応の性質を示すに過ぎないものであることに留意
すべきである。本発明は、ある特定の遺伝子ライブラリ
ーの存在に依存するものではなく、本発明の目的のため
特に集められたかまたは他の目的のためであるかに関わ
らず、本明細書中に説明される要求を満たすものであれ
ば、任意の遺伝子ライブラリーを使用できるものであ
る。 【００３８】単核生物中で複製する任意のベクターが宿
主遺伝子ライブラリーの生産に使用できる。例えば、本
発明の実施で使用するのに適している多くのプラスミド
が、米国特許第4273875 号、第4304863 号、第4419450
号、第4403036 号、第4363877 号、第4356270 号、第43
49629 号および第4332901 号などの最近の米国特許明細
書中に記載されている。本発明の実施で使用するのに適
している他のベクターは、ｐＡＪ６５５（宿主細菌、
Ｅ．coli ＦＥＰＭ−ＢＰ１３６）、ｐＡＪ６１１（宿
主細菌、Ｅ．coli ＦＥＰＭ−ＢＰ１３８）、ｐＡＪ４
４０（宿主細菌、Bacillus Subtilis ＡＴＣＣ３９１
３９１）、ｐＡＪ１８４４（宿主細菌、Ｅ．coli ＦＥ
ＰＭ−ＢＰ１３７）、および、ｐＡＪ３１４８（宿主細
菌、Coryne bacterium glutamicum ＡＴＣＣ３９１３
７）を含む。特に好ましいのは、文献（Young et al, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1194-1198 (1983))に
記述されている方法に従って公的に入手できるファージ
から生産できるファージベクターλｇｔ１１である。簡
単に説明すれば、この好ましいファージベクターは次の
ように生産される。λｇｔ７−ｌａｃ５とλ５４０（Δ
Ｂ ｉｍｍ２１ nin ５）はＨｉｎｄ IIIで開裂され、
断片はプールされ、それから、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで
連結される。望ましいファージ組換え体は、ＤＮＡが大
腸菌（Ｅ．coli）ＢＮＮ９３に感染させられ、細胞が発
色指示薬の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Gal)を含む培地上にプレー
トされたとき、深い（imm ２１）青（lac ５）のプラー
クを生じる。それから、λgt７−lac ５−λ５４０ハイ
ブリッドは、λgt４（ｃ１８５７ Ｓ１００ nin ５）
と組換え体とで交差され、４２℃で成長し、Ｘ−Ｇalプ
レート上で澄んだ（ｃ１８６７）青のプラークの形成に
ついて記録される。アンバー変異Ｓ１００の存在は、ア
ンバーサプレッサーsup Ｆを含むかまたは欠いている宿
主（それぞれＢＮＮ４５またはＢＮＮ９３）上の相対的
な平板効率（プラーク形成効率）を調べることにより確
かめられる。最後に、lac ５ ｃ１８５７ Ｓ１００フ
ァージはＥcoＲＩ開裂部位に対してマップされる。ファ
ージλgt１１は一つのＥcoＲＩ開裂部位を含む。 【００３９】いったん供与体遺伝子ライブラリーが利用
可能となれば、上述の方法または他の任意の方法によっ
て、受け入れ細胞は遺伝子ライブラリーを用いて形質転
換され、種々の供与体ＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）断片を
含む一連の形質転換細胞を生じる。受け入れ細胞への組
換え体ＤＮＡの導入は、文献(Mandel et al, J. Mol. Bi
ol., 53, 159 (1970)）中に報告されるように、受け入
れの単核微生物を塩化カルシウムで処理して細胞膜のＤ
ＮＡに対する透過性を増加させることによってなされ
る。受け入れ細胞を形質転換する他の方法には、文献
（Young et al, Gen e, 1,153 (1977))に報告されている
ような、細胞がＤＮＡを導入することができるようにな
る成長の段階（いわゆるコンピテント細胞段階）での組
換え体ＤＮＡの導入がある。文献（Chang et al, Mol.
Ec. Gen. Genet., 168, 111 (1979)）に記述されるよう
に、ＤＮＡ受け入れ体のプロトプラストまたはスフェロ
プラストを形成することにより、プラスミドもまたＤＮ
Ａ受け入れ体に導入される（特に酵母に対して使用され
る）。受け入れ細胞を形質転換する他の任意の方法が本
発明の実施で使用できる。 【００４０】自己免疫抗原は、多くの既知技術のうち任
意のものを使用して受け入れ細胞から得ることができ
る。例えば、抗原が細胞膜を通って周囲の空間へ輸送さ
れる仕方でペプチド抗原を発現する細胞を、培養基中で
成長させ、望ましい抗原を直接培養基から得ることがで
きる。望ましい抗原が細胞膜の内側に保持される場合に
は、細胞を溶解して抗原を細胞上清に放出させ、これを
精製して望ましい抗原を得ることができる。生産される
抗原が細胞の抗原発現に対して逆の効果を有する場合に
は、抗原に対する遺伝子をインデューサーの制御下に置
いて、遺伝子を収集時にのみ発現させることができる。
例えばλファージはｐＮＣ９を含む細胞中で、ＰＢＲ誘
導体はlac ｉQ を含む細胞中で成長できる。ファージの
細胞溶解（溶菌）成長の間、十分なlac レプレッサーが
細胞中でハイブリッド蛋白質の発現を抑制するために生
産される。ハイブリッドの発現は感染細胞中でＩＰＴＧ
を用いて誘導でき、このようにして生産された抗原は細
胞溶解に際して細胞から放出される。 【００４１】本発明の好ましい点でλgt１１ファージが
使用される場合には、自己免疫抗原の存在を決定するた
めの抗体を用いるスクリーニングとして、次の方法が好
ましい。推薦する宿主は大腸菌Ｙ１０９０であり、これ
は、Δlac Ｕ１６９ proＡ+Δlon araＤ１３９ str
Ａ supＦ ［ trpＣ２２：：Ｔｎ１０］（ｐＭＣ９）
である。宿主細菌は感染され、柔らかい寒天にプレート
された後、プレートは約５時間約４２℃でインキュベー
トされる。ファージの一様な分布のために、小さいプレ
ート当りには約１０4 のファージ、大きいプレート当り
には約１０5のファージが勧められる。プレートは、前
もって１０ｍＭＩＰＴＧ中に浸された、乾燥したニトロ
セルロースフィルターのディスク（nitrocellulose fil
tereddisk）を被せられる。プレートは約３７℃でイン
キュベートされる。それから、フィルターは除かれ、ｐ
Ｈ８．１のトリス緩衝生理食塩水中で室温で約５〜１０
分間洗浄される。フィルターは、約２０％の牛胎児血清
（あるいは３％のＢＳＡまたは卵白アルブミン）を含む
ＴＢＳ中でインキュベートされる。インキュベーション
は室温で約３０分間行われる。それから、フィルター
は、ＴＢＳ＋２０％フィータルカストセラム＋抗体（血
清またはＩｇＧの約１：１希釈。ＩｇＧが使用される場
合は、ＩｇＧは初めは１０mg／mlで存在する。）中でイ
ンキュベートされる。インキュベーションは室温で約１
時間行われる。その後、フィルターは未結合の抗体を除
くために洗浄され、 125Ｉ蛋白質Ａ（約１０6 cpn／フ
ィルター）を含むＴＢＳ中で室温で約１時間インキュベ
ートされる。放射能は、抗体結合が発現された抗原の存
在を示す位置に存在する。 【００４２】この技術は本発明の好ましい具体例を示す
ものであるが、抗体プローブを用いるスクリーニング法
は他にも当業者に知られており、それらを容易にこの技
術の代わりに使用することができる。 【００４３】本明細書中で「形質転換細胞（transforma
nt）」の語は最も広義に使用され、外来性の遺伝子情報
がそこに挿入されている任意の受け入れ細胞を意味す
る。形質転換細胞のより厳密な意味（プラスミドを導入
した細胞）に加えて、本明細書中では、形質転換細胞
は、外来性のＤＮＡを（一つまたは複数の）クロモソー
ムに挿入された細胞、ならびに、上述の任意の組換え体
ベクターを含む細胞を意味する。 【００４４】形質転換細胞は個々の単核生物に無秩序に
挿入された組換え体ＤＮＡベクターからの遺伝子生成物
を発現するので、供与体遺伝子ライブラリーを使用して
形質転換された複数の受け入れ細胞は、発現ライブラリ
ーとみなされる。典型的には、形質転換細胞は、個々の
元来の形質転換細胞から発生する一連の細胞株を生産す
るためにクローンされる。それぞれの細胞株から試料が
選ばれ、（必要ならば細胞溶解の後）上述のようにして
製造された免疫疾患と関連する自己抗体に対して宿主中
でさらされる。自己抗体と、適当な遺伝子を含む形質転
換細胞によって発現された抗原との結合相互作用は、こ
の目的に使用できる種々の方法のうち任意の方法で検出
できる。例えば、形質転換細胞のコロニーからの蛋白質
は、コロニーに被せたニトロセルロースろ紙上に吸着さ
れる。この場合は、この後、自己免疫抗体を添加し、洗
浄して未反応の抗体を除き、放射標識した蛋白質Ａを用
いて蛋白質と結合した抗体を検出する。このようにして
同定された細胞コロニーを大量に成長させて、蛋白質抗
原のコードである遺伝子を望ましい量得ることができ
る。この点でいくつかの変法が可能である。既知の技術
を使用して、蛋白質抗原に対する遺伝子を含む細胞に抗
原を発現させ、その抗原を培養基から回収することがで
きる。その代わりに、供与体ｃＤＮＡ断片を最初のベク
ターから取り（例えば、最初にプラスミドを開裂しＤＮ
Ａを挿入するために使用した同じエンドヌクレアーゼを
用いるエクセッション（excession)によって）、新しい
クローニングベクターに挿入し、ｃＤＮＡまたは蛋白質
抗原の大量生産のために、受け入れ細胞の形質転換に使
用できる。その代わりにまた、いったん比較的大量の蛋
白質抗原またはそれを生産するｃＤＮＡが手に入れば、
分子種の配列を決定することも可能である。一度この配
列が分かれば、自動ペプチド合成装置または他の適切な
合成手段を使用してペプチド抗原を合成することができ
る。合成の実験室の技術、典型的には固相合成、および
自動ペプチド合成装置は共に当業界ではよく知られてい
る。例えば、そのような装置の広告が雑誌（Genetic En
gineering News) の１９８４年１１／１２月号の３４ペ
ージに掲載されている。一つの特定のＤＮＡ塩基配列は
一つのペプチドをコードするので、クローンしたＤＮＡ
セグメント中に存在する遺伝子情報は容易にペプチドの
非生物学的合成に使用できる。ペプチドの疎水領域は通
常ペプチドの内側に、親水領域は通常外側にあるので、
外表面にあり従って抗原決定基として作用するペプチド
の部分を妥当な精度で予測できる。親水性分析（Hopp a
nd Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ, 78, 3824
-3828 (1981)) が高い親水性を有するペプチド領域を固
定するために使用できる。抗原決定基はしばしば、平均
より高い親水性値のアミノ酸の３〜１０の配列を有す
る。遺伝子情報を用いて生産した人工のペプチドは、上
述のような完全な親水領域を含むことが好ましい。人工
のペプチドが、抗原決定基が自己抗体との反応に利用で
きるほど十分に、クローンされたＤＮＡセグメントによ
ってコードされる配列と同じである配列を有すること
が、特に好ましい。同一の配列が最も好ましいが、蛋白
質構造の小さな修飾は抗原決定基に影響を与えることな
く行えることは当業者には容易に認識されるだろう。例
えば、厳密に関連するアミノ酸の置換（イソロイシンに
対してロイシン）、および、未端アミノ酸が置換された
（例えばシステイン）またはそれを欠いているペプチド
（好ましくは全アミノ酸含有量の１０パーセント以下）
の生産は共に可能である。 【００４５】種々のアミノ酸の付加を含む他の典型的な
修飾によって、抗原を種々の表面へ結合（coupling）さ
せることができる。例えば、システインの付加または置
換により機能化表面にスルフヒドリル基を結合させるこ
とができ、疎水性のアミノ酸の付加または置換により可
塑性の表面に疎水結合で結合させることができる。これ
らの方法の両方を、例えばＥＬＩＳＡ試験または他の標
準的な免疫試験で使用できる。本発明の範囲に入る変法
は、自己免疫抗体と反応する能力によって容易に決定さ
れる。これらのまたは他の等価な方法の任意のものが、
血清が初めに得られる宿主の自己免疫疾患と関連する自
己抗体と反応する抗原の獲得に適している。 【００４６】本発明の実施による組換え体ＤＮＡ分子と
形質転換した単核細胞微生物の製造に使用できる上述の
一般的な方法に加えて、他の既知技術およびその変法が
本発明の実施に使用できる。特に、遺伝子工学に関連す
る技術は最近爆発的に成長し発展した。最近の多くの米
国特許が、本発明の実施に使用できる、プラスミド、遺
伝子工学で扱われた微生物および遺伝子工学の方法を開
示している。例えば、米国特許第4273875 号はプラスミ
ドとそれを単離する方法を開示している。米国特許第43
04863 号は、ハイブリッドプラスミドを構築し、それを
細菌宿主の形質転換に使用する遺伝子工学によって細菌
を生産する方法を開示している。米国特許第4419450 号
は組換え体ＤＮＡの作業でクローニングビーイクルとし
て有効なプラスミドを開示している。米国特許第436286
7 号は、組換え体ｃＤＮＡ構築法とそれによって生産さ
れたクローン法に有効なハイブリッドヌクレオチドを開
示している。米国特許第4403036 号はＤＮＡセグメント
の多数の複製を含むプラスミドをつくる遺伝子試薬を開
示している。米国特許第4363877 号は組換え体ＤＮＡ転
移ベクターを開示している。米国特許第4356270 号は組
換え体ＤＮＡクローニングビーイクルを開示しており、
また、遺伝子工学で使用される多くの語とそこで使用さ
れる基本的な方法を定義しているので、遺伝子工学の分
野で限られた経験しか持たないものには特に有効であ
る。米国特許第4336336 号は融合した遺伝子とその製造
方法を開示いている。米国特許第4349629 号はプラスミ
ドベクターとその生産および使用を開示している。米国
特許第4332901 号は組換え体ＤＮＡに有効なクローニン
グビーイクルを開示している。これらの全ての特許なら
びにこの明細書中に引用される他の全ての特許と文献
は、本発明が属する当業者の水準を示すものであり、全
てここに引用して挿入する。 【００４７】これらの特許のいくつかは本発明の範囲に
ない特定の遺伝子生成物の生産を目的としているが、そ
こに記述されている方法は、遺伝子工学に携わる当業者
によって本明細書に説明される本発明の実施のために容
易に改良される。例えば、融合した蛋白質の生産は蛋白
質と抗原の安定性を高めることができ、本発明の実施に
有効である。自己抗体と反応する抗原は正常な宿主構成
物であり、特に分解を受け易い。本発明の診断と治療の
観点からは長期の貯蔵と大量の陳列（exposure）のため
