JP2004073142A

JP2004073142A - Ｇａｎｐ結合性タンパク質

Info

Publication number: JP2004073142A
Application number: JP2002241342A
Authority: JP
Inventors: Shigeo Sakaguchi; 阪口　薫雄
Original assignee: Kumamoto Technology and Industry Foundation
Current assignee: Kumamoto Technology and Industry Foundation
Priority date: 2002-08-22
Filing date: 2002-08-22
Publication date: 2004-03-11

Abstract

【課題】癌又は自己免疫疾患において認められるＢ細胞の異常増殖に関与しているＧＡＮＰタンパク質とともに増減するＧＡＮＰ結合性タンパク質を探索し、同定すること。
【解決手段】下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。（ａ）特定なアミノ酸配列；（ｂ）特定なアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するアミノ酸配列；又は、
（ｃ）特定なアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するアミノ酸配列：
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＢ細胞の増殖と分化に関与するＧＡＮＰに対する結合活性を有する新規なタンパク質、該タンパク質とタンパク質ホスファターゼとからなるタンパク質複合体、ならびにそれらの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌は人間の死亡率の３分の１を占めることからその早期発見の研究が鋭意進められている。また我国では高齢化が進んでいるが、それに伴って自己免疫疾患の症例も多くなってきており、自己免疫疾患の発症のメカニズム、診断薬についての研究も精力的に行われている。癌や自己免疫疾患については、様々な細胞、タンパク質が関与しているが、Ｂ細胞も重要な役割を担っていることが分かっている。Ｂ細胞が癌や自己免疫疾患の発症に関与するメカニズムを解明することができれば、癌や自己免疫疾患に対して有効な対策がとれる。
【０００３】
自己免疫疾患の一つとしてＮＺＢ系マウスにおける自己の赤血球に対する免疫反応で起こる自己免疫性溶血性貧血が知られている。本発明者らはこの自己免疫性溶血性貧血を発症するＮＺＢ系マウスの脾臓で自己免疫状態において異常Ｂ細胞分化のシグナル変換に関与する可能性のある２１０ｋＤａのＧＡＮＰタンパク質を発見した（ＷＯ　００／５０６１１）。最近このＧＡＮＰタンパク質は自己免疫以外に癌細胞の増殖にも関与しているとの報告もある。
【０００４】
ＧＡＮＰタンパク質の機能についてはこれまで幾つか解明されている。
第一には、Ｂ細胞の分化への関与である。一般にＢ細胞の分化については次のことが知られている。まずＴ細胞依存性抗原による免疫でリンパ濾胞の胚芽中心の暗領域において抗原特異性Ｂ細胞がセントロブラストとして増殖する。このクローン増殖の後、セントロブラストは明領域に移動し、細胞周期を停止し、小さなセントロサイトを形成する（Ｋｅｌｓｏｅ，Ｇ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ　１６，３２４−３２６，１９９５；Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３８１，７５１−７５８，１９９６；Ｔｅｗ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５６，３９−５２，１９９７；　ＭａｃＬｅｎｎａｎ，Ｉ．Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５６，５３−６６．１９９７）。ＧＡＮＰは上記のようなＢ細胞のセントロブラストからセントロサイトへの分化に関与している。ＧＡＮＰは脾臓や胸腺においては低レベルで存在するが、ｉｎｖｉｖｏにおいてＴ細胞依存性抗原で免疫された後は胚中心Ｂ細胞において選択的に発現することが確認されている。また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、Ｂ細胞中で抗ＩｇＭ抗体と抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の刺激によって発現が誘導される　（Ｋｕｗａｈａｒａ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ　９５，２３２１−２３２８，２０００）。
【０００５】
第二には、活性化された胚芽中心のＢ細胞のＤＮＡ複製への関与である。
ＧＡＮＰタンパク質のカルボキシル基末端領域はＭａｐ８０の全構造をコードする。このＭａｐ８０はＭＣＭ３（ミニクロモゾーム維持分子３）に結合し（Ｔａｋｅｉ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２２１７７−２２１８０，１９９８）、細胞質から核へのＭＣＭ３の移動に関与している。ＭＣＭ複合体はＤＮＡヘリカーゼ活性を有し（Ｉｓｈｉｍｉ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２４５０８−２４５１３，１９９７）、ＧＡＮＰタンパク質はこのＭＣＭ複合体の成分と結合する能力がある（Ｋｕｗａｈａｒａ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ　９５，２３２１−２３２８，２０００）。また、ＭＣＭとの結合性に加えて、ＧＡＮＰはアミノ基末端領域においてＤＮＡプライマーゼ活性をコードする（Ｋｕｗａｈａｒａ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９８，１０２７９−１０２８３，２００１）これらの両活性はＤＮＡ複製過程においてＤＮＡラギング鎖合成の延長に協働している可能性がある。
【０００６】
ＤＮＡの複製は、複製開始点認識複合体（ＯＲＣ）が結合することにより周期的に存在する複製開始点から始まる。ＯＲＣは８つの部品ＭＣＭ２，３，４，５，６及び７とＤｂｆ４とＣｄｃ４５と命名されたＭＣＭ複合体を取り込む（Ｔｙｅ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　６８，　６４９−６８６，　１９９９）。ＤＮＡ複製に必要なＭＣＭ成分は細胞分裂をコントロールし、認可された因子をデザインすることによりＤＮＡの複製を調整していると考えられる（Ｃｈｏｎｇ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３７５，４１８−４２１，１９９５；Ｋｕｂｏｔａ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１６，３３２０−３３３１，１９９７：　Ｔｈｏｍｍｅｓ，Ｐ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｕｒｖ．２９，７５−９０，１９９７）．
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、癌又は自己免疫疾患において認められるＢ細胞の異常増殖に関与しているＧＡＮＰタンパク質とともに増減するＧＡＮＰ結合性タンパク質を探索し、同定することにある。
本発明の別の課題は、癌又は自己免疫疾患の診断に用いることのできるＧＡＮＰ結合性タンパク質測定用試薬、及び測定用キットを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、酵母を用いてタンパク質−タンパク質相互作用のスクリーニングを実施した結果、ＧＡＮＰと結合する新規タンパク質（Ｇ５ＰＲ）を同定し、さらにこのＧ５ＰＲの構造と機能を解明した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するアミノ酸配列；又は、
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するアミノ酸配列：
【００１０】
本発明によれば、上記タンパク質とタンパク質ホスファターゼとから成るタンパク質複合体が提供される。
本発明の好ましい態様によれば、上記タンパク質ホスファターゼがタンパク質ホスファターゼ５（ＰＰ５）又はタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）である上記タンパク質複合体が提供される。
【００１１】
さらに本発明によれば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子が提供される。
さらに本発明によれば、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子が提供される。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
【００１２】
