JP4426728B2

JP4426728B2 - Ｇａｎｐ蛋白質

Info

Publication number: JP4426728B2
Application number: JP2000601175A
Authority: JP
Inventors: 薫雄阪口; 一彦桑原
Original assignee: 株式会社イムノキック
Priority date: 1999-02-24
Filing date: 1999-08-27
Publication date: 2010-03-03
Anticipated expiration: 2019-08-27
Also published as: US20040229309A1; US6673913B1; CA2365020C; US20060040372A1; US20060057695A1; US6825020B1; US7138509B2; US6943237B2; WO2000050611A1; CA2365020A1

Description

技術分野
本発明は、キナーゼ活性を有する新規な蛋白質及び該蛋白質をコードする遺伝子に関するものである。
背景技術
末梢リンパ系組織（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｌｙｍｐｈｏｉｄｏｒｇａｎｓ）の抗原特異性Ｂ細胞の活性化及び成熟は膜ＩｇＲに結合する抗原により開始される（Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）．，３８１：７５１−７５８，１９９６；Ｓａｋａｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５４：３３７−３９２，１９９３）。Ｂ細胞は免疫後４８時間以内に動脈周囲リンパ鞘（ＰＡＬＳ）（Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）．，３８１：７５１−７５８，１９９６）の外側に入り、特異的Ｔｈ細胞との共同刺激に依存性の相互作用及び樹状細胞の指状突起会合を開始する（ＭａｃＬｅｎｎａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：１１７−１３９，１９９４；Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１５６：１１１−１２６，１９９７）。抗原に誘導されたＢ細胞はＰＡＬＳの外側で増殖し、次にリンパ濾胞でさらに活性化され、胚中心（以下、本明細書において「ＧＣ」と略す場合がある。）が確立される（Ｈａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：５５６−５６７，１９９５；Ｊａｃｏｂｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：６７９−６８７，１９９２；Ｋｅｌｓｏｅ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４：１０７−１１１，１９９６）。このＢ細胞は成熟して、細胞周期の間に迅速に動き回って暗領域を形成する大型のｓｌｇ⁻セントロブラスト（中心芽細胞）となり、さらに成熟して表面の独特な特徴であるＰＮＡ^＋Ｂ２２０^＋ｓｌｇＭ^＋ｓｌｇＤ⁻ＣＤ３８⁻をＧＣの明領域に発現するセントロサイト（中心細胞）となる（Ｋｏｓｃｏ−Ｖｉｌｂｏｉｓｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１８：２２５−２３０，１９９７；Ｋｅｌｓｏｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｔｏｄａｙ，１６：３２４−３２６，１９９５；Ｏｌｉｖｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：１１０８−１１１５，１９９７）。
セントロサイトはおそらくアポトーシス又は免疫グロブリンＶ領域の親和性成熟のいずれかの過程と、ＩｇＧクラス抗原へのクラススイッチの変化過程とを受けているが、一部のセントロサイトは記憶Ｂ細胞としてリンパ様画分中に長期間生存するようになる。その他のセントロサイトはおそらくＧＣの周辺帯に遊走し、さらなる抗原刺激と、ＣＤ４０やＣＤ３８などのＢ細胞活性化分子及び種々のＢ細胞刺激性サイトカインのレセプターを経る共同刺激シグナルとを受ける（Ｇｒａｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：１４１−１５５，１９９４；Ｆｏｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：１５７−１６３，１９９４）。この領域でさらに刺激される抗原特異性Ｂ細胞は、おそらく、様々な他の免疫担当細胞が抗原誘導Ｂ細胞と相互作用する可能性がある脾臓の間質性領域（赤脾髄と呼ばれる。）内に遊走する。数種の自己免疫マウスの組織化学的分析によって、形質細胞として、又はモット細胞（Ｍｏｔｔｃｅｌｌｓ）と呼ばれる異常型の形質細胞として現れるこの領域に独特の抗体産生細胞が同定された（Ｔａｒｌｉｎｔｏｎｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：５３１−５３９，１９９２；Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９９２−９９７，１９９７）。
自己免疫は、自己／非自己の識別障害が抗原特異性リンパ球において頻繁に起こる現象である（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１６：９０−９８，１９９５）。種々の自己免疫疾患の免疫系において、Ｔ細胞及びＢ細胞に関係する複合的なメカニズムが認められる（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ．，ＡｄｖＩｍｍｕｎｏｌ．，３７：２６９−２９０，１９８５；Ｏｋａｍｏｔｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：７１−７９，１９９２；Ｒｅｉｎｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：８５３−８６１，１９９６；Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，５５：１７９−２１６，１９８１；Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）．，３５６：３１４−３１７，１９９２；Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７６：９６９−９７６，１９９４；Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）．，３２８：８０５−８１１，１９８７）。
ＮＺＢ系及びＮＺＷ系は、（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ_１系マウスとして、重篤な自己免疫状態であるＳＬＥを引き起こす多数の遺伝的因子によって特徴づけられている（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：２６９−２９０，１９８５；Ｏｋａｍｏｔｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：７１−７９，１９９２；Ｒｅｉｎｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：８５３−８６１，１９９６；Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，５５：１７９−２１６，１９８１）。ＮＺＢ系マウスでは、自己免疫性溶血性貧血を引き起こす抗赤血球抗体によって、自己免疫状態が自然発生的に形成され（Ｏｋａｍｏｔｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：７１−７９，１９９２）、ＮＺＷ系マウスは潜行性の自己免疫現象を示す（Ｒｅｉｎｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：８５３−８６１，１９９６）。（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ_１系マウスのＳＬＥ状態は、明らかにＴ細胞及びＢ細胞に関連する多数の遺伝的因子によって引き起こされている（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，５５：１７９−２１６，１９８１）。ＮＺＢ系マウスはＢ細胞の明らかな異常を示すが、ＮＺＢ系マウスにおける異常Ｂ細胞活性化の分子的メカニズムは解明されていない。
発明の開示
このようなＢ細胞の成熟に関連する分子の問題を検討するため、本発明者らはマウスのＢ細胞系統であるＷＥＨＩ−２３１系の細胞内成分に対するモノクローナル抗体を作製した。この細胞系はＮＺＢ系の遺伝的背景を有しており、２９−１５と命名したモノクローナル抗体は、末梢リンパ系組織のＧＣ−Ｂ細胞で発現が増強される分化抗原を認識するものである。この２９−１５モノクローナル抗体を用いて、本発明者らは末梢リンパ系組織における抗原の発現を検討したところ、この抗原は高免疫マウスのＧＣの明領域で増強される分化抗原として特徴づけられた。ＮＺＢ系マウスの脾臓では、ＧＡＮＰ抗原を高度に発現するＩｇＭ産生形質細胞が自己免疫の開始以前に現れるが、この発現が末梢免疫応答及び自己抗体による自己免疫を理解するために重要な分子挙動であることが示唆された。
本発明者らは、胚中心のセントロサイトで選択的に発現が増強される上記抗原を確認すべく研究を行ない、単離したｃＤＮＡプローブ（ｇａｎｐプローブ）を用いたイン・サイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）ＲＮＡハイブリダイゼーションによって、２９−１５モノクローナル抗体で染色される領域においてｇａｎｐｍＲＮＡの発現が増加することを確認した。また、その遺伝子産物であるＧＡＮＰ蛋白質が細胞質及び核内に局在する２１０ｋＤの蛋白質であり、酵母の転写調節遺伝子ＳＡＣ３と構造的に類似することを確認した。抗ＩｇＭ抗体及び抗ＣＤ４０抗体でＢ細胞を活性化したところ、ＧＡＮＰ蛋白質に結合してくるキナーゼの量が増加した。これらの結果から、ＧＡＮＰ蛋白質は、ある自己免疫状態において異常Ｂ細胞分化のシグナル変換に関与する可能性があることが示唆された。本発明はこれらの知見を基にして完成された。
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１または配列番号３に記載のアミノ酸配列により特定されるＧＡＮＰ蛋白質を提供するものである。本発明により、配列表の配列番号１または配列番号３に記載のアミノ酸配列において、一又は複数のアミノ酸が欠失し、一又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、及び／又は一又は複数の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＡＮＰ蛋白質と同質のキナーゼ活性を有するＧＡＮＰ変異蛋白質が提供される。本発明により、上記ＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質のアミノ酸配列の全長をその部分配列として含むポリペプチドが提供される。
別の観点からは、本発明により、前記のＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質をコードするポリヌクレオチドが提供される。代表的なポリヌクレオチドは哺乳類動物由来のＧＡＮＰ蛋白質をコードするＤＮＡであり、それらのうち、哺乳類動物が有する遺伝子ＤＮＡが好ましい。最も好ましいポリヌクレオチドの例は、配列表の配列番号２（マウス由来のＧＡＮＰ蛋白質をコードするＤＮＡ配列）または配列番号４（ヒト由来のＧＡＮＰ蛋白質をコードするＤＮＡ配列）に記載された塩基配列により特定される。
