JP2003516130A - リンパ系線の造血幹細胞及びｎｋ細胞の表面に存在するタンパク質ならびにその使用 - Google Patents
リンパ系線の造血幹細胞及びｎｋ細胞の表面に存在するタンパク質ならびにその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
この発明は、リンパ球様細胞系及び成熟NK細胞の造血幹細胞表面に存在するタンパク質、その相当する単離されたcDNA配列及び細胞のマーカーならびに該タンパク質に対する抗体を調製するためのその使用に関する。また、この発明は、該タンパク質を表面で発現する細胞を選択するための抗体の使用に関する。単離されたタンパク質は、配列SEQ ID NO:2に対して、位置21〜152に局在する細胞外ドメイン、位置153〜295に局在する5個のトランスメンブランドメイン及び位置296〜350に局在する細胞質ドメインからなり、約36〜38 kDaの見かけ分子量を有する構造(a)、及び構造(a)のN末端に、20アミノ酸シグナル配列を含み、SEQ ID NO:2のタンパク質及び配列SEQ ID NO:2と少なくとも 70％の同一性又は少なくとも 85％の類似性、好ましくは少なくとも95％の同一性又は少なくとも 99％の類似性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる群から選択されるその前駆体を有する。
Description
【０００１】
この発明は、リンパ系線の造血幹細胞(プレ-T細胞、プレ-B細胞及びプレ-NK細
胞)及び成熟NK細胞の表面に存在するタンパク質、相当する単離されたcDNA配列
、及び該細胞のマーカーとしてのならびに該タンパク質に対する抗体を調製する
ためのその使用に関する; この発明は、表面で該タンパク質を発現する細胞を選
択する上での該抗体の使用にも関する。 このような抗体は、骨髄移植の拒絶及びGVHDを低下させるため、骨髄移植前に
NK細胞の涸渇している骨髄又は臍帯血で特に用いられる。 NK細胞は、末梢血単核細胞の10〜15％を占める。それらは、B及びT細胞ととも
に第三リンパ球性線を構成することが認められている; それらは、CD3分子錯体
やTレセプターのα、β、γ鎖のいずれの表面でも発現せず、ヒトでCD16及びCD5
6のマーカー、マウスでNK1.1/NK2.1を有し、標的細胞表面でクラスIもしくはII
のMHC抗原の発現を要しない細胞溶解作用を発揮する、大きな顆粒状リンパ球(LG
L)として明らかにされている。
胞)及び成熟NK細胞の表面に存在するタンパク質、相当する単離されたcDNA配列
、及び該細胞のマーカーとしてのならびに該タンパク質に対する抗体を調製する
ためのその使用に関する; この発明は、表面で該タンパク質を発現する細胞を選
択する上での該抗体の使用にも関する。 このような抗体は、骨髄移植の拒絶及びGVHDを低下させるため、骨髄移植前に
NK細胞の涸渇している骨髄又は臍帯血で特に用いられる。 NK細胞は、末梢血単核細胞の10〜15％を占める。それらは、B及びT細胞ととも
に第三リンパ球性線を構成することが認められている; それらは、CD3分子錯体
やTレセプターのα、β、γ鎖のいずれの表面でも発現せず、ヒトでCD16及びCD5
6のマーカー、マウスでNK1.1/NK2.1を有し、標的細胞表面でクラスIもしくはII
のMHC抗原の発現を要しない細胞溶解作用を発揮する、大きな顆粒状リンパ球(LG
L)として明らかにされている。
【０００２】
リンパ系線の祖先(プレ-T細胞、プレ-B細胞及びプレ-NK細胞)及び成熟NK細胞
によってのみ発現される表面抗原は、知られていない。2つのマーカーが、特に
他のリンパ球群からNK細胞を識別するのに使用される。それらはCD56抗原及び免
疫グロブリンFcフラグメントに対して親和性の低いレセプター、つまりCD16であ
る。 大部分のNK細胞はCD3-、CD16+、CD56+であると考えられるが、表現型と機能上
の大きな異種がこの細胞群に存在する;大部分の末梢血CD56+ リンパ球も、CD16
分子を発現する; 約10%の末梢血NK細胞はCD16-であるが、同時に高密度でCD56
を発現する。CD16-、CD56強力リンパ球は、CD16+、CD56弱NKリンパ球の前駆体で
あることが示唆されている。
によってのみ発現される表面抗原は、知られていない。2つのマーカーが、特に
他のリンパ球群からNK細胞を識別するのに使用される。それらはCD56抗原及び免
疫グロブリンFcフラグメントに対して親和性の低いレセプター、つまりCD16であ
る。 大部分のNK細胞はCD3-、CD16+、CD56+であると考えられるが、表現型と機能上
の大きな異種がこの細胞群に存在する;大部分の末梢血CD56+ リンパ球も、CD16
分子を発現する; 約10%の末梢血NK細胞はCD16-であるが、同時に高密度でCD56
を発現する。CD16-、CD56強力リンパ球は、CD16+、CD56弱NKリンパ球の前駆体で
あることが示唆されている。
【０００３】
しかし、幾つかのT細胞はCD16分子とCD56分子の双方を発現するので、これら
の2分子は末梢血NK細胞群に特異的ではない。 NK細胞は天然の細胞溶解活性を示す。これは、事前の免疫化なしに直接発揮さ
れ、標的細胞上での主要な組織適合性複合抗原の存在及び抗体依存性細胞媒介細
胞毒性(ADCC)を要しない。ADCCは、標的細胞に結合した抗体がエフェクター細胞
のFcレセプター(CD16)と結合することによって生じる。したがって、NK細胞は、
ウイルス感染に対する宿主の防御及び腫瘍細胞に対する免疫サーベイランスにお
いて重要な役割を果たす。 NK細胞は、同種異系移植での移植片拒絶、また移植片対宿主疾患(GVHD)の一因
となる異質認識(allorecognition)の始原形態を誘発し得る。これらの理由のた
め、単核細胞群におけるNK細胞及びリンパ系線前駆体細胞全体についての信頼性
ある同定が、重要である。
の2分子は末梢血NK細胞群に特異的ではない。 NK細胞は天然の細胞溶解活性を示す。これは、事前の免疫化なしに直接発揮さ
れ、標的細胞上での主要な組織適合性複合抗原の存在及び抗体依存性細胞媒介細
胞毒性(ADCC)を要しない。ADCCは、標的細胞に結合した抗体がエフェクター細胞
のFcレセプター(CD16)と結合することによって生じる。したがって、NK細胞は、
ウイルス感染に対する宿主の防御及び腫瘍細胞に対する免疫サーベイランスにお
いて重要な役割を果たす。 NK細胞は、同種異系移植での移植片拒絶、また移植片対宿主疾患(GVHD)の一因
となる異質認識(allorecognition)の始原形態を誘発し得る。これらの理由のた
め、単核細胞群におけるNK細胞及びリンパ系線前駆体細胞全体についての信頼性
ある同定が、重要である。
【０００４】
幾つかの文献は、骨髄のNK細胞を涸渇させるための方法を提案している; これ
らの種々の方法で、NK細胞は、CD56、CD16、PEN5 又は NKB1のようなマーカーを
用いて選択されている: * PCT国際出願WO 95/20604 は、NK細胞とT細胞に存在する抗原を記載している
。この抗原は、NKB1と命名された。この抗原に対するモノクローナル抗体も記載
されている(DX9 抗体)。このNKB1マーカーは、以下の特性を有する: - DX9抗体に特異的に結合する、 - 約50 kDaの分子量を有する、 - グリコシル化タンパク質である; グリコシル化タンパク質の分子量は、約70
kDaである、 - 天然形態のタンパク質はシアル酸残基を含み、特にリン酸化される、 - NKB1マーカーは、NK細胞のサブセット及びT細胞のサブセットによって発現さ
れる。
らの種々の方法で、NK細胞は、CD56、CD16、PEN5 又は NKB1のようなマーカーを
用いて選択されている: * PCT国際出願WO 95/20604 は、NK細胞とT細胞に存在する抗原を記載している
。この抗原は、NKB1と命名された。この抗原に対するモノクローナル抗体も記載
されている(DX9 抗体)。このNKB1マーカーは、以下の特性を有する: - DX9抗体に特異的に結合する、 - 約50 kDaの分子量を有する、 - グリコシル化タンパク質である; グリコシル化タンパク質の分子量は、約70
kDaである、 - 天然形態のタンパク質はシアル酸残基を含み、特にリン酸化される、 - NKB1マーカーは、NK細胞のサブセット及びT細胞のサブセットによって発現さ
れる。
【０００５】
* PCT国際出願 WO 95/06247 は、それぞれ120-150及び210-245 kDaの見かけ分
子量を有し、PEN5α及び PEN5βと示される、一対の糖タンパク質形態のNK細胞-
特異的抗原を記載している。 糖タンパク質のPEN5α/PEN5β対のユニークエピトープは、好ましくは表現型C
D16+、 CD56dimの末梢血NK細胞の亜群によって発現される; それらは、CD3+ T
リンパ球又はCD20+ B リンパ球に存在しない。 これらの方法は、CD56+、CD16+ 成熟 NK 細胞又はPEN5、NKB1早熟NK 細胞を涸
渇させるが、移植後、移植片拒絶を引起こす成熟細胞に分化し得る始原細胞を涸
渇しない。 他の文献は、特異的なマーカーの欠落を追認している;例えば、E. Dominguez
らによる文献(Immunol., 1998, 94, 109-114)では、NK細胞に対するユニークな
マーカーがいまだ同定されておらず、通常は、それらがCD56を発現するという事
実によって識別されることが述べられている。
子量を有し、PEN5α及び PEN5βと示される、一対の糖タンパク質形態のNK細胞-
特異的抗原を記載している。 糖タンパク質のPEN5α/PEN5β対のユニークエピトープは、好ましくは表現型C
D16+、 CD56dimの末梢血NK細胞の亜群によって発現される; それらは、CD3+ T
リンパ球又はCD20+ B リンパ球に存在しない。 これらの方法は、CD56+、CD16+ 成熟 NK 細胞又はPEN5、NKB1早熟NK 細胞を涸
渇させるが、移植後、移植片拒絶を引起こす成熟細胞に分化し得る始原細胞を涸
渇しない。 他の文献は、特異的なマーカーの欠落を追認している;例えば、E. Dominguez
らによる文献(Immunol., 1998, 94, 109-114)では、NK細胞に対するユニークな
マーカーがいまだ同定されておらず、通常は、それらがCD56を発現するという事
実によって識別されることが述べられている。
【０００６】
まずNK細胞に対して、次に全てのリンパ系線始原細胞に対して特異的なマーカ
ーがないことは、この一連の文献から明らかである。 したがって、出願人は、特に骨髄移植前に、骨髄移植の拒絶及びGVHDを低下さ
せることを目的として、骨髄のリンパ系線前駆体細胞(プレ-NK、プレ-T 及びプ
レ-B細胞)及び成熟NK細胞を特に涸渇させるため、成熟NK細胞及びリンパ系線の
全ての未分化細胞に特異的なマーカーを提供することを目的とした。 実際、驚くべきことに、発明者らは、全てのリンパ始原線(プレ-T、プレ-B 及
びプレ-NK線)及び成熟NK細胞の双方に特異的なマーカーが存在することをここに