さらに本発明によれば、本発明の遺伝子を含むベクターが提供される。
さらに本発明によれば、本発明の遺伝子又は本発明のベクターを有する形質転換体が提供される。
【００１３】
さらに本発明によれば、本発明のタンパク質又はタンパク質複合体に対する抗体が提供される。
さらに本発明によれば、上記抗体を含むＧＡＮＰ結合性タンパク質測定用試薬が提供される。
【００１４】
さらに、本発明によれば、上記抗体を含むＧＡＮＰ結合性タンパク質測定用キットが提供される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施態様及び実施方法について詳細に説明する。
（１）本発明のタンパク質及び遺伝子
本発明は、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質、並びにそれをコードする遺伝子に関する。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するアミノ酸配列；又は、
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するアミノ酸配列：
【００１６】
本発明の遺伝子の具体例としては、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
【００１７】
上記した「配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００１８】
上記した「配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、該アミノ酸配列と配列番号１に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも６０％以上であり、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００１９】
上記した「配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００２０】
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，　２^ｎｄ　Ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ．，１９８９．　以後　”モレキュラークローニング第２版”　と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２１】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２２】
上記した「ＧＡＮＰに対する結合活性を有する」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同程度又はそれ以上の親和性でＧＡＮＰと結合することができることを言う。
【００２３】
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１および配列番号２に記載したアミノ酸配列び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてマウスなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。マウスの由来のｃＤＮＡライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。
【００２４】
ＰＣＲ法により配列番号２に記載した塩基配列を有するＤＮＡを取得することもできる。マウスの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号２に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。
ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００２５】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１〜３８，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載された方法に準じて行うことができる。
【００２６】
本明細書中上記した、（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子（変異遺伝子）は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。具体的には、配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。
【００２７】
例えば、配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２８】
本明細書中上記した、（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列は、上述の通り、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
【００２９】
次に、本発明のタンパク質の入手・製造方法について説明する。本発明のタンパク質の入手・製造方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、組み換えタンパク質が好ましい。
【００３０】
天然由来のタンパク質を入手する場合には、該タンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて単離することができる。化学合成タンパク質を入手する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。
【００３１】
本発明のタンパク質を組み換えタンパク質として産生するには、該タンパク質をコードする塩基配列（例えば、配列番号２に記載の塩基配列）を有するＤＮＡ又はその変異体又は相同体を入手し、これを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を製造することができる。
【００３２】
発現ベクターとしては、好ましくは宿主細胞において自立複製可能であるか、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものであればよく、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーターを含有しているものが使用される。また、本発明のＧＡＮＰに対する結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する形質転換体は、上記の発現ベクターを宿主に導入することにより作製することができる。宿主は、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞のいずれでもよく、また宿主への発現ベクターの導入は、各宿主に応じた公知の手法により行えばよい。
【００３３】
本発明においては、上記のようにして作製した本発明の遺伝子を有する形質転換体を培養し、培養物中に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物より本発明のタンパク質を採取することにより組み換えタンパク質を単離することができる。
【００３４】
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。また培養条件も該微生物を培養するのに通常用いられる条件にて行えばよい。培養後、形質転換体の培養物から本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
【００３５】
なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の一例示す配列番号２に記載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造又は入手することができる。
【００３６】
例えば、配列番号２に記載の塩基配列又はその一部を有するＤＮＡプローブとしてマウス又はマウス以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００３７】
（２）本発明の遺伝子を有するベクター
本発明の遺伝子は適当なベクター中に組み込んで組み換えベクターとして使用することができる。ベクターの種類は発現ベクターでも非発現ベクターでもよく、目的に応じて選ぶことができる。
クローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自律複製できるものが好ましく、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる、発現ベクターとしては、好ましくは宿主細胞において自立複製可能であるか、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものを使用する。また、発現ベクターとしては、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーターを含有しているものが使用される。