また、本発明により、前記ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖の塩基配列からなるアンチセンスポリヌクレオチド又は該アンチセンスポリヌクレオチドの誘導体が提供される。さらに、本発明により、前記ポリヌクレチドチド又は前記アンチセンスポリヌクレオチドのうちの一部であって、連続する１２以上の塩基からなるポリヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチド又は前記アンチセンスポリヌクレオチドを化学修飾したポリヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドが提供される。
さらに別の観点から、本発明により、配列表の配列番号２または配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡあるいは他の哺乳類動物由来のホモログであるＤＮＡを取得する方法であって、前記のポリヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドをプローブとして、哺乳類動物のｃＤＮＡライブラリーから該プローブとハイブリダイズするｃＤＮＡを取得する方法が提供される。該ｃＤＮＡの長さはＧＡＮＰ遺伝子とほぼ同じ長さであり、それがコードする蛋白質は約２１０ｋＤａ程度である。また、本発明により、前記の方法により得られたｃＤＮＡ及びそれがコードするＧＡＮＰ蛋白質が提供される。
本発明の別の観点からは、ＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質を認識する抗体が提供される。
発明を実施するための好ましい形態
本発明のＧＡＮＰ蛋白質の代表例は、配列表の配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列により特定される蛋白質であり、２１０ｋＤａの分子量を有し、かつキナーゼ活性を有することにより特徴付けられる。本発明により提供されるＧＡＮＰ変異蛋白質は、配列番号１または配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１個ないし数個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個程度のアミノ酸残基が、置換、挿入、及び／又は欠失したアミノ酸配列により特定され、かつ配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列により特定されるＧＡＮＰ蛋白質と実質的に同様なキナーゼ活性を有する。これらのＧＡＮＰ変異蛋白質はいずれも本発明の範囲に包含される。配列表の配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸配列により特定される蛋白質及びそのホモログは、当該蛋白質が由来する哺乳類動物の胚中心のセントロサイトで選択的に発現が増強される蛋白質である。
通常、ＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質の活性ドメインは、全長のアミノ酸配列のＮ−末端及び／又はＣ−末端からアミノ酸残基を欠失させたポリペプチドを製造し、そのポリペプチドのキナーゼ活性を測定することにより容易に確認することができる。本発明により提供されるポリペプチドは、ＧＡＮＰ蛋白質及びＧＡＮＰ変異蛋白質の活性ドメインからなるポリペプチド、及び該活性ドメインからなるポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドであり、ＧＡＮＰ蛋白質と実質的に同様なキナーゼ活性を有する。また、本発明により提供される別のポリペプチドは、ＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質のアミノ酸配列の全長をその部分配列として含むポリペプチドであり、ＧＡＮＰ蛋白質と実質的に同様なキナーゼ活性を有する。
本発明により提供されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡのほか、ＤＮＡ又はＲＮＡに化学修飾を施したポリヌクレオチドをすべて包含している。本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」という語は、天然に存在しないものを含めて最も広義に解釈しなければならない。本発明により提供されるポリヌクレオチドの代表例は、上記のＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡである。また、本発明のポリヌクレオチドの別の例は、アンチセンスポリヌクレオチドである。
遺伝暗号の縮重を利用して、ポリヌクレオチドから生産されたポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、該ポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一部の塩基を他の種類の塩基に置換することができることは当業者に周知である。したがって、本発明のポリヌクレオチドには、ＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質をコードする全てのポリヌクレオチドが包含される。本発明の好ましい遺伝子の例として、配列表の配列番号２にマウス由来のＧＡＮＰ蛋白質をコードする遺伝子を示し、また配列番号４にヒト由来のＧＡＮＰ蛋白質をコードする遺伝子を示した。なお、ＧＡＮＰ変異蛋白質のアミノ酸配列は、該変異体をコードする遺伝子の塩基配列から決定することが可能である。例えば、市販のプログラム（例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標、イーストマンケミカル社製）やＧｅｎｅｔｉｘ（ソフトウェア開発社製）を用いて行うことができる。
本発明の範囲には、ＧＡＮＰ蛋白質をコードするポリヌクレオチドのアンチセンス鎖の塩基配列からなるアンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体が包含される。アンチセンスポリヌクレオチドは上記ポリヌクレオチドの一態様として提供されるが、本明細書において、特にアンチセンス鎖の塩基配列からなるポリヌクレオチドであることを明示する場合に「アンチセンスポリヌクレオチド」という場合がある。該アンチセンスポリヌクレオチドは、ＧＡＮＰ蛋白質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であり、それがハイブリダイズするポリヌクレオチドがコード領域のポリヌクレオチドであれば、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの生合成を阻害することが可能である。
ポリペプチドの生合成を阻害するためのアンチセンスポリヌクレオチドは、１２塩基以上からなることが好ましい。一方、細胞内に全長のアンチセンスポリヌクレオチドを取り込ませるためには、必要以上に長い配列は好ましくない。細胞内にアンチセンスポリヌクレオチドを取り込ませ、ＧＡＮＰ蛋白質の生合成を阻害する場合には、１２塩基以上３０塩基以下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩基以上２２塩基以下の塩基からなるアンチセンスポリヌクレオチドを用いるのがよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド又はその誘導体には、天然に存在するか否かにかかわらず、塩基、リン酸、及び糖からなるヌクレオチドが複数結合したものが全て包含される。代表的なものは、天然型のアンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡである。非天然型のポリヌクレオチドとしては、例えば、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチオエート型などのポリヌクレオチドを挙げることができる。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドについて、当業者に利用可能なアンチセンス技術を用いて、目的のＤＮＡやｍＲＮＡとの結合力、組織選択性、細胞透過性、ヌクレアーゼ耐性、細胞内安定性などに優れた様々なアンチセンスポリヌクレオチド誘導体が得られる。
一般的には、ハイブリダイズのし易さの点では、ＲＮＡのループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列を持つアンチセンスポリヌクレオチド又はその誘導体を設計することが好ましい。従って、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体についても、ＲＮＡのループ領域にハイブリダイズするものは好ましい例である。また、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、又はスプライス部位の配列に相補的な配列を有するようなアンチセンスポリヌクレオチドは、一般に高い発現抑制効果が期待できる。したがって、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド又はその誘導体であって、ＧＡＮＰ蛋白質をコードする遺伝子の翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、及び／又はスプライス部位の相補的な配列を含むものは、発現抑制効果の観点から好ましい態様である。
現在、一般的に知られているポリヌクレオチド誘導体のうち、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも一が高められた誘導体として、好ましくはフォスフォロチオエート結合を骨格構造として有する誘導体を挙げることができる。本発明のポリヌクレオチド及びその誘導体には、これらの機能又は構造を有する誘導体が含まれる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドのうち、天然型のアンチセンスポリヌクレオチドについては、化学合成機を使用して合成するか、ＧＡＮＰ蛋白質をコードするＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により製造することができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチオエート型などのポリヌクレオチド誘導体は、通常、化学合成により製造することができる。この場合には、化学合成機に添付されている説明書に従って操作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製することが可能である。
本発明のＧＡＮＰ蛋白質をコードするポリヌクレオチド、そのアンチセンスポリヌクレオチド又はそれらの一部（例えば、連続する１２以上の塩基からなるポリヌクレオチド）であるポリヌクレオチドは、哺乳類動物のｃＤＮＡライブラリーからＧＡＮＰ蛋白質をコードするＤＮＡをスクリーニングするためのプローブとして使用可能である。このような目的には、連続する１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドが特に好ましい。プローブとして用いる該ポリヌクレオチドは誘導体であってもよい。通常、前記の塩基数以上の配列は特異性のある配列であると認識されている。
配列表の配列番号２または配列番号４に記載の塩基配列のうちの連続する１２以上の塩基からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド（アンチセンスポリヌクレオチド）は、ＧＡＮＰ蛋白質をコードするＤＮＡをｃＤＮＡライブラリー等からスクリーニングするためのプローブとして使用可能である。