見出した。
ーがないことは、この一連の文献から明らかである。 したがって、出願人は、特に骨髄移植前に、骨髄移植の拒絶及びGVHDを低下さ
せることを目的として、骨髄のリンパ系線前駆体細胞(プレ-NK、プレ-T 及びプ
レ-B細胞)及び成熟NK細胞を特に涸渇させるため、成熟NK細胞及びリンパ系線の
全ての未分化細胞に特異的なマーカーを提供することを目的とした。 実際、驚くべきことに、発明者らは、全てのリンパ始原線(プレ-T、プレ-B 及
びプレ-NK線)及び成熟NK細胞の双方に特異的なマーカーが存在することをここに
見出した。
【０００７】
この発明の対象は、
- 全てのリンパ始原細胞と全ての成熟NK細胞の表面に存在し、
- 配列SEQ ID NO:2に対して、位置21〜152に局在する細胞外ドメイン、位置153
〜295に局在する5個のトランスメンブランドメイン及び位置296〜350に局在する
細胞質ドメインからなる構造(a)を有し、 - 約36〜38 kDaの見かけ分子量を有し、かつ - 構造(a)のN末端に20アミノ酸シグナル配列を含むその前駆体が、SEQ ID NO:2
のタンパク質、及び配列SEQ ID NO:2と少なくとも 70％の同一性又は少なくとも
85％の類似性、好ましくは少なくとも95％の同一性又は少なくとも 99％の類似
性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる群から選択される ことを特徴とする、単離されたタンパク質である。
〜295に局在する5個のトランスメンブランドメイン及び位置296〜350に局在する
細胞質ドメインからなる構造(a)を有し、 - 約36〜38 kDaの見かけ分子量を有し、かつ - 構造(a)のN末端に20アミノ酸シグナル配列を含むその前駆体が、SEQ ID NO:2
のタンパク質、及び配列SEQ ID NO:2と少なくとも 70％の同一性又は少なくとも
85％の類似性、好ましくは少なくとも95％の同一性又は少なくとも 99％の類似
性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる群から選択される ことを特徴とする、単離されたタンパク質である。
【０００８】
用語「前駆体」は、シグナル配列を含むタンパク質を意味する。
基準配列に対する配列の「同一性」は、互いに最大に一致するように2つの配
列をアラインした際に、同一のアミノ酸残基の割合の関数として評価する。 基準配列との同一性が少なくとも X%のアミノ酸配列を有するタンパク質は、
この発明において、配列が基準配列の100アミノ酸当り100-X個までの修飾を含み
うるタンパク質として定義される。この発明の目的のため、用語「修飾」は、基
準配列におけるアミノ酸の連続的な又は散在する欠失、置換もしくは挿入を含む
。 基準配列に対する配列の「類似性」は、互いに最大に一致するように2配列を
アラインした際に、同一であるか、又は同類置換によって異なるアミノ酸残基の
割合の関数として評価する。この発明の目的のため、用語「同類置換」は、ある
アミノ酸を、一般的にはタンパク質の機能特性を変えない、類似の化学特性(大
きさ、電荷又は極性)を有する別のアミノ酸で置換することを意味する。
列をアラインした際に、同一のアミノ酸残基の割合の関数として評価する。 基準配列との同一性が少なくとも X%のアミノ酸配列を有するタンパク質は、
この発明において、配列が基準配列の100アミノ酸当り100-X個までの修飾を含み
うるタンパク質として定義される。この発明の目的のため、用語「修飾」は、基
準配列におけるアミノ酸の連続的な又は散在する欠失、置換もしくは挿入を含む
。 基準配列に対する配列の「類似性」は、互いに最大に一致するように2配列を
アラインした際に、同一であるか、又は同類置換によって異なるアミノ酸残基の
割合の関数として評価する。この発明の目的のため、用語「同類置換」は、ある
アミノ酸を、一般的にはタンパク質の機能特性を変えない、類似の化学特性(大
きさ、電荷又は極性)を有する別のアミノ酸で置換することを意味する。
【０００９】
基準配列との類似性が少なくとも X%のアミノ酸配列を有するタンパク質は、
この発明で、配列が基準配列の100アミノ酸当り100-X個までの非保存修飾を含
み得るタンパク質として定義される。この発明の目的のため、用語「非保存修飾
」は、基準配列におけるアミノ酸の連続的な又は散在する欠失、非保存置換又は
挿入を含む。 幾つかの文献は、この発明によるタンパク質とあるホモロジーを有するタンパ
ク質を記載している: - PCT出願WO 98/39448 (Human Genome Sciences Inc)は、潜在的に分泌タンパ
ク質(核酸配列: SEQ ID NO:187、ペプチド配列: SEQ ID NO:489)をエンコードす
る、遺伝子177、クローンHE9CM64を記載している; しかし、mRNAは、脳に、より
少量で腎臓、胎盤、平滑筋、心臓及び肺に認められるにすぎない。mRNAで潜在的
にエンコードされるタンパク質は単離されておらず、変化し得るN-及びC-末端で
明らかにされていない実際の機能はこのタンパク質に伴っていない。
み得るタンパク質として定義される。この発明の目的のため、用語「非保存修飾
」は、基準配列におけるアミノ酸の連続的な又は散在する欠失、非保存置換又は
挿入を含む。 幾つかの文献は、この発明によるタンパク質とあるホモロジーを有するタンパ
ク質を記載している: - PCT出願WO 98/39448 (Human Genome Sciences Inc)は、潜在的に分泌タンパ
ク質(核酸配列: SEQ ID NO:187、ペプチド配列: SEQ ID NO:489)をエンコードす
る、遺伝子177、クローンHE9CM64を記載している; しかし、mRNAは、脳に、より
少量で腎臓、胎盤、平滑筋、心臓及び肺に認められるにすぎない。mRNAで潜在的
にエンコードされるタンパク質は単離されておらず、変化し得るN-及びC-末端で
明らかにされていない実際の機能はこのタンパク質に伴っていない。
【００１０】
- PCT国際出願 WO 98/25959(Chiron Corp.) とWO 99/31236 (Genset)、また No
. Q9Y3U9でSWALL DATABASEにアクセス可能な配列に関する情報、又はNo. AW1064
27で EMEST DATABASEにアクセス可能な配列に関する情報は、配列SEQ ID NO:2の
フラグメントとホモロジーを有する配列フラグメントを記載している;しかし、
係属中の出願では、ホモロジーは完全な配列SEQ ID NO:2に対して明らかにされ
ている;さらに、これらの文献は、初期リンパ系線始原細胞及び成熟NK細胞に対
する表面マーカーであるタンパク質を全く開示していない。 具体的には、この発明によるタンパク質は以下の特性を有する: - 極めて初期の始原細胞から成熟細胞毒性細胞までにわたるNK細胞の分化線(di
fferentiation line)の細胞、及びリンパ系線の他の初期始原細胞(プレ-B及びプ
レ-T)の表面に存在する、 - 還元条件下12%ゲルのSDS-PAGE電気泳動によって測定される約 36〜38 kDaの
見かけ分子量を有する、 - 少なくとも 配列SEQ ID NO:6、7 又は24を有する細胞外ドメインを含む、及
び - 細胞外ドメイン、5個のトランスメンブランドメイン及び細胞質ドメインから
なる構造を有する;式SEQ ID NO:25 を有するタンパク質(330アミノ酸からなるヒ
トタンパク質)、及び細胞外ドメインが配列SEQ ID NO:6、7 又は24のフラグメン
トからなる他の哺乳動物タンパク質からなる群から選択することが好ましい。
. Q9Y3U9でSWALL DATABASEにアクセス可能な配列に関する情報、又はNo. AW1064
27で EMEST DATABASEにアクセス可能な配列に関する情報は、配列SEQ ID NO:2の
フラグメントとホモロジーを有する配列フラグメントを記載している;しかし、
係属中の出願では、ホモロジーは完全な配列SEQ ID NO:2に対して明らかにされ
ている;さらに、これらの文献は、初期リンパ系線始原細胞及び成熟NK細胞に対
する表面マーカーであるタンパク質を全く開示していない。 具体的には、この発明によるタンパク質は以下の特性を有する: - 極めて初期の始原細胞から成熟細胞毒性細胞までにわたるNK細胞の分化線(di
fferentiation line)の細胞、及びリンパ系線の他の初期始原細胞(プレ-B及びプ
レ-T)の表面に存在する、 - 還元条件下12%ゲルのSDS-PAGE電気泳動によって測定される約 36〜38 kDaの
見かけ分子量を有する、 - 少なくとも 配列SEQ ID NO:6、7 又は24を有する細胞外ドメインを含む、及
び - 細胞外ドメイン、5個のトランスメンブランドメイン及び細胞質ドメインから
なる構造を有する;式SEQ ID NO:25 を有するタンパク質(330アミノ酸からなるヒ
トタンパク質)、及び細胞外ドメインが配列SEQ ID NO:6、7 又は24のフラグメン
トからなる他の哺乳動物タンパク質からなる群から選択することが好ましい。
【００１１】
したがって、KLIP-1 抗原と命名される表面の分子又はタンパク質は、極めて
初期の始原細胞から細胞毒性成熟細胞までにわたるNK細胞分化線、またリンパ線
の他の初期始原細胞(プレ-B及びプレ-T)に特異的に存在する。 ヒトSEQ ID NO:2に対して、アミノ酸1-20はシグナル配列に一致し;アミノ酸21
-152 (ヒトSEQ ID NO:7; マウスSEQ ID NO:24; ブタ SEQ ID NO:6)は細胞外ドメ
インに一致し; アミノ酸153-295 (SEQ ID NO:8)は5個のトランスメンブランドメ
イン(143アミノ酸) に一致し、アミノ酸296-350 (SEQ ID NO:9)は細胞質ドメイ
ン(54アミノ酸)に一致する。 以下の細胞が、KLIP-1+である: .骨髄、臍帯及び胎児肝のCD34+、CD38- 初期造血始原細胞、 .CD34+、CD38+ 分化始原細胞 .CD4+、CD8+ プレ-T 始原細胞 (新生児胸腺) .CD19+、CD10-、CD20- プレ-B 始原細胞 .CD56+、CD16+、CD19-、CD3-、D33- 成熟NK細胞。
初期の始原細胞から細胞毒性成熟細胞までにわたるNK細胞分化線、またリンパ線
の他の初期始原細胞(プレ-B及びプレ-T)に特異的に存在する。 ヒトSEQ ID NO:2に対して、アミノ酸1-20はシグナル配列に一致し;アミノ酸21
-152 (ヒトSEQ ID NO:7; マウスSEQ ID NO:24; ブタ SEQ ID NO:6)は細胞外ドメ
インに一致し; アミノ酸153-295 (SEQ ID NO:8)は5個のトランスメンブランドメ
イン(143アミノ酸) に一致し、アミノ酸296-350 (SEQ ID NO:9)は細胞質ドメイ