【００３８】
細菌を宿主細胞として用いる場合は、本発明の遺伝子を発現させるための発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３９】
（３）本発明の遺伝子を有する形質転換体
本発明のＧＡＮＰに対する結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する形質転換体は、上記した組み換えベクター（好ましくは発現ベクター）を宿主に導入することにより作製することができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞のいずれをも用いることができる。また、遺伝子導入には、それぞれの宿主に応じて公知の当業者に利用できる手段で行えばよく、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等により行うことができる。
【００４０】
本発明のタンパク質は、後記実施例に示されるように、タンパク質ホスファターゼ５（ＰＰ５）又はタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）と結合してタンパク質複合体を形成する。従って、本発明のタンパク質はこのようなタンパク質ホスファターゼと複合体を形成した態様をも包含する。
【００４１】
（４）本発明のタンパク質、タンパク質複合体に対する抗体
本発明によりＧＡＮＰ結合性タンパク質が同定されたことにより、該タンパク質に対する抗体を作製することができる。このような抗体の作製は、当該タンパク質、タンパク質複合体又はＧＡＮＰの動態の解明などの研究において有用である。本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、その作製は定法により行なうことができる。
【００４２】
例えば、本発明のタンパク質又はタンパク質複合体（以下、これらを総称して本発明のタンパク質という）を認識するポリクローナル抗体は、本発明のタンパク質を抗原として哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物を免疫することができる。免疫感作の方法は当業者に公知であり、例えば抗原を１回以上投与することにより行うことができる。抗原投与は、例えば７〜３０日間隔で２〜３回投与すればよい。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５〜２ｍｇ程度とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に注射することにより投与することが好ましい。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント又は水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができるが、投与経路や条件等に応じてアジュバントを使用しない場合もある。
【００４３】
免疫感作した哺乳動物を一定期間飼育した後、該哺乳動物の血清をサンプリングし、抗体価を測定する。抗体価が上昇してきたら、例えば１００μｇ〜１０００μｇの抗原を用いて追加免疫を行なう。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物から血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム又はポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の常法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、本発明のタンパク質を認識するポリクローナル抗体を得ることができる。なお血清は、たとえば、５６℃で３０分間処理することによって補体系を不活性化してもよい。
【００４４】
本発明のタンパク質を認識するモノクローナル抗体のグロブリンタイプは特に限定されず、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等が挙げられる。本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株は特に制限されないが、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマとして得ることができる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。
【００４５】
抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用する。抗原としては、本発明のタンパク質又はその部分ペプチドを使用する。免疫動物としてはマウス、ラット等を使用でき、これらの動物への抗原の投与は常法により行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原である本発明のタンパク質との懸濁液もしくは乳化液を動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とを公知の方法（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ　．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６　４９５（１９７５））により融合してハイブリドーマを作製することができる。
【００４６】
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選択にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用する。細胞融合により得られるハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングする。さらに必要に応じて、本発明のタンパク質を用いた酵素免疫測定法によりスクリーニングを行うことにより、本発明のタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。
【００４７】
このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。
【００４８】
また、上記した抗体の断片も本発明の範囲内である。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。
さらに、上記した抗体の標識抗体も本発明の範囲内である。即ち、上記のようにして作製した本発明の抗体は標識して使用することができる。抗体の標識の種類及び標識方法は当業者に公知である。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどの酵素標識、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）又はＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート）等の蛍光標識、コロイド金属および着色ラテックスなどの呈色物質による標識、ビオチンなどのアフィニティー標識、あるいは^１２５Ｉなどの同位体標識などを挙げることができる。本発明の標識抗体を用いた酵素抗体法、免疫組織染色法、免疫ブロット法、直接蛍光抗体法又は間接蛍光抗体法等の分析は当業者に周知の方法により行うことができる。
【００４９】
（５）本発明のＧＡＮＰ結合性タンパク質測定用試薬
本発明は、さらに、上記方法で製造された本発明の抗体を含み、免疫学的測定法などにより被検試料中の本発明のタンパク質を測定することのできるＧＡＮＰ結合性タンパク質測定用試薬を提供する。
本発明はまた、上記抗体を標識化した標識化抗体を含むＧＡＮＰ結合性タンパク質測定用試薬を提供する。標識の種類及び標識方法は上記の通りである。
上記試薬を用いて本発明のＧＡＮＰ結合性タンパク質を免疫測定するための方法としては、例えば酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法等を挙げることができる。
【００５０】
（６）本発明のＧＡＮＰ結合性タンパク質測定用キット
本発明のＧＡＮＰ結合性タンパク質測定用キットは、上記方法で製造された抗体を含む。免疫学的測定法が例えば酵素免疫測定法の場合、本キットには、抗体を固定化させるための担体、酵素標識化抗体、標識酵素の基質などの標識酵素活性測定用試薬、緩衝液などを含むことができる。
本発明のＧＡＮＰ結合性タンパク質測定用キットを用いれば、被検試料中の本発明のタンパク質量を正確かつ簡便に測定できる。
ＧＡＮＰタンパク質はＢ細胞の増殖と分化に関与し、Ｂ細胞が異常に増加する癌や自己免疫疾患では、ＧＡＮＰタンパク質とともにＧＡＮＰ結合性タンパクもまた増加する。従って、ＧＡＮＰ結合性タンパクは癌や自己免疫疾患の発症の指標となる。本キットによれば、測定されたＧＡＮＰ結合性タンパク質量を指標として癌又は自己免疫疾患の診断を行うことができる。
【００５１】