また、本発明のＧＡＮＰ蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくはそのアンチセンスポリヌクレオチド、又はそれらの一部であるポリヌクレオチドをプローブとして、各組織由来のｍＲＮＡについてノーザンブロットハイブリダイゼーションを行うことにより、ＧＡＮＰ遺伝子由来のｍＲＮＡが発現している組織を見出すことが可能である。さらに１２以上の塩基からなるポリヌクレオチドはポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）のプライマーとして用いることができ、ＰＣＲによりＧＡＮＰ蛋白質をコードするポリヌクレオチドが得られる。また、プライマーを適宜選択することで、ＧＡＮＰ蛋白質の任意の一部をクローニングすることができる。
該プローブを用いたスクリーニングにおいて使用するｃＤＮＡライブラリーとしては、ｍＲＮＡから作製されたものが好ましく使用できる。これらのｃＤＮＡライブラリーからランダムサンプリングにより選択された一群のｃＤＮＡを検索の試料とすることができる。また、ｃＤＮＡライブラリーとしては市販のものも使用可能である。
前記で得たＧＡＮＰ遺伝子とハイブリダイズするｃＤＮＡを適当なベクター（例えば、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター）に挿入した後、宿主（例えば、大腸菌）に導入することで形質転換体を作製することができる。ベクターの種類及び宿主の種類は特に限定されないが、宿主の種類に応じて適宜の発現用ベクターを選択して用いることが可能である。宿主としては、大腸菌等の細菌類、酵母、又は動物細胞のいずれも使用可能である。組換えベクターを大腸菌等の適当な宿主に導入して形質転換体を得る方法は特に限定されず、当業者に利用可能な方法はいずれも適用可能である。
本発明のＧＡＮＰ遺伝子を導入した形質転換体を培養して遺伝子ＤＮＡの増幅又は蛋白質の発現を行わせ、ＧＡＮＰ蛋白質を製造することが可能である。形質転換体の製造及び培養については各種の成書及び報告があり、種々の手段が開発され、当業界で汎用されている。従って、当業者は本明細書に記載された塩基配列に基づいてＧＡＮＰ蛋白質を容易に製造することが可能である。細胞に遺伝子を導入する手法として、塩化カルシウム法、リポフェクション法、プロトプラスト法、エレクトロポーレーション法などを用いることができる。
培養物から目的蛋白質の分離及び精製は当業者に利用可能な手段を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種クロマトグラフィー等の操作を行うことにより、本発明のＧＡＮＰ蛋白質を効率よく回収及び精製することが可能である。より具体的には、免疫沈降法、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法や抗体クロマトグラフィー法等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィー法、及び逆相クロマトグラフィー法などを適宜選択して行えばよい。ＧＡＮＰ変異蛋白質をコードする遺伝子を用いることによって、ＧＡＮＰ変異蛋白質を同様に製造することができる。
また、ＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質は、他のポリペプチドとの融合ペプチドとして製造することも可能である。このような融合ペプチドも本発明の範囲に包含される。融合すべきポリペプチドの種類は特に限定されないが、例えば、細胞外分泌を促進するシグナルペプチドなどを挙げることができる。このような融合蛋白質の製造も形質転換体を用いて行うことができる。融合蛋白質を用いてＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質を製造する場合には、融合蛋白質をブロムシアン等の化学物質やプロテアーゼ等の酵素で処理し、切り出された目的物を分離及び精製すればよい。
本発明のＧＡＮＰ蛋白質若しくはＧＡＮＰ変異蛋白質、又はそれらの部分ポリペプチドを用いて、ＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質を認識する抗体を製造することができる。本発明の抗体は、哺乳類動物をＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質で免疫感作することによって当業界で汎用の方法に従って製造できる。該抗体が本発明のＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質を認識することは、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、又は免疫染色法（例えばＦＡＣＳでの測定）等により確認することが可能である。免疫原としては、ＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質のほか、それらの一部をウシ血清アルブミンなどの他のキャリアー蛋白質に結合させたものを用いてもよい。ＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質の一部は８アミノ酸残基以上であることが好ましく、このようなポリペプチドは、例えばペプチド合成機を用いて合成してもよい。
また、免疫した動物のリンパ球を用いて製造したハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を本発明の抗体として用いてもよい。モノクローナル抗体の製造方法については当業界で周知されており、かつ汎用されている（『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ』（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８８）第６章）。また、本発明の抗体として、抗原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントやキメラ抗体を用いることも可能である。なお、本発明のＧＡＮＰ蛋白質又はＧＡＮＰ変異蛋白質は、抗体を用いる方法又は抗体と酵素を用いる方法などによって検出可能である。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
実施例
実施例１：マウスＧＡＮＰ遺伝子のクローニングと発現の解析
＜材料及び方法＞
（１）動物及び免疫化
ＢＡＬＢ／ｃ系マウス及びＬｅｗｉｓ系ラットは、セアク・吉富（ＳｅａｃＹｏｓｈｉｔｏｍｉＬｔｄ．）（福岡）より購入した。ＮＺＢ系、ＮＺＷ系、（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ_１系マウス（７週齢、メス）、ＭＲＬ／ｌｐｒ系マウス（８週齢、メス）及びＢＸＳＢ系マウス（７週齢、オス）は、日本ＳＬＣ（静岡）より入手した。高齢のＮＺＢ系マウス（１０月齢、メス）は、広瀬幸子博士（順天堂大学医学部、病理学教室）より寄贈頂いた。ＮＯＤ系マウス（７週齢、オス）は、宮崎純一博士（大阪大学医学部、栄養生理化学教室）より提供頂いた。動物は全て熊本大学の動物研究開発センターで飼育した。ＢＡＬＢ／ｃ系マウスはヒツジ赤血球（日本バイオテスト研究所、東京）で複数回免疫した。免疫は５日間隔で静注により実施し、免疫組織化学的分析を行うために胸腺、脾臓、リンパ節（ＬＮ）及びバイエル板（ＰＰ）の切片標本を作製した。
（２）細胞及び細胞培養
ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾臓Ｂ細胞を既報の通り（Ｎｏｍｕｒａｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，４５：１９５−２０３，１９９５）増殖させた。この細胞を二酸化炭素を５％含むインキュベーター中３７℃で、熱不活化ＦＣＳ（大日本製薬株式会社、大阪）１０％、Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｗｈｉｔｔｅｋｅｒ、アメリカ・メリーランド州Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）５ｍＭ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、及び２−ＭＥ５０μＭを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、ドイツ・Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で培養した。
（３）２９−１５モノクローナル抗体（以下、「２９−１５ｍＡｂ」と略す。）の確立
（ＢＡＬＢ／ｃｘＮＺＢ）Ｆ_１系マウスより鉱物油を用いて確立したマウスのＢ細胞系統であるＷＥＨＩ−２３１系に対するｍＡｂを、既報（Ｋｕｗａｈａｒａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：２７４２−２７５２，１９９４）の方法によって作製した。簡潔に説明すると、阪口らの方法（Ｓａｋａｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，ＥＭＢＯ（Ｅｕｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｏｒｇａｎ．）Ｊ．，５：２１３９−２１４７，１９８６）により、表面表現型ｓｌｇＭ^＋ｓｌｇＤ^＋Ｂ２２０^＋を有するＷＥＨＩ−２３１系の細胞溶解液を、界面活性剤の非存在下、低張緩衝液中で調製し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に対して透析した。この細胞溶解液を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、アメリカ・ミシガン州デトロイト）に懸濁してＬｅｗｉｓ系ラットの足の肉趾中に投与してマウスを免疫にし、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に懸濁して４日目と８日目に追加免疫を２回行った。９日後、膝窩及び鼠径領域のリンパ節を切除し、リンパ様細胞懸濁液を調製した。ハイブリドーマの確立、ＨＡＴ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の選択、及びハイブリドーマクローンのリクローニングは、既述の通り行った（Ｋｕｗａｈａｒａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：２７４２−２７５２，１９９４）。免疫組織化学的分析においてリンパ様細胞を染色する２９−１５ｍＡｂを選択した。
（４）抗体及び試薬