ン(54アミノ酸)に一致する。 以下の細胞が、KLIP-1+である: .骨髄、臍帯及び胎児肝のCD34+、CD38- 初期造血始原細胞、 .CD34+、CD38+ 分化始原細胞 .CD4+、CD8+ プレ-T 始原細胞 (新生児胸腺) .CD19+、CD10-、CD20- プレ-B 始原細胞 .CD56+、CD16+、CD19-、CD3-、D33- 成熟NK細胞。
【００１２】
このKLIP-1抗原が最も初期の始原細胞と分化始原細胞及び成熟NK細胞のいずれ
にも存在するという事実から、抗-KLIP-1抗体の存在下で骨髄のNK-細胞涸渇を生
じさせ、移植片拒絶についてのより良い予防と、自己免疫疾患に対する潜在的な
治療を行うことができる。 上記の KLIP-1 抗原は、NK細胞(初期及び成熟)に特異的なマーカー、特に成
熟細胞に特異的なマーカーであると考えられる。というのは、末梢血では、リン
パ系線の他の細胞(成熟B細胞及びT細胞)は、このような抗原を示さないからであ
る。
にも存在するという事実から、抗-KLIP-1抗体の存在下で骨髄のNK-細胞涸渇を生
じさせ、移植片拒絶についてのより良い予防と、自己免疫疾患に対する潜在的な
治療を行うことができる。 上記の KLIP-1 抗原は、NK細胞(初期及び成熟)に特異的なマーカー、特に成
熟細胞に特異的なマーカーであると考えられる。というのは、末梢血では、リン
パ系線の他の細胞(成熟B細胞及びT細胞)は、このような抗原を示さないからであ
る。
【００１３】
また、この発明の対象は、タンパク質の細胞外ドメインについて7〜132個の連
続的なアミノ酸を含むフラグメント、タンパク質のトランスメンブランドメイン
内に含まれる7〜143個の連続的なアミノ酸からなるフラグメント、及びタンパク
質の細胞質ドメインに含まれる7〜54個の連続的なアミノ酸からなるフラグメン
ト及び配列SEQ ID NO:4のフラグメントからなる群から選択されることを特徴と
するタンパク質のフラグメントである; フラグメントのうち、配列SEQ ID NO:6
、7、8、9 及び24が挙げられる。 この発明の対象は、ヒト又は動物由来の、上記のようなタンパク質又はそのフ
ラグメントをエンコードする単離された核酸配列(特に、cDNA配列)、また相補的
な核酸配列である。
続的なアミノ酸を含むフラグメント、タンパク質のトランスメンブランドメイン
内に含まれる7〜143個の連続的なアミノ酸からなるフラグメント、及びタンパク
質の細胞質ドメインに含まれる7〜54個の連続的なアミノ酸からなるフラグメン
ト及び配列SEQ ID NO:4のフラグメントからなる群から選択されることを特徴と
するタンパク質のフラグメントである; フラグメントのうち、配列SEQ ID NO:6
、7、8、9 及び24が挙げられる。 この発明の対象は、ヒト又は動物由来の、上記のようなタンパク質又はそのフ
ラグメントをエンコードする単離された核酸配列(特に、cDNA配列)、また相補的
な核酸配列である。
【００１４】
これらの配列には、以下が挙げられる:
- 配列SEQ ID NO:1 を有し、1501 bp からなる、ヒトKLIP-1抗原をエンコード
するcDNA; それは、第6染色体に、領域6p21.2-6p21.1で局在するklip-1遺伝子か
ら得られる; - 配列SEQ ID NO:1 の116〜1165塩基のあいだのヒトKLIP-1 タンパク質をエン
コードする配列(SEQ ID NO:10); - ヒト(SEQ ID NO:11)、マウス(SEQ ID NO:3 及び SEQ ID NO:23) 又はブタ(SE
Q ID NO:5)のKLIP-1 タンパク質の細胞外ドメインをエンコードする配列; - ヒトKLIP-1タンパク質のトランスメンブランドメインをエンコードする配列
(SEQ ID NO:12); 5個のトランスメンブランヘリックスの位置は153-169、181-20
9; 218-237、243-261 及び275-295である; 及び - ヒトのKLIP-1タンパク質の細胞質ドメインをエンコードする配列(SEQ ID NO:
13)。
するcDNA; それは、第6染色体に、領域6p21.2-6p21.1で局在するklip-1遺伝子か
ら得られる; - 配列SEQ ID NO:1 の116〜1165塩基のあいだのヒトKLIP-1 タンパク質をエン
コードする配列(SEQ ID NO:10); - ヒト(SEQ ID NO:11)、マウス(SEQ ID NO:3 及び SEQ ID NO:23) 又はブタ(SE
Q ID NO:5)のKLIP-1 タンパク質の細胞外ドメインをエンコードする配列; - ヒトKLIP-1タンパク質のトランスメンブランドメインをエンコードする配列
(SEQ ID NO:12); 5個のトランスメンブランヘリックスの位置は153-169、181-20
9; 218-237、243-261 及び275-295である; 及び - ヒトのKLIP-1タンパク質の細胞質ドメインをエンコードする配列(SEQ ID NO:
13)。
【００１５】
また、この発明の対象は、上記のような少なくとも 8bpの種々のcDNA配列から
なることを特徴とする、核酸フラグメントである。このようなフラグメントは、
例えば配列 SEQ ID NO:16-20の増幅又は逆転写のためのプローブもしくはプライ
マーとして特に使用できる。 また、この発明の対象は、極めて初期の始原細胞から細胞毒性成熟細胞にわた
るNK細胞の分化線、及びリンパ系腺の他の初期始原細胞(プレ-B及びプレ-T) に
特異的な、この発明によるKLIP-1 表面抗原、又はこの抗原フラグメントを特異
的に認識することを特徴とする抗体である。 この抗体の有利な具体例によれば、それらは、KLIP-1抗原の上記領域の1つ、
好ましくはKLIP-1 タンパク質の細胞外ドメインに対する。
なることを特徴とする、核酸フラグメントである。このようなフラグメントは、
例えば配列 SEQ ID NO:16-20の増幅又は逆転写のためのプローブもしくはプライ
マーとして特に使用できる。 また、この発明の対象は、極めて初期の始原細胞から細胞毒性成熟細胞にわた
るNK細胞の分化線、及びリンパ系腺の他の初期始原細胞(プレ-B及びプレ-T) に
特異的な、この発明によるKLIP-1 表面抗原、又はこの抗原フラグメントを特異
的に認識することを特徴とする抗体である。 この抗体の有利な具体例によれば、それらは、KLIP-1抗原の上記領域の1つ、
好ましくはKLIP-1 タンパク質の細胞外ドメインに対する。
【００１６】
この発明によれば、抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のい
ずれかである。 加えて、抗-KLIP-1抗体は、リンパ系線始原細胞(プレ-B 及びプレ-T)を枯渇さ
せることもできる。 骨髄移植では、この発明による抗体、フラグメント及び誘導体を用いて、ドナ
ーの骨髄を被移植者の骨髄に移植する前に、ex vivoで骨髄のKLIP-1+ 細胞を涸
渇させてもよい。 現在、初期NK細胞に対するマーカーは存在しない: したがって、KLIP-1は、完
全なNK細胞分化線及び他の初期リンパ系線の双方に存在する第一マーカーとなる
。
ずれかである。 加えて、抗-KLIP-1抗体は、リンパ系線始原細胞(プレ-B 及びプレ-T)を枯渇さ
せることもできる。 骨髄移植では、この発明による抗体、フラグメント及び誘導体を用いて、ドナ
ーの骨髄を被移植者の骨髄に移植する前に、ex vivoで骨髄のKLIP-1+ 細胞を涸
渇させてもよい。 現在、初期NK細胞に対するマーカーは存在しない: したがって、KLIP-1は、完
全なNK細胞分化線及び他の初期リンパ系線の双方に存在する第一マーカーとなる
。
【００１７】
また、この発明の対象は、
- 生物学的試料を、極めて初期の始原細胞から細胞毒性成熟細胞までにわたる
、NK細胞分化線及びリンパ系線の他の初期始原細胞(プレ-B 及びプレ-T)に特異
的な、この発明による表面分子、又はこの分子フラグメントに対する抗体と接触
させ、かつ - 抗体に結合する細胞を除くこと からなる、異種細胞群からなる生物学的試料からKLIP-1+ 細胞を選択的に除く方
法である。 この方法の有利な具体例によれば、抗体は、磁気ビーズ又は他の免疫吸着支持
体(例えばCNBr セファロース)のような固体支持体に結合される。
、NK細胞分化線及びリンパ系線の他の初期始原細胞(プレ-B 及びプレ-T)に特異
的な、この発明による表面分子、又はこの分子フラグメントに対する抗体と接触
させ、かつ - 抗体に結合する細胞を除くこと からなる、異種細胞群からなる生物学的試料からKLIP-1+ 細胞を選択的に除く方
法である。 この方法の有利な具体例によれば、抗体は、磁気ビーズ又は他の免疫吸着支持
体(例えばCNBr セファロース)のような固体支持体に結合される。
【００１８】
この具体例によれば、細胞表面にKLIP-1抗原を含む細胞の生物学的試料、特に
骨髄、臍帯血又は胎児肝を涸渇させるために、これらの細胞は、抗-KLIP-1抗体
、好ましくはKLIP-1タンパク質の細胞外ドメインに対する抗体で被覆した免疫磁
気ビーズに結合される。 有利には、方法は、胎児肝、臍帯血、胎児、新生児もしくは成体の骨髄又は末
梢血に由来するヒト細胞混合物を用いて、生物学的試料のヒトの成熟又は始原NK
細胞を豊富にするために行ってもよい。 また、この発明の対象は、移植可能な製品を製造するために、上記の方法を用
いて得られる、NK細胞及び/又はリンパ始原細胞の涸渇した、骨髄、臍帯血、胎
児肝又は何れかの他の胎児もしくは成体の造血組織の細胞の使用である。
骨髄、臍帯血又は胎児肝を涸渇させるために、これらの細胞は、抗-KLIP-1抗体
、好ましくはKLIP-1タンパク質の細胞外ドメインに対する抗体で被覆した免疫磁
気ビーズに結合される。 有利には、方法は、胎児肝、臍帯血、胎児、新生児もしくは成体の骨髄又は末
梢血に由来するヒト細胞混合物を用いて、生物学的試料のヒトの成熟又は始原NK
細胞を豊富にするために行ってもよい。 また、この発明の対象は、移植可能な製品を製造するために、上記の方法を用
いて得られる、NK細胞及び/又はリンパ始原細胞の涸渇した、骨髄、臍帯血、胎
児肝又は何れかの他の胎児もしくは成体の造血組織の細胞の使用である。
【００１９】
この発明の対象は、
- この発明による、KLIP-1タンパク質又はこのタンパク質のフラグメントに対
する抗体と異種細胞群からなる生物学的試料を接触させ、かつ - 特に標準的な免疫学的方法を用いて細胞-抗体複合体の形成を検出する ことからなるのを特徴とする、異種細胞群におけるNK細胞及び/又はリンパ細胞
始原細胞(プレ-B、プレ-T及びプレ-NK)の検出及び/又は定量及び/又は単離方法
である。 この方法の有利な具体例によれば、試料が骨髄、臍帯血、胎児肝又はいずれか
の他の造血組織(胎児又は成体)からなるときは、抗体と複合体を形成した細胞を
、プレ-B細胞に特異的な抗体(抗-CD19抗体又は抗-CD10抗体)及び/又はプレ-T 細
胞に特異的な抗体(抗-CD3 抗体、抗-CD4抗体又は抗-CD8抗体)と接触させてもよ
い。
する抗体と異種細胞群からなる生物学的試料を接触させ、かつ - 特に標準的な免疫学的方法を用いて細胞-抗体複合体の形成を検出する ことからなるのを特徴とする、異種細胞群におけるNK細胞及び/又はリンパ細胞