具体的には、測定により本発明のＧＡＮＰ結合性タンパク質量の増加が検出された場合は、例えば、各種癌（子宮体癌、子宮内膜腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、神経芽腫、膀胱癌、黒色腫等）や自己免疫性疾患（慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、リウマチ熱、結節性多発動脈炎、ベーチェット病、強皮症、シェーグレン症候群、慢性甲状腺炎、骨軟化症、門脈圧亢進症炎など）などの疾病である、又は将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
診断に供する被検試料は、血液、血清、滑膜液などを用いることができる。
【００５２】
【実施例】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）　ＧＡＮＰ結合性タンパク質の分子クローニング
ＧＡＮＰ結合分子を、酵母２−ハイブリッドｃＤＮＡクローニング法によってＭａｔｃｈｍａｋｅｒシステム（クロンテク（ＣＬＯＮＴＥＣＨ））を用いてスクリーニングした。完全長マウスｇａｎｐ　ｃＤＮＡ（〜６ｋｂ）を使用し、図１Ａに示す７つのＤＮＡ断片（Ｇ１〜Ｇ７と呼ぶ。各々約１ｋｂの大きさ）をＰＣＲによって調製し、これらをＢａｉｔ　ＶｅｃｔｏｒｐＡＳ２．１に導入した。Ｂａｉｔ　Ｖｅｃｔｏｒに導入したマウスｇａｎｐ　ｃＤＮＡの３，８４４ｎｔ〜５，７５７ｎｔからの領域（Ｇ５）を、改良酢酸リチウム法によりサッカロミセスセレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙ１９０細胞中に導入した。トリプトファンを含まない合成デキストロース培地で選択した細胞を、ｐＡＣＴ２ベクター（クロンテク（ＣＬＯＮＴＥＣＨ））中のＧＡＬ４トランス活性化ドメイン下に導入したマウス胎児（Ｅ１２）肝臓ｃＤＮＡの発現ライブラリーにて形質転換した。約２×１０^６の形質転換体を２５ｍＭの３−アミノトリアゾール（Ｓｉｇｍａ）を含むがトリプトファン、ロイシン、ヒスチジンを含まないプレート上でスクリーニングし、増殖する細胞をβ−ガラクトシダーゼ反応によりさらにスクリーニングした。陽性クローンから回収されたプラスミドＤＮＡを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１への形質転換により増幅し、続くスクリーニング分析では自動ＤＮＡ配列アナライザー（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって挿入物の特徴づけを行った。約１２０の陽性クローンの配列結果を調べると、３つの独立したクローンは同じ遺伝子を示した。
【００５３】
Ｇ５領域に特異的に結合した１つのクローン（Ｇ５ＰＲ）の全長配列を決定するために、５’−ＲＡＣＥ法によってマウスＧ５ＰＲの完全長ｃＤＮＡ（１．６ｋｂ）を単離し、さらに分析した。分子量は５３．４ｋＤａと計算された。マウスＧ５ＰＲは配列番号１に示す４５３のアミノ酸からなり（配列番号１）、マウスＧ５ＰＲの全長ｃＤＮＡは１．３５９ｂｐの読み取り枠を含んでいた。（図１Ｂ、配列番号２）。このＥＭＢＬデータベースに提出されたマウスＧ５ＰＲ　ｃＤＮＡの配列データは、受け入れ番号ＡＪ２３８２４７にて受理された。
【００５４】
データベース上の相同性探索により、Ｇ５ＰＲのアミノ酸１８４番目から４５３番目の領域は、ＰＲ７２（３８％）（Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｐ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１５２６７−１５２７６，１９９３）、ＰＲ４８（４０％）（Ｙａｎ，Ｚ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，２０．１０２１−１０２９，２０００）、およびＰＲ５９（３７％）（Ｖｏｏｒｈｏｅｖｅ，Ｐ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，　５１５−５２４，１９９９）のいくつかの制御因子Ｂのサブユニットと相同性を示した（図１Ｃ）。Ｇ５ＰＲのモチーフ分析では、Ｃａ^２＋相互作用により制御されるホスファターゼの特徴である核移行シグナル配列（ＮＬＳ）とＣａ^２＋結合モチーフであるＥＦ−ハンドを示した。系統樹では、Ｇ５ＰＲが、機能が未知のＡ．　ｔｈａｌｉａｎａ　ＴＯＮ２（４４％）との相同性を示す（Ｔｒａａｓ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３７５，６７６−６７７，１９９５）　（図１Ｄ）。
【００５５】
各種器官でのＧ５ＰＲの発現ＥＳＴクローンを探索すると、ヒトＧ５ＰＲはＦＬＪ２０６４４（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）；ＡＫ０００６５１）と同一であり、アミノ酸の比較によりマウスＧ５ＰＲと９８．９％同一であった。図２ＡはマウスとヒトＧ５ＰＲタンパク質のアミノ酸配列の比較を示す。同一の残基には影をつけてある。
図２ＢはヒトＧ５ＰＲ遺伝子のゲノム構造を示す。エキソンは、黒の四角で示す（エキソンＩＩとＶＩＩの下の矢印は、後記のＲＴ−ＰＣＲ分析に使用したＧ５ＰＲ特異的プライマーを示す）。ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースを用いてヒトＧ５ＰＲ遺伝子の全エキソン（図２Ｂ）に対応する遺伝子クローンＡＬ１２１５９４を見つけた。その遺伝子クローンではヒトＧ５ＰＲ遺伝子は、第１４染色体の３７，５９３ｂｐ領域の１３のエキソンからなることがわかった。
【００５６】
（実施例２）　種々の臓器中のＧ５ＰＲの発現
（１）実験方法
ＴＯＲＩＺＯＬ（登録商標）ＬＳ試薬（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの種々の組織と臓器、マウスＬ細胞、および骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の総ＲＮＡを調製した。ＳＰ２／０からポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡを、オリゴ−ｄＴカラム（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））から調製した。ＲＴ−ＰＣＲのために、既報（Ｍａｅｄａ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６４，７０２−７０６，１９９９）に従い、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡ　ＰＣＲキット（パーキンエルマーシータス（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ））を用いて各１μｇの総ＲＮＡを４２℃で１時間逆転写した。ヒトＧ５ＰＲエキソン２と７に対応するマウスＧ５ＰＲ特異的プライマーｅｘ２（５’−ＴＡＴＡＡＧＡＣＣＡＴＡＣＣＣＣＧＧＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧＧ−３’：配列番号３）とｅｘ−７（５’−ＧＡＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＴＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＧＴＣ−３’：配列番号４）を用いるＰＣＲの増幅産物は、アガロースゲル電気泳動（１．５％）により適切であることが確認された。β−アクチンプライマーであるＦＷＤ（５’−ＣＣＴＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧ−３’：配列番号５）とＲＥＶ（５’−ＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＣＴＡＧＧＡＧＣＣ−３’：配列番号６）を用いて、対照ＰＣＲ反応を行った。ノーザンブロッッティングのために、各２５μｇの総ＲＮＡ又は４μｇのポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡを使用した。マウスＧ５ＰＲ　ｃＤＮＡとβ−アクチンプローブはランダムプライミング法により放射性標識した。
【００５７】
（２）実験結果
図２ＣはＧ５ＰＲの発現を種々の組織や臓器から単離した総ＲＮＡを用いて分析した結果を示す。β−アクチンを対照として用いるＲＴ−ＰＣＲでＲＮＡ量を標準化した。調べたすべてのマウスの臓器と組織（心臓、脳、脾臓、胸腺、肺、肝臓、腎臓、および睾丸を含む）で６４８ｂｐのバンドが検出された。
図２ＤはＧ５ＰＲ　ＲＮＡ発現のノーザンブロット解析の結果を示す。マウスＧ５ＰＲの転写物は、１．６ｋｂ　ｍＲＮＡのバンドを示した（図２Ｄ、上のパネル）。対照として、フィルターをはがしβ−アクチンプローブと再プローブ結合させて得られた結果を示す（図２、下のパネル）。
【００５８】
（実施例３）　Ｇ５ＰＲとＧＡＮＰとの結合