親和精製したヤギの抗マウスμ抗体のＦ（ａｂ’）_２断片（ＩＣＮＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．、アメリカ・カリフォルニア州コスタメーサ）、ビオチン結合ピーナツ凝集素（ＰＮＡ）（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、アメリカ・カリフォルニア州バーリンゲーム）、ビオチン結合抗ＣＤ３５ｍＡｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）結合ヤギ抗ラットＩｇＡｂ（＃５９３０１，ＩＣＮ）、ＨＲＰ結合ヤギ抗ラットＩｇＡｂ（ＩＣＮ）、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＡＬＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＡｂ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）、ＦＩＴＣ結合マウス抗ラットκｍＡｂ（ＩＣＮ）、ＰＥ結合抗−Ｂ２２０ｍＡｂ（ＰｈａＭｉｎｇｅｎ）、およびＡＬＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＡｂ（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．，ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）は購入したものを用いた。抗Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、抗μ（ＡＭ／３）及び抗δ（ＣＳ／１５）などのビオチン結合ｍＡｂは、当研究室で作製した。抗ＣＤ４０ｍＡｂ（ＬＢ４２９）は当研究室で確立した（Ｎｏｍｕｒａｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，４５：１９５−２０３，１９９５）。ＡＭ／３及びＣＳ／１５のハイブリドーマは、三宅健介博士（佐賀医科大学、免疫学教室）より提供頂いた。ビオチン結合抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１は、ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）（アメリカ・カリフォルニア州サンディエゴ）より購入した。抗ＢｒｄＵｍＡｂは、ノボカストラ・ラボラトリーズ・リミテッド（ＮｏｖｏｃａｓｔｒａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）（イギリス・ニューカッスル）より入手した。ウサギ抗マウスＭＣＭ３／Ｐ１Ａｂは文献に記載されている（Ｋｉｍｕｒａ，Ｈ他、１９９４，ＥＭＢＯＪ．１３，４３１１−４３２０）。
（５）免疫組織化学
免疫組織化学的染色は、既報の通り実施した（Ｅｚａｋｉｅｔａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｈｉｓｔｏｌ．Ｃｙｔｏｌ．，５８：１０４−１１５，１９９５；Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：６９６−７０７，１９９８）。簡潔に説明すると、ＢＡＬＢ／ｃ系、ＮＺＢ系、（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ_１系、ＮＯＤ系、ＢＸＳＢ系及びＭＲＬ／ｌｐｒ系マウスより切除した標的器官を、ＯＣＴ化合物（マイルス・インコーポレーティッド（ＭｉｌｅｓＩｎｃ．）、アメリカ・インディアナ州エルクハート）中に置いた。ゼラチンコートしたスライドグラス上に置いた６μｍの凍結切片を完全に空気乾燥した。次にスライドグラスをアセトンで１０分間固定し、続いてＰＢＳで１５分間再水和した。スライドグラスを２９−１５ｍＡｂと共に６０分間インキュベートし、ＰＢＳで数回洗浄した。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ラットＩｇ抗体（ＡＬＰ−抗ラットＩｇ、カタログ番号５９３０１、ＩＣＮＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）と共にインキュベートした後、スライドグラスをＰＢＳで４回洗浄した。スライドグラスはベクター・ブルー（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して現像した。
二次染色のため、スライドグラスをビオチン標識ｍＡｂ及びホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、アメリカ・メリーランド州、ガイサースバーグ）と共にインキュベートした。ｐ−ジメチルアミノアゾベンゼン（ＤＡＢ、同仁化学研究所、熊本）で現像した後、切片を１％グルタルアルデヒド・ＰＢＳ溶液で軽く固定した。生体内（ｉｎｖｉｖｏ）で活発な増殖をしている細胞を検出するために、器官を採取する１時間前にＢｒｄＵ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓＣｏ．、アメリカ・ミズーリ州、セントルイス）を静脈内注射した。ＤＮＡ合成を行っている細胞は、抗ＢｒｄＵｍＡｂ及びＡＬＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ抗体（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓＣｏ．）で染色することによって検出し、ベクター・レッドで現像した（Ｍａｔｓｕｎｏｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ．，２５７：４５９−４７０，１９８９）。過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を既報（Ｊｉａｎｇｅｔａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９９２−９９７，１９９７）の通り実施した。切片は全てアクアテックス（Ａｑｕａｔｅｘ）（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、ドイツ・ダルムシュタット）でマウントした。
（６）λｇｔ１１ベクターを使用したｃＤＮＡの分子クローニング
２０ｍＭＩＰＴＧに予め浸したニトロセルロースフィルター（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ、ドイツ・ダルムシュタット）上に融合タンパクを移した後、２９−１５ｍＡｂの上澄を使用して、マウス脾臓、マウス骨髄、ＷＥＨＩ−２３１細胞及びＡ２０細胞からのｍＲＮＡで構築されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした（Ｉｎｕｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：２７１４−２７２３，１９９５）。ファージプレートを４２℃で４時間インキュベーションし、次にプレートをフィルターで覆い、さらに３７℃で４時間インキュベーションした。フィルターを洗浄緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２００．１％含有ＰＢＳ）で３回洗浄し、ブロック緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ、５％脱脂乾燥乳）中で１時間ブロックし、次に２９−１５ｍＡｂと共にインキュベートした。^１２５Ｉで標識したヒツジ抗ラットＩｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イギリス・バッキンガムシャー）を使用したオートラジオグラフィーによって陽性のシグナルを検出した。最初のｃＤＮＡクローンは、融合タンパクとしてポリペプチドをコードすることができる２８０ｂｐの断片を含有していた。この最初の２８０ｂｐの断片を使用して、より長いｃＤＮＡクローンを別のＷＥＨＩ−２３１ｃＤＮＡライブラリーから単離した。二次ｃＤＮＡクローンの４．９ｋｂの断片は、最長の４．５ｋｂのオープンリーディングフレームをコードした。さらに５’配列を決定するために、５’−ＲＡＣＥ法を利用したＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ社のｒａｃｅキットを使用した。
（７）組織切片上のイン・サイチュ・ＲＮＡハイブリダイゼーション
イン・サイチュ・ＲＮＡハイブリダイゼーションを既報（Ｋｏｎｄｏｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８０：２０４４−２０５１，１９９２）の通り実施した。パラフィン包理切片をシラン化したスライドグラス上にマウントした。スライドグラスを脱パラフィン処理した後、ジゴキシゲニンで標識したｇａｎｐ２８０ｂｐリボプローブを使用してハイブリダイゼーションを５０℃で１６時間実施した。スライドグラスをＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸［ｐＨ７．６］、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ）で数回、３７℃で洗浄した後、２×及び／又は０．２×ＳＳＣ溶液で５０℃で洗浄した。抗ジゴキシゲニン抗体を使用しつつ、ＡＬＰ基質の存在下で発色させた。
（８）ＧＳＴ−ｃＤＮＡ融合タンパク及び別の抗ＧＡＮＰｍＡｂの作製
ＧＡＮＰの一部（配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の６７９〜１０２８番のアミノ酸）をコードするｇａｎｐｃＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、アメリカ・ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）に導入した。組換えプラスミドは全ての挿入及び結合についてのＤＮＡ塩基配列決定で確認した。ＧＳＴ−ＧＡＮＰ融合タンパクは、グルタチオン−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムクロマトグラフィーによって、既報（Ｉｎｕｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：２７１４−２７２３，１９９５）の通り作製した。４２−４３と命名した抗ＧＡＮＰｍＡｂは、上述のようにラットにおける融合タンパクの免疫によって確立した。
（９）ウェスタンブロット分析
蛋白質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット転移及び蛋白質の免疫検出を既報（Ｋｕｗａｈａｒａｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：１２７３−１２８５，１９９６）の通り実施した。５，０００万個の細胞を１ｍｌのＴＮＥ溶解緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸［ｐＨ７．８］、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、０．０２％ＮａＮ_３）で溶解し、免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７％）で分析した。蛋白質をニトロセルロースフィルター上に移した後、脱脂乾燥乳を５％含有するＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０でフィルターをブロックし、抗ＧＡＮＰｍＡｂと共に６０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で数回洗浄した後、フィルターをＨＲＰ結合ヤギ抗ラットＩｇ（ＩＣＮＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）と共に３０分間インキュベートした。ＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して発色させた。
（１０）亜細胞分画化
完全な核を既報（Ｓｃｈｒｉｂｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１７：６４１９，１９８９）の通り分離した。ＷＥＨＩ−２３１系細胞をＴＢＳで洗浄し、ペレットを緩衝液Ａ（１０ｍＭＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］、１０ｍＭ塩化カリウム、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＰＭＳＦ）中に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートし、ＮＰ−４０を最終的に１％になるように加えた。遠心分離の後、上澄を細胞質分画として回収した。ペレットを同一の緩衝液で再懸濁及び均質化し、染色によって完全な核を得た。試料を遠心分離し、ペレットを冷緩衝液Ｃ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］、０．４Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＰＭＳＦ）に再懸濁し、遠心分離した。上澄を核分画として−８０℃で凍結した。
（１１）イン・ビトロのキナーゼ反応及びホスホアミノ酸分析
イン・ビトロでのキナーゼ反応を免疫沈降物を用いて既報（Ｋｕｗａｈａｒａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：２７４２−２７５２，１９９４）の通り実施した。脾臓Ｂ細胞を既報（Ｎｏｍｕｒａｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，４５：１９５−２０３，１９９５）の方法によって精製した。Ｂ細胞は既報（Ｎｏｍｕｒａｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，４５：１９５−２０３，１９９５）の通り、イン・ビトロでヤギ抗ＩｇＭ抗体及び抗ＣＤ４０ｍＡｂ（ＬＢ４２９）のＦ（ａｂ’）_２分画で４８時間刺激した。細胞を集めて洗浄した後、ＴＮＥ溶解緩衝液で溶解し、抗ＧＡＮＰｍＡｂ（４２−２３）で免疫沈降させた。免疫沈降物は［γ−^３２Ｐ］−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共にインキュベートし、放射性標識した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７％）を用いてオートラジオグラフィーで分析した。ＧＡＮＰに対応するバンドを乾燥ゲルより除いた。ＳＤＳをゲルから除去した後、均質化したゲルをＴＰＣＫ−トリプシン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓＣｏ．）によって３７℃で一晩消化した。試料は６Ｎ塩酸で加水分解し、ＴＬＣ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）上で電気泳動した。
示された蛋白質のＶ８切断マッピングは既報の通りに行った（Ｋｕｗａｈａｒａ，Ｋ．，他、１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２７４２−２７５２）。
（１２）細胞質染色
細胞を２．５％パラホルムアルデヒド・ＰＢＳ溶液で固定し、氷上７０％エタノールに１時間浸透化した。細胞を２９−１５ｍＡｂ及びＦＩＴＣ結合マウス抗ラットκｍＡｂと共にインキュベートした。抗体結合は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、アメリカ・カリフォルニア州マウンテンビュー）で分析した。
（１３）免疫沈降−ウエスタンブロット分析
上記（１０）亜細胞分画化で得た蛋白質を、プロテインＧ−セファロースと組み合わせて抗ＧＡＮＰｍＡｂと一緒に免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ウエスタンブロットフィルターを抗ＧＡＮＰｍＡｂとインキュベートし、次いでＨＲＰ−抗−ラットＩｇとインキュベートした。現像はＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行った。
（１４）逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＴＲＩＳＯＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて培養Ｂ細胞から精製した全ＲＮＡ（各々１μｇ）をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いるｃＤＮＡ合成（１００μｌ容量）のための鋳型として用いた。ＰＣＲ増幅は、Ｔａｑ−Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）およびｇａｎｐまたはＨＰＲＴ（対照）のためのプライマー（Ｈａｎ，Ｓ．，他、１９９６．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７４：２０９４−２０９７）とを用いて、各ｃＤＮＡ溶液２μｌを用いて行った。ｇａｎｐ転写物は５’−ＣＣＧＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣ−３’（フォワードプライマー）（配列表の配列番号５）および５’−ＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡ−３’（リバースプライマー）（配列表の配列番号６）により増幅された。
＜結果＞
（１）リンパ様器官におけるＧＡＮＰ抗原の発現
ＷＥＨＩ−２３１系細胞の溶解液でラットを免疫することによって末梢Ｂ細胞中に発現する分化抗原を認識するｍＡｂを作製した。ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの正常リンパ様器官について、２９−１５ｍＡｂを使用した免疫組織化学的分析では、骨髄中の発現は検出されなかったが、胸腺、脾臓及びリンパ節などのリンパ様器官ではわずかな発現が認められた。脾臓の赤脾髄及びリンパ節の副皮質では少数の細胞が２９−１５抗原を強く発現していた。発現がＰＰの濾胞の中心領域において非常に強かったことは興味深い（図１）。細胞は抗Ｂ２２０ｍＡｂで陽性であり、一方、抗ＩｇＤｍＡｂでは陽性ではない。正常マウスは、小腸管腔を通じて導入された種々の抗原物質の継続的刺激のために、ＰＰ中の明瞭なＧＣと共に二次リンパ様濾胞を与えた。
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）による免疫を繰り返すことで、１２日以内に脾臓中にリンパ様濾胞が形成された。抗原免疫化によって、ＰＰのＧＣに加えて、脾臓及びリンパ節のＧＣ領域においても２９−１５^＋細胞が出現した（図２）。２９−１５抗原はＧＣの細胞中で増強していた。二次リンパ様濾胞の構造において２９−１５^＋細胞の表現型をさらに分析したところ、ほぼ半数のＰＮＡ^＋ＧＣ−Ｂ細胞が２９−１５ｍＡｂに陽性であり、一方、抗ＢｒｄＵｍＡｂには陰性であった（図３）。興味深いことに、２９−１５抗原の発現は、中心溝動脈からの入口の遠位領域でセントロサイトにおいて増強されていた。この表現型はＧＣ−Ｂ細胞の判定基準と一致しており、すでに述べたように２９−１５抗原の「ＧＡＮＰ」という名の裏付けとなっている。
（２）自己免疫傾向ＮＺＢ系マウスの赤脾髄領域におけるＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}Ｂ細胞の出現
イン・ビボの刺激がない場合、正常マウスは脾臓の濾胞領域でほとんどＧＡＮＰ^＋Ｂ細胞を発現しないが、ＢＡＬＢ／ｃ系（図２）及びＣ５７ＢＬ／６系の赤脾髄領域ではＧＡＮＰ蛋白質が著しく発現しているＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞が少々認められた。この細胞は大型であり、普通のＢ細胞とは明らかに異なる。しかし、若齢のＮＺＢ系マウス（８週齢）では、このＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞は、免疫のない脾臓の赤脾髄領域で自然に増加した（図４）。別の自己免疫傾向マウスであるＮＺＷ系では、５〜１２週齢において赤脾髄ではＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞を発現していなかったが、重篤な疾患の組合せである（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ_１系では、赤脾髄においてＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞が中程度発現していた。
他の自己免疫傾向マウスの脾臓においてＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞も自然に現れるか否かを検討した。ＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞は、ＢＸＳＢ系及びＭＲＬ／ｌｐｒ系の脾臓に出現するが、特定の病原がない状態（ＳＰＦ）の同様の週齢のＮＺＷ系及びＮＯＤ系マウスでは顕著な出現は認められなかった。ＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞は加齢の間に識別できるようになり、発病した老齢のＮＺＢ系マウス（１０月齢）の末梢リンパ節に出現した。ＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞はリンパ節では大部分が後期の段階に出現するようであり、ＭＲＬ／ｌｐｒ系では若齢の段階（８週齢）でリンパ節にＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞が出現することは特に興味深い（図５）。これらの結果から、自己免疫傾向のＮＺＢ系、ＢＸＳＢ系及びＭＲＬ／ｌｐｒ系マウスの遺伝的因子は、赤脾髄領域におけるＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞の出現及びリンパ節内への漸増を制御する可能性があることが示唆される。
二色分析によって、赤脾髄におけるＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞の表現型がＰＮＡ⁻Ｂ２２０⁻細胞（図６）及びＩｇＤ⁻ＣＤ３８⁻細胞として示された。これらの細胞は、形質細胞を選択的に染色する抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ｍＡｂで染色した場合に陽性となる。ＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞は細胞質でＩｇＭを発現するが（図７）、この細胞がモット細胞である可能性があることから（Ｊｉａｎｇ，Ｙ．，Ｓ．Ｈｉｒｏｓｅ，Ｙ．Ｈａｍａｎｏ，Ｓ．Ｋｏｄｅｒａ，Ｈ．Ｔｓｕｒｕｉ，Ｍ．Ａｂｅ，Ｋ．Ｔｅｒａｓｈｉｍａ，Ｓ．Ｉｓｈｉｋａｗａ及びＴ．Ｓｈｉｒａｉ．１９９７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９９２−９９７）、ＰＡＳ染色で切片を染色したところ、ＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞は、Ｂ２２０⁻Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１^＋ＰＮＡ⁻ＢｒｄＵ⁻ ＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}（図８）及びＣＤ４０⁻ＣＤ３８⁻とともにＰＡＳ⁻であった。この形質様細胞はＮＺＢ系マウスの脾臓において優先的に現れるが、現在報告されているモット細胞とは異なる。
（３）ＧＡＮＰ抗原をコードするｃＤＮＡクローンの同定
我々は、２９−１５ｍＡｂを使用して、ＷＥＨＩ−２３１系ｃＤＮＡライブラリーより候補のｃＤＮＡクローン（２８０ｂｐの挿入ＤＮＡを有する）を単離し、さらにｇａｎｐと命名したより長いｃＤＮＡを単離した。ヌクレオチド配列の全長（６４２９ｂｐ）をオーバーラップクローンで決定することによって、分子の大きさが２１０ｋＤと予測される１９７１個のアミノ酸からなるポリペプチドが推定された（図９）。ＧＡＮＰ蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に、ｇａｎｐｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。