始原細胞(プレ-B、プレ-T及びプレ-NK)の検出及び/又は定量及び/又は単離方法
である。 この方法の有利な具体例によれば、試料が骨髄、臍帯血、胎児肝又はいずれか
の他の造血組織(胎児又は成体)からなるときは、抗体と複合体を形成した細胞を
、プレ-B細胞に特異的な抗体(抗-CD19抗体又は抗-CD10抗体)及び/又はプレ-T 細
胞に特異的な抗体(抗-CD3 抗体、抗-CD4抗体又は抗-CD8抗体)と接触させてもよ
い。
【００２０】
この発明の対象は、自己免疫疾患の治療における上記抗体の使用でもある。
また、この発明の対象は、上記核酸配列を検出することからなることを特徴と
する、生物学的試料における良性及び悪性の血液疾患の診断方法である。 具体的には、KLIP-1 遺伝子の発現調節及び/又は該遺伝子配列の突然変異の
測定により、血液病を診断することができる。 また、この発明の対象は、検出を行うのに適した有用な量の緩衝液に加えて、
免疫吸着固体支持体に任意に接合した、この発明によるKLIP-1 抗原又はこの抗
原のフラグメントに対する適当な用量の抗体及び形成される可能性のある細胞-
抗体複合体を示す適当な用量の試薬からなることを特徴とする、NK細胞及び/又
はリンパ球様細胞始原(プレ-B、プレ-T 及びプレ-NK)の検出及び/又は定量及び/
又は単離のためのキットである。
する、生物学的試料における良性及び悪性の血液疾患の診断方法である。 具体的には、KLIP-1 遺伝子の発現調節及び/又は該遺伝子配列の突然変異の
測定により、血液病を診断することができる。 また、この発明の対象は、検出を行うのに適した有用な量の緩衝液に加えて、
免疫吸着固体支持体に任意に接合した、この発明によるKLIP-1 抗原又はこの抗
原のフラグメントに対する適当な用量の抗体及び形成される可能性のある細胞-
抗体複合体を示す適当な用量の試薬からなることを特徴とする、NK細胞及び/又
はリンパ球様細胞始原(プレ-B、プレ-T 及びプレ-NK)の検出及び/又は定量及び/
又は単離のためのキットである。
【００２１】
また、この発明の対象は、上記のような細胞外ドメインの少なくとも 7個の連
続的なアミノ酸からなるこの発明によるタンパク質フラグメントの、NK細胞検出
用試薬としての使用である。 上記の例のほかに、この発明は、この発明の対象である方法の実施例及び添付
図面に言及する以下の記載から明らかになるであろう他の例も含む。
続的なアミノ酸からなるこの発明によるタンパク質フラグメントの、NK細胞検出
用試薬としての使用である。 上記の例のほかに、この発明は、この発明の対象である方法の実施例及び添付
図面に言及する以下の記載から明らかになるであろう他の例も含む。
【００２２】
- 図1は、RNA 示差ディスプレイ(RDD)を示す;この図で、レーン1は卵黄嚢に相
当し、レーン2-5は胎児肝に相当し、かつレーン6はコントロールに相当する; - 図2は、ヒトKLIP-1 ヌクレオチド及びタンパク質の配列を示す; 図2'は、ト
ランスメンブラン部位についてのモデルを示す; - 図3は、KLIP-1遺伝子の染色体位置を示す; - 図4は、ヒトKLIP-1タンパク質(12 kDa)の細胞外ドメインからなる融合タンパ
ク質の発現の誘導を示す； - 図5は、KLIP-1+ 及び KLIP-1- 群におけるウエスタンブロットを示す; - 図6は、インビトロで転写され、翻訳されたタンパク質の免疫沈降を示す; - 図7は、成熟血細胞のみを含む、末梢血におけるKLIP-1+ 細胞の分布を示す;
当し、レーン2-5は胎児肝に相当し、かつレーン6はコントロールに相当する; - 図2は、ヒトKLIP-1 ヌクレオチド及びタンパク質の配列を示す; 図2'は、ト
ランスメンブラン部位についてのモデルを示す; - 図3は、KLIP-1遺伝子の染色体位置を示す; - 図4は、ヒトKLIP-1タンパク質(12 kDa)の細胞外ドメインからなる融合タンパ
ク質の発現の誘導を示す； - 図5は、KLIP-1+ 及び KLIP-1- 群におけるウエスタンブロットを示す; - 図6は、インビトロで転写され、翻訳されたタンパク質の免疫沈降を示す; - 図7は、成熟血細胞のみを含む、末梢血におけるKLIP-1+ 細胞の分布を示す;
【００２３】
- 図8は、大部分の成熟血球のみならず、小さな画分の未熟細胞を含む、臍帯血
におけるKLIP-1+ 細胞の分布を示す; - 図9は、血球の分化が生じる造血部位である骨髄でのKLIP-1+ 細胞の分布を示
す; - 図10は、胚肝臓でのKLIP-1+ 細胞の分布を示す(6週); - 図11は、新生児の胸腺におけるKLIP-1+ 細胞の分布を示す; - 図12は、NK細胞及びKLIP-1+で精製したNK群(標的細胞)の細胞溶解特性を示す
; - 図13は、ブタの末梢血におけるKLIP-1+ 細胞の分布を示す; かつ - 図14は、NK細胞であると考えられるマウスの脾細胞におけるKLIP-1+ 細胞の
分布を示す(NK 1.1 抗体(Pharmingen)との複合体の形成)。
におけるKLIP-1+ 細胞の分布を示す; - 図9は、血球の分化が生じる造血部位である骨髄でのKLIP-1+ 細胞の分布を示
す; - 図10は、胚肝臓でのKLIP-1+ 細胞の分布を示す(6週); - 図11は、新生児の胸腺におけるKLIP-1+ 細胞の分布を示す; - 図12は、NK細胞及びKLIP-1+で精製したNK群(標的細胞)の細胞溶解特性を示す
; - 図13は、ブタの末梢血におけるKLIP-1+ 細胞の分布を示す; かつ - 図14は、NK細胞であると考えられるマウスの脾細胞におけるKLIP-1+ 細胞の
分布を示す(NK 1.1 抗体(Pharmingen)との複合体の形成)。
【００２４】
しかし、これらの実施例が、この発明の対象を例示するものに過ぎず、いかな
る方法でもそれを限定するものではないことは、明らかに理解されるべきである
。実施例 : - 細胞及び組織の方法 ヒトの胚組織を、フランスの立法にしたがって、妊娠終期のボランティアから
得た。計画は地元の倫理学委員会により承認され、全ての母親から事前のインフ
ォームドコンセントが得られた。それぞれの胚の(妊娠期間の)発達段階は、解剖
学的基準により決定した。卵黄嚢、内臓葉(AGM領域)を有する背動脈及び肝臓を
双眼レンズ下で切開し、RNAの抽出用にすぐに調製するか、あるいは液体窒素で
凍結し、-80℃で保存した。胚の発達段階が多岐にわたるために、切開した組織
を個別に処理し、混合しなかった。 臍帯血は、月満ちて生まれた直後の健康状態が良好(健康)な新生児から、母親
の同意を得て回収した。 骨髄及び末梢血は、正常な大人のドナーから施設のガイドラインにしたがって
回収した。単核細胞は、標準的な条件下、フィコール-ハイパック勾配の遠心分
離で得た。正常な出生直後の胸腺細胞は、心臓矯正手術(heart-correcting oper
ation)中に得た胸腺片から溶出して単離した。サイトフローメトリー分析のため
に、単核細胞を新鮮なまま用いるかあるいは凍結させた。
る方法でもそれを限定するものではないことは、明らかに理解されるべきである
。実施例 : - 細胞及び組織の方法 ヒトの胚組織を、フランスの立法にしたがって、妊娠終期のボランティアから
得た。計画は地元の倫理学委員会により承認され、全ての母親から事前のインフ
ォームドコンセントが得られた。それぞれの胚の(妊娠期間の)発達段階は、解剖
学的基準により決定した。卵黄嚢、内臓葉(AGM領域)を有する背動脈及び肝臓を
双眼レンズ下で切開し、RNAの抽出用にすぐに調製するか、あるいは液体窒素で
凍結し、-80℃で保存した。胚の発達段階が多岐にわたるために、切開した組織
を個別に処理し、混合しなかった。 臍帯血は、月満ちて生まれた直後の健康状態が良好(健康)な新生児から、母親
の同意を得て回収した。 骨髄及び末梢血は、正常な大人のドナーから施設のガイドラインにしたがって
回収した。単核細胞は、標準的な条件下、フィコール-ハイパック勾配の遠心分
離で得た。正常な出生直後の胸腺細胞は、心臓矯正手術(heart-correcting oper
ation)中に得た胸腺片から溶出して単離した。サイトフローメトリー分析のため
に、単核細胞を新鮮なまま用いるかあるいは凍結させた。
【００２５】
- RNA示差ディスプレイ(RDD)、クローニング及びシーケンシング
全mRNAは、製造者の推薦にしたがって、RNA NOW試薬(Ozyme, France)を用いて
調べた組織(新鮮なもの又は凍結したもの)から抽出し、37℃で1時間RNAse-フリ
ーDNAseI (Boehringer Mannheim, Meylan, France)で処理し、エタノールで沈澱
させた。RNAの質を、1.5% アガロース変性ゲルでの電気泳動により確認した。cD
NAは、3' アンカープライマーとしての5'T11XY (X=A, G 又はC; Y=A, T, G 又は
C) (SEQ ID NO:14)及びM-MLVリバーストランスクリプターゼ(GIBCO-BRL, Life
Technologies, Cergy, France)の存在下、42℃で1時間、5μgの全RNAから調製し
た。リバースPCRによる増幅は、5μCiの[α32P]-dCTP (Amersham France, Les U
lis, France)の存在下、同じ3'アンカープライマー(アンチセンスプライマー)と
5'における10個の任意のヌクレオチド(センスプライマー)で行った。図1に示し
た結果は、以下のプライマーを用いて得られた: 5'-T11GG (SEQ ID NO:14) 及び
5'-GTTGCGATCC (SEQ ID NO:15)。PCR生成物は、シーケンシング停止緩衝液中で8
0℃で3分熱変性させ、6%ポリアクリルアミド変性ゲルでの電気泳動により分離し
た。ゲルを固定せずに3MM Whatmanろ紙上で乾燥させ、16時間Kodak Biomax フィ
ルム(Amersham France, Les Ulis, France)に曝した。
調べた組織(新鮮なもの又は凍結したもの)から抽出し、37℃で1時間RNAse-フリ
ーDNAseI (Boehringer Mannheim, Meylan, France)で処理し、エタノールで沈澱
させた。RNAの質を、1.5% アガロース変性ゲルでの電気泳動により確認した。cD
NAは、3' アンカープライマーとしての5'T11XY (X=A, G 又はC; Y=A, T, G 又は
C) (SEQ ID NO:14)及びM-MLVリバーストランスクリプターゼ(GIBCO-BRL, Life
Technologies, Cergy, France)の存在下、42℃で1時間、5μgの全RNAから調製し
た。リバースPCRによる増幅は、5μCiの[α32P]-dCTP (Amersham France, Les U
lis, France)の存在下、同じ3'アンカープライマー(アンチセンスプライマー)と
5'における10個の任意のヌクレオチド(センスプライマー)で行った。図1に示し
た結果は、以下のプライマーを用いて得られた: 5'-T11GG (SEQ ID NO:14) 及び