に、安定性が高いことが望ましい。更に、多様な異なる
抗原物質が共通の診断および治療の装置で適用されるの
で、共通の融合した蛋白質部分（例えばβ−ガラクトシ
ダーゼ）は本発明の柔軟性を高めることができる。 【００４８】本発明の方法はいずれの自己免疫疾患の治
療にも使用できるが、ＳＬＥおよび、硬皮症、乾燥症候
群、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、シェーグレン症候群
などの関連した自己免疫疾患における使用が特に好まし
い。 【００４９】本発明の方法により同定され生産された抗
原は、例えば、自己免疫疾患の診断（identification）
と治療における使用など多くの使用法がある。多くの自
己免疫疾患では、病気の人または動物から自己抗体を除
くことにより症状は緩和される。病気の宿主が依然とし
て外来性の抗原に対して正常な免疫応答を示すことがで
きるように、選択的に除くことが望ましい。文献(Terma
n et al, Clinical Im munology and Immunopathology,
８，90-96 (1977)）に議論されているように、体中での
ＤＮＡ抗体の除去が、血液を木炭に固定化された(immob
ilized) ＤＮＡ上を体外循環させることにより行われ
た。この技術は、木炭に固定化されたＤＮＡを、適当な
基質に固定化されたここに記述されるようにして生産さ
れた適切な蛋白質抗原に置き換えることにより、容易
に、蛋白質抗原を含む自己免疫疾患での使用に適用でき
る。自己免疫疾患治療の他の方法と装置の例が米国特許
第4362155 号に示されている。この特許は血液からのイ
ンターフェロンおよび／または自己抗体の除去を開示し
ている。この方法と装置は、その特許に開示されている
一般的な吸着剤の代わりに本発明で開示されている抗原
を使用するように容易に適用できる。 【００５０】患者の自己抗体と反応する精製した抗原を
固体マトリックスに結合させて、病気の宿主の血しょう
から反応性の自己抗体を取る、捕えるまたは除去するた
めに使用できる。ペプチドを表面に結合する方法はよく
知られており、本発明での使用に容易に適用できる。例
えば、ペプチド抗原の末端アミノ酸は、固体重合体（ま
たは重合体に結合した連結基（linking group)の反応性
のカルボニル、カルボキシレート、ヒドロキシルまたは
アミノ基と反応できる。可塑性物質またはガラス上への
未修飾ペプチドの被覆によっても免疫学的に反応性の表
面が得られる。 【００５１】重症筋無力症や全身性ループスなどの自己
免疫疾患の患者ならびにいくつかの型の癌の患者が、患
者の血液から全ての抗体を除去する引算的な治療法でう
まく治療された。これらの方法は化学的に純粋で反応性
の抗原が入手できないために使用が困難であった。ここ
に説明した方法によって、始めて、特定の自己抗体を宿
主の血しょうから除去するために使用できる抗原蛋白質
が大量に提供される。従って、実際には、有益な抗体を
宿主に戻すことができ、高価な潜在的に複雑な置換流体
（例えばアルブミン）の使用が避けられる。 【００５２】例えば、Ｌａ蛋白質と反応する自己抗体を
生産するＳＬＥまたはシェーグレン症候群の患者は、細
胞性の破壊（cellular destruction）と炎症の危機に出
会うことがある。そのような患者は、遺伝的に生産され
たＬａ蛋白質が高い濃度で入れられているアフェレーシ
ス（apheresis)装置を通して血清を循環またはろ過させ
ることにより治療される。その装置は、全ての能力のあ
るＬａ自己抗体が固定化されたＬａ抗原で処理されるよ
うに設計することができる。抗原は、遺伝的に融合され
発現される蛋白質部分（例えばβ−ガラクトシダーゼ、
またはアビジンなどの強力なマトリックス結合蛋白質）
によって固体マトリックスに結合させることができる。
融合するハンドル、腕またはタグによる結合は、（１）
種々の抗原が同様に共通のマトリックスに結合できる共
通の化学結合の源を与える、（２）抗原の可動性に最大
の自由を与える、この性質は抗体−抗原反応性を改良す
ることが知られている、（３）安全性の高まった抗原を
提供するという利点を有する。その結果患者の血液から
Ｌａ自己抗体が取られて免疫複合体の形成能が抑えられ
または変えられ、患者の炎症組織での複合体の沈積を減
少させることができる。この方法の最初の工程は、粗い
血しょう搬出またはブドウ球菌蛋白質Ａを用いる免疫グ
ロブリンの除去によって以前に形成されたＬａ免疫複合
体を取り去ることであり、その後、宿主中で反応する抗
原に出会う前に新たに生産されたＬａ自己抗体を特異的
に除去する。このようにして、患者の血液はＬａ抗原を
含む免疫複合体を含まないようになる。 【００５３】本発明によって生産される蛋白質抗原は、
免疫複合体の形成を乱すために病気の宿主に抗原を直接
注射することによっても使用できる。自己免疫の結果と
して形成される免疫複合体は臨界的な濃度の反応物（抗
原と抗体）の存在に依存しており、反応物の互いの比が
結合が起こるか否かを決定する。この比は自己免疫疾患
状態の危機的な期間に最適値であると考えられている。
本発明の方法によって、同質的に（homogeneously)純粋
な抗原が宿主の血液へ注射されて抗原−抗体比を変える
ことができる。その結果新しい免疫複合体は形成されな
いので、細網内皮細胞系および食細胞は以前に形成され
た免疫複合体をうまく除去でき、このようにして、自己
免疫の病理学と関連する標的組織に免疫複合体が沈積す
る能力を減ずる。 【００５４】例えば、精製したＬａ抗原を、Ｌａ抗原の
免疫複合体がそれらの浄化または破壊よりも速く形成さ
れる生命を脅かす自己免疫危機の間に、Ｌａ自己抗体を
生産する患者に静脈注射することができる。体重が６８
kgで全血液が４．８ｌの平均的な人の宿主には約５×１
０4 mmのＩｇＧがある。Ｌａ自己抗体が循環している典
型的な患者では、これは全体で１０15分子のＬａ蛋白質
とほとんど等価である。従って、１モル等価のＬａ抗原
（約１．６ナノモル）の注射は免疫複合体の形成を妨
げ、最適には高抗体−抵抗原比の状態をもたらすだろ
う。自己免疫の現在の仮説は、自由循環ではなく沈積部
位での病因の免疫複合体の形成に基づいており、循環中
の高親和性の抗原の存在が標的組織での免疫複合体の沈
積の速度を減少させると主張する。循環する自己抗体の
量を適切に測定するために、本発明で説明した定量的診
断方法を適用でき、注射する精製した抗原の量を自己抗
体のレベルの昇降に従って調節できる。 【００５５】 【実施例】これまで一般的に説明した本発明はここに含
まれる特定の例を参照することによってより良く理解さ
れるだろう。この例は説明のためだけのものであって、
特に断わらない限りは本発明またはその具体例を限定す
るものではない。 【００５６】例 人ループスＬａ抗原を発現するｃＤＮＡクローンの単離
と分析。緒言 本発明は、全身性エリテマトーデスおよびシェーグレン
症候群と関連するＬａ蛋白質を発現する、人肝臓から製
造された組換え体ｃＤＮＡの同定によって実施され説明
される。本発明以前には特定の抗原物質を同定できる方
法は知られていず、標準の原型抗血清に対する抗原特異
性のおよその帰属のみが可能であった（１）。哺乳類の
細胞Ｌａ蛋白質は、ｔＲＮＡ、４．５Ｓ ＲＮＡ、５Ｓ
ＲＡＮおよび７−２ＲＮＡを含むＲＮＡポリメラーゼ
III 転写体の前駆体と関連することが見出された（３，
４，５，６）。アデノウイルスのＶＡＩ ＲＡＮ（７，
８）、エプスタイン−バール（Epstein-Barr）ウイルス
のＥＢＥＲ ＲＡＮ（９）、水疱性口内炎ウイルス
（２，10）と狂犬病ウイルス（11）のリーダーＲＮＡな
どの幾つかの小さいウイルス転写体がＬａ蛋白質と複合
体を形成することも示された。Ｌａ抗体を使用するリボ
核蛋白質複合体の免疫沈降によって、幾つかのこれらの
ＲＮＡ種に対するＬａ蛋白質結合部位が、３′末端付近
の残基であることが示された（４，８，12）。これらの
ＲＮＡの３′未満にウリジレート残基が存在すること
が、結合に必要とされる可能性がある。更に、余分な
３′末端ウリジレート残基の付加が、Ｌａ蛋白質のＶＡ
Ｉ ＲＡＮ（13）および転移ＲＡＮ（14）に対する結合
を高めることが見い出された。Ｌａ蛋白質はプロセスさ
れていない転写体に優先的に結合するので、スタイツ
（Steitz）と協同研究者らは（４，５）、Ｌａ蛋白質が
ＲＮＡポリメラーゼIII に対する転写因子であると提案
した。ＲＮＡ代謝における正確な機能については不明確
であるにも関わらず、Ｌａ蛋白質が遺伝子発現の調節に
おいて生物学的に重要であることは明らかである。とい
うのは、それが多様な細胞性およびウイルス性のＲＮ
Ａ、その多くが既知の機能を有している、と関連してい
るからである。 【００５７】Ｌａ蛋白質の生化学的機能を更に特徴づけ
るために、それを哺乳類細胞から精製する試みがなされ
た（14）。これらの精製法からの回収は７％以下で、Ｌ
ａ蛋白質は明らかにＲＮＡ成分との相互作用のために生
化学的不均一性（heterogeneity)を示した。高純度のＬ
ａ蛋白質を大量に生産するために、本発明者は、Ｌａ蛋
白質のコードである組換え体ｃＤＮＡクローンを誘導し
た。λgt１１発現ライブラリー（15）からのＬａ−ｃＤ
ＮＡコロニーは、選ばれたループルス患者からの血清を
抗体プローブとして使用して同定された。 【００５８】物質と方法酵素 酵素は購入した(Bethesda Research Laboratories およ
び New England Biolabs）。試験管中の翻訳のためのウ
サギ網状赤血球溶解産物系も購入した（New England Nu
clear)。抗血清 ループス抗血清はデューク大学医学センター蛍光抗核抗
体実験室から得た。単一の特定の抗原と強力に反応する
血清は、静脈穿刺により同定され大量に得られた。 【００５９】細胞と免疫沈降 ＨｅＬａ細胞は、抗体沈降のために、メチオニンを含ま
ない培地中で５時間［35Ｓ］メチオニン（New England
Nuclear)を用いて０．２〜０．５ｍＣｉ／ｍｌに標識さ
れた。蛋白質抽出物が製造され、免疫沈降が、蛋白質Ａ
源としてパンソルビン（Pansorbin)（Calbiochem）を使
用して（８）に記述されるように行われた。免疫沈降し
た蛋白質は、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ）（16）およびそれに続くフルオログラ
フィーによって分析された。 【００６０】細菌株とλgt１１発現ライブラリー 大腸菌の菌株Ｙ１０８８およびＹ１０９０はスタフォー
ド（D. Stafford, University of North Carolina at C
hapel Hill）から得た。λgt１１を用いて構築された人
肝臓ｃＤＮＡライブラリーは、スタフォードとモドリッ
ク（P. Modrich, Duke University Medical Center）と
ラザリニ（R. A. Lazzarini, NationalInstitutes of H
ealth）により提供された。 【００６１】抗体プローブを用いる発現ライブラリーの
スクリーニング ヤングとデイビス（15）に記述されるように、λgt１１
組換え体ファージは５７６cm2 プレート（ＮＵＣＵ Int
er Med）当り１０5 pfu で大腸菌Ｙ１０９０上にプレー
トされた。β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の発現は、
１０ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）（Boehringer Mannheim Biochemicals）で飽和した
ニトロセルロースフィルター（Schleicher and Schuel
l）を被せることにより誘導された。ループス患者から
の血清は、自己抗体のユニークな特異性を確かめるため
の［35Ｓ］−メチオニン標識および［ 3Ｈ］−アミノ酸
標識のＨｅＬａ細胞抽出物の免疫沈降によって、また
は、文献（Towbin et al, Proc . Natl. Acad. Sci. US
A, 76, 4350-4354 (1979)）に記述された技術を使用す
るイムノブロッティングによって、スクリーニングされ
た。Ｌａ血清は、発現ライブラリーのスクリーニングで
使用する前に、Ｒｏ、Ｓｍ、ＲＮＰおよび他のループス
自己抗体を含まないことを測定された。誘導した蛋白質
をニトロセルロースへ移した後、フィルターは牛胎児血
清でブロックされ、ループス抗血清の１：１００希釈で
スクリーニングされ、［ 125Ｉ］標識蛋白質Ａ（ＩＣＮ
Radiochemicals）でプローブされた。 【００６２】試験管中の翻訳におけるハイブリッド選択 ｐＢＲ３２２中へ再クローンされたＥco ＲＩ−ＤＮＡ
挿入体（inserts)は、ニトロセルロースフィルターに固
定化されてハイブリッド選択のために使用された。マニ
アチスら（17）によって記述されるように、全ＨｅＬａ
細胞細胞質ＲＮＡがハイブリッド選択に使用された。ハ
イブリッド選択されたｍＲＮＡは、試験管中で［35Ｓ］
−メチオニンの存在したウサギ網状赤血球溶解産物を使
用して翻訳され、生成物は１５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分
析された。オートラジオグラフィーで同定されたＬａ蛋
白質を含むゲル薄片は、第２のゲルの試料ウエル（wel
l）へ移された。種々の量の黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテ
アーゼ（Sigma)がそれぞれのウエルへ加えられ、消化が
クリーブランドらの方法（18）によって積み重なったゲ
ル中で進行させられる。制限された蛋白質分解により生
じたペプチドは同じゲル中で分別され、フルオログラフ
ィーによって同定された。 【００６３】ＤＮＡ塩基配列形成（sequencing） λgt１１−Ｌａクローンから単離されたＥco ＲＩ−挿
入体は、制限酵素を使用してフラグメント化され、Ｍ１
３−mp１８およびＭ１３−mp１９ベクター中にサブクロ
ーンされた。ジデオキシＤＮＡ塩基配列形成（19）が［
35Ｓ］−ｄＡＴＰ（Amersham）と緩衝勾配ゲル（20）を
使用して行われた。 【００６４】エンザイムリンクド イムノソルベント
アッセイ（ＥＬＩＳＡ） １０ｍＭのＩＰＴＧに浸されたニトロセルロースのシー
トが、クローン的に精製された全長さのＬａ ｃＤＮＡ
を含む集密的（confluent)ファージプラークの誘導によ
って、Ｌａ抗原で被覆された。より感度の高い試験に対
しては、部分的に精製されたβ−ガラクトシダーゼ−Ｌ
ａ融合蛋白質が、ニトロセルロースシートを被覆するた
めに使用された。抗原で被覆したニトロセルロースシー