ＧＡＮＰアミノ酸配列は、温度突然変異体であるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａ）に特徴的な核転写調節因子であると考えられるＳＡＣ３およびヒトＭａｐ８０蛋白質（Ｔａｋｅｉ，Ｙ他，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２１７７−２２１８０）と部分的に相同性を示す（図１０および図１５；Ｂａｕｅｒ，Ａ．及びＲ．Ｋｏｅｌｌｉｎｇ．１９９６．Ｙｅａｓｔ１２：９６５−９７５）。また、ＧＡＮＰ蛋白質は、インスリン促進因子（アミノ酸９９６〜１０６３）、及びＮＦ−ＩＬ−６（アミノ酸３８８〜４５０）を含む種々の転写因子の短い領域内に低い相同性を示す。
ＧＡＮＰ遺伝子は超らせんモチーフのコンセンサス塩基配列を有するが、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー及びホメオドメインのモチーフは認められない。セリン／トレオニンの豊富な領域がＮ−末端の１００個のアミノ酸中に認められたが、この領域は核膜孔複合体として知られるヌクレオポリンとわずかに相同性を有していた。ＧＡＮＰは二つの核局在配列（^４９７ＨＫＫＫ及び^１３４４ＰＭＫＱＫＲＲ）を有するが、これらはＰＳＯＲＴプログラムで示唆されるように、核におけるＧＡＮＰの発現に関与している可能性がある。ＧＡＮＰはまた２つのコイルド−コイルモチーフを有するが、ジンクフィンガー、ロイシンジッパーあるいはホメオドメインモチーフは有していない。さらには、ＣＢＰ／ｐ３００およびｐ／ＣＩＰを含む核転写コ・アクティベータ分子中に認められる４つのＬＸＸＬＬモチーフが存在していたが（ＴｏｒｃｈｉａＪ．ｅｔａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．），３８７：６７７−６８４；Ｈｅｅｒｙｅｔａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．），３８７：７３３−７３６）、これらのモチーフを通じた会合分子は同定されていない。
（５）ｇａｎｐ転写の発現
ノーザンブロット分析によって７ｋｂのｍＲＮＡが検出されたが、対照のβ−アクチンのシグナルに比較して非常に弱いシグナルであり、その発現は試験を行った全ての細胞系、器官及び組織においてかなり偏在していた。２９−１５ｍＡｂにより切片上に検出された領域と同一の領域でｇａｎｐｍＲＮＡが増強されるか否かを検討するために、イン・サイチュ・ＲＮＡハイブリダイゼーション分析を行なったところ、ｇａｎｐｍＲＮＡがＳＲＢＣで免疫した脾臓のＧＣの中央領域において大量に発現されおり、一方、免疫されていない脾臓（図１１）、胸腺、及びリンパ節では発現されていなかった。ｇａｎｐｍＲＮＡは免疫したマウスのＧＣ−Ｂ細胞において増強されたが、この発現パターンは、同一の切片上のヘマトキシリン染色に基づく２９−１５ｍＡｂによる結果と非常に類似していた。非免疫ＢＡＬＢ／ｃ系マウスにおいては、ＰＰのＧＣ領域でもｇａｎｐｍＲＮＡが増強されており、ｇａｎｐｍＲＮＡの発現は、非免疫ＮＺＢ系マウスの脾臓の赤脾髄領域の形質様細胞で盛んであった（図１１）。これらの結果から、ｇａｎｐ遺伝子が２９−１５ｍＡｂによって認識される分子をコードすることが示唆される。
（６）Ｂ細胞におけるＧＡＮＰの発現
抗ＧＡＮＰｍＡｂ（４２−２３）によって、ＷＥＨＩ−２３１系細胞の核及び細胞質の両区画から、２１０ｋＤの一本の蛋白質バンドが検出された（図１２）。つぎに、Ｂ系列細胞の活性化及び分化にＧＡＮＰが機能的に関係する証拠を見出す目的で、非免疫ＢＡＬＢ／ｃ系マウスのＢ細胞を抗ＩｇＭ及び抗ＣＤ４０を併用してイン・ビトロで刺激したところ、抗ＧＡＮＰｍＡｂで検出されるＧＡＮＰ蛋白質の発現が増加した（図１３）。イン・ビトロのＧＡＮＰ免疫沈降物とのキナーゼ反応では、イン・ビトロで刺激された脾臓Ｂ細胞においてＧＡＮＰ蛋白質に結合しているキナーゼ活性が上昇した。従って、ＧＡＮＰ蛋白質では、セリン／トレオニン残基にリン酸化が誘発される（図１４）。これらの結果から、末梢免疫応答において、ＧＡＮＰがＢ細胞を活性化している可能性が示唆された。
また、抗μＡｂおよび抗ＣＤ４０ｍＡｂによる刺激は最大応答を示したが、これらの何れか片方では、僅かの応答のみを示した（データは示さず）。この活性化はまた、インビトロでの抗−μおよび抗−ＣＤ４０コ・ライゲーションによって刺激されたＢ細胞におけるｇａｎｐｍＲＮＡの増加によっても検出された（図１６）。コントロールＨＰＲＴｍＲＮＡと比較して刺激後２４時間および４８時間においてｇａｎｐｍＲＮＡの量が増大することがＲＴ−ＰＣＲにより明確に実証された。
２１０ｋＤａのＧＡＮＰ蛋白質は多数の潜在的リン酸化部位を有しているので、我々は抗ＧＡＮＰ免疫沈降物とのインビトロキナーゼ反応によるリン酸化の誘導を試験した。図１７に示される通り、２１０ｋＤａの蛋白質のリン酸化が、抗−μおよび抗−ＣＤ４０コ・ライゲーションによって刺激された脾臓Ｂ細胞からの抗−ＧＡＮＰ免疫沈降物中に見られた。この結果は、ＧＡＮＰが沈降してもキナーゼ活性が維持されることを示している。
（７）ＧＡＮＰとＭＣＭ３蛋白質との会合
我々は、ＧＡＮＰのカルボキシル末端にＭａｐ８０相同領域（アミノ酸レベルで７６．３％の同一性）を見つけた。Ｍａｐ８０は、ＭＣＭ３（ＤＮＡ複製に必須の蛋白質）の細胞質と核の間の転移に関与する８０ｋＤａの核蛋白質である（Ｔａｋｅｉ，Ｙ．他，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２１７７−２２１８０；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈ．他，１９９４，ＥＭＢＯＪ．１３：４３１１−４３２０；Ｃｈｏｎｇ，Ｊ．Ｐ．他，１９９６，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：１０２−１０６；及びＲｏｍａｎｏｗｓｋｉ，Ｐ．他，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１４１６−１４２５）。そこで、我々はＷＥＨＩ−２３１におけるＧＡＮＰとＭＣＭ３との相互作用について試験した。我々は、抗ＧＡＮＰ免疫沈降物にＭＣＭ３が含まれていることを検出した。ＭＣＭ蛋白質のリン酸化状態は細胞周期の進行の調節において決定的であるようなので（Ｋｉｍｕｒａ，Ｈ．他，１９９４，ＥＭＢＯＪ．１３：４３１１−４３２０；Ｃｈｏｎｇ，Ｊ．Ｐ．他，１９９６，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：１０２−１０６；及びＲｏｍａｎｏｗｓｋｉ，Ｐ．他，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１４１６−１４２５）、抗ＭＣＭ３免疫沈降物を用いてインビトロキナーゼアッセイを行った。ＭＣＭ３の免疫沈降により２１０ｋＤａの位置にリン酸化蛋白質が同時に沈降し、これはＧＡＮＰと同じサイズである（図１９の左のパネル）。抗ＧＡＮＰと抗ＭＣＭ３免疫沈降物由来のこれらの２１０ｋＤａのバンドはＶ８切断マッピングにおいて同一のパターンを示し（図１９の右のパネル）、ＧＡＮＰとＭＣＭ３とがＢ細胞株中で会合していることが示唆される。
次に、我々は、ＭＣＭ３がインビボでマウスの抗原免疫化によってＧＣ−Ｂ細胞において活性化されるかどうかを試験した。上記で使用したものに隣接する切片を抗ＭＣＭ３Ａｂで染色した（図２０）。ＭＣＭ３はＧＣｓにおいても活性化されている。二重染色によりＭＣＭ３とＰＮＡの両方の同時局在が明白に実証された。ＧＣ領域の一部はＦＤＣｓ（リンパ濾胞細胞）によって強く囲まれている。これらの結果により、ＭＣＭ３は、ＦＤＣｓによって大部分が囲まれているセントロブラストおよびＧＡＮＰ^＋セントロサイトを含むＧＣ−Ｂ細胞で活性化されていることが実証された（図２０）。
（８）考察
以上のように、本発明者らは、脾臓の二次濾胞の明領域に局在するＧＣ−Ｂ細胞で発現される新規な蛋白質であるＧＡＮＰを見出した。正常の条件下では多種類の細胞で痕跡量のｇａｎｐｍＲＮＡが検出可能であるが、ＧＡＮＰ蛋白質は免疫されたマウスの特定のＧＣ領域で増強される。多数の研究によって、ｍＡｂを用いて又は特異的なｃＤＮＡクローニングによって認識される分子として、ＧＣ中の種々の分化抗原が示されている（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１２０３−１２１１，１９９４；Ｌｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３：１０２２２−１０２２７，１９９６；Ｋｕｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６：１５４７−１５５６，１９９７）。ほとんどの分子はＧＣ−Ｂ細胞の全領域に出現するが、８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼは暗領域において発現する（Ｋｕｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６：１５４７−１５５６，１９９７）。
ＧＡＮＰ抗原が明領域であるセントロサイトにおいて選択的であることは興味深い。最近の研究では、免疫グロブリン遺伝子の再構成に必要なＲＡＧ蛋白質は明領域のセントロサイトにおいて選択的に発現していることが示されている（Ｈｉｋｉｄａｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈ．ＤＣ），２７４：２０９２−２０９４，１９９６；Ｈａｎｅｔａｌ．，ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈ．ＤＣ），２７４：２０９４−２０９７，１９９６）。パパバシリオウら及びハンらによって示されているように（Ｐａｐａｖａｓｉｌｉｏｕｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈ．ＤＣ），２７８：２９８−３０１，１９９７；Ｈａｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈ．ＤＣ），２７８：３０１−３０５，１９９７）、ＧＣ領域はＴ細胞依存性の抗体応答の間に起こる二次Ｉｇ遺伝子再構成の部位を提供しているので、ＧＡＮＰ蛋白質は、セントロサイト段階での抗原特異的Ｂ細胞の成熟に関係する成分であるのかもしれない。