5'-GTTGCGATCC (SEQ ID NO:15)。PCR生成物は、シーケンシング停止緩衝液中で8
0℃で3分熱変性させ、6%ポリアクリルアミド変性ゲルでの電気泳動により分離し
た。ゲルを固定せずに3MM Whatmanろ紙上で乾燥させ、16時間Kodak Biomax フィ
ルム(Amersham France, Les Ulis, France)に曝した。
【００２６】
2つの個々の増幅で規則的に異なると思われるバンドを切り出し、ゲルから溶
出し、同じ反応条件下で再増幅し(35サイクル)、2%アガロースゲル上で分析し、
ベクターpCRII (TA Cloning Kit, Invitrogen, Leek, The Netherlands)にクロ
ーンした。最低40個の個々の組換え体(白色)コロニーを回収し、インサートの有
無を、ベクター由来のフランキングプライマーを用いるPCRで試験した。幾つか
の組換えプラスミドをミニプレップで増幅し、Qiagen キット(Qiagen, Courtabo
euf, France)を用いて精製し、次いで[α32P]-dCTPで放射線標識した。これらの
プラスミドをプローブとして用いて、同様のクローンを除いた。重複していない
クローンを、製造者のプロトコル(US Biochemicals, Cleveland, OH)にしたがっ
て、シーケナーゼ(登録商標)2.0及びベクター由来のフランキングプライマーの
存在下、ジデオキシヌクレオチドを用いる酵素方法(サンガー法)を用いて手動で
シークエンスした。配列ホモロジーの検索は、GenBank 及びEMBLデータベース上
でINFOBIOGEN/BLAST (http://www.infobiogen.fr)を介して行った。
出し、同じ反応条件下で再増幅し(35サイクル)、2%アガロースゲル上で分析し、
ベクターpCRII (TA Cloning Kit, Invitrogen, Leek, The Netherlands)にクロ
ーンした。最低40個の個々の組換え体(白色)コロニーを回収し、インサートの有
無を、ベクター由来のフランキングプライマーを用いるPCRで試験した。幾つか
の組換えプラスミドをミニプレップで増幅し、Qiagen キット(Qiagen, Courtabo
euf, France)を用いて精製し、次いで[α32P]-dCTPで放射線標識した。これらの
プラスミドをプローブとして用いて、同様のクローンを除いた。重複していない
クローンを、製造者のプロトコル(US Biochemicals, Cleveland, OH)にしたがっ
て、シーケナーゼ(登録商標)2.0及びベクター由来のフランキングプライマーの
存在下、ジデオキシヌクレオチドを用いる酵素方法(サンガー法)を用いて手動で
シークエンスした。配列ホモロジーの検索は、GenBank 及びEMBLデータベース上
でINFOBIOGEN/BLAST (http://www.infobiogen.fr)を介して行った。
【００２７】
- PCR-RDDによる胚の造血組織由来KLIP-1 cDNA (クローンNo. 36-16)の単離
ヒトの胚発生中の遺伝子のプロフィル発現を研究した。32日目のYS (卵黄嚢)
及び27日目から49日目までの FL (胎児肝)で示差的に発現される転写物を、PCR-
RDD技術を用いて調べた。クローン36-16をRDDゲルから単離し、その示差的な発
現を、25日目に強力な発現(卵黄嚢)、32日目に弱い発現(卵黄嚢)及び28日目に強
力な発現[AGM (大動脈-性腺-中腎領域)]、28日目(胎児肝)に、続いて後期段階の
発現の低下(胎児肝)により確認した。
及び27日目から49日目までの FL (胎児肝)で示差的に発現される転写物を、PCR-
RDD技術を用いて調べた。クローン36-16をRDDゲルから単離し、その示差的な発
現を、25日目に強力な発現(卵黄嚢)、32日目に弱い発現(卵黄嚢)及び28日目に強
力な発現[AGM (大動脈-性腺-中腎領域)]、28日目(胎児肝)に、続いて後期段階の
発現の低下(胎児肝)により確認した。
【００２８】
- 完全なcDNAのクローニング及び推定されるタンパク質の解析
ベクター pACT2におけるヒトの肺cDNAライブラリー(Plasmid MATCHMAKER Libr
ary, Clontech, Paris, France)を用いた。36-16 cDNAクローンは、Hybond N+ナ
イロン膜でのハイブリダイゼーション用プローブとしての32P-ラベル化255 bp 3
6-16インサートを用いて、1×106個のcDNAライブラリーコロニーをスクリーニン
グして得られた。陽性のクローンは、ベクター由来のフランキングプライマーを
用いるPCRで試験し、放射線標識した36-16インサートでのハイブリダイゼーショ
ンにより確認された。2つのクローンは陽性のハイブリダイゼーションシグナル
と、ノーザンブロッティングの結果に一致する、約1600 pbの適当な大きさを示
した。それらの1つを、蛍光ターミネーター及びApplied Biosystems ABI シーケ
ンサー(Pharmacia, Orsay, France)を用いてサンガー法でシーケンスした。
ary, Clontech, Paris, France)を用いた。36-16 cDNAクローンは、Hybond N+ナ
イロン膜でのハイブリダイゼーション用プローブとしての32P-ラベル化255 bp 3
6-16インサートを用いて、1×106個のcDNAライブラリーコロニーをスクリーニン
グして得られた。陽性のクローンは、ベクター由来のフランキングプライマーを
用いるPCRで試験し、放射線標識した36-16インサートでのハイブリダイゼーショ
ンにより確認された。2つのクローンは陽性のハイブリダイゼーションシグナル
と、ノーザンブロッティングの結果に一致する、約1600 pbの適当な大きさを示
した。それらの1つを、蛍光ターミネーター及びApplied Biosystems ABI シーケ
ンサー(Pharmacia, Orsay, France)を用いてサンガー法でシーケンスした。
【００２９】
- 完全なKLIP-1 cDNA (36-16) 及び推定タンパク質の特徴づけ
完全なcDNAは1501 bpからなり、115 bp の5' UTRと333 bpの3' UTR を有する1
050 bp の単一のオープンリーディングフレームを有する。これは、38.2 kDa の
分子量を有し、KLIP-1と称される350アミノ酸タンパク質と推定される (図2)。
KLIP-1 配列の疎水性解析は、5個の強力なTMヘリックスを示唆している(図2')。 つまり、KLIP-1タンパク質は、1〜20のシグナルペプチドアミノ酸(aa)、132 aa
(21 〜152aa)の細胞外ドメイン、143 aa (153-295 aa)の5個のTMドメイン及び5
4 aa (296〜350aa)のC-末端細胞質テールを有する。
050 bp の単一のオープンリーディングフレームを有する。これは、38.2 kDa の
分子量を有し、KLIP-1と称される350アミノ酸タンパク質と推定される (図2)。
KLIP-1 配列の疎水性解析は、5個の強力なTMヘリックスを示唆している(図2')。 つまり、KLIP-1タンパク質は、1〜20のシグナルペプチドアミノ酸(aa)、132 aa
(21 〜152aa)の細胞外ドメイン、143 aa (153-295 aa)の5個のTMドメイン及び5
4 aa (296〜350aa)のC-末端細胞質テールを有する。
【００３０】
- RH (放射線ハイブリッド)染色体マッピング
cDNAクローンは、ハムスター-ヒトキメラ由来の93クローンを含む、GeneBridg
e4 全ゲノム放射線ハイブリッド(RH)パネル(Research Genetics, Huntsville, A
L)に対してPCRによりスクリーンした。各クローンを、以下の条件下: 10サイク
ルについて、94℃、45秒; 61℃、1分; 72℃、45秒、及び30サイクルについて94
℃、45秒; 58℃、1分; 72℃、45秒、72℃で10分のインキュベーションによる終
結で、3' UTR: 1265F (5'-ACCCCACCTGAAATTCTTGG) (SEQ ID NO:16) 及び1522R (
5'-GAGATAAAGAGGAAGGAAGG) (SEQ ID NO:17)に特異的な2つのプライマーを用いる
2つの独立PCR増幅で個々に試験した。 PCR生成物及びヒト(陽性)又はハムスター
(陰性)コントロールのDNAを含むサザンブロットを、32P-ラベル化特異的内部プ
ローブでハイブリダイズし、ストリンジェントな条件、60℃で0.2X SSC + 0.2%
SDS で洗浄し、次いで16時間Kodak Biomax フィルムに曝した。単一の特異的な
ヒトのバンドが、257bpの予定された大きさに認められた。スクリーニングプロ
フィルから誘導されるハイブリダイゼーションデータは、Genome Research RH M
apper Server (http://www.genome.wi.mit.edu)用のWhitehead Institute/MIT C
enter に提出し、KLIP-1 遺伝子を物理的マーカーにリンクさせた。GeneMap'98
physical map (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap)を用いて、RHマッピング
結果に相当するバンドの細胞遺伝学的位置をそれから作った。KLIP-1遺伝子の位
置を確認するために、32P-ラベル化内部プローブ5'-CTGTGGGCACTTCTGAAAGG (SEQ
ID NO:18)とハイブリッドした、3' UTRのKLIP-1に特異的なプライマー1265F (S
EQ ID NO:16) と1522R (SEQ ID NO:17)でのPCR増幅を、マーカーD6S271とD6S459
をそれぞれに含むYAC クローン 907_H_2 及び 939_E_12 (Centre d'Etudes du P
olymorphisme Humain [Center for Studies on Human Polymorphism], Paris, F
rance)で行った。これらのマーカーは、第6染色体上のKLIP-1領域及びマーカーA
FM136YD12を取り囲んだ。ゲノムDNAと第1染色体(D1S444)に局在するYACクローン
979#B#3は、それぞれ陽性及び陰性のコントロールとして用いた。
e4 全ゲノム放射線ハイブリッド(RH)パネル(Research Genetics, Huntsville, A
L)に対してPCRによりスクリーンした。各クローンを、以下の条件下: 10サイク
ルについて、94℃、45秒; 61℃、1分; 72℃、45秒、及び30サイクルについて94
℃、45秒; 58℃、1分; 72℃、45秒、72℃で10分のインキュベーションによる終
結で、3' UTR: 1265F (5'-ACCCCACCTGAAATTCTTGG) (SEQ ID NO:16) 及び1522R (