トはＢＳＡ含有のブロック溶液（Kirkegaard and Perry
Laboratories)を用いて処理され、人血清の希釈が１時
間抗原と接触したまま置かれた。血清は除かれ、フィル
ターは、０．０２Ｍイミダゾール緩衝生理食塩水と０．
０２％トゥイン（Tween)２０（Kirkegaard and Perry L
aboratories)を含有する緩衝液で完全に洗浄された。ニ
トロセルロースシートは、トゥイン２０緩衝液中および
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中では２度、それぞれ
１０分間洗浄された。抗体と反応させたシートは、１μ
ｇ／ｍｌの濃度のラクトペルオキシダーゼ結合蛋白質Ａ
を用いて３０分間インキュベートされた。３周期の洗浄
の後、フィルターをペルオキシダーゼ基質系（Kirkegaa
rd and Perry）中で４−クロロ−１−ナフトールと１０
分間反応させた。 【００６５】結果Ｌａ−ｃＤＮＡクローンの単離と同定 ５００，０００個の組換え体の最初のプラークスクリー
ニングでは、２０の推定のＬａクローンが同定された。
種々のＬａ特異性の自己抗体を用いる精製と再スクリー
ニングを何回か行ううちに、３つの陽性のＬａクローン
が単離され確認された。図１は、免疫学的スクリーニン
グ法によってＬａ ｃＤＮＡクローンの単離と同定が証
明されている、一連の培養基の写真を示している。組換
え体ファージは最初、５７６cm2 のプレート上に約２０
０ pfu／cm2 の密度でプレートされた。直径０．５cmの
寒天プラグ（plug）がそれぞれの信号の位置から取ら
れ、直径９cmのプレート上で約２０ pfu／cm2 の密度で
再プレートおよび再スクリーニングされる前に、力価を
測定された（titer)。再プレートと再スクリーニングの
工程は、それぞれのファージプラークがクローン的に精
製された組換え体を含むようになるまで、何回か繰返さ
れた。これは、プレート上の全てのプラークが幾人かの
異なる患者からのＬａ抗血清と反応するときに決定され
る。 【００６６】Ｌａクローンのうちの２個がλgt１１プラ
ークとして発現され、そして、Ｌａに特異的な自己抗体
を含まない（ＲＮＡと蛋白質の免疫沈降、細胞蛍光（Ａ
ＮＡ）およびカウンタ−免疫電気泳動（ＣＩＥ）により
試験されたように）ＳＬＥ患者からの血清のパネルおよ
び正常な人血清に対する反応性を分析されたときに、図
２のデータが得られた。使用された血清はＬａ、Ｓｍお
よびＲＮＰ特異性を示した。Ｌａ抗原を発現するクロー
ンがＬａ特異性のＳＬＥ患者からの血清とのみ反応した
ことは明らかである。 【００６７】これらのクローン的に発現されたＬａ抗原
は、更に、エンザイムリンクドイムノソルベントアッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）により同定された。Ｌａ抗原クローン
のうちの一つを用いた典型的なドット（dot)ＥＬＩＳＡ
の結果を図３に示す。 【００６８】１８人のＳＬＥ患者からの血清が発現Ｌａ
抗原に対する反応性を分析された。３人のＳＬＥ−Ｌａ
患者からの血清は明らかな陽性の応答を示したが、他の
ループス特異性（Ｓｍ、Ｒｏ、ＲＮＡ、Ｇａ、Ｔｏおよ
びクラス分けされていない反応性）の患者と正常人は反
応性における低いバックグラウンドを示したのみであっ
た。フィルターは、物質と方法のところに記述したよう
に製造され処理され、そして、ラクトペルオキシダーゼ
結合黄色ブドウ球菌蛋白質Ａによって分析された。（１
〜２）Ｌａ、（３）Ｌａ／Ｒｏ、（４）Ｒｏ、（５）Ｓ
ｍ、（６）ＲＮＰ、（７）ＳＭ／ＲＮＰ、（８）Ｓｍ／
ＲＮＰ、（９）未知のＳＬＥ、（10）Ｔｏ、（11）ＲＮ
Ｐ、（12）ＲＮＰ＋未知、（13）Ｓｍ／ＲＮＰ、（14）
ＲＮＰ、（15）未知のＳＬＥ、（16）Ｓｍ／ＲＮＰ、
（17）未知のＳＬＥ（Ｌａ）、（18）未知のＳＬＥ、
（19）正常、（20）正常。ある場合には、ＡＮＡとＣＩ
Ｅによっては未知の特異性とされた血清が、ＥＬＩＳＡ
によってＬａ蛋白質に対して弱い陽性を示すことが見い
出された。引き続きＲＮＡと蛋白質の免疫沈降によって
分析を行い、これらの試料中にＬａ抗体が存在すること
が確認された（データは示していない）。 【００６９】ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーショから
のデータ（示していない）と制限酵素分析は、部分的に
重なり合うＬａクローンが単離されたことを示した。こ
れらの全てはコードの塩基配列のカルボキシル末端部分
を含んでいた。５０，０００ダルトンの人Ｌａ蛋白質に
対して予想されるコード塩基配列の長さは約１．５kbで
ある。ｃＤＮＡの最大のものは約１．５kbの挿入体を含
み、ほとんど全長さのコード塩基配列に相当するようで
ある。部分的な制限マップを図４に示す。 【００７０】ハイブリッド選択と試験管中の翻訳による
蛋白質同一性 ｃＤＮＡクローンの同一性を確認するために、ハイブリ
ッド選択と試験管中での翻訳の技術が使用された。ｐＢ
Ｒ３２２中にサブクローンされたλgt１１−Ｌａクロー
ンからのＤＮＡ挿入体が、全ＨｅＬａ細胞質ＲＮＡから
のｍＲＡＮのハイブリッド選択に使用された。選択され
たフィルター結合のｍＲＮＡは溶離され、ウサギ網状赤
血球溶解産物を使用して試験管中で翻訳された。図５
は、試験管中で合成され、１５％ＳＤＳ／アクリルアミ
ドゲル上で分別された［35Ｓ］−メチオニン標識生成物
のフルオログラフィーを示す。図５には次のような種々
のゲルが示されている。 【００７１】（ａ）第１レーン（lane）、体中［35Ｓ］
標識ＨｅＬａ細胞蛋白質、ＬａとＲｏ特異性のループル
血清で免疫沈降された。第２レーン、Ｌａ ｃＤＮＡ挿
入体を用いてハイブリッド選択されたＨｅＬａ ｍＲＮ
Ａからの試験管中での翻訳生成物。第３レーン、Ｌａ
ｃＤＮＡプラスミドを用いてハイブリッド選択されたＨ
ｅＬａ ｍＲＮＡからの試験管中での翻訳生成物。第４
と第５のレーン、プラスミドｐＢＲ３２２を用いてハイ
ブリッド選択されたＨｅＬａ ｍＲＮＡからの試験管中
での翻訳生成物。第６レーン、１０μｇの担体ｔＲＮＡ
を使用する試験管中での翻訳生成物。 【００７２】（ｂ）第１レーン、体中［35Ｓ］標識Ｈｅ
Ｌａ細胞蛋白質、Ｌａ特異性のループル血清で免疫沈降
された。第２レーン、（ａ）の第３レーンと同じ。第３
レーン、抗Ｌａ血清で免疫沈降された第２レーンからの
翻訳生成物。第４レーン、（ａ）の第４レーンと同じ。
第５レーン、（ａ）の第６レーンと同じ。第６レーン、
１０μｇの全ＨｅＬａ細胞ＲＮＡを使用する試験管中で
の翻訳生成物。 【００７３】約５０，０００ダルトンの一つの蛋白質
が、Ｌａ−ｃＤＮＡ選択ｍＲＮＡに対してユニークな唯
一の蛋白質種であった（図５ａの第１と第２のレーン、
図５ｂの第２のレーン）。この蛋白質は、抗Ｌａ血清に
より免疫沈降された体中標識Ｌａ蛋白質と共に移動した
（図５ａと図５ｂの第１レーン）。試験管中で合成され
た種は同じ抗血清と反応することが見い出された（図５
ｂの第３レーン）。試験管中で翻訳された蛋白質が実際
に確実な（authentic)細胞性Ｌａ蛋白質であることを更
に証明するために、ハイブリッド選択と翻訳および分離
用（preparative)ゲル上での生成物の分別が行われた。
分離用ゲルはオートラジオグラフィーを行われ、試験管
中と体中の両方の標識Ｌａ蛋白質を含むゲル薄片が、第
２のゲルの試料ウエルに移された。クリーブランドらの
方法（17）を使用して、試料に黄色ブドウ球菌Ｖ８プロ
テアーゼを用いる制限した蛋白質分解を行い、生じたペ
プチドを分析した。図６は、試験管中および体中で合成
されたＬａ蛋白質のペプチドマッピングのフルオログラ
フィーを示す。体中［35Ｓ］標識ＨｅＬａ細胞蛋白質
と、Ｌａ ｃＤＮＡハイブリッド選択したｍＲＮＡを使
用してウサギ網状赤血球溶解産物を用いて試験管中で合
成された前述の共に移動する蛋白質バンドとが、ゲル精
製され、種々の量の黄色ブドウ球菌Ｖ８のプロテアーゼ
で消化され、１５％ＳＤＳ／アクリルアミドゲル上で分
析された。試料は、積み重なったゲル中で３０分間、第
１〜第４のレーンが示しているそれぞれ０、１０、１０
０、１０００ngのプロテアーゼを用いてインキュベート
された。これらのデータは、試験管中で翻訳された生成
物が、体中標識Ｌａ蛋白質と同じ部分蛋白質分解（part
ialproteolytic)プロフィールを有することを示してい
る。従って、ｃＤＮＡクローンは人Ｌａ蛋白質のコード
であり、それを発現する。 【００７４】Ｌａ蛋白質の抗原部位のマッピング λgt１１は抗原性によって定義されるように正しい読み
取り枠（reading frame)中でｃＤＮＡを発現するので、
５′ＥcoＲＩ開裂部位の直後から始まっているＤＮＡ塩
基配列からアミノ酸配列を決定することができた。単離
された最小のｃＤＮＡ挿入体は３９０ヌクレオチドの長
さで、Ｌａ蛋白質のカルボキシル末端にある１２２個の
アミノ酸のコードである３６６個の塩基と、それに加え
て何も情報をコードしていない２４個のヌクレオチドを
含んでいた。他のｃＤＮＡ挿入体のコード塩基配列は、
カルゴキシル末端の５５個のアミノ酸のみを含んでいる
ことが見い出された。両方のｃＤＮＡ挿入体λgt１１ベ
クター中でβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質として発現
されるので、Ｌａ抗血清と反応する抗原部位の少なくと
も一つは、その蛋白質のこの５５個のアミノ酸領域（末
端１２％）中に位置する。ヌクレオチドとアミノ酸の配
列を次に示す。 【００７５】 ＧＧＣ ＴＧＧ ＧＴＡ ＣＣＴ ＴＴＧ ＧＡＧ ｇｌｙ ｔｒｐ ｖａｌ ｐｒｏ ｌｅｕ ｇｌｕ 30 ＡＴＡ ＡＴＧ ＡＴＡ ＡＡＡ ＴＴＣ ＡＡＣ ｉｌｅ ｍｅｔ ｉｌｅ ｌｙｓ ｐｈｅ ａｓｎ ＡＧＧ ＴＴＧ ＡＡＣ ＣＧＴ ＣＴＡ ＡＣＡ ａｒｇ ｌｅｕ ａｓｎ ａｒｇ ｌｅｕ ｔｈｒ 60 ＡＣＡ ＧＡＣ ＴＴＴ ＡＡＴ ＧＴＡ ＡＴＴ ｔｈｒ ａｓｐ ｐｈｅ ａｓｎ ｖａｌ ｉｌｅ 90 ＧＴＧ ＧＡＡ ＧＣＡ ＴＴＧ ＡＧＣ ＡＡＡ ｖａｌ ｇｌｕ ａｌａ ｌｅｕ ｓｅｒ ｌｙｓ ＴＣＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＧＡＡ ＣＴＣ ＡＴＧ ｓｅｒ ｌｙｓ ａｌａ ｇｌｕ ｌｅｕ ｍｅｔ 120 ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＧＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＡＡＡ ｇｌｕ ｉｌｅ ｓｅｒ ｇｌｕ ａｓｐ ｌｙｓ ＡＣＴ ＡＡＡ ＡＴＣ ＡＧＡ ＡＧＧ ＴＣＴ ｔｈｒ ｌｙｓ ｉｌｅ ａｒｇ ａｒｇ ｓｅｒ 150 ＣＣＡ ＡＧＣ ＡＡＡ ＣＣＣ ＣＴＡ ＣＴＧ ｐｒｏ ｓｅｒ ｌｙｓ ｐｒｏ ｌｅｕ ｌｅｕ 168 ＡＡＧ ＴＧＡ ｌｙｓ ＴＥＲＭ 一つの枠内（in-frame）終結コドンが１６６位の始めに
あった。 【００７６】この配列は疎水性アミノ酸を高い含有量で
有する。ホップとウッドの方法（21）を使用する親水性
分析から、アミノ酸４０から４９までのデカペプチドは
＋１．６１の値であると同定された。５５個のアミノ酸
の抗原部分の平均親水性は＋０．３と計算された。この
方法に基づけば、このデカペプチド領域は蛋白質の表面
にさらされている可能性が高く、また、Ｌａ蛋白質に対
する抗原決定基と部分的に重なっている可能性がある。
従って、このデカペプチド配列、ｇｌｕ−ａｓｐ−ｌｙ
ｓ−ｔｈｒ−ｌｙｓ−ｉｌｅ−ａｒｇ−ａｒｇ−ｓｅｒ
−ｐｒｏによって、始めて、自己免疫疾患と関連するユ
ニークな抗原決定基が示された。 【００７７】上述の方法はまた、天然のＲｏ、Ｌ−４
２、ＳclおよびＵ2 bp抗原に対して交差反応性である抗
原を発現するクローンの生産にも適用した。 【００７８】本発明の好ましい点を例証するために、Ａ
ＴＣＣ（American type Culture Collecion, 12301 Par
klawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Ｕ．Ｓ．
Ａ．）への寄託が行われた。大腸菌（Ｅ．coli）ＨＢ１
０１０−Ｌabが寄託され、寄託番号はＡＴＣＣ３９９８
４である。この菌株は、そこに挿入されたＬａ抗原遺伝
子を有し、大腸菌ＨＢ１０１中に形質転換された一つの
ｐＢＲ３２２プラスミドを包含している。 【００７９】参照文献：明細書中に参照番号によって参
照された文献を以下に示す。 参照文献１ 「核抗原（ＡＮＡ）に対する自己抗体。そ
の免疫生物学と医学」（Tan, E.M. (1982) in Advances
in Immunology, Vol. 33, H. Kunkel and F. Dixon, e
ds., Academic Press, Inc., pp. 167-240) 参照文献２ （Kurilla, M.G. and Keene, J.D. (198
3), Cell 34, pp. 837-845）参照文献３ （Chambers,
J.C., Kurilla, M.G. and Keene, J.D. (1983), J. Bio
l. Chem. 258, pp. 11438-11441) 参照文献４ （Hendrick, J.P., Wolin, S.L., Rinke,
J., Lerner, M.R., andSteitz, J.A. (1981), Mol. Cel
l. Biol. 1, pp. 1138-1149） 参照文献５ （Rinke, J., and Steitz, J.A. (1982),
Cell 29, pp.149-159) 参照文献６ （Hashimoto, C. and Steitz, J.A. (198
3), J. Biol. Chem. 258,pp. 1379-1384) 参照文献７ （Lerner, M.R., Boyle, J.A., Hardin,
J.A. and Steitz, J.A.（1981), Science 211, pp. 400
-402) 参照文献８ （Francoeur, A.M. and Mathews, M.B. (1
982), Proc. Natl. Acad . Sci. USA, 79, PP. 6772-677
6) 参照文献９ （Rosa, M.D., Gottlieb, E., Lerner, M.
R., and Steitz, J.A.(1981), Mol. Cell. Biol. 1, p
p. 785-796) 参照文献10 （Wilusz, J., Kurilla, M.G., and Keen
e, J.D. (1983), Proc. N atl. Acad. Sci. USA 80, PP.