我々は、ＧＡＮＰのカルボキシル末端部分がＭＣＭ３の核転移を容易にするヒトＭａｐ８０（Ｔａｋｅｉ，Ｙ他，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２１７７−２２１８０）と有意な類似性を有することを見出した。免疫沈降実験によりＧＡＮＰがＷＥＨＩ−２３１におけるＭＣＭ３にも結合することが実証された。ＭＣＭ３は、ＤＮＡ複製の開始に必須であるＭＣＭ蛋白質ファミリー（Ｋｉｍｕｒａ，Ｈ．他，１９９４，ＥＭＢＯＪ．１３：４３１１−４３２０；Ｂｌｏｗ，Ｊ．Ｊ．１９９３．Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２２．９９３−１００２；Ｔｙｅ，Ｂ．Ｋ．１９９４．ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．４：１６０−１６６；Ｃｈｏｎｇ，Ｊ．Ｐ．他，１９９６，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：１０２−１０６；Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｉ，Ｐ．他，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１４１６−１４２５及びＴｈｏｍｍｅｓ，Ｐ．他，１９９２，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：１０６９−１０７４）の一員である。核ＭＣＭ蛋白質の主要画分はＳ期の開始時にクロマチンに結合するが、複製中に解離し、核質に遊離蛋白質として蓄積する。クロマチンからのＭＣＭｓの放出は複数のＭＣＭ蛋白質のリン酸化によって達成され、有糸分裂後のそれらの再会合はそれらの脱リン酸化を付随する。ＭＣＭ蛋白質は、増殖が抑制された分化中の細胞では合成されず、半減期に関連した速度で消滅するようである（Ｍｕｓａｈｌ，Ｃ．，他，１９９８，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２４１，２６０−２６４）。ＭＣＭ３蛋白質は最近、アポトーシス性蛋白質分解の初期の標的であることが示された（Ｓｃｈｗａｂ，Ｂ．Ｌ．他，１９９８，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２３８：４１５−４２１）。Ｓｃｈｗａｂ，Ｂ．Ｌ．他は、ＭＣＭ３の活発な破壊がＭＣＭ複合体を不活性化し、細胞死プログラムの実行中の時期外れのＤＮＡ複製現象を防止する役割を担っていることを提唱している。我々の結果は、ＧＣ−Ｂ細胞が高レベルのＭＣＭ３を発現し、そのうちのあるものはＧＡＮＰと会合することを示している。しかし、細胞周期を停止した分化した細胞で活性化された蛋白質が、Ｓ期の進行に必須な別の蛋白質に結合することは奇妙である。ＧＡＮＰの機能は、結合を通じてのＭＣＭ３蛋白質の不活性化であることが推測される。免疫組織化学データは次の考えと一致する。ＧＡＮＰは、増殖を停止したセントロサイトで活性化される一方、ＭＣＭ３は急速に周期しているセントロブラストそしてＧＣｓのセントロサイトでも発現している。ＭＣＭ３の量は遺伝子発現と活発な破壊を停止することによって減少するであろうが（Ｍｕｓａｈｌ，Ｃ．，他，１９９８，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２４１，２６０−２６４；及びＳｃｈｗａｂ，Ｂ．Ｌ．他，１９９８，Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２３８：４１５−４２１）、ＧＡＮＰとの相互作用を通じてのセントロサイトで依然発現するＭＣＭ３の不活性化は、ＤＮＡ複製を防止する別の機構であるかもしれない。さらに、ＧＡＮＰおよびＭＣＭ３は共に同時沈降するキナーゼによってリン酸化されるようになる（図１９）。高度にリン酸化されたＭＣＭ３は不活性化形態であると考えられるため（Ｋｉｍｕｒａ，Ｈ．他，１９９４，ＥＭＢＯＪ．１３：４３１１−４３２０）、ＧＡＮＰとの会合はＭＣＭ３のリン酸化を刺激するかもしれない。
さらに、ＧＡＮＰ蛋白質は酵母のサッカロミセス・セレビシエのＳＡＣ３分子（ＳＡＣ、アクチンのサプレッサー）と密接な相同性を有しているが、この菌はアクチン遺伝子において温度感受性突然変異（ａｃｔ１−１）のサプレッサーの遺伝的スクリーニングで単離されたものである（図１０；Ｎｏｖｉｃｋｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２１：６５９−６７４，１９８９）。ＳＡＣ３蛋白質は核で発現しており、有糸分裂の正常な進行及び染色体の損失に対する保護のために必要である（Ｂａｕｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．，１０９：１５７５−１５８３，１９９６）。また、ＳＡＣ３の欠失（ｎｕｌｌ）変異体は非常にゆっくりと成長し、野生型の細胞よりも大型である。ＳＡＣ３はアクチン細胞骨格及び有糸分裂の両方に影響する過程に関与しているが、これはＳＡＣ３がアクチン又はアクチン結合蛋白質の遺伝子発現を調節することを示している。
サッカロミセスにおいてロイシン透過酵素活性の転写を増加させる遺伝子（ＬＥＰ−１と呼ばれる）は、ＳＡＣ３と同一である（Ｓｔｅｌｌａｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１１：４６０−４６０，１９９５）。ＬＥＰ−１遺伝子は、選択的アミノ酸輸送に関係する酵母菌ロイシン透過酵素の増強を引き起こすが、真核細胞におけるアミノ酸輸送、特にアミノ酸透過に関与する分子に関してはよく判っていない（Ｍａｓｔｒｏｂｅｒａｒｄｉｎｏｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．），３９５：２８８−２９１，１９９８）。ＳＡＣ３／ＬＥＰ−１配列は多数の転写因子と相同のモチーフを示さないが、すでに決定された生物学的機能（Ｂａｕｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．，１０９：１５７５−１５８３，１９９６）からは、この配列が核において種々の標的遺伝子の調節活性を有することが示唆されている。マウスのＧＡＮＰは、核転写因子に対する典型的なコンセンサスモチーフを示さないものの、酵母のＳＡＣ３遺伝子と共通の先祖をもち、可能なリン酸化部位、２つの核の局在化配列、及び他の転写分子と相互作用する可能性がある２つの超らせん構造と構造的に類似している。
ＧＡＮＰは、Ａｇ免疫化した脾臓のセントロサイトにおいて選択的に活性化されている。それは、ＧＣ領域中のＦＤＣｓと密接に相互作用するセントロサイトサブセットを特定するための分化マーカーとしても有用である。我々の研究は、ＢＣＲシグナルとＣＤ４０同時刺激が一緒になってＧＡＮＰの活性化を引き起こし、ＧＡＮＰ／ＭＣＭ３複合体を介したシグナル伝達を誘導することを示した。
常染色体の劣性遺伝子疾患の自己免疫多腺性内分泌障害（ＡＰＥＣＥＤ）における欠損遺伝子は、ヒト第２１染色体（２１ｑ２２．３）の連鎖分析によって場所が特定されるが、この遺伝子は可能な転写レギュレーターでＡＩＲＥ遺伝子産物をコードしており（Ｎａｇａｍｉｎｅｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，１７：３９３−３９８，１９９７）、この自己抗体は副腎及び他の生殖腺産生組織で発現されるＡＩＲＥ蛋白質を認識している。ＡＰＥＣＥＤの研究から、核コ・アクティベータ活性を有する分子の関与が自己免疫と関係する可能性が考えられる。ＡＩＲＥ及びＧＡＮＰの両蛋白質は、転写レギュレーターの典型的なドメインを有していないが、核転写コ・アクティベータにおいて同様に観察されるようなＬＸＸＬＬモチーフを有している。
Ｂ細胞特異性核コ・アクティベータ（Ｂｏｂ１／ＯＣＡ−Ｂ／ＯＢＦ１）は、最近、細胞型特異性レギュレーターであるＯｃｔ１及びＯｃｔ２として特徴付けられた（Ｌｕｏｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５：４１１５−４１２４，１９９５）。ＯＣＡ−Ｂ標的マウスでは、Ｔ−依存性抗原を用いた免疫の後、脾臓においてＧＣ形成の障害が認められるが、これはＧＣ領域においてＢ細胞成熟が機能的に関与することを示唆している（Ｋｉｍｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．），３８３：５４２−５４７，１９９６；Ｑｉｎｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１７：５０６６−５０７５，１９９８）。ＧＡＮＰ蛋白質はセントロサイトにおけるＯＣＡ−Ｂ細胞の制御下に発現される可能性があり、核コ・アクティベータ分子の分子的相互作用の問題は、ＧＣにおけるＢ細胞成熟を理解するために重要であると思われる。
ＳＬＥのニュージーランドモデルは、疾病感受性遺伝子の染色体位置をマッピングするためのゲノム連鎖研究の実験材料である。腎炎、及び第４染色体上（Ｎｂａ１と称する）、第７染色体上及び第１染色体上（Ｎｂａ２と称する；Ｖｙｓｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：５５６６−５５７４，１９９７）などの自己抗体産生に連鎖する少なくとも１２の非ＭＨＣ遺伝子座がそれぞれ独立にマッピングされた。大型細胞上のＧＡＮＰ抗原は、非免疫ＮＺＢ系マウスの赤脾髄領域で高度に増強されるが（図４〜８）、ＮＺＢ系マウスは、赤脾髄領域にモット細胞と呼ばれる類似の大型ＩｇＭ産生細胞を有していた。モット細胞は、ＮＺＢ系及び（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１系マウスにおいて選択的に現れるが、正常ＢＡＬＢ／ｃ系又はＣ５７ＢＬ／６系マウスには出現しない。
モット細胞の前駆細胞はおそらくＢ−１Ｂ細胞であり（Ｔａｒｌｉｎｔｏｎｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：５３１−５３９，１９９２；Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９９２−９９７，１９９７）、このことはＢ細胞が自己免疫と密接に関係することを示唆している。モット細胞は、細胞質においてＩｇＭの封入体によって識別され、ＰＡＳで陽性に染色される（Ｔａｒｌｉｎｔｏｎｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：５３１−５３９，１９９２；Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９９２−９９７，１９９７）。ＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞はモット細胞であると思われるのでＰＡＳ染色を行ったところ、ＮＺＢ系マウスの赤脾髄領域のＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞はＰＡＳ⁻であった。ＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}ＩｇＭ産生細胞はモット細胞と同様にＮＺＢ系マウスの脾臓中に現れるが、これらの細胞は異なるものであった。疾病感受性にリンクする染色体の遺伝子座の一つに関係する異常Ｂ細胞集団の活性化が起こり得るが、この活性化によってＩｇＭ産生細胞の新しい型が生じるのかもしれない。
いくつかの研究グループから報告されたＬｙｎ^−／−マウス及びＣＤ４０Ｌ^−／−マウスは、類似した自己免疫及び高ＩｇＭ症候群を示すが、これらの状態では封入体を有する免疫芽細胞が脾臓において多く認められる（Ｈｉｂｂｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，８３：３０１−３１１，１９９５；Ｎｉｓｈｉｚｕｍｉｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：５４９−５６０，１９９５；Ｘｕｅｔａｌ．，Ｉｍｍｎｉｔｙ，１：４２３−４３１，１９９４）。これらの観察から、ＢＣＲ及びＣＤ４０によるシグナルの形質導入によって、異常抗体産生形質細胞の産生が調節されていることが示唆される。また、抗ＩｇＭ及び抗ＣＤ４０抗体で脾臓Ｂ細胞を刺激することによってＧＡＮＰ蛋白質のリン酸化活性が誘発されるが、この観察から、ＧＡＮＰ蛋白質がＧＣ領域におけるＢ細胞活性化部位の下流と関係し得ること、及びＮＺＢ系マウスにおける異常Ｂ細胞活性化が、ＧＡＮＰ蛋白質の発現の増加に関係し得ることが示唆された。
実施例２：ヒトＧＡＮＰ遺伝子のクローニング
ラットのＧＡＮＰ遺伝子の配列の情報に基づいてヒトのＧＡＮＰ遺伝子のクローニングおよび配列決定を行った。具体的には、λｇｔ１１−ヒトｈｅａｒｔｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、プライマーとしてｇｓｐｌ−１：ＴＴＴＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴＣＧＣ（配列表の配列番号７）、ｇｓｐｌ−２：ＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣ（配列表の配列番号８）、およびｇｓｐｌ−３：ＣＣＡＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＡＡＡＧＣ（配列表の配列番号９）を使用し、さらに５’ＲＡＣＥＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲａｐｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡＥｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用い、常法によりクローニングと塩基配列の決定を行った。