Ｇ５ＰＲタンパク質全体のタンパク質−タンパク質の結合を研究するために、酵母に全Ｇ５ＰＲ　ｃＤＮＡ発現構築体を作成した。Ｇ５ＰＲタンパク質はＧＡＮＰのＧ５領域と結合するが、Ｇ６領域とは結合しない。ベクター中の逆結合ではＧ５ＰＲはｐＡＣＴ２により発現したＧ５領域と結合することを示した。すなわち、Ｇ５ＰＲは酵母細胞において特にＧＡＮＰタンパク質と結合することを示した。そこで、本実施例では哺乳類の細胞においてＧ５ＰＲがＧＡＮＰと結合するかどうか確認するために、Ｆｌａｇ−ＧＡＮＰとＭｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲとの結合を調べた。
【００５９】
（１）実験方法
▲１▼　ｐＣＸＮ２−Ｍｙｃ−Ｇ５ＰＲの構築
Ｍｙｃ標識配列（５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＣＣ−３’：配列番号７）をＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８部位の間に導入することにより、ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＡベクターからｐｃＤＮＡ−Ｍｙｃ構築物を作成した。グリーンフルオレセントタンパク質（ＧＦＰ）発現のために、増強したＧＦＰ（ＥＧＦＰ）ｃＤＮＡを、ＰＣＲによりｐＥＧＦＰ（クロンテク（ＣＬＯＮＴＥＣＨ））から増幅し、ｐｃＤＮＡ−Ｍｙｃベクター（ｐｃＤＮＡ−Ｍｙｃ−ＥＧＦＰ）に導入した。推定されるＧ５ＰＲタンパク質（アミノ酸１４番目〜４５３番目）のほとんどをコードするオリジナルクローンのマウスＧ５ＰＲ　ｃＤＮＡをｐＧＥＸ−４Ｔ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ））のＥｃｏＲＩ部位に連結し、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との組換え融合タンパク質を調製した。哺乳動物発現用構築物を作成するために、マウスＧ５ＰＲのＢａｍＨＩ断片をｐｃＤＮＡ−Ｍｙｃ又はｐｃＤＮＡ−Ｍｙｃ−ＥＧＦＰのＢａｍＨＩ部位に導入した。ＳａｌＩ消化により調製したＭｙｃ−Ｇ５ＰＲ又はＭｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲ断片を、平滑末端連結によりｐＣＸＮ２ベクターのＸｈｏＩ部位に導入し、ｐＣＸＮ２−Ｍｙｃ−Ｇ５ＰＲを得た。
【００６０】
▲２▼　トランスフェクション、免疫沈降、およびウェスタンブロッティング
ＣＯＳ−７細胞を、熱不活性化１０％胎児牛血清を補足したダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ））中で５％ＣＯ_２で３７℃で維持した。細胞（１×１０^６）を１０ｃｍのシャーレに接種し、ＦｕＧＥＮＥ−６（ロッシュダイアグノスティクス（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を用い、製造業者のプロトコールに従ってｐＣＸＮ２−Ｍｙｃ−Ｇ５ＰＲとＦｌａｇ−ＧＡＮＰを同時トランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を採取し、１μｇ／ｍｌの各プロテアーゼ阻害剤（フッ化フェニルメチルスルホニル、ロイペプチン、ペプスタチン、およびアプロチニン）を含有する１％ＴＮＥ溶解緩衝液（１％ノニデットＰ４０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した。細胞溶解物を、プロテインＧ−又はプロテインＡ−セファロースであらかじめ清澄化し、１０μｇ／ｍｌの抗Ｆｌａｇ　Ｍ２モノクローナル抗体（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））又は４μｇ／ｍｌの抗Ｍｙｃ９Ｅ１０モノクローナル抗体（サンタクルツバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ　ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））とともに、絶えず交代させながら１２時間インキュベートした。ビーズを溶解緩衝液で５回洗浄し、ＳＤＳ−試料緩衝液で処理し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離し、ニトロセルロースフィルター膜に移した。フィルターを抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体と抗Ｍｙｃモノクローナル抗体とともに１時間インキュベートした後、０．０２％ツイーン２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中で３回洗浄し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）の第２抗体（ザイメッドラボラトリーズインク（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．））でインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ペルオキシダーゼ活性をＥＣＬキット（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ））を用いて検出した。
【００６１】
▲３▼　ＧＳＴプルダウンアッセイ
発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔに導入したＧ５ＰＲ　ｃＤＮＡ断片を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＢＬ２１中に形質転換し、組換えＧＳＴ−Ｇ５ＰＲ融合タンパク質を既報（Ｉｎｕｉ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４，２７１４−２７２３，１９９５）に従い精製した。等量のＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｇ５ＰＲ融合タンパク質（５μｇ）を１０μｌのグルタチオン−セファロースビーズ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ））に結合させ、ビーズをＦｌａｇ−ＧＡＮＰトランスフェクション体の細胞溶解物とインキュベートした。洗浄後、結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで、次に抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体を用いる免疫ブロッティングで分析した。
【００６２】
（２）結果
図３ＡはＭｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲをＦｌａｇ−ＧＡＮＰ又はＭｏｃｋプラスミドＤＮＡと同時トランスフェクフェクションした結果を示す。図３Ａに示すように、Ｍｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲは、同時トランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞中のＦｌａｇ−ＧＡＮＰと共沈した。同じフィルターを抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体で再プローブ結合して、Ｆｌａｇ−ＧＡＮＰの免疫沈降を確認した（図３Ａ、下のパネル）。またＭｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲの量は、両方のトランスフェクション体の全溶解物（ＷＣＬ）でほとんど同一であった。
【００６３】
図３ＢはＦｌａｇ−ＧＡＮＰのトランスフェクション体を用いたプルダウンアッセイ（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ　ａｓｓａｙ）の結果を示す。図３Ｂに示すように、ＧＳＴ−Ｇ５ＰＲはＦｌａｇ−ＧＡＮＰと結合した。
【００６４】
図３Ｃは、Ｍｙｃ−ＥＧＦＰ又はＭｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲをＦｌａｇ−ＧＡＮＰと同時トランスフェクションした結果を示す。Ｍｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲはＦｌａｇ−ＧＡＮＰと共沈したが（図３Ｃ、上のパネル）、陰性対照のＭｙｃ−ＥＧＦＰとは共沈しなかった。抗Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いる再プローブ結合によって、Ｍｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲ又はＭｙｃ−ＥＧＦＰの免疫沈降を確認した（図３Ｃ、下のパネル）。ｎ．ｓ．は非特異的バンドを示す。
【００６５】
抗Ｍｙｃモノクローナル抗体分析で現れた他のバンドは、Ｍｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲの分解産物であると考えられた。これらの結果により、Ｇ５ＰＲが哺乳動物細胞中でＧＡＮＰと結合していることが明らかとなった。
【００６６】
（実施例４）　Ｇ５ＰＲとＰＰａｓｅの種々の触媒サブユニットとの結合