5827-5831) 参照文献11 （Kurilla, M.G., Cabradilla, C.D., Hol
loway, B.P., and Keene，J.D. (1984), J. Virol. 50,
773-778) 参照文献12 （Reddy, R., Henning, D., Tan, E., and
Busch, H. (1983), J. Biol. Chem. 258, pp. 8352-835
6） 参照文献13 （Mathews, M.B. and Francoeur, A.M. (1
984), Mol. Cell. Biol. 4, pp. 1134-1140) 参照文献14 （Stefano, J.E. (1984), Cell 36, pp. 1
45-154） 参照文献15 （Young, R.A. and Davis, R.W. (1983),
Science 222, pp. 778-782) 参照文献16 （Laemmli, U.K. (1970), Nature (Londo
n) 227, pp. 680-685) 参照文献17 （Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sam
brook, J. (1982), Mole cular Cloning : A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring
Harbor, N.Y.) 参照文献18 （Cleveland, D.W., Fischer, S.G., Kirs
chner, M.W., and Laemmli, U.K. (1977), J. Biol. Ch
em. 252, pp. 1102-1106) 参照文献19 （Sanger, F., Coulson, A.R., Barrell,
B.G., Smith, A.J.H., and Roe, B.A. (1980), J. Mol.
Biol. 143, 161-178) 参照文献20 （Biggin, M.D., Gibosn, T.J. and Hong,
G.F. (1983), Proc. Na tl. Acad. Sci. 80, pp.3963-3
965) 参照文献21 （Hopp, T.P. and Woods, K.R. (1981), P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 78, pp.3824-3828） 本発明は以上で十分に説明された。これまでに述べた本
発明の技術的範囲を逸脱することなく、本発明に対する
多くの変形と修正を行うことができることは当業者には
明らかであろう。
反応性の自己免疫抗原に接触させて抗原／抗体コンプレ
ックスを形成し、コンプレックスの存在を検出するるこ
とを包含する、試料における自己免疫自己抗体の存在を
決定する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】人および動物においては、個体が異物に
さらされたとき、個体は特異的な抗体を生産することに
より、または、異物に対する細胞介在性の免疫を発達さ
せることによりこれに応答する。個体は一般に、自己の
一部を通常に形成する物質については寛容（tolerant）
であり、従って、自己寛容（self-tolerant)であるとさ
れる。自己に対する免疫応答の発達は自己免疫（autoim
munity）と呼ばれ、自己寛容の障害の結果である。 【０００３】自己免疫の発達を説明するために多くの理
論が提出されてきた。例えば、いくつかの動物モデルで
証明されたように、ウイルスが自己免疫の病因に関して
重要な役割を果たすと考えられる。ウイルス抗原の宿主
細胞表面への発現（expression）が、ウイルス抗原に対
すると同様に細胞膜抗原に対する自己抗体を誘導すると
考えられている。また、自己免疫は、異常な免疫調節、
特にＴ細胞活性の変化によって引起こされる疾患である
とする説も提出された。サプレッサーＴ細胞活性の減少
またはヘルパーＴ細胞活性の増加は、低レベルの自己抗
体の過剰な生産を引き起こすだろう。この理論は、自己
免疫疾患が証明されない正常な数人の人に、また、種々
の動物モデルに自己抗体が見出されることにより支持さ
れる。あるマウス系は全身性エリテマトーデス（ＳＬ
Ｅ）と類似する自己免疫疾患を示すことが証明されたの
で、少なくともある種の自己免疫疾患では遺伝子制御も
存在するようである。ＳＬＥの高い相関は一卵性双生児
にも見出される。更に、ＨＬＡ−Ｄ座に位置する遺伝子
が自己免疫疾患に関与していることが、成人リウマチ様
関節炎および多発性硬化症で見出された。 【０００４】全身性エリテマトーデスは、人体の結合組
織のコラーゲンに影響を及ぼす重篤な自己免疫疾患であ
る。ＳＬＥは、血管、心臓、腎臓、皮膚、しょう膜など
体中の多くの異なる組織や器官の一つまたはそれ以上に
影響することがあるので、症状がリウマチ様関節炎、皮
膚癌、血清症、リウマチ熱、多発性骨髄腫およびシェー
グレン症候群などの多数の他の疾患と類似することもあ
って、臨床診断がしばしば困難となる。 【０００５】腎臓、中枢神経系および血管の損傷が高い
確率で起こるので、ＳＬＥを他の疾患と区別できること
が重要である。例えば、ループス腎炎はこの疾患に非常
に頻繁に見られ、ＳＬＥの最も重大な症状の一つであ
る。腎炎はしばしばＳＬＥ患者の死亡の原因となるの
で、ＳＬＥを重大な腎障害を防ぐまたは緩和することが
できるほど十分早く発見できれば非常な利益となるであ
ろう。 【０００６】結合組織の疾患を有する患者の血清は多く
の核成分に対する抗体を含むことが示された。例えば、
自身の（native）ＤＮＡ（デオ−キシリボ核酸）と反応
する循環する抗体は、全身性エリテマトーデスの患者に
非常に特異的であることが見出された。ＳＬＥに付随す
る腎炎の出現と悪化は、腎臓特に腎糸球体中での［抗体
／ＤＮＡ］および他の免疫複合体の形成と沈積に関連す
るようである。これらの抗体の生産の正確な理由および
それらがＳＬＥに対して特別に特異的である理由はまだ
分っていないが、これらの抗体の検出と測定は、この疾
患の臨床診断と評価において急速に重要になってきてい
る。 【０００７】最近、14Ｃ標識ＤＮＡを用いて種々の少量
の抗ＤＮＡ抗体を測定する正確な方法が発達してきた。
「全身性エリテマトーデスにおける血清ＤＮＡ結合活性
の測定」（T. Pincus et al, New England Journal of
Medicine, 281, 701-705 (1969))を参照。この方法は現
在利用できる最も確かな方法のようである。研究された
ＳＬＥ患者の７５パーセントが陽性であったと報告され
ている。一方、他の主要な試験ではＳＬＥ症例の約２５
〜６４パーセントが陽性であった。更に、この抗ＤＮＡ
抗体試験は、使用された免疫拡散法、補体結合や沈降な
どの他の診断試験とよりもＳＬＥに対して高い特異性を
示した。 【０００８】しかし、この試験はＤＮＡと反応する抗体
に対する試験であるが、ＤＮＡが真正な（authentic)抗
原でない可能性もある。更に、この方法は抗原が蛋白質
である自己免疫疾患には応用できない。蛋白質抗原は、
他の型の自己免疫疾患と同様にＳＬＥのほとんどの型に
関連している。そのような蛋白質抗原は、自己免疫疾患
に関連する自己抗体と特異的に反応できるので、診断お
よび治療方法において有効である。しかし、抗原物質の
不足と不安定性のためおよび分離技術が複雑なために、
これらの抗原の単離と精製はこれまで収穫のあるもので
はなかった。従って、宿主中で自己免疫疾患と関連する
自己抗体と反応する蛋白質抗原を生産する方法は、依然
として必要とされている。 【０００９】 【発明の解決しようとする課題、解決手段】本発明の目
的は、自己免疫疾患と関連する自己抗体と反応する蛋白
質抗原を生産する方法を提供することである。 【００１０】更に、本発明の目的はそのような抗原を大
量に、かつ、宿主からの大量の物質の供与を必要とせず
に生産できる方法を提供することである。 【００１１】この後次第に明らかとなる本発明のこれら
のおよび他の目的は、宿主中で自己免疫疾患と関連する
自己抗体と反応する蛋白質抗原を生産する方法によって
達成される。この方法は、交差反応性供与体（donor)遺
伝子ライブラリーからの遺伝子情報を複数の受入れ細胞
(recipient cell)に導入して、それにより形質転換細胞
を得る工程、上記の宿主から得られた上記の自己抗体
と、上記の蛋白質抗原のコードである遺伝子を含む上記
の形質転換細胞である産生細胞によって発現される蛋白
質抗原との結合反応を検出することにより、この抗原を
発現する細胞を選択する工程、この抗原を発現する細胞
を培養基（culture medium）中で培養する工程、およ
び、この培養基から上記の蛋白質抗原を単離する工程を
包含する。 【００１２】本発明の目的は、また、本発明の実施なら
びに、今や初めて大量に利用できることになった蛋白質
抗原を使用する自己免疫疾患の診断と治療の方法の実施
に有効な組換え体ＤＮＡを提供することである。 【００１３】添附した図面と共にこの後の詳細な説明を
参照することにより、本発明とそれに付随する多くの利
点がより完全に理解されるだろう。 【００１４】図１は一連の培養基の写真であり、Ｌａ特
異性のループス血清を用いるλｇｔ１１組換え体ファー
ジプラーク（溶菌斑）の免疫学的スクリーニングによる
ＬａｃＤＮＡクローンの単離と同定を示している。 【００１５】図２は、種々の特異性のループス血清を用
いるλｇｔ１１−Ｌａ クローンの免疫学的スクリーニ
ングを示す一連の写真である。 【００１６】図３は、ニトロセルロースに結合させた発
現したＬａ抗原を用いて、これを自己免疫疾患の１８人
の患者からの血清と２人の正常血清とに対して反応させ
たエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（酵素
結合免疫吸着剤分析）（ＥＬＩＳＡ）を示す一連の写真
である。 【００１７】図４では、１．５kbのＬａ蛋白質ｃＤＮＡ
の制限地図（restriction map)を示す。 【００１８】図５は一連のアクリルアミドゲル電気泳動
を写真で再現したものであり、Ｌａ蛋白質に対するｃＤ
ＮＡを使用するハイブリッド選択のＨｅＬａ細胞ｍＲＮ
Ａの試験管中の翻訳を示している。 【００１９】図６はＬａ蛋白質の部分的なペプチドマッ
ピングを写真で再現したものであり、体中で放射標識し
たＨｅＬａ細胞Ｌａ蛋白質を示している。 【００２０】 【発明の実施の最良の形態】本発明は、部分的に、人の
肝臓発現ライブラリー（expression library）から得ら
れたいくつかのｃＤＮＡクローンが、一定の自己免疫疾
患と関連する自己抗体により認識されたと認められたこ
とと共に始まった。本発明以前には、自己免疫抗体と反
応するペプチドをこのようにして生産できることは知ら
れていなかった。更に、医者または研究者が特定の患者
または他の感染した個体からの抗原を欲した場合には、
それを源として抗体を単離する必要があった。そのよう
な抗原は、一般に溶液中で遊離のままではなく、いずれ
の方法でもほんの少量しか手に入らず、この同定、分析
と使用を実際上不可能にしていた。というのは、大量の
抗原の生産は感染した人または動物からの大量の物質を
必要とし、その個体を損傷することとなったからであ
る。 【００２１】本発明者の実験室では、それからｃＤＮＡ
クローンが生産される初めの（original）メッセンジャ
ーＤＮＡの供与源は自己抗体の源と同一ではなかったの
で、自己免疫疾患と関連する自己抗体と反応する蛋白質
抗原、それは以前には大量に手に入れることができなか
った、その抗原が、自己免疫疾患を有する宿主からの一
つの血清試料以上のものを必要とすることなく、血清ま
たはそれから誘導された抗体を、異なる源からのｃＤＮ
Ａライブラリーと反応させることによって生産されるこ
とが認められた。従って、本発明は、宿主中でその宿主
に特異的な方法で自己免疫疾患を治療する効果的な方法
を始めて可能にした。 【００２２】「宿主」は自己免疫疾患にかかっている人
または動物を意味する。本発明は最初に人の宿主で証明
され、今後も人の宿主は関心の範囲に留まるだろうと予
測されるが、本発明は獣医学の分野でも使用できる。例
えば、馬、牛、羊、家禽（例えば、鶏、アヒル、七面鳥
など）、霊長類、犬、猫、豚、ヤギ（特にヤギの関節炎
の治療に）、ミンク（特にアリューシャンミンク病の治
療に）など。 【００２３】本発明の実施で使用される一つの試薬は宿
主血清からの抗血清（または精製した抗体）である。血
清または血しょう試料は宿主から典型的には静脈穿刺に
より得られ、赤血球および血餅が除かれる。抗体はそれ
から適当な任意の技術により他の蛋白質から分離され
る。宿主の抗原反応性は、放射標識した宿主細胞抽出物
の免疫沈降または未標識の宿主細胞抽出物のイムノブロ
ッティング（immunoblotting）により測定される。いず
れの場合も反応性の抗原は、これらの反応を行う他の多
くの方法が同じように適しているが、文献（Towbin et
al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354 (197
9)およびFrancoeur et al, Proc. Natl. A cad. Sci. US
A, 79, 6772-6776 (1982))に記述されるように、分子量
分別（アクリルアミドゲル電気泳動）と黄色ブドウ球菌
（Staphylococcus aureus ）からの蛋白質Ａ（protein
Ａ）に対する免疫複合体の結合によって同定される。 【００２４】本発明の実施に必要な他の試薬は、交差反
応性の蛋白質抗原を生産するための宿主に十分に関連し
た供与種からの遺伝子ライブラリーである。本明細書で
使用されているように、「遺伝子ライブラリー」は、細
胞または供与体種の細胞からのＤＡＮ断片がそこに操作
的に挿入されたまたはそれに連結されたベクターの集り
（collection) を意味する。本明細書に記載されるよう
に宿主および供与体は真核生物なので、ＤＮＡセグメン
トが受け入れの単核細胞生物中でペプチドとして発現さ
れるとき、抗原決定基は、イントロンと機能性（functi
onal）遺伝子セグメントの両方を含むＤＮＡセグメント
から生産される蛋白質に存在することができるので、必
須ではないけれども特に相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライ
ブラリーが好ましい。しかし、メッセンジャーＤＮＡか
ら生産され、そのため通常真核細胞に存在するイントロ
ンを欠いたｃＤＮＡが、受け入れの前核細胞に挿入され
たとき蛋白質の発現において高い成功率を有することは
よく知られている。従って、ｃＤＮＡライブラリーの使
用が好ましい。 【００２５】本明細書でこれまでに示したように、供与