5'-GAGATAAAGAGGAAGGAAGG) (SEQ ID NO:17)に特異的な2つのプライマーを用いる
2つの独立PCR増幅で個々に試験した。 PCR生成物及びヒト(陽性)又はハムスター
(陰性)コントロールのDNAを含むサザンブロットを、32P-ラベル化特異的内部プ
ローブでハイブリダイズし、ストリンジェントな条件、60℃で0.2X SSC + 0.2%
SDS で洗浄し、次いで16時間Kodak Biomax フィルムに曝した。単一の特異的な
ヒトのバンドが、257bpの予定された大きさに認められた。スクリーニングプロ
フィルから誘導されるハイブリダイゼーションデータは、Genome Research RH M
apper Server (http://www.genome.wi.mit.edu)用のWhitehead Institute/MIT C
enter に提出し、KLIP-1 遺伝子を物理的マーカーにリンクさせた。GeneMap'98
physical map (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap)を用いて、RHマッピング
結果に相当するバンドの細胞遺伝学的位置をそれから作った。KLIP-1遺伝子の位
置を確認するために、32P-ラベル化内部プローブ5'-CTGTGGGCACTTCTGAAAGG (SEQ
ID NO:18)とハイブリッドした、3' UTRのKLIP-1に特異的なプライマー1265F (S
EQ ID NO:16) と1522R (SEQ ID NO:17)でのPCR増幅を、マーカーD6S271とD6S459
をそれぞれに含むYAC クローン 907_H_2 及び 939_E_12 (Centre d'Etudes du P
olymorphisme Humain [Center for Studies on Human Polymorphism], Paris, F
rance)で行った。これらのマーカーは、第6染色体上のKLIP-1領域及びマーカーA
FM136YD12を取り囲んだ。ゲノムDNAと第1染色体(D1S444)に局在するYACクローン
979#B#3は、それぞれ陽性及び陰性のコントロールとして用いた。
【００３１】
- RHキメラパネルのタイピングによる、KLIP-1 遺伝子(36-16)の染色体の位置
付け マッピング解析は、GeneBridge4の構造マーカーD6S271とAFM165YD12のあいだ
のKLIP-1配列、それぞれLOD 1.08においてD6S271からの5.66 cR及びAFM65YD12か
らの2.84 cRに局在する。 細胞遺伝学的なバンドの位置に関連したGeneMap'98 physical mapは、第6染色
体の6p21.1-6p21.2にKLIP-1遺伝子を位置付けた。それぞれマーカーD6S271 及び
AFM165YD12を含むCEPH YAC クローンNo. 907_h_2 及び No. 939_e_12のRHキメラ
に用いられるプライマーでのPCR増幅により、この位置が確認される(図3)。
付け マッピング解析は、GeneBridge4の構造マーカーD6S271とAFM165YD12のあいだ
のKLIP-1配列、それぞれLOD 1.08においてD6S271からの5.66 cR及びAFM65YD12か
らの2.84 cRに局在する。 細胞遺伝学的なバンドの位置に関連したGeneMap'98 physical mapは、第6染色
体の6p21.1-6p21.2にKLIP-1遺伝子を位置付けた。それぞれマーカーD6S271 及び
AFM165YD12を含むCEPH YAC クローンNo. 907_h_2 及び No. 939_e_12のRHキメラ
に用いられるプライマーでのPCR増幅により、この位置が確認される(図3)。
【００３２】
- 組換えKLIP-1タンパク質の発生
プライマー180F: 5'-TCGAAGAAAACATCCAGGGC (SEQ ID NO:19) 及び 556R: 5'-A
GAGGTCCATAGAGTTCCACC (SEQ ID NO:20)でのPCR増幅後に得られるcDNAは、22-156
位置に134 aa の細胞外タンパク質をエンコードする。PCR生成物は、His6x-タグ
pQE-31 発現ベクター(QIAexpress System, Qiagen, Courtaboeuf, France)に連
結し、次いでリプレッサープラスミド pREP4を有するM15株に形質転換した。構
築物及び陽性の形質転換体を、正確な挿入及びインフレーム保存のため、直接的
なシーケンシングでスクリーンした。IPTGで誘導された12 kDa のHis6X-タグタ
ンパク質(図 4A)を変性条件下、Ni-NTAアガロースで精製し、12%のSDS/PAGEゲル
にクマシーブルー染色して視覚化した(図4B)。
GAGGTCCATAGAGTTCCACC (SEQ ID NO:20)でのPCR増幅後に得られるcDNAは、22-156
位置に134 aa の細胞外タンパク質をエンコードする。PCR生成物は、His6x-タグ
pQE-31 発現ベクター(QIAexpress System, Qiagen, Courtaboeuf, France)に連
結し、次いでリプレッサープラスミド pREP4を有するM15株に形質転換した。構
築物及び陽性の形質転換体を、正確な挿入及びインフレーム保存のため、直接的
なシーケンシングでスクリーンした。IPTGで誘導された12 kDa のHis6X-タグタ
ンパク質(図 4A)を変性条件下、Ni-NTAアガロースで精製し、12%のSDS/PAGEゲル
にクマシーブルー染色して視覚化した(図4B)。
【００３３】
- KLIP-1ポリクローナル抗体の発生と精製
抗体(Ab)は、不完全フロイントアジュバント中100μlの精製した12kKDaの組換
え細胞外タンパク質で、毎月ホワイトニュージーランドラビットを免疫化して発
生させた。3回の注射後、血清を回収し、Hitrap タンパク質G アフィニティカラ
ム(Pharmacia Biotech, Orsay, France)を用いて全てのIgGを精製し、固定化し
た大腸菌溶解物(Pierce, Rockford, IL)を用いて、非特異的な抗-大腸菌のウサ
ギ抗体を除いた。
え細胞外タンパク質で、毎月ホワイトニュージーランドラビットを免疫化して発
生させた。3回の注射後、血清を回収し、Hitrap タンパク質G アフィニティカラ
ム(Pharmacia Biotech, Orsay, France)を用いて全てのIgGを精製し、固定化し
た大腸菌溶解物(Pierce, Rockford, IL)を用いて、非特異的な抗-大腸菌のウサ
ギ抗体を除いた。
【００３４】
- ウエスタンブロッティングによる明示
全骨髄又はKLIP-1+ 細胞及び帯血単核細胞の豊富な骨髄を、50 mM Tris (pH 6
.8)、10% グリセロール、2% SDS、5% 2-メルカプトエタノール及び0.02%ブロモ
フェノールブルーを含む緩衝液に100℃で10分溶解した。タンパク質(3×105 細
胞の当量)を、12%ゲルでのSDS-PAGE で分離し、Hybond C-Extraニトロセルロー
ス膜(Amersham, Les Ulis, France)にエレクトロトランスファーした。膜を、室
温で1時間、1X PBS, 0.2% Tween 20中の低脂肪粉末牛乳でブロックし、PBS中1:5
000の抗-KLIP-1抗体、0.2% Tween 20でインキュベートした。洗浄後、ブロット
をセイヨウワサビパーオキシダーゼ-接合ヤギ抗-ウサギ抗体とインキュベートし
た; 製造者の推薦にしたがってECLシステム(Amersham, Les Ulis, France)を用
い、着色させた。図5に示した結果は、KLIP+臍帯細胞画分における38kDaでのKLI
P分子に対するバンドの存在を示している。
.8)、10% グリセロール、2% SDS、5% 2-メルカプトエタノール及び0.02%ブロモ
フェノールブルーを含む緩衝液に100℃で10分溶解した。タンパク質(3×105 細
胞の当量)を、12%ゲルでのSDS-PAGE で分離し、Hybond C-Extraニトロセルロー
ス膜(Amersham, Les Ulis, France)にエレクトロトランスファーした。膜を、室
温で1時間、1X PBS, 0.2% Tween 20中の低脂肪粉末牛乳でブロックし、PBS中1:5
000の抗-KLIP-1抗体、0.2% Tween 20でインキュベートした。洗浄後、ブロット
をセイヨウワサビパーオキシダーゼ-接合ヤギ抗-ウサギ抗体とインキュベートし
た; 製造者の推薦にしたがってECLシステム(Amersham, Les Ulis, France)を用
い、着色させた。図5に示した結果は、KLIP+臍帯細胞画分における38kDaでのKLI
P分子に対するバンドの存在を示している。
【００３５】
- KLIP-1タンパク質のインビトロでの転写と翻訳ならびに免疫沈降
1. マトリクスの調製
翻訳されたマトリクスは、臍帯血単核細胞由来RNA(RNA NOW, Biogentex, Fran
ce)の逆転写によって得られるKLIP-1 遺伝子cDNA (MMLV RT, Gibco BRL, France
) のPCR増幅に由来する。PCRは、以下の条件下で全容量100μl中で行う: - 300 nM のセンス+T7 プライマー (5'-AgATCCTAATACGACTCACTATAgggAggAgggACATggCCAACTAAgC-3') (SEQ ID NO:21)
及び300 nMのアンチセンス又はリバースプライマー (5'AAgAggAAggAAggggTAgg3
') (SEQ ID NO:22) - 35サイクルにわたるPCR増幅(サーモサイクラー9600、PERKIN ELMER)、94℃、 1分; 55℃、1分; 72℃、2分。72℃10分での最終的な伸長。増幅生成物は、MICR
OCON 100 (AMICON, USA)での遠心分離(20分500 g)により精製し、次いでH2O中に
溶解した。
ce)の逆転写によって得られるKLIP-1 遺伝子cDNA (MMLV RT, Gibco BRL, France
) のPCR増幅に由来する。PCRは、以下の条件下で全容量100μl中で行う: - 300 nM のセンス+T7 プライマー (5'-AgATCCTAATACGACTCACTATAgggAggAgggACATggCCAACTAAgC-3') (SEQ ID NO:21)
及び300 nMのアンチセンス又はリバースプライマー (5'AAgAggAAggAAggggTAgg3
') (SEQ ID NO:22) - 35サイクルにわたるPCR増幅(サーモサイクラー9600、PERKIN ELMER)、94℃、 1分; 55℃、1分; 72℃、2分。72℃10分での最終的な伸長。増幅生成物は、MICR
OCON 100 (AMICON, USA)での遠心分離(20分500 g)により精製し、次いでH2O中に
溶解した。
【００３６】
2. インビトロでの転写と翻訳
マトリクスのインビトロでの転写と翻訳は、