Ｇ５ＰＲはＰＰ２Ａの制御性Ｂサブユニットと相同性を示す（図１Ｃ）。ＰＰ２Ａは、一部は制御性サブユニットＡ（ＰＲ６５）と触媒性サブユニットＣ（ＰＰ２Ａｃ）からなる（ＡＣダイマー）。種々のＢサブユニットがＡＣダイマーと結合して、ＡＢＣトリマーを形成する（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，３２１−３２８，１９９９；　Ｍｉｌｌｗａｒｄ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４，１８６−１９１，１９９９；　Ｚｏｌｎｉｃｒｏｗｉｃｚ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６０，１２２５−１２３５，２０００）。これらの知見に基づき、本実施例ではＧ５ＰＲがＰＰａｓｅの種々の触媒サブユニットと結合するかどうかを調べた。
（１）実験方法
▲１▼ｐＣＭＶ−Ｆｌａｇ−ＰＰａｓｅの構築
種々のＰＰａｓｅの発現構築物を以下のように調製した。ヒトＰＰ１ｃ、ＰＰ２Ａｃ、ＰＰ３（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ　Ａ；ＰＰ２Ｂ）、ＰＰ４、ＰＰ５、およびＰＰ６をコードするｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて作成し、ｐＣＭＶ　Ｔａｇ２ベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中に連結した。次にｐＣＭＶ−Ｆｌａｇ−ＰＰａｓｅを、Ｆｌａｇ標識を結合したマウスＧＡＮＰ発現ベクターについて記載する既報（Ｋｕｗａｈａｒａ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ　９５，２３２１−２３２８，２０００）に従い調製した。各構築体の方向とフレームは、ＤＮＡ配列決定により証明した。
【００６７】
▲２▼トランスフェクション、免疫沈降、ウェスタンブロッティング
Ｍｙｃ−Ｇ５ＰＲを、各Ｆｌａｇ−ＰＰａｓｅと同時トランスフェクションし、相互作用を免疫沈降、ウェスタンブロティングにより分析した。トランスフェクション、免疫沈降、ウェスタンブロッティングの手法は実施例３に記載の方法に従った。
▲３▼プルダウンアッセイ
ＰＲ６５ｂａｉｔを用いる酵母２−ハイブリッドスクリーニングにより、ＰＰ５とＰＲ６５との結合が証明されていることから（Ｌｕｂｅｒｔ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，３８５８２−３８５８７，２００１）、ＧＳＴ−Ｇ５ＰＲがＰＲ６５／ＰＰ２Ａｃ複合体と結合するかどうかを調べた。
ＧＳＴおよびＧＳＴ−Ｇ５ＰＲ融合タンパク質を、既報Ｉｎｕｉ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４，２７１４−２７２３，１９９５）に従い大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）中で産生させた。等量のタンパク質をグルタチオン−セファロースビーズに結合させ、洗浄したビーズを細胞溶解物（ＣＯＳ−７、ヒトＪｕｒｋａｔ、およびマウス脾臓と脳細胞）とともにインキュベートした。洗浄後、結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、抗ＰＰ２Ａｃ　１Ｄ６（アップステートバイオテクノロジーインク（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩＮｃ．）、レークプラシッド、ニューヨーク州）、抗ＰＲ６５（サンタクルツバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））、および抗ＰＰ５抗体（トランスダクションラボラトリーズ（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を用いてウェスタンブロッティング法で分析した。
【００６８】
（２）実験結果
図４ＡはＭｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲと各Ｆｌａｇ−ＰＰａｓｅを同時トランスフェクションした結果を示す。図４Ａに示すように、Ｍｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲは、同時トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞中の各Ｆｌａｇ−ＰＰａｓｅと共沈した。抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体との非特異結合バンド（ｎ．ｓ．で示す）が一貫して観察された（図４Ａ、上のパネル）。トランスフェクションした遺伝子産物の免疫沈降は、抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体により確認した（図４Ａ、下のパネル）。各免疫沈降物中におけるＦｌａｇ−ＰＰａｓｅを矢印で示す。
【００６９】
図４Ｂは、Ｆｌａｇ−ＰＰ５をＭｙｃ−ＥＧＦＰ又はＭｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲと同時トランスフェクションした結果を示す。Ｍｙｃ−ＥＧＦＰ又はＭｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲタンパク質を、抗Ｍｙｃモノクローナル抗体で免疫沈降させ、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。免疫沈降物を、抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体（図４Ｂ、上のパネル）又は抗Ｍｙｃモノクローナル抗体（図４Ｂ、下のパネル）でブロットした。
【００７０】
ＰＰ５はＮ末端ＴＰＲドメインを有し、これは、種々の分子に結合することができる（Ｂｌａｔｃｈ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ　１１，９３２−９３９．１９９９）。ＰＰ５とＧ５ＰＲとの特異的結合領域をさらに局在化するために共沈試験に供するＴＰＲ構築体を使用し、Ｍｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲと免疫沈降させた。
図４Ｃは、Ｍｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲをＦｌａｇ−ＴＰＲ又はＦｌａｇ−ＰＰ５と同時トランスフェクションした結果を示す。Ｆｌａｇ−ＴＰＲとＦｌａｇ−ＰＰ５タンパク質を抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体と免疫沈降させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。免疫沈降物を、抗Ｍｙｃモノクローナル抗体（図４Ｃ、上のパネル）又は抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体（図４Ｃ、下のパネル）でブロットした。Ｍｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲは、明らかにＰＰ５のＴＰＲドメインと結合した。Ｆｌａｇ−ＰＰ５は、追加のいくつかの低分子量バンドを有し、これはおそらく免疫沈降中に発生するＰＰ５の分解産物である。これらの結果により、Ｇ５ＰＲは哺乳動物細胞中でＰＰ５のＮ末端ＴＰＲドメインを介してＰＰ５と結合できることが示された。
【００７１】
図４Ｄは、ＧＳＴ−Ｇ５ＰＲと種々の細胞溶解物を用いてプルダウンアッセイを行った結果を示す。抗ＰＰ２Ａｃ（図４Ｄ、上のパネル）、抗ＰＲ６５（図４Ｄ、中のパネル）、および抗ＰＰ５抗体（図４Ｄ、下のパネル）でブロットした。図４Ｄに示されるように、ＣＯＳ−７、ヒトＪｕｒｋａｔ、マウス脾臓及び脳細胞でＧＳＴ−Ｇ５ＰＲはＰＰ５のみならず、ＰＲ６５とＰＰ２Ａｃとも結合することが明らかとなった（図４Ｄ）。しかし、ＧＳＴは、ＰＲ６５およびＰＰ２Ａｃと複合体を形成しなかった。これらの結果から、Ｇ５ＰＲはＰＲ６５／ＰＰ５とＰＲ６５／ＰＰ２Ａｃという少なくとも２つのタイプのＰＰａｓｅに結合することがわかった。
【００７２】
（実施例５）　Ｇ５ＰＲとＰＰ５又はＰＰ２Ａｃとの結合状態
Ｇ５ＰＲが、ＰＰ２Ａｃ又はＰＰ５とどのように複合体を形成するかを分析するために、Ｆｌａｇ−ＰＰ５とＦｌａｇ−ＰＰ２ＡｃをＣＯＳ−７細胞中にトランスションした。トランスフェクションの２４時間後に細胞を採取し、１％ＴＮＥ溶解緩衝液で溶解した。各全細胞溶解物を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ブロットを抗ＰＰ２Ａｃ抗体と抗ＰＲ６５抗体で検出した（図５Ａ、上のパネル）。プローブを除去後、フィルターを抗ＰＰ５抗体で再プローブ結合させた（図５Ａ、下のパネル）。矢印は個々のタンパク質を示す。