体種は必ずしも宿主の種と同一である必要はないことは
当業者には明らかであろう。しかし、供与体種は、宿主
の自己抗体と交差反応性である抗原部位（決定基）を有
する蛋白質を発現できることが要求される。供与体種の
選択は、使用しようとする供与体種からの培養細胞を
（例えば、35Ｓメチオニンで）放射標識し、培養細胞か
ら粗細胞抽出物を製造し、この粗細胞抽出物を宿主から
得た自己抗体と黄色ブドウ球菌からの蛋白質Ａとを共に
用いて免疫沈降することにより容易に行われる。放射活
性物が沈降されるときには、宿主から得られる自己抗体
と反応する抗原が供与体細胞抽出物中に存在し、この供
与体からの遺伝子ライブラリーが本発明の方法に使用で
きる。その代わりに、供与体種または供与体からの特定
の組織を抽出して、抽出された蛋白質をマトリックス中
で分別することができる。分離された蛋白質は、膜へ移
し宿主からの自己抗体と反応させられることにより固定
化される。黄色ブドウ球菌からの蛋白質Ａがフィルター
と結合する場合は、供与体組織からの対応する遺伝子ラ
イブラリーが本発明で使用できる。しかし、与えられた
形質転換で産生細胞（適切な蛋白質抗原を生産する細
胞）のパーセントを増加させるために、供与体と宿主が
同じ属であること、好ましくは、同じ種であることが望
ましい。しかし、哺乳類の供与体と哺乳類の宿主の使用
も適切である。 【００２６】本明細書中で「交差反応性(crossreactiv
e) 」は、宿主の自己抗体が、供与体によって生産され
た蛋白質抗原と反応することを意味する。この供与体の
蛋白質抗原は、宿主の自己免疫疾患と関連する自己抗体
に対する抗原決定基を提供する、宿主中に存在する通常
の蛋白質抗原と同一である必要はない。交差反応性は、
問題とする抗原が自己抗体と反応する能力として定義さ
れる。本来は、蛋白質抗原が同一であるとき、交差反応
性が存在する。しかし、交差反応性の抗原が、宿主の抗
原の生化学組成物からの異なる生化学組成物を全部また
は一部包含していることも可能である。 【００２７】リウマチ性疾患の中で、特に全身性エリテ
マトーデスに関しては、メジャー（major)とマイナー
（minor)と呼ぶことができる臨床的に定義される自己抗
体の異なるクラスがある。メジャークラスは、Ｌａ、Ｒ
ｏ、ＲｍおよびＲＮＰとして知られている４つの通常の
蛋白質抗原特異性を含む。大部分の人の宿主はこれらの
特異性の混合物を有しているが、多くの宿主は上述の免
疫沈降およびイムノブロッティングの方法を使用して、
反応性のＬａ、Ｒｏ、ＲｍまたはＲＮＰ自己抗体のユニ
ークな一つのクラスを有するものとして同定できる。従
って、この技術の実施に当っては、単一の抗原特異性を
有する宿主から選んだ自己抗体を、供与体ライブラリー
から、通常の特異性またはクラスが同じであるいずれの
宿主とも共通に反応する遺伝子組換え体を得るために使
用できる。ＳＬＥでは、全患者の半数以上が、これらの
４つのメジャーの特異性またはクラスのうちの一つと反
応する自己抗体を示している。ここに記述される方法に
従って、当業者は、同じ特異性またはクラスの自己抗体
を有する他の個体に対する一般的な診断および治療の試
薬としての、それぞれのクラスの精製抗原を生産でき
る。 【００２８】「遺伝子情報」という語は、一般には蛋白
質抗原の全部または一部のコードであるＤＮＡを意味す
る。しかし、この語はまた、ＲＮＡウイルスまたは他の
ＲＮＡを基にするべクターと共に使用されるときには、
ＲＮＡも含む。 【００２９】蛋白質抗原のコードである遺伝子情報を受
け取った細胞であり、しかも、蛋白質抗原を発現して細
胞内に保持するかまたは培養基に放出する細胞は、「産
生細胞（producer cell)」と呼ばれる。 【００３０】「ベクター」という語はよく知られてお
り、しばしば使用される「クローニング ビーイクル
（cloning vehicle)」と同意である。ベクターは非クロ
モソーム性の二重らせんＤＮＡであり、例えば形質転換
の方法などにより単核生物中に置かれるときベクターが
複製されるような完全な（intact）レプリコンを包含す
る。 【００３１】物質が、問題としている反応性または性質
を妨害する他の成分、および天然に形成されたとき物質
中に存在する他の成分を含まないとき、その物質は「精
製されて」いる。精製した物質が少なくとも９５重量％
の単一物質を含有することが更に好ましく、９９％含有
することがそれ以上に好ましい。最も好ましいのは、９
９．８％の単一物質を含有することである。水は純度を
計る際には考慮しない。 【００３２】生化学における最近の進歩によって、例え
ば外来性のＤＮＡを含んでプラスミドがつくられるよう
な「組換え体」ベクターの構築が行われるようになっ
た。特殊な例では、組換え体ベクターは異種（heterolo
gous) のＤＮＡ、つまり、組換え体ベクターによって形
質転換されやすい生物によっては元来生産されないポリ
ペプチドのコードであるＤＮＡを含むことができる。遺
伝子ライブラリーを生産する工程中の組換え体ＤＮＡベ
クターの生産については、よく理解されており、詳細に
記述する必要はないが、この工程を参考のためにここに
簡単に説明する。 【００３３】例えば、プラスミドベクターを開裂して、
連結可能な末端を有する線状ＤＮＡを得ることができ
る。これらの末端は、連結可能な末端のような相補性を
有する外来性のＤＮＡと結合して、完全レプリコンと望
ましい表現型の性質を有する、生物学的に機能する組換
え体ＤＮＡ分子を与える。ＤＮＡ組換えに対しては多様
な方法が利用でき、そこでは別々のＤＮＡ断片の隣接
（adjoining)する末端を結合（tailor）して連結が容易
にされる。連結（ligation）は、最も頻繁には酵素Ｔ4
ＤＮＡリガーゼの作用を通して、隣接するヌクレオチド
間にリン酸ジエステル結合を形成することを意味する。
このように、ブラントエンド（blunt end)を直接連結す
ることができる。その代わりに、水素結合により相補的
な一重らせんと結合するような一重らせんを、その隣接
（adjoining)末端に含む断片の連結を行うことができ
る。付着端（cohesive termini）と呼ばれるそのような
一重らせんは、ブラントエンドにターミナル トランス
フェラーゼを使用してヌクレオチドを付加することによ
り形成される。しかし、付着端形成には、制限エンドヌ
クレアーゼが最も普通に使用される。これらの酵素は、
長さが約４〜６塩基対のユニークなヌクレオチド配列の
中およびその周辺のリン酸ジエステル結合を開裂する。
多くの制限エンドヌクレアーゼとその認識部位が既知で
あり、いわゆるＥcoＲＩエンドヌクレアーゼが最も広く
知られている。典型的には、プラスミドまたは他のクロ
ーニング ビーイクルが開裂されて、それぞれが制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位の半分を包含する末端が残さ
れ、それから、相補的な末端を有する同じ制限エンドヌ
クレアーゼで得られた外来性のＤＮＡの開裂生成物が、
この開裂されたベクターへ挿入される。これについて
は、多くの多様な技術が当業者には知られており、本発
明の実施に使用できる。 【００３４】本発明の遺伝子ライブラリーの生産に使用
される外来性の、例えば供与体のＤＮＡは、前述のよう
にして同定された供与体の適切な細胞から得られる。ｃ
ＤＮＡ供与体遺伝子ライブラリーが生産されるときに
は、宿主中で自己免疫疾患により攻撃された器官と同じ
である、ｍＤＮＡ供与体の器官から得られた細胞を使用
することが好ましい。例えば、自己免疫疾患が宿主の肝
臓を攻撃している場合には、異なる器官の細胞は、それ
に対する保護が望まれている自己抗体と反応しないペプ
チドを発現され易いので、供与体の肝細胞が好ましい。
ｃＤＮＡ断片が製造される場合には、この目的のための
任意の種々の方法によって、メッセンジャーＤＮＡが供
与体細胞から得られる。 【００３５】例えば、単一の細胞に分散できる任意の哺
乳類組織または細胞培養からメッセンジャーＲＮＡを単
離するために、次の方法が使用できる。この技術のより
詳細な説明は、ここに引用して挿入される文献(Maniati
s et al, molecular cloning : a laboratory manual, C
old Spring Harbor New York, 1982, pages 191-199）
に記載されている。細胞は培養基から分離され、リン酸
緩衝生理食塩水中で洗浄される。それから、細胞は遠心
分離されて上清を除かれ、約１，０００単位／ｍｌのＲ
Ｎasinまたは１０ｍＮのバナジル−リボヌクレオシド複
合体を含有する細胞溶液緩衝液（lysis buffer）中に懸
濁される。混合、貯蔵および勾配上での遠心分離の後、
細胞質層は回収されて、変成剤を含む緩衝液へ添加され
る。それから、蛋白質を破壊するためにプロテイナーゼ
が添加される。蛋白質はフェノール／クロロホルムで一
度抽出されることにより除かれる。水相は回収され、エ
タノール添加後貯蔵される。貯蔵された溶液を遠心分離
して、核酸を含むペレットが得られる。核酸は、ＲＮas
inまたはバナジル−リボヌクレオシド複合体を含有する
少量の緩衝液中に再溶解される。ＤＮase がＤＮＡを破
壊するために添加される。インキュベーション後、生成
の物質はフェノール／クロロホルムで一度抽出される。
酢酸ナトリウム溶液が添加され、核酸はエタノールで沈
澱する。沈澱したＲＮＡは水性エタノール中に−７０℃
で貯蔵される。その代わりに、グアニジニウム／ホット
フェノール法およびグアニジニウム／塩化セシウム法が
使用できる。これらの二つの方法は上に引用した文献に
説明されている。必要ならば、ポリアデニル化ＲＮＡを
非ポリアデニル化ＲＮＡから分離することができる。そ
のために選ばれた方法はオリゴ（ｄＴ）セルロース上で
のクロマトグラフィーである。オリゴ（ｄＴ）セルロー
スは実験室で製造でき、市販もされている。ポリアデニ
ル化ＲＮＡの選択のための詳細な技術は上に引用した文
献に説明されている。 【００３６】それから、相補的ＤＮＡが単離されたｍＲ
ＮＡから逆転写酵素により生産される。生成の一重らせ
んＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼを使用して二重らせんＤ
ＮＡはへ変換される。ｃＤＮＡがこの方法で細胞中に存
在する全てのｍＲＮＡから生産され、クローニング ビ
ーイクル中に挿入される場合には、本来の（original）
ｍＲＮＡが集められたときに発現されていた供与体の遺
伝子生成物のコードであるＤＮＡ塩基配列が含まれてい
るので、生成のｃＤＮＡの集まりは「供与体遺伝子ライ
ブラリー」と呼ばれる。 【００３７】供与体遺伝子ライブラリーの生産それ自体
はよく知られており、ここでの供与体ライブラリーの生
産についての議論は、単に、本発明の実施で行われる生
化学反応の性質を示すに過ぎないものであることに留意
すべきである。本発明は、ある特定の遺伝子ライブラリ
ーの存在に依存するものではなく、本発明の目的のため
特に集められたかまたは他の目的のためであるかに関わ
らず、本明細書中に説明される要求を満たすものであれ
ば、任意の遺伝子ライブラリーを使用できるものであ
る。 【００３８】単核生物中で複製する任意のベクターが宿
主遺伝子ライブラリーの生産に使用できる。例えば、本
発明の実施で使用するのに適している多くのプラスミド
が、米国特許第4273875 号、第4304863 号、第4419450
号、第4403036 号、第4363877 号、第4356270 号、第43
49629 号および第4332901 号などの最近の米国特許明細
書中に記載されている。本発明の実施で使用するのに適
している他のベクターは、ｐＡＪ６５５（宿主細菌、
Ｅ．coli ＦＥＰＭ−ＢＰ１３６）、ｐＡＪ６１１（宿
主細菌、Ｅ．coli ＦＥＰＭ−ＢＰ１３８）、ｐＡＪ４
４０（宿主細菌、Bacillus Subtilis ＡＴＣＣ３９１
３９１）、ｐＡＪ１８４４（宿主細菌、Ｅ．coli ＦＥ
ＰＭ−ＢＰ１３７）、および、ｐＡＪ３１４８（宿主細
菌、Coryne bacterium glutamicum ＡＴＣＣ３９１３
７）を含む。特に好ましいのは、文献（Young et al, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1194-1198 (1983))に
記述されている方法に従って公的に入手できるファージ
から生産できるファージベクターλｇｔ１１である。簡
単に説明すれば、この好ましいファージベクターは次の
ように生産される。λｇｔ７−ｌａｃ５とλ５４０（Δ
Ｂ ｉｍｍ２１ nin ５）はＨｉｎｄ IIIで開裂され、
断片はプールされ、それから、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで
連結される。望ましいファージ組換え体は、ＤＮＡが大
腸菌（Ｅ．coli）ＢＮＮ９３に感染させられ、細胞が発
色指示薬の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Gal)を含む培地上にプレー
トされたとき、深い（imm ２１）青（lac ５）のプラー
クを生じる。それから、λgt７−lac ５−λ５４０ハイ
ブリッドは、λgt４（ｃ１８５７ Ｓ１００ nin ５）
と組換え体とで交差され、４２℃で成長し、Ｘ−Ｇalプ
レート上で澄んだ（ｃ１８６７）青のプラークの形成に
ついて記録される。アンバー変異Ｓ１００の存在は、ア
ンバーサプレッサーsup Ｆを含むかまたは欠いている宿
主（それぞれＢＮＮ４５またはＢＮＮ９３）上の相対的
な平板効率（プラーク形成効率）を調べることにより確
かめられる。最後に、lac ５ ｃ１８５７ Ｓ１００フ
ァージはＥcoＲＩ開裂部位に対してマップされる。ファ
ージλgt１１は一つのＥcoＲＩ開裂部位を含む。 【００３９】いったん供与体遺伝子ライブラリーが利用
可能となれば、上述の方法または他の任意の方法によっ
て、受け入れ細胞は遺伝子ライブラリーを用いて形質転
換され、種々の供与体ＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）断片を
含む一連の形質転換細胞を生じる。受け入れ細胞への組
換え体ＤＮＡの導入は、文献(Mandel et al, J. Mol. Bi
ol., 53, 159 (1970)）中に報告されるように、受け入
れの単核微生物を塩化カルシウムで処理して細胞膜のＤ
ＮＡに対する透過性を増加させることによってなされ
る。受け入れ細胞を形質転換する他の方法には、文献
（Young et al, Gen e, 1,153 (1977))に報告されている
ような、細胞がＤＮＡを導入することができるようにな
る成長の段階（いわゆるコンピテント細胞段階）での組
換え体ＤＮＡの導入がある。文献（Chang et al, Mol.