得られたクローンの塩基配列を決定した。得られたヒトＧＡＮＰ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号４に示す。また、この塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号３および図２１に示す。ヒトＧＡＮＰ遺伝子はマウスＧＡＮＰ遺伝子と高い相同性を示し、またヒトＧＡＮＰはカルボキシル末端側に８０−ｋＤａのＭａｐ８０ドメインを含んでいた。
ＩｎｓｉｔｕＲＮＡハイブリダイゼーションにより、ｇａｎｐ転写物は、扁桃腺のＧＣ領域で活性化されているようであった。ＧＡＮＰ^＋細胞は、メモリーＢ細胞のＣＤ３８^＋ＩｇＤ⁻表現型を発現している。これらの結果は、ヒトＧＡＮＰが二次リンパ性組織におけるＧＣ−Ｂ細胞でも発現していることを示した。また、１９８０アミノ酸から成るヒトＧＡＮＰは、Ｂ細胞中のＭＣＭ３蛋白質に結合するＭａｐ８０相同領域のストレッチを有することから、ＧＣ−Ｂ細胞における細胞周期調節にＧＡＮＰが関与していることが示唆される。
さらに、得られたヒトＧＡＮＰ遺伝子とヒト染色体標本を用いてＦＩＳＨ法によりＩｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。結果を図２２に示す。図２２から分かるように、ヒトＧＡＮＰ遺伝子とＭａｐ８０を有するゲノム断片は染色体２１番長腕２２．３にマッピングされた。
産業上の利用可能性
本発明の蛋白質はキナーゼ活性を有する新規な蛋白質であり、自己免疫状態において異常Ｂ細胞分化のシグナル変換に関与する可能性がある。従って、本発明の蛋白質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド及び抗体は、自己免疫の機構を解明するのに有用である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、正常マウスのＰＰにおける２９−１５^＋細胞の検出を示した写真である。２９−１５ｍＡｂ及びＡＬＰ抗ラットＩｇ抗体を用いて、ＰＰについて免疫組織化学的分析を実施した。陽性細胞は、ベクターブルーＡＬＰ基質を有する中央領域に出現し、非特異的内在性ＡＬＰ活性を含む小腸絨毛では、周辺領域に強いシグナルが認められた。二色染色を行うために、切片はビオチン抗Ｂ２２０ｍＡｂ又はビオチン抗ＩｇＤｍＡｂのいずれかでさらに染色し、ＤＡＢ及びＨＲＰ−ストレプトアビジンによって発色させた。
図２は、ＳＲＢＣ免疫化マウスのＧＣ領域における２９−１５^＋細胞の出現を示した写真である。正常ＢＡＬＢ／ｃ系マウスは、１２日間に４回ＳＲＢＣを注射し、脾臓切片をヘマトキシリンで染色するか、図１と同様な免疫組織化学染色で調べた。２９−１５ｍＡｂで染色した後に比較すると、正常及びＳＲＢＣ免疫化ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの切片は類似していた。
図３は、ＳＲＢＣ免疫化マウスのＧＣ領域における２９−１５^＋細胞の出現を示した写真である。ＧＣ領域の切片を「材料と方法」に記載した個々の色と組み合わせてＰＮＡ、抗ＢｒｄＵ及び２９−１５ｍＡｂで染色した。上段の写真はＧＣ領域（ＧＣ）及び中心溝動脈（ＣＡ）のヘマトキシリン染色を示し、中央の写真は２９−１５^＋ＰＮＡ^＋細胞を指す三色染色を示す。下段は２９−１５^＋ＰＮＡ^＋細胞を図解したものである。
図４は、自己免疫傾向マウスの赤脾髄領域におけるＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞の発現を示した写真である。ＢＡＬＢ／ｃ系、ＮＯＤ系、ＮＺＢ系、（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ_１系、ＢＸＳＢ系及びＭＲＬ／ｌｐｒ系の非免疫マウスの脾臓から切片を作製した。全てのマウスは生後６〜８週間で使用した。２９−１５ｍＡｂで染色したＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞は、ＮＺＢ系、（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ_１系、ＭＲＬ／ｌｐｒ系及びＢＸＳＢ系の赤脾髄に出現した。
図５は、自己免疫傾向マウスの赤脾髄領域におけるＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞の発現を示した写真である。膝窩領域のＬＮ切片を２９−１５ｍＡｂで染色した。ＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞は、高齢のＮＺＢ系マウス（１０月齢）及びＭＲＬ／ｌｐｒ系マウス（８週齢）の末梢ＬＮに出現した。
図６は、自己免疫傾向マウスにおけるＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞の特徴づけを示した写真である。非免疫ＮＺＢ系マウス（８週齢）の脾臓切片を作製した。下記の試薬の一種と組み合わせて２９−１５ｍＡｂを用いて免疫組織化学的分析を実施した：抗Ｂ２２０、ＰＮＡ。
図７は、自己免疫傾向マウスにおけるＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞の特徴づけを示した写真である。非免疫ＮＺＢ系マウス（８週齢）の脾臓切片を作製した。下記の試薬の一種と組み合わせて２９−１５ｍＡｂを用いて免疫組織化学的分析を実施した：抗ＩｇＭ、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１、抗ＢｒｄＵｍＡｂ。
図８は、ＰＡＳ染色によってＮＺＢ系マウスに現れるモット細胞を示した写真である。
図９は、マウスＧＡＮＰ蛋白質の推定アミノ酸配列を１文字標記で示した図である。
図１０は、ＧＡＮＰ蛋白質の構造を示した図である。図中、Ｓ／Ｔｒｉｃｈｒｅｇｉｏｎ：セリン／トレオニンが豊富な領域、ＳＡＣ３ｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎ：ＳＡＣ３相同領域、ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ：核局在化シグナルを示す。４つのＬＸＸＬＬモチーフが存在する。
図１１は、ｇａｎｐ遺伝子のイン・サイチュＲＮＡハイブリダイゼーションの結果を示した写真である。ＳＲＢＣ免疫、非免疫ＢＡＬＢ／ｃ系、及びＮＺＢ系マウスの脾臓切片をｇａｎｐアンチセンスプローブを用いてハイブリッド形成させた。図中、白脾髄領域（ＷＰ）、赤脾髄領域（ＲＰ）及びＧＣ領域（ＧＣ）を示す。ＮＺＢ系マウスの赤脾髄領域にＧＡＮＰ^{ｄｅｎｓｅ＋}細胞が認められた。
図１２は、ＧＡＮＰ蛋白質を免疫沈降後のウエスタンブロットで分析した結果を示した図である。ＧＡＮＰ蛋白質は、ＷＥＨＩ−２３１系細胞の細胞質分画及び核分画で発現する２１０ｋＤの蛋白質として検出された。
図１３は、正常ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾臓Ｂ細胞を、ヤギ抗ＩｇＭ抗体（１０μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ４０ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）のＦ（ａｂ’）_２で４８時間刺激し、抗ＧＡＮＰｍＡｂで染色した結果を示した図である。
図１４は、抗ＧＡＮＰ免疫沈降物を用いて［γ−^３２Ｐ］−ＡＴＰの存在下で１０分間イン・ビトロのキナーゼ反応を実施した結果を示した図である。蛋白質のリン酸化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離の後、オートラジオグラフィーによって検出した。ＧＡＮＰのリン酸化を矢印で示し（図Ａ）、リン酸化ＧＡＮＰ蛋白質のホスホアミノ酸分析も示した（図Ｂ）。
図１５は、マウスＧＡＮＰ蛋白質の構造を示した図である。図中、ＳＡＣ３およびＭａｐ８０と相同な領域、核局在化配列（ＮＬＳｓ）、およびコイルド−コイル領域を示す。４つのＬＸＸＬＬモチーフを黒で示す。
図１６は、ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。インビトロでの抗−μ−及び抗−ＣＤ４０−刺激Ｂ細胞におけるｇａｎｐｍＲＮＡの活性化が示されている。ＨＰＲＴをコントロールとして使用し、各鋳型の量を確認した。
図１７は、インビトロキナーゼ反応の結果を示す。細胞溶解物を未刺激（左）または刺激（右）した細胞から調製し、抗ＧＡＮＰ免疫沈降に付した。インビトロキナーゼ反応は［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰの存在下において１０分間抗ＧＡＮＰ（４２−２３）免疫沈降物を用いて行った。蛋白質のリン酸化はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後にオートラジオグラフィーによって検出した。矢印はリン酸化されたＧＡＮＰの位置を示す。
図１８は、ＧＡＮＰとＭＣＭ３の物理的会合を示す図である。ＷＥＨＩ−２３１からの細胞溶解物を抗−ＧＳＴ、抗−ＧＡＮＰ（４２−２３）、または抗−ＭＣＭ３Ａｂで免疫沈降した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、蛋白質を電気泳動により膜に移し、抗ＭＣＭ３−Ａｂをプローブとして検出した。
図１９は、ＧＡＮＰとＭＣＭ３の物理的会合を示す図である。ＷＥＨＩ−２３１細胞溶解物からの抗−ＧＳＴ、抗−ＧＡＮＰ（４２−２３）および抗−ＭＣＭ３免疫沈降物をインビトロキナーゼアッセイに付した。正常ウサギ血清（ＮＲＳ）を抗−ＭＣＭ３Ａｂのためのコントロールとして用いた。試料を７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ＧＡＮＰおよびＭＣＭ３に対応するバンドを左側のパネルにおいて矢印で示した。右側のパネルでは、２１０−ｋＤａのバンドのＶ８切断マッピングが同一の切断パターンを示した。コントロールとして、無関係のＶ８消化蛋白質を平行して分離した。
図２０は、抗−ＭＣＭ３Ａｂと抗−ＣＲ１ｍＡｂまたはＰＮＡとの二重染色を行った結果を示す図である。ＭＣＭ３の発現はＧＣ領域で活性化された。
図２１は、ヒトＧＡＮＰ蛋白質の推定アミノ酸配列を１文字標記で示した図である。
図２２は、ヒト染色体を用いてＦＩＳＨ法によってヒトｇａｎｐとＭａｐ８０をマッピングした結果を示す写真である。

Claims

配列表の配列番号１または配列番号３に記載のアミノ酸配列により特定されるＧＡＮＰ蛋白質。
配列表の配列番号１または３に記載のアミノ酸配列において、一若しくは複数のアミノ酸が欠失しており、一若しくは複数のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されており、及び／又は一若しくは複数の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するＧＡＮＰ変異蛋白質。
請求項１又は２に記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
請求項３に記載のポリヌクレオチドのアンチセンス鎖の塩基配列からなるアンチセンスポリヌクレオチド。
請求項１又は２に記載の蛋白質を認識する抗体。