図５Ａに示されるように、内因性ＰＲ６５タンパク質の発現は変化しないが、内因性ＰＰ２Ａｃの発現は既に報告されているように（Ｂａｈａｒｉａｎｓ，Ｚ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１９０１９−１９０２４，１９９８）、Ｆｌａｇ−ＰＰ２Ａｃの導入により顕著に低下した。一方、抗ＰＰ５抗体により確認されたＦｌａｇ−ＰＰ５の過剰発現は、ＰＰ２ＡｃとＰＲ６５タンパク質の内因性発現に大きな影響を与えなかった。
【００７３】
次に、Ｆｌａｇ−ＰＰ５トランスフェクション体を用いるプルダウンアッセイを行って、Ｇ５ＰＲがＰＰ５とＰＰ２Ａｃの両方と結合して複合体を形成するのか、又は各ＰＰａｓｅが個別にＧ５ＰＲに結合するのかを調べた。等量のＧＳＴ−Ｇ５ＰＲ融合タンパク質をグルタチオン−セファロースビーズに結合させ、洗浄した後、Ｍｏｃｋ又はＦｌａｇ−ＰＰ５トランスフェクション細胞溶解物とインキュベートした。再度洗浄後、ＧＳＴ−Ｇ５ＰＲに結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、続いて抗ＰＰ２Ａｃ抗体（図５Ｂ、第１のパネル）、抗ＰＲ６５抗体（図５Ｂ、第２のパネル）、抗ＰＰ５（図５Ｂ、第３のパネル）および抗Ｆｌａｇ抗体（図５Ｂ、第４のパネル）で免疫ブロッティングした。
図５Ｂに示されるように、ＰＲ６５との結合は不変であったが、ＰＰ２Ａｃとの結合は著しく低下し、ＰＰ５との結合は増加した。これは、インビトロではＦｌａｇ−ＰＰ５がＰＰ２ＡｃのＧ５ＰＲへの結合に対して競合的に作用していると説明できる。これらの結果により、Ｇ５ＰＲは細胞中のＰＰ５又はＰＰ２Ａｃのタンパク質ホスファターゼ成分の１つと個別に結合し、複数のタンパク質ホスファターゼ成分からなる複合体を形成するのではないことがわかった。
【００７４】
（実施例６）　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＧ５ＰＲタンパク質複合体のホスファターゼ活性
制御性Ｂサブユニットとの相同性とＰＰａｓｅへの結合活性に鑑みると、Ｇ５ＰＲは、ホスファターゼ活性に直接的な役割を果たすか、又は種々の機能に影響を与える重要な基質へのホスファターゼサブユニットの集約の役割を果たしている可能性がある。そこで、本実施例においてはＧ５ＰＲのタンパク質ホスファターゼ活性を分析するために、基質として^３２Ｐ標識カゼインとヒストンＨ１を用いてインビトロホスファターゼアッセイを行った。
【００７５】
▲１▼　ＰＰ２Ａホロ酵素のホスファターゼ活性
最初に制御性Ｂサブユニットを用いることなく、精製したＰＰ２Ａホロ酵素のホスファターゼ活性を測定した。ＰＰ２Ａホロ酵素（０．２５Ｕ）を、３００ｎｇのＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｇ５ＰＲ又はＨｉｓ−Ｇ５ＰＲと混合し、３０℃で１０分インキュベートした。ＴＣＡ沈殿後、カゼイン（図６Ａ、左のパネル）とヒストンＨ２（図６Ａ、右のパネル）からの３２Ｐｉの放出を測定した。
対照（ＧＳＴ）と比べると、ＧＳＴ−Ｇ５ＰＲ又はＨｉｓ−Ｇ５ＰＲを添加してもホスファターゼ活性に影響を与えないことが示された。
【００７６】
▲２▼　ＰＰ５のホスファターゼ活性
ＰＰ５ホスファターゼ活性に及ぼすＧ５ＰＲの作用を測定した。抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体で免疫共沈したＦｌａｇ−ＰＰ５をプロテインＧ−セファロースビーズで回収した後、洗浄した。各試料を、５００ｎＭのアラキドン酸（ＡＡ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含むか又は含まない反応混合物中で、３００ｎｇのＧＳＴ−Ｇ５ＰＲ融合タンパク質とインキュベートした。ホスファターゼ活性は、既報（Ｉｎｕｉ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ　９２，５３９−５４６，１９９８）の記載に従い、測定した。
図６Ｂに示すように、ＰＰ５活性はＡＡを加えることにより６倍に増加した。これは、免疫複合体が酵素的働きを有する標識ＰＰ５を含んでいることを示す。Ｇ５ＰＲはＡＡにて活性化されたＰＰ５のホスファターゼ活性にややネガティブな影響を与えた。
【００７７】
▲３▼　ＧＳＴ−Ｇ５ＰＲ融合タンパク質のホスファターゼ活性
超音波処理により調製した１ｍｇの全脾臓細胞溶解物を、１０μｇのＧＳＴ−Ｇ５ＰＲと混合し、ＧＳＴ−Ｇ５ＰＲに結合したタンパク質を２５μｌのグルタチオン−セファロースビーズでプルダウンした。プルダウン産物を、５０ｎＭのオカダ酸（ＯＡ：ＰＰ２ＡとＰＰ５の両方の阻害剤）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））又は５００ｎＭのアラキドン酸（ＡＡ：ＰＰ５の活性化剤）とプレインキュベートした。５分後、^３２Ｐ標識カゼインを加え、３０℃で１０分インキュベートし、^３２Ｐ標識カゼインからの３２Ｐｉの放出を測定した。
ＯＡ無しの条件下ではホスファターゼ活性は４．５倍に増加した。また、ＡＡを添加することにより活性が更に５倍増加した（図６Ｃ）。これらの結果は、Ｇ５ＰＲと結合したＰＰ５とＰＰ２Ａｃが、ＯＡ感受性にホスファターゼ活性を発揮することを示す。
【００７８】
▲４▼　Ｇ５ＰＲタンパク質複合体ホスファターゼによるリン酸化ＭＣＭ３タンパク質の脱リン酸化
Ｇ５ＰＲタンパク質複合体ホスファターゼがリン酸化されたＭＣＭ３タンパク質を脱リン酸化するかどうかを調べた。
ｐＳＲα−ＨＡ−ＭＣＭ３発現ベクター（Ｋｕｗａｈａｒａ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ　９５，２３２１−２３２８，２０００）のｃＤＮＡ構築体を使用して、融合タンパク質ＧＳＴ−ＭＣＭ３のためのベクターｐＧＥＸ−ＭＣＭ３を作成し、組換え融合タンパク質ＧＳＴ−ＭＣＭ３を精製した。ＧＳＴ−ＭＣＭ３（１μｇ）を、インビトロでｃｄｃ２／サイクリンＢ（ＣＤＫ１）（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９５）により１０μｌのグルタチオン−セファロースビーズでリン酸化した。リン酸化試料を６５℃で５分処理し、ビーズを界面活性剤を含まないＴＮＥ緩衝液で洗浄した。ホスファターゼタンパク質複合体の調製のために、ＧＳＴ−Ｇ５ＰＲ融合タンパク質を既に記載したようにプルダウンし、次に反応混合物中の最終５０ｎＭのＯＡ又は５００ｎＭのＡＡで再インキュベートした。５分後、^３２Ｐ標識ＧＳＴ−ＭＣＭ３を加え、脱リン酸化を３０℃で３０分行った。界面活性剤を含まないＴＮＥ緩衝液で数回洗浄後、反応物中のタンパク質を溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、クマシーブリリアンドブルー（ＣＢＢ）染色によりタンパク質量を証明し、オートラジオグラフィーにより基質タンパク質上に残った放射能レベルを示した。
【００７９】
インビトロリン酸化ＧＳＴ−ＭＣＭ３は、ＯＡの非存在下でＧ５ＰＲ複合体により脱リン酸化され、脱リン酸化はＡＡの存在下で促進された（図６Ｄ：上のパネル）。ＧＳＴ−ＭＣＭ３の量をすべてのレーンで調整した。下のバンドはＧＳＴ−ＭＣＭ３の分解産物を示す（星印で示す）（Ｓｃｈｗａｂ，Ｂ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．２３８，４１５−４２１，１９９８）。これらの結果はＧ５ＰＲタンパク質複合体ホスファターゼはｉｎ　ｖｉｔｒｏでＭＣＭ３のリン酸化状態を制御する能力があることを示唆する。等量のＧＳＴ融合タンパク質を、ＣＢＢ染色により示した（図６Ｄ：下のパネル）。
【００８０】
（実施例７）　細胞周期中におけるＧ５ＰＲの存在場所
ＰＰ５は、哺乳動物細胞の細胞周期中に核と細胞質中に現れる（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｘ．，ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４００，１３６−１４０，１９９７；Ｏｌｌｅｎｄｏｒｆｆ，Ｖ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３２０１１−３２０１８，１９９８；Ｂｏｒｔｈｗｉｃｋ，Ｅ．Ｂ．，ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４９１，２７９−２８４，２００１）。ＰＰ５の移行は、他のＰＰａｓｅと比較して顕著に検出される。本実施例においては、ＤＮＡトランスフェクション実験により、Ｇ５ＰＲもまた増殖中に細胞質と核中に現れるかどうかを検討した。
【００８１】
（１）実験方法