Ec. Gen. Genet., 168, 111 (1979)）に記述されるよう
に、ＤＮＡ受け入れ体のプロトプラストまたはスフェロ
プラストを形成することにより、プラスミドもまたＤＮ
Ａ受け入れ体に導入される（特に酵母に対して使用され
る）。受け入れ細胞を形質転換する他の任意の方法が本
発明の実施で使用できる。 【００４０】自己免疫抗原は、多くの既知技術のうち任
意のものを使用して受け入れ細胞から得ることができ
る。例えば、抗原が細胞膜を通って周囲の空間へ輸送さ
れる仕方でペプチド抗原を発現する細胞を、培養基中で
成長させ、望ましい抗原を直接培養基から得ることがで
きる。望ましい抗原が細胞膜の内側に保持される場合に
は、細胞を溶解して抗原を細胞上清に放出させ、これを
精製して望ましい抗原を得ることができる。生産される
抗原が細胞の抗原発現に対して逆の効果を有する場合に
は、抗原に対する遺伝子をインデューサーの制御下に置
いて、遺伝子を収集時にのみ発現させることができる。
例えばλファージはｐＮＣ９を含む細胞中で、ＰＢＲ誘
導体はlac ｉQ を含む細胞中で成長できる。ファージの
細胞溶解（溶菌）成長の間、十分なlac レプレッサーが
細胞中でハイブリッド蛋白質の発現を抑制するために生
産される。ハイブリッドの発現は感染細胞中でＩＰＴＧ
を用いて誘導でき、このようにして生産された抗原は細
胞溶解に際して細胞から放出される。 【００４１】本発明の好ましい点でλgt１１ファージが
使用される場合には、自己免疫抗原の存在を決定するた
めの抗体を用いるスクリーニングとして、次の方法が好
ましい。推薦する宿主は大腸菌Ｙ１０９０であり、これ
は、Δlac Ｕ１６９ proＡ+Δlon araＤ１３９ str
Ａ supＦ ［ trpＣ２２：：Ｔｎ１０］（ｐＭＣ９）
である。宿主細菌は感染され、柔らかい寒天にプレート
された後、プレートは約５時間約４２℃でインキュベー
トされる。ファージの一様な分布のために、小さいプレ
ート当りには約１０4 のファージ、大きいプレート当り
には約１０5のファージが勧められる。プレートは、前
もって１０ｍＭＩＰＴＧ中に浸された、乾燥したニトロ
セルロースフィルターのディスク（nitrocellulose fil
tereddisk）を被せられる。プレートは約３７℃でイン
キュベートされる。それから、フィルターは除かれ、ｐ
Ｈ８．１のトリス緩衝生理食塩水中で室温で約５〜１０
分間洗浄される。フィルターは、約２０％の牛胎児血清
（あるいは３％のＢＳＡまたは卵白アルブミン）を含む
ＴＢＳ中でインキュベートされる。インキュベーション
は室温で約３０分間行われる。それから、フィルター
は、ＴＢＳ＋２０％フィータルカストセラム＋抗体（血
清またはＩｇＧの約１：１希釈。ＩｇＧが使用される場
合は、ＩｇＧは初めは１０mg／mlで存在する。）中でイ
ンキュベートされる。インキュベーションは室温で約１
時間行われる。その後、フィルターは未結合の抗体を除
くために洗浄され、 125Ｉ蛋白質Ａ（約１０6 cpn／フ
ィルター）を含むＴＢＳ中で室温で約１時間インキュベ
ートされる。放射能は、抗体結合が発現された抗原の存
在を示す位置に存在する。 【００４２】この技術は本発明の好ましい具体例を示す
ものであるが、抗体プローブを用いるスクリーニング法
は他にも当業者に知られており、それらを容易にこの技
術の代わりに使用することができる。 【００４３】本明細書中で「形質転換細胞（transforma
nt）」の語は最も広義に使用され、外来性の遺伝子情報
がそこに挿入されている任意の受け入れ細胞を意味す
る。形質転換細胞のより厳密な意味（プラスミドを導入
した細胞）に加えて、本明細書中では、形質転換細胞
は、外来性のＤＮＡを（一つまたは複数の）クロモソー
ムに挿入された細胞、ならびに、上述の任意の組換え体
ベクターを含む細胞を意味する。 【００４４】形質転換細胞は個々の単核生物に無秩序に
挿入された組換え体ＤＮＡベクターからの遺伝子生成物
を発現するので、供与体遺伝子ライブラリーを使用して
形質転換された複数の受け入れ細胞は、発現ライブラリ
ーとみなされる。典型的には、形質転換細胞は、個々の
元来の形質転換細胞から発生する一連の細胞株を生産す
るためにクローンされる。それぞれの細胞株から試料が
選ばれ、（必要ならば細胞溶解の後）上述のようにして
製造された免疫疾患と関連する自己抗体に対して宿主中
でさらされる。自己抗体と、適当な遺伝子を含む形質転
換細胞によって発現された抗原との結合相互作用は、こ
の目的に使用できる種々の方法のうち任意の方法で検出
できる。例えば、形質転換細胞のコロニーからの蛋白質
は、コロニーに被せたニトロセルロースろ紙上に吸着さ
れる。この場合は、この後、自己免疫抗体を添加し、洗
浄して未反応の抗体を除き、放射標識した蛋白質Ａを用
いて蛋白質と結合した抗体を検出する。このようにして
同定された細胞コロニーを大量に成長させて、蛋白質抗
原のコードである遺伝子を望ましい量得ることができ
る。この点でいくつかの変法が可能である。既知の技術
を使用して、蛋白質抗原に対する遺伝子を含む細胞に抗
原を発現させ、その抗原を培養基から回収することがで
きる。その代わりに、供与体ｃＤＮＡ断片を最初のベク
ターから取り（例えば、最初にプラスミドを開裂しＤＮ
Ａを挿入するために使用した同じエンドヌクレアーゼを
用いるエクセッション（excession)によって）、新しい
クローニングベクターに挿入し、ｃＤＮＡまたは蛋白質
抗原の大量生産のために、受け入れ細胞の形質転換に使
用できる。その代わりにまた、いったん比較的大量の蛋
白質抗原またはそれを生産するｃＤＮＡが手に入れば、
分子種の配列を決定することも可能である。一度この配
列が分かれば、自動ペプチド合成装置または他の適切な
合成手段を使用してペプチド抗原を合成することができ
る。合成の実験室の技術、典型的には固相合成、および
自動ペプチド合成装置は共に当業界ではよく知られてい
る。例えば、そのような装置の広告が雑誌（Genetic En
gineering News) の１９８４年１１／１２月号の３４ペ
ージに掲載されている。一つの特定のＤＮＡ塩基配列は
一つのペプチドをコードするので、クローンしたＤＮＡ
セグメント中に存在する遺伝子情報は容易にペプチドの
非生物学的合成に使用できる。ペプチドの疎水領域は通
常ペプチドの内側に、親水領域は通常外側にあるので、
外表面にあり従って抗原決定基として作用するペプチド
の部分を妥当な精度で予測できる。親水性分析（Hopp a
nd Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ, 78, 3824
-3828 (1981)) が高い親水性を有するペプチド領域を固
定するために使用できる。抗原決定基はしばしば、平均
より高い親水性値のアミノ酸の３〜１０の配列を有す
る。遺伝子情報を用いて生産した人工のペプチドは、上
述のような完全な親水領域を含むことが好ましい。人工
のペプチドが、抗原決定基が自己抗体との反応に利用で
きるほど十分に、クローンされたＤＮＡセグメントによ
ってコードされる配列と同じである配列を有すること
が、特に好ましい。同一の配列が最も好ましいが、蛋白
質構造の小さな修飾は抗原決定基に影響を与えることな
く行えることは当業者には容易に認識されるだろう。例
えば、厳密に関連するアミノ酸の置換（イソロイシンに
対してロイシン）、および、未端アミノ酸が置換された
（例えばシステイン）またはそれを欠いているペプチド
（好ましくは全アミノ酸含有量の１０パーセント以下）
の生産は共に可能である。 【００４５】種々のアミノ酸の付加を含む他の典型的な
修飾によって、抗原を種々の表面へ結合（coupling）さ
せることができる。例えば、システインの付加または置
換により機能化表面にスルフヒドリル基を結合させるこ
とができ、疎水性のアミノ酸の付加または置換により可
塑性の表面に疎水結合で結合させることができる。これ
らの方法の両方を、例えばＥＬＩＳＡ試験または他の標
準的な免疫試験で使用できる。本発明の範囲に入る変法
は、自己免疫抗体と反応する能力によって容易に決定さ
れる。これらのまたは他の等価な方法の任意のものが、
血清が初めに得られる宿主の自己免疫疾患と関連する自
己抗体と反応する抗原の獲得に適している。 【００４６】本発明の実施による組換え体ＤＮＡ分子と
形質転換した単核細胞微生物の製造に使用できる上述の
一般的な方法に加えて、他の既知技術およびその変法が
本発明の実施に使用できる。特に、遺伝子工学に関連す
る技術は最近爆発的に成長し発展した。最近の多くの米
国特許が、本発明の実施に使用できる、プラスミド、遺
伝子工学で扱われた微生物および遺伝子工学の方法を開
示している。例えば、米国特許第4273875 号はプラスミ
ドとそれを単離する方法を開示している。米国特許第43
04863 号は、ハイブリッドプラスミドを構築し、それを
細菌宿主の形質転換に使用する遺伝子工学によって細菌
を生産する方法を開示している。米国特許第4419450 号
は組換え体ＤＮＡの作業でクローニングビーイクルとし
て有効なプラスミドを開示している。米国特許第436286
7 号は、組換え体ｃＤＮＡ構築法とそれによって生産さ
れたクローン法に有効なハイブリッドヌクレオチドを開
示している。米国特許第4403036 号はＤＮＡセグメント
の多数の複製を含むプラスミドをつくる遺伝子試薬を開
示している。米国特許第4363877 号は組換え体ＤＮＡ転
移ベクターを開示している。米国特許第4356270 号は組
換え体ＤＮＡクローニングビーイクルを開示しており、
また、遺伝子工学で使用される多くの語とそこで使用さ
れる基本的な方法を定義しているので、遺伝子工学の分
野で限られた経験しか持たないものには特に有効であ
る。米国特許第4336336 号は融合した遺伝子とその製造
方法を開示いている。米国特許第4349629 号はプラスミ
ドベクターとその生産および使用を開示している。米国
特許第4332901 号は組換え体ＤＮＡに有効なクローニン
グビーイクルを開示している。これらの全ての特許なら
びにこの明細書中に引用される他の全ての特許と文献
は、本発明が属する当業者の水準を示すものであり、全
てここに引用して挿入する。 【００４７】これらの特許のいくつかは本発明の範囲に
ない特定の遺伝子生成物の生産を目的としているが、そ
こに記述されている方法は、遺伝子工学に携わる当業者
によって本明細書に説明される本発明の実施のために容
易に改良される。例えば、融合した蛋白質の生産は蛋白
質と抗原の安定性を高めることができ、本発明の実施に
有効である。自己抗体と反応する抗原は正常な宿主構成
物であり、特に分解を受け易い。本発明の診断と治療の
観点からは長期の貯蔵と大量の陳列（exposure）のため
に、安定性が高いことが望ましい。更に、多様な異なる
抗原物質が共通の診断および治療の装置で適用されるの
で、共通の融合した蛋白質部分（例えばβ−ガラクトシ
ダーゼ）は本発明の柔軟性を高めることができる。 【００４８】本発明の方法はいずれの自己免疫疾患の治
療にも使用できるが、ＳＬＥおよび、硬皮症、乾燥症候
群、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、シェーグレン症候群
などの関連した自己免疫疾患における使用が特に好まし
い。 【００４９】本発明の方法により同定され生産された抗
原は、例えば、自己免疫疾患の診断（identification）
と治療における使用など多くの使用法がある。多くの自
己免疫疾患では、病気の人または動物から自己抗体を除
くことにより症状は緩和される。病気の宿主が依然とし
て外来性の抗原に対して正常な免疫応答を示すことがで
きるように、選択的に除くことが望ましい。文献(Terma
n et al, Clinical Im munology and Immunopathology,
８，90-96 (1977)）に議論されているように、体中での
ＤＮＡ抗体の除去が、血液を木炭に固定化された(immob
ilized) ＤＮＡ上を体外循環させることにより行われ
た。この技術は、木炭に固定化されたＤＮＡを、適当な
基質に固定化されたここに記述されるようにして生産さ
れた適切な蛋白質抗原に置き換えることにより、容易
に、蛋白質抗原を含む自己免疫疾患での使用に適用でき
る。自己免疫疾患治療の他の方法と装置の例が米国特許
第4362155 号に示されている。この特許は血液からのイ
ンターフェロンおよび／または自己抗体の除去を開示し
ている。この方法と装置は、その特許に開示されている
一般的な吸着剤の代わりに本発明で開示されている抗原
を使用するように容易に適用できる。 【００５０】患者の自己抗体と反応する精製した抗原を
固体マトリックスに結合させて、病気の宿主の血しょう
から反応性の自己抗体を取る、捕えるまたは除去するた
めに使用できる。ペプチドを表面に結合する方法はよく
知られており、本発明での使用に容易に適用できる。例
えば、ペプチド抗原の末端アミノ酸は、固体重合体（ま
たは重合体に結合した連結基（linking group)の反応性
のカルボニル、カルボキシレート、ヒドロキシルまたは
アミノ基と反応できる。可塑性物質またはガラス上への
未修飾ペプチドの被覆によっても免疫学的に反応性の表
面が得られる。 【００５１】重症筋無力症や全身性ループスなどの自己
免疫疾患の患者ならびにいくつかの型の癌の患者が、患
者の血液から全ての抗体を除去する引算的な治療法でう
まく治療された。これらの方法は化学的に純粋で反応性
の抗原が入手できないために使用が困難であった。ここ
に説明した方法によって、始めて、特定の自己抗体を宿
主の血しょうから除去するために使用できる抗原蛋白質
が大量に提供される。従って、実際には、有益な抗体を
宿主に戻すことができ、高価な潜在的に複雑な置換流体
（例えばアルブミン）の使用が避けられる。 【００５２】例えば、Ｌａ蛋白質と反応する自己抗体を
生産するＳＬＥまたはシェーグレン症候群の患者は、細
胞性の破壊（cellular destruction）と炎症の危機に出
会うことがある。そのような患者は、遺伝的に生産され
たＬａ蛋白質が高い濃度で入れられているアフェレーシ
ス（apheresis)装置を通して血清を循環またはろ過させ
ることにより治療される。その装置は、全ての能力のあ
るＬａ自己抗体が固定化されたＬａ抗原で処理されるよ
うに設計することができる。抗原は、遺伝的に融合され
発現される蛋白質部分（例えばβ−ガラクトシダーゼ、
またはアビジンなどの強力なマトリックス結合蛋白質）
によって固体マトリックスに結合させることができる。
融合するハンドル、腕またはタグによる結合は、（１）
種々の抗原が同様に共通のマトリックスに結合できる共
通の化学結合の源を与える、（２）抗原の可動性に最大
の自由を与える、この性質は抗体−抗原反応性を改良す
ることが知られている、（３）安全性の高まった抗原を
提供するという利点を有する。その結果患者の血液から
Ｌａ自己抗体が取られて免疫複合体の形成能が抑えられ
または変えられ、患者の炎症組織での複合体の沈積を減
少させることができる。この方法の最初の工程は、粗い
血しょう搬出またはブドウ球菌蛋白質Ａを用いる免疫グ
ロブリンの除去によって以前に形成されたＬａ免疫複合
体を取り去ることであり、その後、宿主中で反応する抗
原に出会う前に新たに生産されたＬａ自己抗体を特異的
に除去する。このようにして、患者の血液はＬａ抗原を
含む免疫複合体を含まないようになる。 【００５３】本発明によって生産される蛋白質抗原は、
免疫複合体の形成を乱すために病気の宿主に抗原を直接
注射することによっても使用できる。自己免疫の結果と
して形成される免疫複合体は臨界的な濃度の反応物（抗
原と抗体）の存在に依存しており、反応物の互いの比が
結合が起こるか否かを決定する。この比は自己免疫疾患
状態の危機的な期間に最適値であると考えられている。
本発明の方法によって、同質的に（homogeneously)純粋
な抗原が宿主の血液へ注射されて抗原−抗体比を変える
ことができる。その結果新しい免疫複合体は形成されな
いので、細網内皮細胞系および食細胞は以前に形成され