- 1μgのマトリクス
- 40μlのTnT Quick Master Mix (Promega Biotech, France)
- 2μlの10 mCi/ml 35S-メチオニン(Amersham, France)
- H2O、QS 50μl
- 試薬を30℃で90分インキュベートする、
を用いて行った。
【００３７】
3. 免疫沈降
5μlの翻訳産物と2μlのウサギポリクローナル抗-KLIP-1抗体を、攪拌しなが
ら、1時間4℃で50μlの1X PBS中でインキュベートする。 60μlのタンパク質 A-セファロースを加え、混合物を4℃で30分ホイール(whee
l)上でインキュベートする。 緩衝液で洗浄を行う: 0.1% NP 40、20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl 及
び0.05% アジ化ナトリウム。 試料を12%のSDS-PAGE ゲルでの電気泳動により分析する;結果をオートラジオ
グラフィーで視覚化する。図6は、抗-KLIP抗体で検出される、約38kDaのKLIP分
子に相当するバンドの存在を示すが、コントロールの免疫前血清はKLIPタンパク
質を検出しない。これは、抗-KLIP 抗体の特異性を示している。
ら、1時間4℃で50μlの1X PBS中でインキュベートする。 60μlのタンパク質 A-セファロースを加え、混合物を4℃で30分ホイール(whee
l)上でインキュベートする。 緩衝液で洗浄を行う: 0.1% NP 40、20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl 及
び0.05% アジ化ナトリウム。 試料を12%のSDS-PAGE ゲルでの電気泳動により分析する;結果をオートラジオ
グラフィーで視覚化する。図6は、抗-KLIP抗体で検出される、約38kDaのKLIP分
子に相当するバンドの存在を示すが、コントロールの免疫前血清はKLIPタンパク
質を検出しない。これは、抗-KLIP 抗体の特異性を示している。
【００３８】
- KLIP-1+ 細胞の免疫選択
末梢血もしくは臍帯血、骨髄又は胸腺及び胎児肝由来の約2.5×108個の単核細
胞を、30分室温でPBS中の20%ヒトAB血清中でインキュベートする。2% SVF含有PB
Sで洗浄後、細胞を4℃で30分90μlの(この発明による)ウサギ抗-KLIP-1血清とイ
ンキュベートし、次いで30分4℃で50μlのFITC-ラベル化抗-ウサギ IgG 抗-イノ
シシ(swine) (Dako, France)とインキュベートし、次いで30分4℃で200μlの抗-
FITC磁気マイクロビーズ(Miltenyi-Biotech, Paris, France)とインキュベート
する。 次いで、KLIP-1+細胞を、VarioMACS機器を用いる磁気分野のLS+ 磁気カラム(M
iltenyi-Biotech, Paris, France)、続くRS+磁気カラム(Miltenyi-Biotech, Par
is, France)での連続的な移動(passage)により単離する。 得られた群はFACS-Vantage (Becton Dickinson, France)で分析し、この研究
で用いた群の純度は、90〜99%の範囲であった。
胞を、30分室温でPBS中の20%ヒトAB血清中でインキュベートする。2% SVF含有PB
Sで洗浄後、細胞を4℃で30分90μlの(この発明による)ウサギ抗-KLIP-1血清とイ
ンキュベートし、次いで30分4℃で50μlのFITC-ラベル化抗-ウサギ IgG 抗-イノ
シシ(swine) (Dako, France)とインキュベートし、次いで30分4℃で200μlの抗-
FITC磁気マイクロビーズ(Miltenyi-Biotech, Paris, France)とインキュベート
する。 次いで、KLIP-1+細胞を、VarioMACS機器を用いる磁気分野のLS+ 磁気カラム(M
iltenyi-Biotech, Paris, France)、続くRS+磁気カラム(Miltenyi-Biotech, Par
is, France)での連続的な移動(passage)により単離する。 得られた群はFACS-Vantage (Becton Dickinson, France)で分析し、この研究
で用いた群の純度は、90〜99%の範囲であった。
【００３９】
- FACSによる免疫表現型
KLIP-1+ 細胞群についての1-、2-及び 3-色の免疫蛍光分析は、FACS-Vantage
(Becton Dickinson, France)を用いて行った。 イソタイプに適当なコントロールIgに無関係な適当な接合蛍光色素も、全ての
実験に用いた。結果を造血組織ごとに示す: .図 7-11 (ヒト細胞): 図7: 末梢血: 成熟血球のみを含む 全血液中、4%の単核細胞がKLIP-1+である。99%の純粋なKLIP-1+ 分類画分では
、 0% CD34+、95% CD56+ (成熟NK細胞)、1.5% CD19+ (B 細胞)及び0.5% CD3+ (T
細胞)が見られ、これらの最後の2つの値はバックグランドノイズによるものであ
る。
(Becton Dickinson, France)を用いて行った。 イソタイプに適当なコントロールIgに無関係な適当な接合蛍光色素も、全ての
実験に用いた。結果を造血組織ごとに示す: .図 7-11 (ヒト細胞): 図7: 末梢血: 成熟血球のみを含む 全血液中、4%の単核細胞がKLIP-1+である。99%の純粋なKLIP-1+ 分類画分では
、 0% CD34+、95% CD56+ (成熟NK細胞)、1.5% CD19+ (B 細胞)及び0.5% CD3+ (T
細胞)が見られ、これらの最後の2つの値はバックグランドノイズによるものであ
る。
【００４０】
図8: 大部分の成熟血球のみならず、小さな画分の未成熟細胞を含む臍帯血
全帯血中、5%の単核細胞がKLIP-1+である。
98.5%の純粋なKLIP-1+ 分類画分において、0.5% CD34+、76% CD56+ (成熟NK細
胞)、1.5% CD19+ (B 細胞)ならびに0.3% CD3+ (T細胞)が認められる。 図9: 骨髄: 血球の分化が生じる造血部位; したがって、未成熟血球全てを含む 骨髄全体で、8%の単核細胞がKLIP-1+である。 99%の純粋なKLIP-1+ 分類画分において、2つの亜群「低強度及び高強度」、つ
まり17% KLIP-1 低+ 82% KLIP-1 高 +、及び32% CD19 KLIP-1 低 (B細胞)、19%
CD3 KLIP-1 低(プレ-T細胞)、31% CD56+ KLIP-1 高 + (NK)が認められる。
胞)、1.5% CD19+ (B 細胞)ならびに0.3% CD3+ (T細胞)が認められる。 図9: 骨髄: 血球の分化が生じる造血部位; したがって、未成熟血球全てを含む 骨髄全体で、8%の単核細胞がKLIP-1+である。 99%の純粋なKLIP-1+ 分類画分において、2つの亜群「低強度及び高強度」、つ
まり17% KLIP-1 低+ 82% KLIP-1 高 +、及び32% CD19 KLIP-1 低 (B細胞)、19%
CD3 KLIP-1 低(プレ-T細胞)、31% CD56+ KLIP-1 高 + (NK)が認められる。
【００４１】
図10: 胚肝臓(6週)
全肝臓の単核細胞で、3%の細胞がKLIP-1+である。
細胞はほとんど得られないので、収率は純度以上に有利であった。
47%のKLIP-1+細胞のうち、35%はCD34+ (極めて初期の造血始原細胞)である。
図11: 新生児の胸腺 胸腺は、T細胞の免疫学的成熟のための器官である。 胸腺全体で、2%の単核細胞が KLIP-1+である。 98%の純粋なKLIP-1+ 分類画分において、1.5% CD34+、2% CD56+、 0.8% CD19+
(B 細胞) 及び70% CD3+ (T 細胞、つまりこの成熟段階ではT/NK細胞)が認めら
れる。しかし、KLIP-1+ CD3+ 群は、91%以上のCD4+CD8+ (プレ-T)細胞からなる
。
図11: 新生児の胸腺 胸腺は、T細胞の免疫学的成熟のための器官である。 胸腺全体で、2%の単核細胞が KLIP-1+である。 98%の純粋なKLIP-1+ 分類画分において、1.5% CD34+、2% CD56+、 0.8% CD19+
(B 細胞) 及び70% CD3+ (T 細胞、つまりこの成熟段階ではT/NK細胞)が認めら
れる。しかし、KLIP-1+ CD3+ 群は、91%以上のCD4+CD8+ (プレ-T)細胞からなる
。
【００４２】
これらの結果は、骨髄及び帯のCD34+ 初期始原細胞に存在するために、KLIP-1
マーカー(抗原又は分子)がその造血分化をとおしてNK細胞に特異的に存在する
ことを明らかに示している。それは常に、CD56- 未成熟NK細胞及びCD56+ 成熟NK
細胞及び未成熟のプレ-B ならびにプレ-T細胞に存在する。新生児の胸腺では、K
LIP抗原の存在は、未成熟T細胞であるCD3+CD4+CD8+ 細胞で認められる。なぜな
ら、CD3+CD4-CD8+ 又は CD3+CD4+CD8-の成熟T細胞はKLIP-1-だからである。
マーカー(抗原又は分子)がその造血分化をとおしてNK細胞に特異的に存在する
ことを明らかに示している。それは常に、CD56- 未成熟NK細胞及びCD56+ 成熟NK
細胞及び未成熟のプレ-B ならびにプレ-T細胞に存在する。新生児の胸腺では、K
LIP抗原の存在は、未成熟T細胞であるCD3+CD4+CD8+ 細胞で認められる。なぜな
ら、CD3+CD4-CD8+ 又は CD3+CD4+CD8-の成熟T細胞はKLIP-1-だからである。
【００４３】
.図13-14 (動物細胞)
図13 (ブタ): 血液全体において、7%の単核細胞がKLIP-1+である:非免疫化ウ
サギ血清でブタの血液全体をインキュベートして得られる陰性のコントロール(
図13A)と、免疫化したウサギの血清で得られる、陽性のコントロールとの違い。 図14 (マウス): 図14A: KLIP-1+ 分類画分において: 98% 純度 (9% バックグ
ランドノイズ); 図14B: 抗-マウスNK細胞抗体(NK1.1)の存在下、40%のKLIP-1+
細胞がNK細胞であることが認められる。
サギ血清でブタの血液全体をインキュベートして得られる陰性のコントロール(
図13A)と、免疫化したウサギの血清で得られる、陽性のコントロールとの違い。 図14 (マウス): 図14A: KLIP-1+ 分類画分において: 98% 純度 (9% バックグ
ランドノイズ); 図14B: 抗-マウスNK細胞抗体(NK1.1)の存在下、40%のKLIP-1+
細胞がNK細胞であることが認められる。
【００４４】
- 細胞-媒介細胞毒性
自然発生的な細胞毒性及び抗体依存性細胞-媒介細胞毒性(ADCC)は、標準的な4
-時間の51Cr ラジオアイソトープ-放出実験で測定した。NK-感受性K562赤白血病
細胞(American Type Culture Collection, Rockville, MD)を、標的として用い