前記のようにトランスフェクションし、２４時間培養したＣＯＳ−７細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで１５分固定し、０．１％トリトンＸ−１００／ＰＢＳを１５分浸透させ、ＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡで１５分インキュベートし、１％ＦＣＳ／ＰＢＳで１５分処理した。標識シグナルの検出のために、細胞を抗Ｍｙｃモノクローナル抗体（１／５００に希釈）で６０分インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、次にＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）、ユージーン、オレゴン州）で６０分インキュベートした。洗浄後、細胞を１００ｎｇのヨウ化プロピオジウム（ＰＩ；シグマ（Ｓｉｇｍａ））で３分インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、２．５％ＤＡＢＣＯ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有する８０％グリセロール１滴で処理した。標識された細胞を、アルゴンレーザーの蛍光波長（４８８ｎｍ）と４０×ＵＰＬＡＰＯ対物レンズを取り付けたオリンパス顕微鏡装置で評価した。
【００８２】
（２）実験結果
図７ＡはＰＩ染色した細胞を蛍光顕微鏡により観察した結果を示す（倍率＝×４００）。図７Ａに示すように、Ｍｙｃ−Ｇ５ＰＲは、ＣＯＳ−７細胞中で核と細胞質に発現した。ＤＮＡ転写実験において、Ｇ５ＰＲは主に核で増加するが、細胞質では増加しなかった。核周辺領域ではＭｙｃ−Ｇ５ＰＲのかすかな増加が認められた。
図７Ｂは、細胞周期の異なる段階にある細胞を選択して、細胞質と核中のＭｙｃ−Ｇ５ＰＲの発現をＭｙｃ−Ｇ５ＰＲ染色と核ＰＩ染色の重層により調べた結果を示す。図７Ｂに示されるように、細胞周期行程において、ＰＩ染色で確認されたように、Ｍｙｃ−Ｇ５ＰＲは中期に核膜を通過して核の一部に出現する。そして、前中期には濃縮されたクロマチン構造から排除される。中期では、Ｍｙｃ−Ｇ５ＰＲ発現の局在化は、核分裂中の有糸分裂紡錘体と似ており、この段階でＤＮＡ染色は、赤道線付近に限定された。後期の核破壊後は、Ｇ５ＰＲは、細胞分裂中に細胞質中に拡散して現れ、次に細胞分裂中に核から排除されながら細胞質中にとどまった。Ｇ５ＰＲの細胞局在化は、ＰＰ５と極めて類似していた（Ｏｌｌｅｎｄｏｒｆｆ，Ｖ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３２０１１−３２０１８，１９９８）。Ｇ５ＰＲとＰＰ５は同様の細胞コンパートメント中に現れ、これらが細胞サイクル中に機能性相互作用を受けることができることを示唆している。
【発明の効果】
本発明によれば、癌又は自己免疫疾患において認められるＢ細胞の異常増殖に関与しているＧＡＮＰタンパク質とともに増減する新規なＧＡＮＰ結合性タンパク質が同定された。本発明で同定された該タンパク質を利用して、癌又は自己免疫疾患の診断を行うことができる。
【００８３】
【配列表】

【００８４】

【００８５】

【００８６】

【００８７】

【００８８】

【００８９】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１ＡはマウスＧＡＮＰタンパク質の略図を示す。ＧＡＮＰタンパク質のＳＡＣ３相同性領域とＭａｐ８０領域（ＭＣＭ３ＡＰ）を示す。図１ＢはＧ５ＰＲ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を示す。下線部位は推定の核局在化シグナル、四角で囲んだ部位はＥＦ−ハンドモチーフを表す。
【図２】図１ＣはＧ５ＰＲの推定アミノ酸配列とＰＰ２ＡのＢサブユニットおよびジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）中の相同配列の比較を示す。同一の残基には影をつけてある。図１ＤはＧ５ＰＲと関連タンパク質との相対的類似性を示す、ＤＮＡＳＩＳソフトウェアによる分析から得た系統樹を示す。
【図３】図２ＡはマウスとヒトＧ５ＰＲタンパク質のアミノ酸配列の比較を示す。図２ＢはヒトＧ５ＰＲ遺伝子のゲノム構造を示す。
【図４】図２ＣはＧ５ＰＲの発現を種々の組織や臓器から単離した総ＲＮＡを用いて分析した結果を示す。図２ＤはＧ５ＰＲ　ＲＮＡ発現のノーザンブロット解析の結果を示す。
【図５】図３ＡはＭｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲを、Ｆｌａｇ−ＧＡＮＰ又はＭｏｃｋプラスミドＤＮＡと同時トランスフェクションした結果を示す（図３Ａ、上のパネル：抗Ｍｙｃモノクローナル抗体でブロット。図３Ａ、下のパネル：抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体でブロット。）。図３Ｂは、Ｆｌａｇ−ＧＡＮＰのトランスフェクション体を用いたプルダウンアッセイの結果を示す。
【図６】図３Ｃは、Ｍｙｃ−ＥＧＦＰ又はＭｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲをＦｌａｇ−ＧＡＮＰと同時トランスフェクションした結果を示す（図３Ｃ、上のパネル：抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体でブロット。図３Ｃ、下のパネル：抗Ｍｙｃモノクローナル抗体でブロット。）。
【図７】図４ＡはＭｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲと各Ｆｌａｇ−ＰＰａｓｅを同時トランスフェクションした結果を示す（図４Ａ、上のパネル：抗Ｍｙｃモノクローナル抗体でブロット。図４Ａ、下のパネル：抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体でブロット。）。図４ＢはＭｙｃ−ＥＧＦＰ又はＭｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲと同時トランスフェクションした結果を示す（図４Ｂ、上のパネル：抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体でブロット、図４Ｃ、下のパネル：抗Ｍｙｃモノクローナル抗体でブロット。）。
【図８】図４Ｃは、Ｍｙｃ−ＥＧＦＰ−Ｇ５ＰＲをＦｌａｇ−ＴＰＲ又はＦｌａｇ−ＰＰ５と同時トランスフェクションした結果を示す（図４Ｃ、上のパネル：抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体でブロット、図４Ｃ、下のパネル：抗Ｍｙｃ−モノクローナル抗体でブロット。）。図４Ｄは、ＧＳＴ−Ｇ５ＰＲとの種々の細胞溶解物を用いてプルダウンアッセイを行った結果を示す（図４Ｄ、上のパネル：抗ＰＰ２Ａｃ、図４Ｄ、中のパネル：抗ＰＲ６５、図４Ｄ、下のパネル：抗ＰＰ５抗体でブロット。）。図４Ａ，Ｃ中、星印はＦｌａｇ−ＰＰ５の分解産物由来の断片、ｎ．ｓ．は非特異結合を示す。
【図９】図５Ａは、Ｆｌａｇ−ＰＰ５又はＦｌａｇ−ＰＰ２Ａｃトランスフェクション体の細胞溶解物の結合を示す（図５Ａ、上のパネル：抗ＰＲ６５と抗ＰＰ２Ａｃ抗体でプローブ結合、図５Ｂ、下のパネル：抗ＰＰ５抗体で再プローブ結合）。矢印は個々のタンパク質を示す。図５ＢはＦｌａｇ−ＰＰ５トランスフェクション体を用いてプルダウンアッセイを行った結果を示す（図５Ｂ、第１のパネル：抗ＰＰ２Ａｃでブロット、図５Ｂ、第２のパネル：抗ＰＲ６５でブロット、第３のパネル：抗ＰＰ５抗体でブロット、図５Ｂ、第４のパネル；抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体でブロット。）。
【図１０】図６Ａは、ＰＰ２Ａホロ酵素のホスファターゼ活性を示す。図６Ｂは、ＰＰ５のホスファターゼ活性を示す。
【図１１】図６Ｃは、ＧＳＴ−Ｇ５ＰＲタンパク質複合体のホスファターゼ活性を示す。図６Ｄは、Ｇ５ＰＲタンパク質複合体ホスファターゼによるリン酸化ＭＣＭ３タンパク質の脱リン酸化を示す。
【図１２】図７Ａは、Ｍｙｃ−Ｇ５ＰＲを導入したＣＯＳ−７細胞をＰＩ染色して蛍光顕微鏡により観察した結果を示す（倍率；×４００）。図７Ｂは、細胞周期の異なる段階にある細胞を選択して、細胞質と核中のＭｙｃ−Ｇ５ＰＲの発現をＭｙｃ−Ｇ５ＰＲ染色と核ＰＩ染色の重層により調べた結果を示す。

Claims

下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するアミノ酸配列；又は、
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するアミノ酸配列：
請求項１に記載のタンパク質とタンパク質ホスファターゼとから成るタンパク質複合体。
タンパク質ホスファターゼが、タンパク質ホスファターゼ５（ＰＰ５）又はタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）であることを特徴とする請求項２記載のタンパク質複合体。
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、ＧＡＮＰに対する結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列：
請求項４又は５に記載の遺伝子を含むベクター。
請求項４若しくは５に記載の遺伝子又は請求項６に記載のベクターを有する形質転換体。
請求項１に記載のタンパク質、又は請求項２若しくは３に記載のタンパク質複合体に対する抗体。
請求項８に記載の抗体を含むＧＡＮＰ結合性タンパク質測定用試薬。
癌又は自己免疫疾患の診断に用いられる請求項９に記載の試薬。
請求項８に記載の抗体を含むＧＡＮＰ結合性タンパク質測定用キット。
癌又は自己免疫疾患の診断に用いられる請求項１１に記載のキット。