た免疫複合体をうまく除去でき、このようにして、自己
免疫の病理学と関連する標的組織に免疫複合体が沈積す
る能力を減ずる。 【００５４】例えば、精製したＬａ抗原を、Ｌａ抗原の
免疫複合体がそれらの浄化または破壊よりも速く形成さ
れる生命を脅かす自己免疫危機の間に、Ｌａ自己抗体を
生産する患者に静脈注射することができる。体重が６８
kgで全血液が４．８ｌの平均的な人の宿主には約５×１
０4 mmのＩｇＧがある。Ｌａ自己抗体が循環している典
型的な患者では、これは全体で１０15分子のＬａ蛋白質
とほとんど等価である。従って、１モル等価のＬａ抗原
（約１．６ナノモル）の注射は免疫複合体の形成を妨
げ、最適には高抗体−抵抗原比の状態をもたらすだろ
う。自己免疫の現在の仮説は、自由循環ではなく沈積部
位での病因の免疫複合体の形成に基づいており、循環中
の高親和性の抗原の存在が標的組織での免疫複合体の沈
積の速度を減少させると主張する。循環する自己抗体の
量を適切に測定するために、本発明で説明した定量的診
断方法を適用でき、注射する精製した抗原の量を自己抗
体のレベルの昇降に従って調節できる。 【００５５】 【実施例】これまで一般的に説明した本発明はここに含
まれる特定の例を参照することによってより良く理解さ
れるだろう。この例は説明のためだけのものであって、
特に断わらない限りは本発明またはその具体例を限定す
るものではない。 【００５６】例 人ループスＬａ抗原を発現するｃＤＮＡクローンの単離
と分析。緒言 本発明は、全身性エリテマトーデスおよびシェーグレン
症候群と関連するＬａ蛋白質を発現する、人肝臓から製
造された組換え体ｃＤＮＡの同定によって実施され説明
される。本発明以前には特定の抗原物質を同定できる方
法は知られていず、標準の原型抗血清に対する抗原特異
性のおよその帰属のみが可能であった（１）。哺乳類の
細胞Ｌａ蛋白質は、ｔＲＮＡ、４．５Ｓ ＲＮＡ、５Ｓ
ＲＡＮおよび７−２ＲＮＡを含むＲＮＡポリメラーゼ
III 転写体の前駆体と関連することが見出された（３，
４，５，６）。アデノウイルスのＶＡＩ ＲＡＮ（７，
８）、エプスタイン−バール（Epstein-Barr）ウイルス
のＥＢＥＲ ＲＡＮ（９）、水疱性口内炎ウイルス
（２，10）と狂犬病ウイルス（11）のリーダーＲＮＡな
どの幾つかの小さいウイルス転写体がＬａ蛋白質と複合
体を形成することも示された。Ｌａ抗体を使用するリボ
核蛋白質複合体の免疫沈降によって、幾つかのこれらの
ＲＮＡ種に対するＬａ蛋白質結合部位が、３′末端付近
の残基であることが示された（４，８，12）。これらの
ＲＮＡの３′未満にウリジレート残基が存在すること
が、結合に必要とされる可能性がある。更に、余分な
３′末端ウリジレート残基の付加が、Ｌａ蛋白質のＶＡ
Ｉ ＲＡＮ（13）および転移ＲＡＮ（14）に対する結合
を高めることが見い出された。Ｌａ蛋白質はプロセスさ
れていない転写体に優先的に結合するので、スタイツ
（Steitz）と協同研究者らは（４，５）、Ｌａ蛋白質が
ＲＮＡポリメラーゼIII に対する転写因子であると提案
した。ＲＮＡ代謝における正確な機能については不明確
であるにも関わらず、Ｌａ蛋白質が遺伝子発現の調節に
おいて生物学的に重要であることは明らかである。とい
うのは、それが多様な細胞性およびウイルス性のＲＮ
Ａ、その多くが既知の機能を有している、と関連してい
るからである。 【００５７】Ｌａ蛋白質の生化学的機能を更に特徴づけ
るために、それを哺乳類細胞から精製する試みがなされ
た（14）。これらの精製法からの回収は７％以下で、Ｌ
ａ蛋白質は明らかにＲＮＡ成分との相互作用のために生
化学的不均一性（heterogeneity)を示した。高純度のＬ
ａ蛋白質を大量に生産するために、本発明者は、Ｌａ蛋
白質のコードである組換え体ｃＤＮＡクローンを誘導し
た。λgt１１発現ライブラリー（15）からのＬａ−ｃＤ
ＮＡコロニーは、選ばれたループルス患者からの血清を
抗体プローブとして使用して同定された。 【００５８】物質と方法酵素 酵素は購入した(Bethesda Research Laboratories およ
び New England Biolabs）。試験管中の翻訳のためのウ
サギ網状赤血球溶解産物系も購入した（New England Nu
clear)。抗血清 ループス抗血清はデューク大学医学センター蛍光抗核抗
体実験室から得た。単一の特定の抗原と強力に反応する
血清は、静脈穿刺により同定され大量に得られた。 【００５９】細胞と免疫沈降 ＨｅＬａ細胞は、抗体沈降のために、メチオニンを含ま
ない培地中で５時間［35Ｓ］メチオニン（New England
Nuclear)を用いて０．２〜０．５ｍＣｉ／ｍｌに標識さ
れた。蛋白質抽出物が製造され、免疫沈降が、蛋白質Ａ
源としてパンソルビン（Pansorbin)（Calbiochem）を使
用して（８）に記述されるように行われた。免疫沈降し
た蛋白質は、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ）（16）およびそれに続くフルオログラ
フィーによって分析された。 【００６０】細菌株とλgt１１発現ライブラリー 大腸菌の菌株Ｙ１０８８およびＹ１０９０はスタフォー
ド（D. Stafford, University of North Carolina at C
hapel Hill）から得た。λgt１１を用いて構築された人
肝臓ｃＤＮＡライブラリーは、スタフォードとモドリッ
ク（P. Modrich, Duke University Medical Center）と
ラザリニ（R. A. Lazzarini, NationalInstitutes of H
ealth）により提供された。 【００６１】抗体プローブを用いる発現ライブラリーの
スクリーニング ヤングとデイビス（15）に記述されるように、λgt１１
組換え体ファージは５７６cm2 プレート（ＮＵＣＵ Int
er Med）当り１０5 pfu で大腸菌Ｙ１０９０上にプレー
トされた。β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の発現は、
１０ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）（Boehringer Mannheim Biochemicals）で飽和した
ニトロセルロースフィルター（Schleicher and Schuel
l）を被せることにより誘導された。ループス患者から
の血清は、自己抗体のユニークな特異性を確かめるため
の［35Ｓ］−メチオニン標識および［ 3Ｈ］−アミノ酸
標識のＨｅＬａ細胞抽出物の免疫沈降によって、また
は、文献（Towbin et al, Proc . Natl. Acad. Sci. US
A, 76, 4350-4354 (1979)）に記述された技術を使用す
るイムノブロッティングによって、スクリーニングされ
た。Ｌａ血清は、発現ライブラリーのスクリーニングで
使用する前に、Ｒｏ、Ｓｍ、ＲＮＰおよび他のループス
自己抗体を含まないことを測定された。誘導した蛋白質
をニトロセルロースへ移した後、フィルターは牛胎児血
清でブロックされ、ループス抗血清の１：１００希釈で
スクリーニングされ、［ 125Ｉ］標識蛋白質Ａ（ＩＣＮ
Radiochemicals）でプローブされた。 【００６２】試験管中の翻訳におけるハイブリッド選択 ｐＢＲ３２２中へ再クローンされたＥco ＲＩ−ＤＮＡ
挿入体（inserts)は、ニトロセルロースフィルターに固
定化されてハイブリッド選択のために使用された。マニ
アチスら（17）によって記述されるように、全ＨｅＬａ
細胞細胞質ＲＮＡがハイブリッド選択に使用された。ハ
イブリッド選択されたｍＲＮＡは、試験管中で［35Ｓ］
−メチオニンの存在したウサギ網状赤血球溶解産物を使
用して翻訳され、生成物は１５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分
析された。オートラジオグラフィーで同定されたＬａ蛋
白質を含むゲル薄片は、第２のゲルの試料ウエル（wel
l）へ移された。種々の量の黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテ
アーゼ（Sigma)がそれぞれのウエルへ加えられ、消化が
クリーブランドらの方法（18）によって積み重なったゲ
ル中で進行させられる。制限された蛋白質分解により生
じたペプチドは同じゲル中で分別され、フルオログラフ
ィーによって同定された。 【００６３】ＤＮＡ塩基配列形成（sequencing） λgt１１−Ｌａクローンから単離されたＥco ＲＩ−挿
入体は、制限酵素を使用してフラグメント化され、Ｍ１
３−mp１８およびＭ１３−mp１９ベクター中にサブクロ
ーンされた。ジデオキシＤＮＡ塩基配列形成（19）が［
35Ｓ］−ｄＡＴＰ（Amersham）と緩衝勾配ゲル（20）を
使用して行われた。 【００６４】エンザイムリンクド イムノソルベント
アッセイ（ＥＬＩＳＡ） １０ｍＭのＩＰＴＧに浸されたニトロセルロースのシー
トが、クローン的に精製された全長さのＬａ ｃＤＮＡ
を含む集密的（confluent)ファージプラークの誘導によ
って、Ｌａ抗原で被覆された。より感度の高い試験に対
しては、部分的に精製されたβ−ガラクトシダーゼ−Ｌ
ａ融合蛋白質が、ニトロセルロースシートを被覆するた
めに使用された。抗原で被覆したニトロセルロースシー
トはＢＳＡ含有のブロック溶液（Kirkegaard and Perry
Laboratories)を用いて処理され、人血清の希釈が１時
間抗原と接触したまま置かれた。血清は除かれ、フィル
ターは、０．０２Ｍイミダゾール緩衝生理食塩水と０．
０２％トゥイン（Tween)２０（Kirkegaard and Perry L
aboratories)を含有する緩衝液で完全に洗浄された。ニ
トロセルロースシートは、トゥイン２０緩衝液中および
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中では２度、それぞれ
１０分間洗浄された。抗体と反応させたシートは、１μ
ｇ／ｍｌの濃度のラクトペルオキシダーゼ結合蛋白質Ａ
を用いて３０分間インキュベートされた。３周期の洗浄
の後、フィルターをペルオキシダーゼ基質系（Kirkegaa
rd and Perry）中で４−クロロ−１−ナフトールと１０
分間反応させた。 【００６５】結果Ｌａ−ｃＤＮＡクローンの単離と同定 ５００，０００個の組換え体の最初のプラークスクリー
ニングでは、２０の推定のＬａクローンが同定された。
種々のＬａ特異性の自己抗体を用いる精製と再スクリー
ニングを何回か行ううちに、３つの陽性のＬａクローン
が単離され確認された。図１は、免疫学的スクリーニン
グ法によってＬａ ｃＤＮＡクローンの単離と同定が証
明されている、一連の培養基の写真を示している。組換
え体ファージは最初、５７６cm2 のプレート上に約２０
０ pfu／cm2 の密度でプレートされた。直径０．５cmの
寒天プラグ（plug）がそれぞれの信号の位置から取ら
れ、直径９cmのプレート上で約２０ pfu／cm2 の密度で
再プレートおよび再スクリーニングされる前に、力価を
測定された（titer)。再プレートと再スクリーニングの
工程は、それぞれのファージプラークがクローン的に精
製された組換え体を含むようになるまで、何回か繰返さ
れた。これは、プレート上の全てのプラークが幾人かの
異なる患者からのＬａ抗血清と反応するときに決定され
る。 【００６６】Ｌａクローンのうちの２個がλgt１１プラ
ークとして発現され、そして、Ｌａに特異的な自己抗体
を含まない（ＲＮＡと蛋白質の免疫沈降、細胞蛍光（Ａ
ＮＡ）およびカウンタ−免疫電気泳動（ＣＩＥ）により
試験されたように）ＳＬＥ患者からの血清のパネルおよ
び正常な人血清に対する反応性を分析されたときに、図
２のデータが得られた。使用された血清はＬａ、Ｓｍお
よびＲＮＰ特異性を示した。Ｌａ抗原を発現するクロー
ンがＬａ特異性のＳＬＥ患者からの血清とのみ反応した
ことは明らかである。 【００６７】これらのクローン的に発現されたＬａ抗原
は、更に、エンザイムリンクドイムノソルベントアッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）により同定された。Ｌａ抗原クローン
のうちの一つを用いた典型的なドット（dot)ＥＬＩＳＡ
の結果を図３に示す。 【００６８】１８人のＳＬＥ患者からの血清が発現Ｌａ
抗原に対する反応性を分析された。３人のＳＬＥ−Ｌａ
患者からの血清は明らかな陽性の応答を示したが、他の
ループス特異性（Ｓｍ、Ｒｏ、ＲＮＡ、Ｇａ、Ｔｏおよ
びクラス分けされていない反応性）の患者と正常人は反
応性における低いバックグラウンドを示したのみであっ
た。フィルターは、物質と方法のところに記述したよう
に製造され処理され、そして、ラクトペルオキシダーゼ
結合黄色ブドウ球菌蛋白質Ａによって分析された。（１
〜２）Ｌａ、（３）Ｌａ／Ｒｏ、（４）Ｒｏ、（５）Ｓ
ｍ、（６）ＲＮＰ、（７）ＳＭ／ＲＮＰ、（８）Ｓｍ／
ＲＮＰ、（９）未知のＳＬＥ、（10）Ｔｏ、（11）ＲＮ
Ｐ、（12）ＲＮＰ＋未知、（13）Ｓｍ／ＲＮＰ、（14）
ＲＮＰ、（15）未知のＳＬＥ、（16）Ｓｍ／ＲＮＰ、
（17）未知のＳＬＥ（Ｌａ）、（18）未知のＳＬＥ、
（19）正常、（20）正常。ある場合には、ＡＮＡとＣＩ
Ｅによっては未知の特異性とされた血清が、ＥＬＩＳＡ
によってＬａ蛋白質に対して弱い陽性を示すことが見い
出された。引き続きＲＮＡと蛋白質の免疫沈降によって
分析を行い、これらの試料中にＬａ抗体が存在すること
が確認された（データは示していない）。 【００６９】ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーショから
のデータ（示していない）と制限酵素分析は、部分的に
重なり合うＬａクローンが単離されたことを示した。こ
れらの全てはコードの塩基配列のカルボキシル末端部分
を含んでいた。５０，０００ダルトンの人Ｌａ蛋白質に
対して予想されるコード塩基配列の長さは約１．５kbで
ある。ｃＤＮＡの最大のものは約１．５kbの挿入体を含
み、ほとんど全長さのコード塩基配列に相当するようで
ある。部分的な制限マップを図４に示す。 【００７０】ハイブリッド選択と試験管中の翻訳による
蛋白質同一性 ｃＤＮＡクローンの同一性を確認するために、ハイブリ
ッド選択と試験管中での翻訳の技術が使用された。ｐＢ
Ｒ３２２中にサブクローンされたλgt１１−Ｌａクロー
ンからのＤＮＡ挿入体が、全ＨｅＬａ細胞質ＲＮＡから
のｍＲＡＮのハイブリッド選択に使用された。選択され
たフィルター結合のｍＲＮＡは溶離され、ウサギ網状赤
血球溶解産物を使用して試験管中で翻訳された。図５
は、試験管中で合成され、１５％ＳＤＳ／アクリルアミ
ドゲル上で分別された［35Ｓ］−メチオニン標識生成物
のフルオログラフィーを示す。図５には次のような種々
のゲルが示されている。 【００７１】（ａ）第１レーン（lane）、体中［35Ｓ］
標識ＨｅＬａ細胞蛋白質、ＬａとＲｏ特異性のループル
血清で免疫沈降された。第２レーン、Ｌａ ｃＤＮＡ挿
入体を用いてハイブリッド選択されたＨｅＬａ ｍＲＮ
Ａからの試験管中での翻訳生成物。第３レーン、Ｌａ
ｃＤＮＡプラスミドを用いてハイブリッド選択されたＨ
ｅＬａ ｍＲＮＡからの試験管中での翻訳生成物。第４
と第５のレーン、プラスミドｐＢＲ３２２を用いてハイ
ブリッド選択されたＨｅＬａ ｍＲＮＡからの試験管中
での翻訳生成物。第６レーン、１０μｇの担体ｔＲＮＡ
を使用する試験管中での翻訳生成物。 【００７２】（ｂ）第１レーン、体中［35Ｓ］標識Ｈｅ
Ｌａ細胞蛋白質、Ｌａ特異性のループル血清で免疫沈降
された。第２レーン、（ａ）の第３レーンと同じ。第３
レーン、抗Ｌａ血清で免疫沈降された第２レーンからの
翻訳生成物。第４レーン、（ａ）の第４レーンと同じ。
第５レーン、（ａ）の第６レーンと同じ。第６レーン、
１０μｇの全ＨｅＬａ細胞ＲＮＡを使用する試験管中で
の翻訳生成物。 【００７３】約５０，０００ダルトンの一つの蛋白質