た。標的細胞を200μCiの51Cr-クロム酸ナトリウム(Amersham, Les Ulis, Franc
e)で2 hラベルした。混合しておらず、種々のドナー(＜50歳)に由来する種々の
数のエフェクター細胞を標的細胞に加え、4 h 37℃でインキュベートした。ADCC
を測定するために、細胞をブタ抗-ウサギ抗-Fc レセプター1:50でプレインキュ
ベートした。全ての測定は、3回行った。
-時間の51Cr ラジオアイソトープ-放出実験で測定した。NK-感受性K562赤白血病
細胞(American Type Culture Collection, Rockville, MD)を、標的として用い
た。標的細胞を200μCiの51Cr-クロム酸ナトリウム(Amersham, Les Ulis, Franc
e)で2 hラベルした。混合しておらず、種々のドナー(＜50歳)に由来する種々の
数のエフェクター細胞を標的細胞に加え、4 h 37℃でインキュベートした。ADCC
を測定するために、細胞をブタ抗-ウサギ抗-Fc レセプター1:50でプレインキュ
ベートした。全ての測定は、3回行った。
【００４５】
図12に示す得られた結果は、
1. 抗-KLIP-1抗体が、NK細胞の細胞毒性に作用を有さず、それゆえにKLIP抗原
がNKのインヒビタ−でもアクチベーターでもないこと; 2. KLIP-1+細胞の分類(分離又は選択)が、おそらくは濃縮作用のために細胞毒
性を増し、それにもかかわらず、これが、抗-KLIP-1によって分類される末梢血
中の細胞が、実際に細胞毒性機能を有するNK細胞であることを明らかにしている
ことを示している。 上記から明らかなように、この発明は、より詳細に記載したにすぎないその実
施、調製及び応用の方法には全く限定されない;逆に、この発明は、この発明の
関係又は範囲を逸脱しない限り、当業者に行い得る全ての変形を包含するもので
ある。
がNKのインヒビタ−でもアクチベーターでもないこと; 2. KLIP-1+細胞の分類(分離又は選択)が、おそらくは濃縮作用のために細胞毒
性を増し、それにもかかわらず、これが、抗-KLIP-1によって分類される末梢血
中の細胞が、実際に細胞毒性機能を有するNK細胞であることを明らかにしている
ことを示している。 上記から明らかなように、この発明は、より詳細に記載したにすぎないその実
施、調製及び応用の方法には全く限定されない;逆に、この発明は、この発明の
関係又は範囲を逸脱しない限り、当業者に行い得る全ての変形を包含するもので
ある。
【００４６】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年２月１４日（２００２．２．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 16/28 ４Ｈ０４５
16/28 Ｃ１２Ｑ 1/02
Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ
1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ
Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566
33/566 Ｃ１２Ｐ 21/08
// Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(72)発明者 ル ディスコルデ，マゲリ
フランス、エフ−75011 パリ、リュ サ
ン−サビ 66
(72)発明者 プロスト，ステファン
フランス、エフ−93500 パンティン、リ
ュ ユージーン エ マリ−ルイーズ カ
ルネ 24
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 HA14
HA15
4B063 QA19 QQ08 QQ43 QR32 QR62
QS33 QS34
4B064 AG27 CA10 DA01 DA14
4C081 AB11 CD34
4C085 AA13 AA14 BB11 DD62 DD63
EE01
4H045 AA10 AA11 AA30 CA42 DA50
DA76 DA86 EA22 EA51
Claims (18)
- 【請求項１】 - 全てのリンパ始原細胞と全ての成熟NK細胞の表面に存在
し、 - 配列SEQ ID NO:2に対して、位置21〜152に局在する細胞外ドメイン、位置153
〜295に局在する5個のトランスメンブランドメイン及び位置296〜350に局在する
細胞質ドメインからなる構造(a)を有し、 - 約36〜38 kDaの見かけ分子量を有し、かつ - 構造(a)のN末端に20アミノ酸シグナル配列を含むその前駆体が、SEQ ID NO:2
のタンパク質、及び配列SEQ ID NO:2と少なくとも 70％の同一性又は少なくとも 85％の類似性、好ましくは少なくとも95％の同一性又は少なくとも 99％の類似
性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる群から選択される ことを特徴とする、単離されたタンパク質。 - 【請求項２】 式SEQ ID NO:25のタンパク質、及びその細胞外ドメインが配
列SEQ ID NO:6、7又は24のフラグメントからなる他の哺乳動物タンパク質からな
る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載されるタンパク質の細胞外ドメインに
ついて7〜132個の連続的なアミノ酸を含むフラグメント、該タンパク質のトラン
スメンブランドメイン内に含まれる7〜143個の連続的なアミノ酸からなるフラグ
メント、該タンパク質の細胞質ドメインに含まれる7〜54個の連続的なアミノ酸
からなるフラグメント及び配列SEQ ID NO:4のフラグメントからなる群から選択
されることを特徴とする、タンパク質フラグメント。 - 【請求項４】 配列SEQ ID NO:6、7、8、9及び24からなる群から選択される
ことを特徴とする、請求項３に記載のタンパク質フラグメント。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１つに記載されるタンパク質、又は
このタンパク質のフラグメントに対するものであることを特徴とする抗体。 - 【請求項６】 請求項３及び４のいずれか１つに記載のフラグメントの1つ
、好ましくは配列SEQ ID NO:7のフラグメントに対するものであることを特徴と
する、請求項５に記載の抗体。 - 【請求項７】 モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体から選択される
ことを特徴とする請求項５又は請求項６に記載の抗体。 - 【請求項８】 請求項１〜４のいずれか１つに記載のタンパク質、又はその
タンパク質フラグメントをエンコードすることを特徴とする、単離及び精製され
たcDNA。 - 【請求項９】 配列SEQ ID NO:1、3、5、10、11、12、13ならびに23及びSEQ
ID NO:16-20からなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の単離
及び精製されたcDNA。 - 【請求項１０】 - 生物学的試料を、請求項５〜７のいずれか１つに記載
の抗体と接触させ、かつ - 抗体に結合する細胞を除くこと からなる、異種細胞群からなる生物学的試料からKLIP-1+ 細胞を選択的に除く方
法。 - 【請求項１１】 抗体が固体支持体に結合されていることを特徴とする、
請求項１０に記載の除去方法。 - 【請求項１２】 - 異種細胞群からなる試料を、請求項５〜７のいずれ
か１つに記載の抗体と接触させ、かつ - 細胞-抗体複合体の形成を検出すること からなることを特徴とする、異種細胞群においてNK細胞及び/又はリンパ細
胞始原細胞を検出及び/又は定量及び/又は単離する方法。 - 【請求項１３】 試料が骨髄、臍帯血、胎児肝又はいずれかの他の胎児も
しくは成体の造血組織からなるときに、抗体と複合体を形成した細胞を、プレ-B
細胞に特異的な抗体(抗-CD19抗体又は抗-CD10抗体)及び/又はプレ-T 細胞に特異
的な抗体(抗-CD3 抗体、抗-CD4抗体又は抗-CD8抗体)と接触させてもよいことを
特徴とする、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 医薬品、特に自己免疫疾患の治療に用いるための請求項５
〜７のいずれか１つに記載の抗体。 - 【請求項１５】 移植可能な製品を製造するための、請求項１０又は請求項
１１に記載の方法を用いて得られる、NK細胞及び/又はリンパ始原細胞を涸渇し
た骨髄、臍帯血、胎児肝又はいずれかの他の胎児もしくは成体の造血組織の細胞
の使用。 - 【請求項１６】 請求項８及び９のいずれか１つに記載される核酸配列を生
物学的試料中に検出することからなることを特徴とする、良性及び悪性の血液疾
患の診断方法。 - 【請求項１７】 検出を行うのに適した有用な量の緩衝液に加えて、免疫吸
着固体支持体に任意に接合した、請求項５〜７のいずれか１つに記載のKLIP-1
抗原又はこの抗原のフラグメントに対する適当な用量の抗体及び形成された可能
性のある細胞-抗体複合体を示す適当な用量の試薬からなることを特徴とする、N
K細胞及び/又はリンパ球様始原細胞(プレ-B、プレ-T 及びプレ-NK)の検出及び/
又は定量及び/又は単離のためのキット。 - 【請求項１８】 細胞外ドメインの少なくとも 7個の連続的なアミノ酸から
なる、NK細胞の検出用試薬としての請求項１又は請求項２に記載のタンパク質フ
ラグメントの使用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR99/14241 | 1999-11-12 | ||
| FR9914241A FR2801056B1 (fr) | 1999-11-12 | 1999-11-12 | Proteine presente a la surface des cellules souches hematopoietiques de la lignee lymphoide et des cellules nk, et ses applications |
| PCT/FR2000/003137 WO2001034653A2 (fr) | 1999-11-12 | 2000-11-10 | Proteine presente a la surface des cellules souches hematopoietiques de la lignee lymphoide et des cellules nk, et ses applications. |
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|---|---|
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Cited By (1)
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