が、Ｌａ−ｃＤＮＡ選択ｍＲＮＡに対してユニークな唯
一の蛋白質種であった（図５ａの第１と第２のレーン、
図５ｂの第２のレーン）。この蛋白質は、抗Ｌａ血清に
より免疫沈降された体中標識Ｌａ蛋白質と共に移動した
（図５ａと図５ｂの第１レーン）。試験管中で合成され
た種は同じ抗血清と反応することが見い出された（図５
ｂの第３レーン）。試験管中で翻訳された蛋白質が実際
に確実な（authentic)細胞性Ｌａ蛋白質であることを更
に証明するために、ハイブリッド選択と翻訳および分離
用（preparative)ゲル上での生成物の分別が行われた。
分離用ゲルはオートラジオグラフィーを行われ、試験管
中と体中の両方の標識Ｌａ蛋白質を含むゲル薄片が、第
２のゲルの試料ウエルに移された。クリーブランドらの
方法（17）を使用して、試料に黄色ブドウ球菌Ｖ８プロ
テアーゼを用いる制限した蛋白質分解を行い、生じたペ
プチドを分析した。図６は、試験管中および体中で合成
されたＬａ蛋白質のペプチドマッピングのフルオログラ
フィーを示す。体中［35Ｓ］標識ＨｅＬａ細胞蛋白質
と、Ｌａ ｃＤＮＡハイブリッド選択したｍＲＮＡを使
用してウサギ網状赤血球溶解産物を用いて試験管中で合
成された前述の共に移動する蛋白質バンドとが、ゲル精
製され、種々の量の黄色ブドウ球菌Ｖ８のプロテアーゼ
で消化され、１５％ＳＤＳ／アクリルアミドゲル上で分
析された。試料は、積み重なったゲル中で３０分間、第
１〜第４のレーンが示しているそれぞれ０、１０、１０
０、１０００ngのプロテアーゼを用いてインキュベート
された。これらのデータは、試験管中で翻訳された生成
物が、体中標識Ｌａ蛋白質と同じ部分蛋白質分解（part
ialproteolytic)プロフィールを有することを示してい
る。従って、ｃＤＮＡクローンは人Ｌａ蛋白質のコード
であり、それを発現する。 【００７４】Ｌａ蛋白質の抗原部位のマッピング λgt１１は抗原性によって定義されるように正しい読み
取り枠（reading frame)中でｃＤＮＡを発現するので、
５′ＥcoＲＩ開裂部位の直後から始まっているＤＮＡ塩
基配列からアミノ酸配列を決定することができた。単離
された最小のｃＤＮＡ挿入体は３９０ヌクレオチドの長
さで、Ｌａ蛋白質のカルボキシル末端にある１２２個の
アミノ酸のコードである３６６個の塩基と、それに加え
て何も情報をコードしていない２４個のヌクレオチドを
含んでいた。他のｃＤＮＡ挿入体のコード塩基配列は、
カルゴキシル末端の５５個のアミノ酸のみを含んでいる
ことが見い出された。両方のｃＤＮＡ挿入体λgt１１ベ
クター中でβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質として発現
されるので、Ｌａ抗血清と反応する抗原部位の少なくと
も一つは、その蛋白質のこの５５個のアミノ酸領域（末
端１２％）中に位置する。ヌクレオチドとアミノ酸の配
列を次に示す。 【００７５】 ＧＧＣ ＴＧＧ ＧＴＡ ＣＣＴ ＴＴＧ ＧＡＧ ｇｌｙ ｔｒｐ ｖａｌ ｐｒｏ ｌｅｕ ｇｌｕ 30 ＡＴＡ ＡＴＧ ＡＴＡ ＡＡＡ ＴＴＣ ＡＡＣ ｉｌｅ ｍｅｔ ｉｌｅ ｌｙｓ ｐｈｅ ａｓｎ ＡＧＧ ＴＴＧ ＡＡＣ ＣＧＴ ＣＴＡ ＡＣＡ ａｒｇ ｌｅｕ ａｓｎ ａｒｇ ｌｅｕ ｔｈｒ 60 ＡＣＡ ＧＡＣ ＴＴＴ ＡＡＴ ＧＴＡ ＡＴＴ ｔｈｒ ａｓｐ ｐｈｅ ａｓｎ ｖａｌ ｉｌｅ 90 ＧＴＧ ＧＡＡ ＧＣＡ ＴＴＧ ＡＧＣ ＡＡＡ ｖａｌ ｇｌｕ ａｌａ ｌｅｕ ｓｅｒ ｌｙｓ ＴＣＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＧＡＡ ＣＴＣ ＡＴＧ ｓｅｒ ｌｙｓ ａｌａ ｇｌｕ ｌｅｕ ｍｅｔ 120 ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＧＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＡＡＡ ｇｌｕ ｉｌｅ ｓｅｒ ｇｌｕ ａｓｐ ｌｙｓ ＡＣＴ ＡＡＡ ＡＴＣ ＡＧＡ ＡＧＧ ＴＣＴ ｔｈｒ ｌｙｓ ｉｌｅ ａｒｇ ａｒｇ ｓｅｒ 150 ＣＣＡ ＡＧＣ ＡＡＡ ＣＣＣ ＣＴＡ ＣＴＧ ｐｒｏ ｓｅｒ ｌｙｓ ｐｒｏ ｌｅｕ ｌｅｕ 168 ＡＡＧ ＴＧＡ ｌｙｓ ＴＥＲＭ 一つの枠内（in-frame）終結コドンが１６６位の始めに
あった。 【００７６】この配列は疎水性アミノ酸を高い含有量で
有する。ホップとウッドの方法（21）を使用する親水性
分析から、アミノ酸４０から４９までのデカペプチドは
＋１．６１の値であると同定された。５５個のアミノ酸
の抗原部分の平均親水性は＋０．３と計算された。この
方法に基づけば、このデカペプチド領域は蛋白質の表面
にさらされている可能性が高く、また、Ｌａ蛋白質に対
する抗原決定基と部分的に重なっている可能性がある。
従って、このデカペプチド配列、ｇｌｕ−ａｓｐ−ｌｙ
ｓ−ｔｈｒ−ｌｙｓ−ｉｌｅ−ａｒｇ−ａｒｇ−ｓｅｒ
−ｐｒｏによって、始めて、自己免疫疾患と関連するユ
ニークな抗原決定基が示された。 【００７７】上述の方法はまた、天然のＲｏ、Ｌ−４
２、ＳclおよびＵ2 bp抗原に対して交差反応性である抗
原を発現するクローンの生産にも適用した。 【００７８】本発明の好ましい点を例証するために、Ａ
ＴＣＣ（American type Culture Collecion, 12301 Par
klawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Ｕ．Ｓ．
Ａ．）への寄託が行われた。大腸菌（Ｅ．coli）ＨＢ１
０１０−Ｌabが寄託され、寄託番号はＡＴＣＣ３９９８
４である。この菌株は、そこに挿入されたＬａ抗原遺伝
子を有し、大腸菌ＨＢ１０１中に形質転換された一つの
ｐＢＲ３２２プラスミドを包含している。 【００７９】参照文献：明細書中に参照番号によって参
照された文献を以下に示す。 参照文献１ 「核抗原（ＡＮＡ）に対する自己抗体。そ
の免疫生物学と医学」（Tan, E.M. (1982) in Advances
in Immunology, Vol. 33, H. Kunkel and F. Dixon, e
ds., Academic Press, Inc., pp. 167-240) 参照文献２ （Kurilla, M.G. and Keene, J.D. (198
3), Cell 34, pp. 837-845）参照文献３ （Chambers,
J.C., Kurilla, M.G. and Keene, J.D. (1983), J. Bio
l. Chem. 258, pp. 11438-11441) 参照文献４ （Hendrick, J.P., Wolin, S.L., Rinke,
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l. Biol. 1, pp. 1138-1149） 参照文献５ （Rinke, J., and Steitz, J.A. (1982),
Cell 29, pp.149-159) 参照文献６ （Hashimoto, C. and Steitz, J.A. (198
3), J. Biol. Chem. 258,pp. 1379-1384) 参照文献７ （Lerner, M.R., Boyle, J.A., Hardin,
J.A. and Steitz, J.A.（1981), Science 211, pp. 400
-402) 参照文献８ （Francoeur, A.M. and Mathews, M.B. (1
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6) 参照文献９ （Rosa, M.D., Gottlieb, E., Lerner, M.
R., and Steitz, J.A.(1981), Mol. Cell. Biol. 1, p
p. 785-796) 参照文献10 （Wilusz, J., Kurilla, M.G., and Keen
e, J.D. (1983), Proc. N atl. Acad. Sci. USA 80, PP.
5827-5831) 参照文献11 （Kurilla, M.G., Cabradilla, C.D., Hol
loway, B.P., and Keene，J.D. (1984), J. Virol. 50,
773-778) 参照文献12 （Reddy, R., Henning, D., Tan, E., and
Busch, H. (1983), J. Biol. Chem. 258, pp. 8352-835
6） 参照文献13 （Mathews, M.B. and Francoeur, A.M. (1
984), Mol. Cell. Biol. 4, pp. 1134-1140) 参照文献14 （Stefano, J.E. (1984), Cell 36, pp. 1
45-154） 参照文献15 （Young, R.A. and Davis, R.W. (1983),
Science 222, pp. 778-782) 参照文献16 （Laemmli, U.K. (1970), Nature (Londo
n) 227, pp. 680-685) 参照文献17 （Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sam
brook, J. (1982), Mole cular Cloning : A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring
Harbor, N.Y.) 参照文献18 （Cleveland, D.W., Fischer, S.G., Kirs
chner, M.W., and Laemmli, U.K. (1977), J. Biol. Ch
em. 252, pp. 1102-1106) 参照文献19 （Sanger, F., Coulson, A.R., Barrell,
B.G., Smith, A.J.H., and Roe, B.A. (1980), J. Mol.
Biol. 143, 161-178) 参照文献20 （Biggin, M.D., Gibosn, T.J. and Hong,
G.F. (1983), Proc. Na tl. Acad. Sci. 80, pp.3963-3
965) 参照文献21 （Hopp, T.P. and Woods, K.R. (1981), P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 78, pp.3824-3828） 本発明は以上で十分に説明された。これまでに述べた本
発明の技術的範囲を逸脱することなく、本発明に対する
多くの変形と修正を行うことができることは当業者には
明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｌａ特異性のループス血清を用いるλ
ｇｔ１１組換え体ファージプラーク（溶菌斑）の免疫学
的スクリーニングによるＬａ ｃＤＮＡクローンの単離
と同定を示す一連の培養基の写真である。 【図２】図２は、種々の特異性のループス血清を用いる
λｇｔ１１−Ｌａ クローンの免疫学的スクリーニング
を示す一連の写真である。 【図３】図３は、ニトロセルロースに結合させた発現し
たＬａ抗原を用いて、これを自己免疫疾患の１８人の患
者からの血清と２人の正常血清とに対して反応させたエ
ンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（酵素結合
免疫吸着剤分析）（ＥＬＩＳＡ）を示す一連の写真であ
る。 【図４】図４は、１．５kbのＬａ蛋白質ｃＤＮＡの制限
地図を示す図である。 【図５】図５は、Ｌａ蛋白質に対するｃＤＮＡを使用す
るハイブリッド選択のＨｅＬａ細胞ｍＲＮＡの試験管中
の翻訳を示す、一連のアクリルアミドゲル電気泳動を再
現する写真である。 【図６】図６は、体中で放射標識したＨｅＬａ細胞Ｌａ
蛋白質を示す、Ｌａ蛋白質の部分的なペプチドマッピン
グを再現する写真である。
ｇｔ１１組換え体ファージプラーク（溶菌斑）の免疫学
的スクリーニングによるＬａ ｃＤＮＡクローンの単離
と同定を示す一連の培養基の写真である。 【図２】図２は、種々の特異性のループス血清を用いる
λｇｔ１１−Ｌａ クローンの免疫学的スクリーニング
を示す一連の写真である。 【図３】図３は、ニトロセルロースに結合させた発現し
たＬａ抗原を用いて、これを自己免疫疾患の１８人の患
者からの血清と２人の正常血清とに対して反応させたエ
ンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（酵素結合
免疫吸着剤分析）（ＥＬＩＳＡ）を示す一連の写真であ
る。 【図４】図４は、１．５kbのＬａ蛋白質ｃＤＮＡの制限
地図を示す図である。 【図５】図５は、Ｌａ蛋白質に対するｃＤＮＡを使用す
るハイブリッド選択のＨｅＬａ細胞ｍＲＮＡの試験管中
の翻訳を示す、一連のアクリルアミドゲル電気泳動を再
現する写真である。 【図６】図６は、体中で放射標識したＨｅＬａ細胞Ｌａ
蛋白質を示す、Ｌａ蛋白質の部分的なペプチドマッピン
グを再現する写真である。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．試料を自己抗体と反応性の自己免疫抗原に接触させ
て抗原／抗体コンプレックスを形成し、コンプレックス
の存在を検出することを包含する方法であって、 自己免疫抗原が、 遺伝子ライブラリーからの遺伝子情報を複数の受入れ細
胞に導入し、遺伝子ライブラリーは自己抗体に対して反
応性である蛋白質抗原を発現する供与体から得られるも
のであり、それによって形質転換細胞を生産する工程、 抗体と産生細胞によって発現される自己抗原との間の結
合反応を検出することによって自己免疫抗原をコードす
る遺伝子を含む形質転換産生細胞を選択し、それによっ
て供与体からのクローンＤＮＡセグメントを同定する工
程、 このクローンＤＮＡセグメントから自己抗原を生産する
工程を包含する方法によって生産される、試料における
自己免疫自己抗体の存在を決定する方法。 ２．自己免疫抗原が固体マトリックスに固定化される特
許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．供与体が第１のヒトであり、宿主が第２の異なるヒ
トである特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４．自己免疫抗原が、全身性エリテマトーデス、硬皮
症、乾燥症候群、混合結合組織病及びシェーグレン症候
群からなる群から選ばれる自己免疫疾患と関連する自己
抗体と反応性である特許請求の範囲第１項に記載の方
法。
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| US06/687,908 US4751181A (en) | 1984-12-31 | 1984-12-31 | Methods and compositions useful in the diagnosis and treatment of autoimmune diseases |
| US687908 | 1984-12-31 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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| JP61500244A Expired - Lifetime JP2680811B2 (ja) | 1984-12-31 | 1985-12-18 | 自己免疫疾患の診断と治療に有効な方法および組成物 |
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| JP (2) | JP2680811B2 (ja) |
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